Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publikováno online 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstraktní
Cíle / hypotéza
Přejídání tuků v potravě způsobuje u lidí a hlodavců obezitu. Nedávné studie na lidech a hlodavcích prokázaly, že závislost na tucích sdílí běžný mechanismus závislosti na alkoholu, nikotinu a narkotikách, pokud jde o dysfunkci systémů odměňování mozku. Bylo zdůrazněno, že dieta s vysokým obsahem tuků (HFD) tlumí signalizaci dopaminového D2 (D2R) signalizace ve striatu, klíčovém regulátoru systému odměňování mozku, což má za následek hedonické přejídání. Již dříve jsme uvedli, že bioaktivní složka y-oryzanol specifická pro hnědou rýži oslabila preferenci HFD pomocí hypotalamické kontroly. Proto jsme prozkoumali možnost, že y-oryzanol bude modulovat fungování systému odměňování mozku u myší.
Metody
Samci myší C57BL / 6J krmení HFD byli orálně léčeni y-oryzanolem a byly vyhodnoceny striatální hladiny molekul zapojených do signalizace D2R. Byl zkoumán vliv y-oryzanolu na methylaci DNA promotoru D2R a následné změny v preferencích pro dietní tuk. Kromě toho byly zkoumány účinky 5-aza-2'-deoxycytidinu, účinného inhibitoru DNA methyltransferáz (DNMT), na potravinové preference, signalizaci D2R a hladiny DNMT ve striatu. Inhibiční účinky y-oryzanolu na aktivitu DNMT byly enzymaticky hodnoceny in vitro.
výsledky
Ve striatu u myší krmených HFD byla produkce D2R snížena zvýšením methylace DNA promotorové oblasti D2R. Perorální podání y-oryzanolu snížilo expresi a aktivitu DNMT, čímž se obnovila hladina D2R ve striatu. Farmakologická inhibice DNMTs 5-aza-2'-deoxycytidinem také zlepšila preferenci dietního tuku. V souladu s těmito zjištěními enzymatické in vitro testy ukázaly, že y-oryzanol inhiboval aktivitu DNMT.
Závěry / interpretace
Ukázali jsme, že y-oryzanol zlepšuje HFD-indukovanou hypermetylaci DNA promotorové oblasti D2R ve striatu myší. Naše experimentální paradigma zdůrazňuje γ-oryzanol jako slibnou látku proti obezitě s výraznou vlastností nového epigenetického modulátoru.
Elektronický doplňkový materiál
Online verze tohoto článku (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) obsahuje recenzované, ale neupravené doplňkové materiály, které jsou k dispozici oprávněným uživatelům.
Úvod
Přejídání u obézních jedinců sdílí, alespoň částečně, společné mechanismy se závislostí na alkoholu, nikotinu a narkotikách [1]. Stejně jako hypotalamická a hormonální regulace chuti k jídlu, systém odměňování mozku, zejména signalizace dopaminového receptoru, úzce souvisí s návykovým nebo hedonickým krmením [2]. Předchozí studie na potkanech ukázala, že knockdown striatálního dopaminového D2 receptoru (D2R) pomocí lentivirem zprostředkované krátké vlásenky interferující RNA rychle vyvolané deficity odměn podobné závislosti a nutkavé hledání potravy [3]. Vzhledem ke snížené hustotě D2R je dorzální striatum méně citlivé na odměnu v porovnání s chudými kontrolními skupinami u obézních lidí a hlodavců [3-5]. V souladu s touto představou TaqIA alela ANKK1 genový lokus (kódující repetici DRD2 / ankyrin a kinázovou doménu obsahující 1), která snižuje produkci striatalu D2R, je u lidí spojen s obézním fenotypem [6], zatímco účinky hubnutí po bariatrické chirurgii jsou spojeny se zvýšenou striatální hustotou D2R [7]. Tato data silně naznačují důležitost striatálního D2R jako nového terapeutického cíle pro léčbu obezity. Nicméně některé léky, které byly vyvinuty a působily na systém odměňování mozku, způsobily značné nepříznivé účinky, včetně závažných psychiatrických problémů, které vedly k jejich případnému stažení z klinik [8].
