Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Publikováno online 2011 Feb 9. dva: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstraktní
Již dříve jsme uvedli, že podávání inzulínu do obloukovitého jádra hypotalamu snižuje motivaci sacharózy u potkanů, což je hodnoceno samoobslužným úkolem. Protože vzor aktivace centrálního nervového systému (CNS) ve spojení se sacharózovým podáváním nebyl hodnocen, v této studii jsme měřili expresi c-Fos jako index neuronální aktivace. Cvičili jsme krysy na bar-press pro sacharózu, podle harmonogramu s pevným poměrem (FR) nebo progresivním poměrem (PR) a mapovanou expresi imunoreaktivity c-Fos v CNS, ve srovnání s expresí c-Fos v manipulovaných kontrolách. Pozorovali jsme jedinečnou expresi c-Fos ve středním hypotalamu (obloukovitá, paraventrikulární, retrochiasmatická, dorzomediální a ventromediální jádra) ve spojení s nástupem PR výkonu a expresí c-Fos v laterálním hypotalamu a jádru postele stria terminalis ve spojení s nástupem výkonu FR. Exprese c-Fos byla zvýšena v nucleus accumbens krys FR a PR. Naše studie zdůrazňuje význam obvodů homeostázy hypothalamické energie i limbických obvodů při plnění úkolů odměňování potravin. Vzhledem k úloze mediálního hypotalamu v regulaci energetické rovnováhy, naše studie naznačuje, že tento obvod může přispět k odměňování za regulaci v širším kontextu energetické homeostázy.
mezolimbické dopaminergní (DA) obvody, včetně ventrální tegmentální oblasti (VTA) a projekce na striatum a kortikální místa, byly identifikovány jako hrající kritickou roli v motivujících nebo odměňujících aspektech mnoha tříd zneužívání drog (13, 22-24, 26, 48). Nedávný výzkum z naší laboratoře a dalších naznačuje, že tento obvod také hraje hlavní roli v motivujících nebo odměňujících aspektech potravin. Funkční a anatomická interakce s obvody, které regulují energetickou homeostázu, je navržena ve zprávách o modulaci odměny za jídlo podle nutričního stavu zvířat (10, 14, 16, 43). Modulace odměny, včetně odměny za jídlo, podle nutričního nebo metabolického stavu, je silně ovlivněna nervovými a endokrinními signály, včetně inzulínu (15), leptin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), hormon koncentrující melanin (MCH) (45) a orexin (5, 7): v posledních letech byla hojně prokázána přítomnost receptorů, biochemická a buněčná účinnost a in vivo nebo behaviorální účinnost těchto signálů v centrálním nervovém systému (CNS).
Rovněž se ukázalo, že rozšířené limbické obvody hrají roli v krmení a odměně za jídlo (2, 19, 28). Existují však i další přispívající weby CNS. Pozoruhodné je, že laterální hypothalamus (LH) je již dlouho znám jako místo zprostředkovávající stravovací a sebep stimulační chování (4, 31). Orexinergní neurony a leptinová signalizace v LH byly identifikovány jako důležité pro výživu a odměnu za jídlo (5, 29, 30). Nedávno jsme pozorovali, že inzulín podávaný buď do třetí mozkové komory nebo do obloukovitého jádra hypotalamu (ARC) může snížit vlastní podání sacharózy, ale podávání inzulínu do VTA nebo nucleus accumbens nemělo žádný vliv na tento specifický model odměny (15). Zdá se tedy, že více hypothalamických míst může hrát významnou roli při motivovaném hledání a získávání potravy, a v souladu s tím by se dalo předpokládat, že hypothalamické oblasti jsou podstatně aktivovány ve spojení se samotným podáváním potravy. Abychom mohli tuto hypotézu začít testovat, mapovali jsme expresi c-Fos v CNS potkanů vyškolených v paradigmatu se sacharózovým samodělením, po tréninku s pevným poměrem (FR) nebo po tréninku s progresivním poměrem (PR), přísnějším úkolem pro hodnocení motivace (20).
MATERIÁLY A METODY
Předměty.