Epigenetické modifikace jsou kritické nejen pro vývoj a diferenciaci, ale také proto, že vznikají v důsledku změn prostředí, včetně stravování a životního stylu [9]. Methylace DNA je hlavní epigenetickou událostí pro stabilitu genové exprese [9]. U potkanů ovlivňuje expozice matek vysokotučnou dietou (HFD) mezigeneračně DNA metylaci v centrálním systému odměn u potomků, což vede k nadměrné konzumaci HFD u mláďat [10]. Zejména DNA methyltransferázy (DNMT) hrají klíčovou roli v regulaci chování při krmení a fyzické aktivity [10, 11], což naznačuje, že DNMT by mohly být slibnými terapeutickými cíli pro terapii syndromu obezity - diabetes. Je důležité, že některé přírodní látky odvozené od potravin, včetně kyseliny kofeové a epigalokatechinu, jsou známy jako inhibitory DNMT [12, 13].
Nedávno jsme prokázali, že bioaktivní složka y-oryzanol specifická pro hnědou rýži, směs esteru kyseliny ferulové a několika fytosterolů, utlumuje preferenci dietního tuku snížením hypothalamického endoplazmatického retikula (ER) [14]. U myší a králíků byl orálně podávaný y-oryzanol rychle absorbován ze střeva a distribuován hlavně do mozku [15, 16]. Na základě těchto poznatků by přírodní produkty získané z potravin působící na centrální nervový systém mohly být alternativou k bezpečnému zlepšení zhoršeného chování při stravování u obezity. V této souvislosti jsme testovali hypotézu, že y-oryzanol by změnil stav methylace DNA v systému odměňování mozku, což by vedlo k oslabení preference HFD u myší.
Metody
Zvířata
Sedm týdnů staré samčí myši C57BL / 6J získané od společnosti Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonsko) byly umístěny (3–4 na klec) za podmínek bez specifických patogenů při teplotě 24 ° C za světla 12 h / 12 h / temný cyklus. Po týdnu aklimatizace byly 8týdenní myši porovnány podle hmotnosti a rozděleny do dvou nebo tří skupin, aby podstoupily každý experiment. Myším byl umožněn volný přístup k jídlu a vodě. Všechny experimenty na zvířatech byly schváleny Etickou komisí pro experimenty na zvířatech University of Ryukyus (č. 5352, 5718 a 5943).
Podávání y-oryzanolu a 5-aza-2'-deoxycytidinu
Aby se vyhodnotila preference pro HFD, byl y-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonsko) podán myším 8 týdně sondou během testu výběru jídla, jak bylo popsáno dříve [14, 17]. Pro další experimenty byl jako pelety vyroben HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) obsahující 0.4% y-oryzanol. Složky stravy jsou uvedeny v tabulce elektronických doplňkových materiálů (ESM) 1. Po 12 týdnech krmení byla tkáň odebrána ze striata a hypotalamu. Denní příjem y-oryzanolu, odhadovaný z průměrného příjmu potravy myší, byl přibližně 320 μg / g tělesné hmotnosti. Dávky y-oryzanolu byly stanoveny, jak bylo popsáno výše [14]. 5-aza-2'-deoxycytidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) byl intraperitoneálně injikován (0.25 μg / g tělesné hmotnosti) třikrát týdně po dobu 12 týdnů [18].
Odhad preference pro dietní tuk
Pro vyhodnocení preferencí pro dietní tuk poskytly potravinové testy výběr mezi chow a HFD (D12450B a D12451; Research Diets), jak bylo popsáno dříve [14]. Složky stravy jsou uvedeny v tabulce ESM 1. Stručně, myším byl umožněn volný přístup k krmivu a HFD. Příjem krmiva a HFD byl měřen každý týden a analyzovány na změny v preferenci tuku v potravě. Preference HFD byla vypočtena podle vzorce: Preference HFD = [(příjem HFD / celkový příjem potravy) × 100].
Bisulfitové sekvenování pro methylaci DNA
DNA byla purifikována pomocí DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Japonsko). Roztok DNA byl smíchán s čerstvě připraveným 3 mol / l NaOH, inkubován při 37 ° C po dobu 15 minut a přidán k 5.3 mol / l močoviny, 1.7 mol / l hydrogensiřičitanu sodného a 4.9 mmol / l hydrochinonu. Roztok byl podroben 15 cyklům denaturace při 95 ° C po dobu 30 s a inkubaci při 50 ° C po dobu 15 minut [19]. Bisulfitem ošetřená DNA byla purifikována pomocí MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) a amplifikována pomocí PCR pomocí KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) a primerů kolem místa CpG promotorové oblasti D2R . Sekvence primerů byly následující: přímý primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; reverzní primer, 5´-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Dále byly přidány a adaptovány sekvence adaptéru pomocí Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Vzorky byly poté spojeny a naloženy na GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japonsko) pro sekvenování podle protokolu výrobce. Úroveň methylace byla vyjádřena jako procento methylovaných cytosinů ve všech zbytcích cytosinů.
Test aktivity DNMT
Test enzymatické aktivity DNMT byl prováděn s použitím soupravy EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) a EPIgeneous Methyltransferase Assay Kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) podle protokolů výrobce.
Aby se vyhodnotila inhibiční aktivita každé sloučeniny na methylaci DNA, tvorba S-adenosyl-l-homocystein (SAH) byl měřen v přítomnosti každé sloučeniny (20 μmol / l pro screeningové testy), S-adenosyl methionin (SAM; 10 μmol / l) a substrát DNMT (4 ng / μl) při teplotě 37 ° C po dobu 90 minut. Pro vyhodnocení kinetiky Michaelis – Menten byl DNMT1 (20 μmol / l) inkubován s γ-oryzanolem, SAM (5 μmol / l) a indikovanou koncentrací poly dI-dC při 37 ° C po dobu 90 minut. DNMT3a (100 μmol / l) a DNMT3b (100 μmol / l) byly inkubovány s y-oryzanolem, SAM (5 μmol / l) a indikovanou koncentrací poly dG · dC při 37 ° C po dobu 120 minut. Testy byly prováděny čtyřnásobně. Extrahovaný protein (0.75 mg / ml) byl inkubován s SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml) a poly dG · dC (5 μg / ml) při 40 ° C po dobu 120 minut a Byla měřena tvorba SAH.
Test aktivity receptoru-y na estrogen
Potenciální antagonistická aktivita y-oryzanolu na estrogenový receptor-y (ERRγ) byla hodnocena pomocí systému pro stanovení lidského estrogenového receptoru gama Reporter (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) podle protokolu výrobce. Ve stručnosti, nelidské savčí reportérové buňky konstitutivně exprimující aktivní ERRy byly vystaveny uvedeným koncentracím každé sloučeniny po dobu 24 hodin v trojím provedení.
Western blotting
Toto bylo provedeno tak, jak bylo dříve popsáno [20] s protilátkami proti D2R (1: 500, králík), transportéru dopaminu (DAT; 1: 500, králík), tyrosinhydroxyláze (TH; 1: 1000, králík) (AB5084P, AB1591P a AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), signální měnič a aktivátor transkripce 3α (STAT3α; 1: 1000, králík), DNMT1 (1: 1000, králík), DNMT3a (1: 1000, králík) (č. 8768, 5032 a 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonsko), DNMT3b (1 μg / ml, králík), ERRγ (1: 1000, králík) a β-aktin (1: 10,000 16049, myš) (ab128930, ab6276 a abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Kvantitativní PCR v reálném čase
Exprese genu byla zkoumána, jak bylo popsáno dříve [14]. Hladiny mRNA byly normalizovány na Rn18 (18S rRNA). Sady primerů použité pro kvantitativní analýzy v reálném čase PCR jsou shrnuty v tabulce ESM 2.