Subjekty byly samci potkanů Albino (325–425 g) ze Simonsenu (Gilroy, CA). Krysy byly udržovány na chow ad libitum. Byly udržovány v cyklu 12:12 h světlo-tma se zapnutými světly v 6 hodin ráno a byly trénovány a testovány mezi 7:XNUMX a polednem, v postprandiálním a postabsorpčním stavu. Všechny postupy prováděné na krysách se řídily pokyny National Institutes of Health pro péči o zvířata a byly schváleny subkomisí pro péči o zvířata a její použití ve výboru pro výzkum a vývoj v systému zdravotní péče VA Puget Sound.
Sacharózová samospráva.
Postupy byly založeny na naší publikované metodice (15) a byly provedeny na krmených krysách. Experiment zahrnoval tři fáze: automatické vykreslování pro zahájení tréninku, trénink FR a trénink progresivních poměrů (PR) pomocí algoritmu PR Richardsona a Roberts (38). Algoritmus PR vyžaduje 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX atd.) pákové lisy pro následné dodávky odměn v rámci relace (38). Krysy byly vyškoleny, aby si samy podávaly 5% sacharózu (odměna 0.5 ml) dodávané do nádoby na kapky kapaliny. Obslužné boxy, ovládané systémem Med Associates (Georgia, VT), měly dvě páky, ale pouze jedna páka (aktivní, zatahovací páka) aktivovala infuzní pumpu. Rovněž byly zaznamenány lisy na druhé páce (neaktivní, stojící páka). Jak jsme již dříve poznamenali, počet lisů na neaktivní páce byl velmi nízký (méně než lisy 10 / relace). Roztok sacharózy byl dodáván do kapkové kapkové nádoby pro orální spotřebu (Med Associates, St. Albans, VT). Počáteční výcvik byl veden během 1-h relací v rámci průběžného posilovacího plánu (FR1: každý pákový lis byl posílen). Každé sezení začalo vložením aktivní páky a rozsvícením světla bílého domu, které zůstalo po celou dobu sezení zapnuto. Každou odměnu doprovázely diskrétní složené narážky 5 s (2900 Hz, 20 dB nad pozadím) a světlo (7.5 W bílé světlo nad aktivní pákou), přičemž časový limit 20 začínal dodáním sacharózy. Školení FR bylo prováděno po dobu 10 dní; stabilní reakce je dosaženo pátým sezením. PR školení bylo prováděno po maximální možný 3 h / den po dobu 10 dnů. PR relace skončily poté, co 30 min. Neodpovědělo žádné aktivní stisknutí páky, v tom okamžiku se automaticky zhaslo domovní světlo a aktivní páka se zatáhla; krysy byly vyjmuty z komor a vráceny do svých domácích klecí. „Stop time“ nahlášeno v Tabulka 2 představuje čas, kdy byl systém vypnut; proto by poslední aktivní stisk páky nastal 30 min před časem zastavení. Údaje o chování (Tabulka 2) představují průměry relace 6-10 pro výcvik FR a relace 1-9 pro školení PR. Krysy ošetřené pomocí kontroly byly odebrány z ustájovací místnosti a umístěny do čisté pracovní komory se zapnutým světlem 60 min, uvnitř procedurální místnosti, aby se simulovaly zkušenosti s manipulací a pokojem u potkanů, kteří si sami podávali sacharózu. Když byli v krabicích s obsluhou, nedostali nic k jídlu ani pití a neměli přístup k pákám.
Poslední den byly krysy umístěny do komor podle tréninkových dnů a byly drženy v komorách po dobu 90 minut, poté byly odstraněny pro anestézii, perfuzi a následnou imunohistochemii. Kontrolní krysy byly rovněž přivedeny do místnosti pro procedury a udržovány v čisté operační komoře po dobu tréninkových dnů po dobu 90 minut, poté byly anestetizovány a promývány. Bezprostředně po této poslední 90minutové relaci byly krysy hluboce anestetizovány inhalací isofluranu a promyty 0.9% NaCI a následně studeným 4% roztokem paraformaldehydu. Načasování anestetika a eutanazie bylo založeno na známém časovém průběhu vrcholové exprese proteinu c-Fos 90–120 minut po události. Exprese c-Fos by tedy odrážela aktivaci CNS na začátku behaviorálního úkolu, spíše než by byla výsledkem toho, že zvířata úkol prožila a požila sacharózu. Mozky byly odstraněny a několik dní fixovány v paraformaldehydu; poté byly následně umístěny do 20% sacharózy-PBS, poté byly umístěny do 30% roztoku sacharózy-PBS. Mozky byly řezány na kryostatu (Leica CM 3050S kryostat) pro imunohistochemii.