Statistická analýza
Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. V případě potřeby byla použita jednosměrná ANOVA a ANOVA s opakovaným měřením, po nichž následovalo několik srovnávacích testů (metoda Bonferroni – Dunn). Studentské t test byl použit k analýze rozdílů mezi dvěma skupinami. Rozdíly byly považovány za významné p <0.05.
výsledky
Farmakologická inhibice DNMT pomocí 5-aza-dC oslabila preferenci dietního tuku u myší
U myší krmených HFD byla methylace DNA v promotorové oblasti D2R ve striatu významně zvýšena ve srovnání s myšmi krmenými krmivem pro chow (Obr. (Obr.1a) .1A). Na druhé straně, hypothalamická methylace DNA v promotorové oblasti D2R byla zjevně vyšší než ve striatu v krmivech pro strava (p <0.01) (obr. (Obr.1a, 1a, f) a nebyl změněn pomocí HFD (Obr. (Obr.1f) .1F). U myší krmených HFD byla zvýšená methylace DNA v promotorové oblasti D2R ve striatu normalizována ošetřením 5-aza-dC, silným inhibitorem DNMT (Obr. (Obr.1a) .1A). Na rozdíl od toho, methylace DNA v promotorové oblasti D2R v hypotalamu nebyla významně změněna ošetřením 5-aza-dC (Obr. (Obr.1f) .1F). Ve striatu 20 týdnů starých samců myší krmených HFD po dobu 12 týdnů byly hladiny mRNA a proteinu D2R významně sníženy (obr. (Obr.1b, 1b, k, l). Naproti tomu hladiny dopaminových D1 receptorů (D1R, kódované pomocí Drd1), které působí opačně než D2R na adenylyl cyklázu a cAMP zprostředkovanou intracelulární signalizaci, se nezměnily (obr. (Obr.1c) .1C). Dále nedošlo k žádné změně hladin jiných molekul souvisejících se signalizací D2R, jako je TH a DAT na úrovni mRNA a / nebo proteinu (Obr. (Obr.1d, 1d, e, k, m). Na druhé straně nebyly pozorovány žádné zjevné změny v hypotalamu, včetně D2R (Obr. (Obr.1g – m) .1g – m). Pozoruhodné bylo, že hladiny proteinů D2R a TH v hypotalamu byly mnohem nižší než hladiny ve striatu (Obr. (Obr.1l, 1l, m), možná odrážející relativní význam signalizace dopaminového receptoru v mozkovém odměnovém systému ve srovnání s hypotalamem.
Aby se prozkoumalo, zda by methylace DNA v promotorové oblasti D2R nezměnila preferenci pro dietní tuk, bylo analyzováno chování krmení myší ošetřených 5-aza-dC. Jak se očekávalo, 5-aza-dC významně zvýšila hladinu mRNA a proteinů pro D2R ve striatu myší s krmením HFD (Obr. (Obr.1b, 1b, k, l). Na druhou stranu, nebyl žádný vliv na hladinu Drd1, Th a Slc6a3 (kódování DAT) ve striatu nebo na úrovních Drd2, Drd1, Th a Slc6a3 v hypotalamu (Obr. (Obr.1c – e, 1c – e, g – m). Zatímco myši ošetřené vehikulem preferovaly HFD, preference HFD byla významně snížena u myší ošetřených 5-aza-dC (88% hodnot pro myši ošetřené vehikulem) (Obr. (Obr.1n) .1n). V důsledku toho léčba 5-aza-dC snížila přírůstek tělesné hmotnosti (Obr. (Obr.11Ó).
y-oryzanol snižuje hladiny DNMT ve striatu myší s krmením HFD
Jak jsme již dříve nahlásili [14], orální podávání y-oryzanolu samcům myší sondou významně oslabilo preferenci pro HFD (93% hodnot pro myši ošetřené vehikulem) (Obr. (Obr.2a), 2a), což má za následek zjevný úbytek tělesné hmotnosti (obr. (Obr.2b) .2b). Proto jsme zkoumali potenciální dopad y-oryzanolu na epigenetickou modulaci D2R ve striatu.
U savců existují tři hlavní DNMT - DNMT1, 3a a 3b. Funkce DNMT1 slouží k udržování methylace DNA, zatímco DNMT3a a 3b hrají roli při usnadnění de novo methylace DNA [21]. Abychom prozkoumali potenciální dopad y-oryzanolu na DNMT in vivo, hodnotili jsme hladiny DNMT v mozcích myší s krmením HFD. Přestože HFD jako takový neměla žádný účinek na hladiny mRNA a proteinů DNMT ve striatu ani v hypotalamu, suplementace y-oryzanolem významně snížila hladiny DNMT ve striatu, ale nikoli v hypotalamu (Obr. (Obr.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Tato data zvyšují možnost, že y-oryzanol může regulovat hladiny DNMTs striatum-specifickým způsobem. Podobným způsobem 5-aza-dC významně snížil hladiny mRNA DNMT3a a 3b přednostně ve striatu (ESM Obr. 1inzerát).
Na základě předchozí studie, která ukazuje, že hladina mRNA DNMT1 byla pozitivně regulována, alespoň částečně, jaderným receptorem ERRy [22], zkoumali jsme potenciální účinek y-oryzanolu na aktivitu ERRy. V nehumánních savčích buňkách konstitutivně exprimujících aktivní ERRy, 4-hydroxy tamoxifen, silný inverzní agonista ERRy, výrazně snížil aktivitu ERRy. Je třeba poznamenat, že y-oryzanol částečně snížil aktivitu ERRy (přibližně 40% snížení vrozené hodnoty) (Obr. (Obr.3a) .3A). Důležité je, že ERRy byl vysoce exprimován ve striatu, ale nikoli v hypotalamu (Obr. (Obr.3b – d) .3b – d). Na rozdíl od situace ve striatu, y-oryzanol významně zvýšil hladinu proteinů DNMT1 pouze v hypotalamu (Obr. (Obr.2k, 2k, l). Tyto výsledky lze alespoň částečně vysvětlit naším zjištěním, že STAT3α, pozitivní regulátor úrovně DNMT1 [23], byl hojně vyjádřen v hypotalamu, ale ne ve striatu (Obr. (Obr.33např).
Pro další posouzení dopadu y-oryzanolu na aktivitu DNMT in vivo byla u myší ošetřených y-oryzanolem krmených HFD hodnocena tvorba SAH, vedlejší produkt DNA methylace a také silný inhibitor DNMT. Nebyly zaznamenány žádné významné změny ve tvorbě SAH u striata ani hypotalamu mezi HFD-krmenými a krmenými myší (Obr. (Obr.2f, 2f, j). Je patrné, že y-oryzanol významně snížil tvorbu SAH ve striatu (Obr. (Obr.2f) 2f) ale ne v hypotalamu (Obr. (Obr.2j), 2j), což naznačuje, že y-oryzanol může potlačovat aktivitu DNMTs striatum-specifickým způsobem u myší s krmením HFD.
Enzymatické analýzy inhibičních vlastností y-oryzanolu pro DNMT in vitro
Dále jsme hodnotili dopad y-oryzanolu na aktivitu DNMT in vitro. Byla hodnocena inhibiční účinnost y-oryzanolu, kyseliny ferulové, 5-aza-dC, haloperidolu (reprezentativní antagonista D2R), chinpirolu (reprezentativní agonista D2R) a SAH proti DNMT. Jako pozitivní kontrola SAH silně utlumil aktivity DNMT v závislosti na dávce (Obr. (Obr.4a – f) .4a – f). Jak se očekávalo, haloperidol a chinpirol nevykazovaly žádný účinek na aktivitu DNMT (ESM Obr. 2). Je zřejmé, že y-oryzanol významně inhiboval aktivity DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) a 3b (maximální inhibice 57%) (obr. (Obr.4d – f) .4d – f). Naproti tomu inhibiční aktivita kyseliny ferulové, metabolitu y-oryzanolu, byla mnohem nižší než inhibiční aktivita y-oryzanolu (Obr. (Obr.44d – f).