Imunohistochemie a kvantifikace c-Fos.
Pomocí naší zavedené metodiky jsme kvantifikovali imunoreaktivní protein c-Fos v mozkových řezech (12). Počáteční kvalitativní obrazovka celého mozku byla provedena pro expresi c-Fos. Klouzavé 12-μm celé mozkové koronální řezy byly promyty 3krát v PBS (Oxoid, Hampshire, Velká Británie). Řezy byly poté blokovány na 1 h při pokojové teplotě v PBS obsahujícím 5% normální kozí nebo oslí sérum. Řezy byly poté promyty několikrát v PBS a inkubovány přes noc při 4 ° C v roztocích primárních protilátek připravených v PBS. Řezy byly promyty třikrát v PBS a pak inkubovány ve tmě při teplotě místnosti v roztoku sekundární protilátky připraveném v PBS po dobu 1 h. Řezy byly následně promyty znovu v PBS a namontovány a přikryty krycím materiálem v upevňovacím médiu pevného setu Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Digitální snímky řezů byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu Nikon Eclipse E-800 připojeného k fotoaparátu Optiphot a pomocí softwaru Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Následně jsme se zaměřili na omezený počet oblastí vykazujících zjevný rozdíl mezi podmínkami, pro kvantifikaci a pro neuronální fenotypování. Konkrétně jsme se zaměřili na jádro accumbens jádro a skořápku (NAc); jádro předního a zadního lůžka stria terminalis (aBNST, pBNST); mediální hypothalamické oblasti [ventromediální jádro (VMH), dorsomediální hypotalamus (DMH), paraventrikulární jádro (PVN), retrochiasmatická oblast (RCh) a ARC]; laterální hypotalamus (LH), včetně hřbetních a ventrálních oblastí a perifornické oblasti (peF); VTA; mozkové kmenové [spodní olivové, hypoglossální (nXII) jádro solitárního traktu, laterální retikulární jádro a C1 / A1 adrenalin / noradrenalinová jádra]. Řezy 12-μm odpovídající atlasu byly vyhodnoceny z hlediska exprese a kvantifikace c-Fos v odpovídajících řezech a regionech na základě atlasu Paxinos a Watson (34). Prosím podívej se Tabulka 1 pro specifické stereotaxické souřadnice. Primárním zaměřením testů bylo porovnání každého behaviorálního úkolu s jeho příslušnou kontrolou (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Pro optimalizaci možných rozdílů na základě chování versus kontrolních podmínek byli pro analýzu vybráni špičkoví umělci ze skupin PR a FR. Byly tedy analyzovány krysy 4 / 12 PR a 3 / 12 FR: Tyto krysy měly aktivní číslo pákového lisu (primární koncový bod chování), které bylo větší než jedna standardní odchylka nad průměrem pro jejich příslušnou skupinu chování. Byla také analyzována podskupina kontrolních krys (krysy 5 PRC a 3 FRC, přítomné ve vyšetřovací místnosti ve stejnou dobu jako krysy FR nebo PR). Další skupina tří krys byla odebrána postupem FR („FRext“), aby napodobila přidané trvání postupu PR (tj. Celkem 20 dní, protože PR krysy se odebírají prostřednictvím FR a poté PR), aby se vyhodnotilo, zda rozdíly mezi FR a PR byly způsobeny behaviorálním úkolem nebo délkou postupu. Mozky FRext nebyly analyzovány a systematicky testovány, ale specifické oblasti zájmu byly analyzovány s ostatními čtyřmi skupinami, aby bylo možné provést srovnávací kvantifikaci, jak je uvedeno konkrétně ve výsledcích.