Dále jsme zkoumali inhibiční vlastnosti y-oryzanolu na DNMT. Tvorba SAH byla měřena pro hodnocení inhibiční aktivity y-oryzanolu na DNMT in vitro. Údaje o tvorbě SAH během DNMT-zprostředkované methylace DNA ukazují nasycený vzorec kinetiky Michaelis – Menten pro přítomnost i nepřítomnost y-oryzanolu (Obr. (Obr.4g – i) .4g – i). Při DNMT1-zprostředkované methylaci DNA analýza Eadie – Hofstee prokázala, že γ-oryzanol nevykazoval žádný účinek na V max tvorby SAH (vehikulum, 597 pmol / min; y-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; y-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), zatímco γ-oryzanol zjevně zvýšil K m (vehikulum, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (obr. (Obr.4j) .4j). Tyto výsledky naznačují, že y-oryzanol inhibuje DNMT1 alespoň částečně konkurenčním způsobem. Na druhou stranu, pro DNMT3a- a 3b-zprostředkovanou methylaci DNA, y-oryzanol snížil V max tvorby SAH (DNMT3a: vehikulum, 85.3 pmol / min; y-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; y-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vehikulum, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) a podobně K m pro tuto reakci (DNMT3a: vehikulum, 0.0086 μg / ml; y-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vehikulum, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (obr. (Obr.4k, 4k, l). Tyto výsledky naznačují, že y-oryzanol inhibuje DNMT3a a 3b alespoň částečně nekompetitivním způsobem.
y-oryzanol zvyšuje hladiny D2R ve striatu myší s krmením HFD
Dále jsme testovali možnost, že y-oryzanol by zvýšil striatální obsah D2R prostřednictvím inhibice DNMT. U myší s krmením HFD perorální podávání y-oryzanolu významně snížilo methylaci striatální DNA v promotorové oblasti D2R (Obr. (Obr.5a), 5a), zatímco to neudělalo v hypotalamu (Obr. (Obr.5f) .5F). V souladu s těmito zjištěními byly hladiny mRNA a proteinů D2R recipročně zvýšeny (Obr. (Obr.5b, 5b, g, k, l). Podobné s údaji o léčbě 5-aza-dC (obr. (Obr.1), 1), nebyly pozorovány žádné zjevné účinky na hladiny RNA a proteinů Drd1, Th a Slc6a3 (DAT) ve striatu a nemá žádný vliv na hladinu Drd1, Th a Slc6a3 v hypotalamu (Obr. (Obr.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Předchozí studie ukázaly, že hladiny D2R a DNMT1 jsou regulovány stresem ER a zánětem alespoň částečně prostřednictvím NF-kB [17, 24, 25]. Proto jsme zkoumali hladiny genů souvisejících se stresem ER a zánětem. Jak bylo dříve prokázáno [26], HFD zvýšila expresi genů kódujících TNF-a (Tnfa), monocytární chemoatraktantový protein - 1 (MCP-1) (Ccl2), Homologní protein C / EBP (Kotleta), ER-lokalizovaný DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) a sestřiženou formu X-box vázajícího proteinu 1 (Xbp1) v hypotalamu, ale ne ve striatu (Obr. (Obr.6) .6). Zejména doplnění HFD y-oryzanolem významně snížilo zvýšenou expresi Ccl2, Kotleta, Dnajb9 a Xbp1 výhradně v hypotalamu, ale ne ve striatu (Obr. (Obr.66).
Diskuse
Hlavním zjištěním v této studii je, že y-oryzanol působí jako silný inhibitor DNMT ve striatu myší, čímž oslabuje, alespoň částečně, preferenci HFD epigenetickou modulací striatálního D2R. Ve striatu u myší s krmením HFD byly hladiny D2R významně sníženy, zatímco hladiny D1R, TH a DAT nebyly změněny (Obr. (Obr.1b – e, 1b – e, k – m). Tato data jsou v souladu s představou, že dysregulace striatálního D2R hraje rozhodující roli ve vnímání potravinové odměny při HFD, což vede k hedonické nadměrné konzumaci HFD u obézních zvířat [3]. V této studii léčba myší s krmením HFD pomocí 5-aza-dC významně zvýšila hladiny striatálního D2R (Obr. (Obr.1b, 1b, k, l) možná snížením úrovně methylace DNA v promotorové oblasti D2R (Obr. (Obr.1a), 1a), a následně zmírnil preferenci dietního tuku (Obr. (Obr.1n) .1n). Toto zjištění také podporuje kritickou roli striatálních D2R ve vnímání potravinové odměny na HFD.