Pro kvantifikaci (při 40 × zvětšení) byly vybrány oblasti odpovídající atlasu. K zachycení obrazu požadované oblasti byl použit software ImagePro Plus (Media Cybernetics). Oblast byla vymezena pro počítání a byl stanoven práh pro pozitivní počet buněk. Stejná oblast a pozadí (práh) byly použity pro řezy z příslušných experimentálních skupin a softwarové počítání pozitivních buněk (kvantifikace) bylo provedeno ve stejné relaci pro všechny experimentální skupiny, aby se zabránilo změnám v nastavení pozadí mezi relacemi. Pro statistickou analýzu byly počty odebrány jednotlivým potkanům, pouze pokud odpovídající nebo úplné řezy přes každou oblast (jak je definováno v Tabulka 1) byly k dispozici; data pro konkrétní oblast nebyla získána od krysy, pokud pro tuto oblast bylo neúplné dvoustranné zastoupení.
Kvalitativní dvojitě značená imunofluorescenční analýza.
Mozkové řezy byly odebrány potkanům, u kterých byl kvantifikován c-Fos, pro dvojitě značenou imunohistochemii. Protože jsme nechtěli narušit chování zvířat, nebyla předem ošetřena kolchicinem, aby se optimalizovala vizualizace peptidových neurotransmiterů. Proto byla vizualizace neuronových fenotypů aktivovaných ve spojení s úkolem samopodávání omezena. Avšak pro zahájení hodnocení fenotypů aktivovaných neuronů v řadě míst CNS byly pořízeny digitální obrazy (získané, jak je popsáno v části výše) při zvětšení 20 ×, 40 × nebo 60 × (jak je znázorněno na obrázkových legendách) . Postup dvojitého barvení glutamát dekarboxylázy (GAD), tyrosin hydroxylázy (TH), CRF, neuropeptidu Y (NPY), peptidu souvisejícího s Agouti (AgRP) a tryptofan hydroxylázy byl srovnatelný s testem imunoreaktivity c-Fos vlastní, kromě toho, že směs c-Fos-Ab a jedné z dalších primárních protilátek byla použita pro inkubaci přes noc při 4 ° C; podobně byly obě sekundární protilátky ve stejném roztoku a inkubovány po dobu 1 hodiny ve tmě při teplotě místnosti. Pro zkoušku orexinem bylo použito 20minutové promytí 50% ethanolem před krokem blokování. Byly provedeny počáteční optimalizační testy ke stanovení vhodného ředění primárních protilátek. Použité primární protilátky byly králičí anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) a myší anti-c-Fos (1: 800) (obě od Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); myší anti-GAD (1: 1,000 1), myší anti-tyrosin hydroxyláza (500: 1) a ovčí anti-tryptofan hydroxyláza (vše od Chemicon, Temecula, CA); králičí anti-CRF (500: 1) (dárek od Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); králičí anti-NPY (1,000: 1 1,000), králičí anti-AGRP (1: 5,000 3) a kozí anti-orexin A (488: 1 500), vše od společnosti Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Jako sekundární protilátky byly použity kozí anti-králičí nebo anti-myší konjugovaní Cy1 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), kozí anti-myší nebo anti-králičí nebo oslí anti-ovčí IgG (Molecular Probes, Eugene, OR), Alexa Fluor 2,500. ; všechny sekundární protilátky byly naředěny v poměru 488: 1. duální imunoznačení c-Fos / MCH bylo testováno sériově; nejprve pro MCH (primární protilátka 500: 5 1, Millipore) se sekundární protilátkou proti králičí Alexě-500 (3: 20). Sklíčka byla znovu blokována 50% normálním kozím sérem a barvena na anti-c-Fos (XNUMX: XNUMX) a cyXNUMX-kozí anti-králík jako sekundární protilátka. Pro MCH test bylo použito XNUMXminutové promytí XNUMX% ethanolem před krokem blokování.
Statistické analýzy.
Skupinová data jsou v textu, tabulkách a obrázcích prezentována jako průměr ± SE. Význam je definován jako P ≤ 0.05. Statistické srovnání se provádí mezi experimentálními skupinami (FR vs. PR) nebo mezi experimentálními skupinami a odpovídajícími kontrolami (PR vs. PRC; FR vs. FRC) pomocí nepárového Studentova t-test. Pearsonovy korelační koeficienty mezi aktivními pákovými lisy a expresí c-Fos v různých oblastech mozku, stejně jako korelace exprese c-Fos mezi různými oblastmi mozku za stejných experimentálních podmínek, byly vypočteny pomocí programu statistické analýzy StatPlus: mac LE pro verzi Mac OS 2009 od společnosti AnalystSoft. Testovali jsme lineární korelace (Pearsonova R statistika) mezi expresí c-Fos v různých oblastech CNS. Rovněž jsme zkoumali korelace mezi expresí c-Fos v různých aktivovaných oblastech CNS a chováním. Pro tyto korelace byly použity údaje FR a PR od potkanů, u kterých byla provedena kvantifikace c-Fos.
VÝSLEDKY
Kvantifikace c-Fos.
Jak jsme již dříve poznamenali, počet aktivních pákových lisů byl výrazně vyšší u PR oproti FR výkonu (Tabulka 2) a počet sacharózových odměn byl vyšší během výkonu FR. Délka relace pro PR krysy byla asi 90 min (doba zastavení - 30). Tabulka 3 uvádí seznam imunoreaktivních buněk c-Fos ve všech oblastech CNS, kde byla provedena kvantifikace. Vzorec exprese c-Fos pro FR a PR krysy je shrnut v Obr. 1. Došlo k významné aktivaci mediálního hypotalamu (MHmrně, složený z ARC, PVN, RCh, DMH a VMH) krys zapojených do lisování páky PR na sacharózu, ale žádná celková aktivace u krys zapojených do lisování páky FR na sacharózu, ve srovnání s příslušnými kontrolami. V mediální hypotalamu PR potkanů došlo k této aktivaci u PVN, ARC a VMH (Obr. 2). Lisování páky FR, ale nikoli lisování páky PR, bylo spojeno s významnou aktivací v LH (založeno převážně na aktivaci v perifornické oblasti). Jak aktivní pákové lisy, tak exprese hypothalamického c-Fos byly srovnatelné mezi skupinami FRext a FR (MHmrně, 946 ± 26 a 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 a 186 ± 10; LHmrně, 468 ± 79 a 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 a 173 ± 15, v tomto pořadí, což naznačuje, že rozdíl ve vzorci exprese mezi skupinami FR a PR není spojen s délkou výcviku / zkušenosti, ale s povahou pomocného úkolu. V případě skupiny FR došlo k významnému zvýšení exprese c-Fos v BNST, a to jak u aBNST, tak u pBNST. Jak stlačení páky FR, tak PR byly spojeny se zvýšenými c-Fos-imunopozitivními neurony v plášti NAc; Počty c-Fos byly významně zvýšeny v jádru NAc od krys zapojených do lisování páky FR, s nevýznamným trendem směrem ke zvýšené expresi c-Fos u krys zapojených do lisování páky PR. c-Fos nebyl zvýšen ve VTA s úkolem PR, ačkoli u úkolu FR byl pozorován nevýznamný trend ke zvýšení. Nakonec byl c-Fos signifikantně zvýšen v jádru hypoglossálu (lebeční nerv XII) v mozkovém kmeni potkanů trénovaných na PR, ale nikoli na FR.
Exprese c-Fos byla pozorována v dalších oblastech CNS, včetně amygdaly a mozkové kůry (Obr. 3). Exprese však byla pozorována jak v kontrolních podmínkách, tak ve spojení s úkoly PR a FR, což naznačuje, že nespecifické aspekty postupu (manipulace, přesun do místnosti procedury) mohly mít za následek tuto aktivaci. Kvantifikace v těchto regionech nebyla provedena. Podobně byla pozorována aktivace v oblastech mozkových kmenů jiných než nXII, ale objevila se ve spojení s podmínkami souvisejícími s kontrolou a úkoly, což také naznačuje roli v nespecifické aktivaci vzrušení nebo chování.