Náš in vitro test ukázal, že inhibiční aktivita y-oryzanolu proti DNMT byla zjevně silnější než jeho metabolitová kyselina ferulová (Obr. (Obr.4d – f), 4d – f), což naznačuje důležitost kompletní struktury y-oryzanolu pro jeho inhibiční účinek na DNMT. U myší s krmením HFD naše studie naznačují, že po perorálním podání y-oryzanol dosáhne mozku jako úplná struktura a snižuje hladiny a aktivity DNMTs přednostně ve striatu, s následným snížením methylace DNA v promotorové oblasti D2R ve striatu. Naše in vitro studie dále prokázaly, že y-oryzanol působí jako částečný antagonista proti ERRy, který primárně slouží jako pozitivní regulátor produkce DNMT1 [22] a následně snížila aktivitu DNMT1 (Obr. (Obr.3a) .3A). Za zmínku stojí, že ERRy byl vysoce exprimován ve striatu, ale nikoli v hypotalamu u myší (Obr. (Obr.3b) .3b). Tato data naznačují, že y-oryzanol má potenciál snížit hladinu mRNA DNMT1, alespoň částečně, prostřednictvím inhibice ERRy. Na rozdíl od striata, y-oryzanol nevykazoval žádný účinek na hladinu D2R v hypotalamu u myší s krmením HFD (Obr. (Obr.5g, 5g, k, l).
Na druhé straně jsme prokázali, že y-oryzanol významně zvýšil hladiny DNMT1 v hypotalamu, ale nikoli ve striatu (Obr. (Obr.2k, 2k, l). Ukázalo se, že STAT3 zvyšuje obsah DNMT1 v maligních buňkách T-lymfomu [23]. Zejména jsme dříve demonstrovali, že y-oryzanol významně zvýšil leptinem indukovanou STAT3 fosforylaci v hypotalamu u myší s krmením HFD [14]. Je třeba také poznamenat, že STAT3a byl v podstatě exprimován v hypotalamu, ale nikoli ve striatu u myší (Obr. (Obr.3e – g) .3např). Tato data nás pokoušejí spekulovat, že zjevný rozdíl v účinku y-oryzanolu na hladiny DNMT1 mezi hypotalamem a striatem lze přinejmenším částečně připsat regionálně specifickému obsahu STAT3α a ERRy v mozku myší ( Obr. (Obr.3b – g) .3b – g). Společně se zdá, že existuje reciproční vzorec exprese ERRy a STAT3a mezi striatem a hypotalamem u myší. Na základě našich výsledků je proto rozumné spekulovat, že ve striatu, kde je produkce ERRy hojná, může y-oryzanol přednostně snižovat hladinu mRNA a enzymatickou aktivitu DNMT1 jako negativní regulátor ERRy. Naproti tomu v hypotalamu, kde je dominantní produkce STAT3a, může y-oryzanol přednostně zvyšovat hladiny DNMT1.
Nedávná studie prokázala, že oslabení striatální D2R signalizace indukované HFD narušuje chování při krmení [3], což naznačuje potenciální význam inhibice striatálních DNMT pro léčbu obezity. Na druhé straně předchozí studie prokázala možnost, že stav DNA methylace genu 4 receptoru melanokortinu exprimovaného ve specifických hypothalamických jádrech by mohl modulovat transgenerační formy obezity u agouti životaschopných žlutých myší [27]. Ačkoli jsou další studie oprávněny objasnit základní mechanismy, tyto studie naznačují význam tkáňové, genové a sekvenčně specifické methylace DNA v patofyziologii obezity vyvolané HFD.