Testovali jsme korelace mezi expresí c-Fos v různých oblastech CNS. Kombinací dat ze skupin s lisováním pomocí páky jsme našli negativní korelaci mezi expresí c-Fos v LH a VMH; aktivace VMH byla tedy spojena se sníženou celkovou aktivací LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Také jsme pozorovali významnou pozitivní korelaci mezi expresí c-Fos v perifornské oblasti LH a VTA (Pearsonova R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), v souladu se známou monosynaptickou konektivitou mezi těmito dvěma regiony (viz diskuse v cit. 2 a 13). Zjistili jsme významnou negativní korelaci mezi expresí c-Fos ve VTA vs. NAc-shell, ať už testovány samostatně pro výkon FR (Pearsonova R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) nebo pro PR výkon (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), v souladu se známými vzájemnými vstupy mezi striatálními regiony do substantia nigra a VTA (2, 13). Také jsme testovali korelace mezi expresí c-Fos v různých oblastech CNS a chováním. Při kombinaci dat ze skupin s lisováním pomocí páky jsme pozorovali významnou pozitivní korelaci mezi c-Fos v ARC a aktivními lisy s pákou (Pearsonova R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identifikace neuronů aktivovaných příjemem sacharózy a motivace pro sacharózu.
V mozkovém kmeni nevykazovaly c-Fos-pozitivní neurony pozitivní imunostainování na TH, enzym omezující rychlost epinefrinu a norepinefrinu (a dopaminu); proto se nezdálo, že by tyto katecholaminergní neurony byly aktivovány úkoly FR nebo PR. Některé c-Fos-pozitivní neurony však vykazovaly pozitivní imunostainování na tryptofanhydroxylázu, což naznačuje, že byla aktivována populace serotoninových neuronů. Jak je uvedeno v Obr. 4V ARC byla c-Fos-pozitivní buněčná těla obklopena vlákny obarvenými AGRP a byl pozorován podobný vzorec pro imunofarbení NPY vlákna / c-Fos (není ukázáno). V PVN se zdálo, že c-Fos-pozitivní neurony obklopují CRF-pozitivní neurony, ale nebyla pozorována žádná kolokalizace (data neuvedena). Obr. 5 ukazuje imunofarbení jak orexinu, tak MCH v LH. Orexinové neurony byly nalezeny jak v dLH, tak v peLH. Ačkoli jsme v peLH pozorovali MCH-pozitivní neurony, v této oblasti LH nedošlo v zásadě k žádné kolokalizaci s c-Fos. Pozorovali jsme však kolokalizaci c-Fos v neuronech pozitivních na orexin v rámci peLH (Obr. 6, AutoCruitment LLC („Společnost“ nebo „My“ nebo „AutoCruitment“) respektuje ochranu vašeho soukromí a je odhodlaná ho dodržováním těchto zásad chránit. Tyto zásady popisují typy informací, které můžeme shromažďovat od vás nebo které vy můžete poskytnout, když navštívíte webové stránky) a velmi omezená kolokalizace c-Fos s MCH v vLH (Obr. 6, spodní). Je třeba znovu zdůraznit, že jak lokalizace, tak kolokalizace s c-Fos, mohou být podhodnoceny pro peptidové neurotransmitery, jako je CRH, protože krysy nebyly předem ošetřeny kolchicinem. Nakonec uvnitř jádra accumbens jádro a skořápka (Obr. 7), byl pozorován c-Fos koimunostní barvení s GAD, syntetickým enzymem pro neurotransmiter GABA, jak pro FR, tak pro PR krysy. V rámci VTA došlo k robustnímu zabarvení; nicméně c-Fos-pozitivní neurony byly zřídka pozorovány a nezdálo se, že by výlučně kolokalizovaly s TH.