Nedávno jsme uvedli, že HFD zvýšila hladinu D2R v pankreatických ostrůvcích myší [17, 24]. Je pravděpodobné, že taková augmentace je zprostředkována, alespoň částečně, stresem ER a zánětem prostřednictvím NF-KB, protože v promotorové oblasti D2R existuje několik prvků reagujících na NF-KB [17, 24]. Nedávná studie dále ukázala, že TNF-a a IL-1β zvyšují hladinu a aktivitu DNMT1 v tukové tkáni myší s krmením HFD [25]. Důležité je, že tato studie prokázala, že HFD indukuje ER stres a zánět přednostně v hypotalamu, ale nikoli ve striatu (Obr. (Obr.6) .6). Hloubkové mechanismy tkáňové, regionální a místně specifické DNA methylace a demetylace DNA v našem experimentálním paradigmatu musí čekat na další zkoumání.
Spolu s naší předchozí zprávou, která ukazuje, že y-oryzanol oslabuje preference HFD pomocí hypotalamické regulace stresu ER u myší [14], y-oryzanol také představuje jedinečnou vlastnost zlepšující jak hedonickou, tak metabolickou dysregulaci chování při krmení. Protože je známo, že některá vyvinutá léčiva proti obezitě způsobují kritické nepříznivé účinky [8], očekává se, že přirozený přístup k mozkové odměně založené na potravinách bude bezpečně léčit syndrom obezity - diabetes [16]. V tomto paradigmatu je y-oryzanol slibným kandidátem proti obezitě s výraznou vlastností epigenetického modulátoru.
Poděkování
Děkujeme S. Okamoto (University of Ryukyus, Japonsko) za přezkoumání rukopisu. Děkujeme M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato a C. Noguchi (University of Ryukyus, Japonsko) za pomoc sekretariátu.
Zkratky
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoxycytidin |
| D1R | Dopaminový D1 receptor |
| D2R | Dopaminový D2 receptor |
| DAT | Dopaminový transportér |
| DNMT | DNA methyltransferáza |
| ER | Endoplazmatické retikulum |
| ERR | Estrogenový receptor |
| HFD | Strava s vysokým obsahem tuků |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocystein |
| SAM | S-Adenosyl methionin |
| STAT3α | Převodník signálu a aktivátor transkripce 3α |
| TH | Tyrosinhydroxyláza |
Poznámky
Dostupnost dat
Datové soubory generované a / nebo analyzované během aktuální studie jsou k dispozici od příslušného autora na základě přiměřených požadavků.
Financování
Tato práce byla částečně podporována Granty v rámci pomoci od Japonské společnosti pro podporu vědy (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 a 24591338), Radou pro vědu, technologii a inovace (CSTI), mezirezortní strategický program podpory inovací (SIP) „Technologie pro vytváření nové generace zemědělství, lesnictví a rybolovu“, Lotteova nadace, Japonská nadace pro aplikovanou enzymologii, Nová organizace pro rozvoj energetických a průmyslových technologií (NEDO), projekt pro vytvoření sítě vědy o životě (farmaceutická oblast) ) (Prefektura Okinawa, Japonsko) a propagační projekt lékařského klastru prefektury Okinawa, Japonsko, spolu s grantem prefektury Okinawa na propagaci pokročilého lékařství (prefektura Okinawa, Japonsko).
Dualita zájmu
Autoři prohlašují, že s tímto rukopisem není spojena žádná dualita zájmu.
Prohlášení o příspěvku
CK a HM navrhly výzkum. CK a TK provedly experimenty a analyzovaly data. K interpretaci dat přispěly TK, CS-O, CT, MT, MM a KA. CK a HM napsali rukopis. Všichni autoři přispěli k interpretaci dat. Všichni autoři se připojili k revizi rukopisu a schválili jeho konečnou verzi. HM je garantem této práce, měl plný přístup ke všem datům a přebírá plnou odpovědnost za integritu dat a správnost analýzy dat.
Poznámky pod čarou
Elektronický doplňkový materiál
Online verze tohoto článku (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) obsahuje recenzované, ale neupravené doplňkové materiály, které jsou k dispozici oprávněným uživatelům.
Reference
;