DISKUSE
V této studii jsme použili expresi okamžitého raného genu, c-Fos, k vyhodnocení vzorce akutní aktivace CNS spojené s nástupem samovolné aktivity vyvolávající páku se sacharózou, buď jako relativně nenáročný úkol (FR) nebo progresivně náročnější úkol odrážející motivované hledání odměny, jako je sacharóza, a silně zapojit limbické obvody (22, 24, 49) (PR). Hypotalamické vzorce aktivace se mezi těmito dvěma úkoly lišily, přičemž v úkolu FR převládala LH / limbická aktivace a v úkolu PR převládala mediální hypothalamická / limbická aktivace (viz viz. Obr. 1). Existuje několik možných důvodů. Zaprvé, tato paradigmata by se mohla „mapovat“ jako kvalitativně odlišné zkušenosti s CNS. Potkani trénovaní na výkon FR by očekávali snadnou aktivitu s vysokou odměnou. Očekávání prospěšné potravy by mělo silně ovlivnit vzorec c-Fos pozorovaný u FR krys. Zjevný kvalitativní rozdíl v aktivačním vzorci naznačuje, že druhá možnost - že PR zvířata prostě mají více zkušeností s úkolem - je méně pravděpodobná, a to bylo podpořeno naším měřením c-Fos v hypotalamu u potkanů, kteří obdrželi 20 FR relace. , který vykazoval aktivitu podobnou skupině FR, nikoli skupině PR. Obě tyto možnosti by mohly být testovány systematickým zvyšováním obtížnosti tréninku FR a hodnocením změn v aktivaci CNS, v takovém případě by se dala předvídat kvalitativní změna v aktivačním vzorci. Přestože počet tréninkových zkušeností nemusí odpovídat za model aktivace CNS, průměrný počet odměn sacharózy v relaci by se mohl: Úkol PR by se mohl jednoduše naučit jako „méně prospěšný“ zážitek, a to by mohlo být funkčně spojeno s nedostatek aktivace LH. Vzorec aktivace CNS na začátku relace by tedy mohl odrážet interoceptivní stav, jako je například paradigma podmíněného místa: síla aktivace v limbických obvodech je spojena s učením a motivací. Pozorovali jsme variabilitu exprese c-Fos ve středním hypotalamu zvířat FRC. Zejména v rámci PVN by tato variabilita mohla maskovat aktivaci u FR krys, u kterých byl pozorován trend směrem ke zvýšeným c-Fos vs. FRC krys (Tabulka 3). Celková mediální aktivace hypotalamu se však nelišila mezi zvířaty FR a FRC.
Je třeba poznamenat, že ačkoli naším cílem bylo identifikovat weby CNS, které přispívají k nástupu chování, dočasné rozlišení je poněkud v úvahu. Jak je diskutováno níže, nyní se oceňuje, že různé subkomponenty instrumentálního nebo operativního chování jsou zprostředkovány aktivací různých populací neuronů (13, 23, 33, 49). Nemůžeme úplně vyloučit, že aktivace v důsledku velmi okamžitého stisknutí baru nebo lízání odměn mohla do jisté míry přispět k aktivačním modelům, které jsme pozorovali. Naše zjištění poskytují základ pro další zkoumání rolí konkrétních míst CNS v různých aspektech nebo složkách úkolu samosprávy a pro takové studie měření dalších bezprostředních časných genů s různými časovými průběhy „on“ a „off“ (36) bude velmi užitečná.
Korelace, které jsme našli v expresi c-Fos mezi různými oblastmi mozku, podporují známou funkční konektivitu hypothalamických a primárních limbických oblastí pro tento konkrétní úkol odměny, jako například mezi LH a VMH, a mezi perifornickou oblastí LH a VTA (viz diskuse v Ref. 2 a 13). Rovněž jsme zkoumali korelace mezi expresí c-Fos v různých aktivovaných oblastech a chováním. Korelace mezi c-Fos v ARC a aktivními pákovými lisy odpovídá dobře definované roli aktivity ARC v příjmu potravy (1); s naším předchozím pozorováním, že injekce inzulínu specificky do ARC snížila vlastní podání sacharózy (15); s předchozími zprávami o kritické úloze ARC a jeho endorfinergních neuronů, při získávání a provádění samopodávání kokainu (40-42); as identifikovanými projekcemi z ARC na NAc (17). ARC tedy hraje klíčovou roli v motivovaném chování při hledání a získávání mnoha druhů odměňujících podnětů, včetně, ale bez omezení na, jídlo. Nakonec jsme pozorovali významnou aktivaci PVN a VMH s počátkem hledání PR sacharózy. To je v souladu s dobře charakterizovanými úlohami těchto středních hypothalamických jader v regulaci příjmu potravy, přímé synaptické konektivity s ARC a identifikovaných spojení s limbickými obvody (1, 27, 37).
Zjistili jsme významnou negativní korelaci mezi expresí c-Fos ve VTA vs. NAc-shell, ať už byly testovány na FR nebo PR výkon. Bylo poněkud překvapivé, že silnější aktivace VTA nebyla pozorována ve spojení s PR nebo FR sacharózovým samopodáním (vs. příslušné kontroly). Možná toto zjištění odráží načasování našeho měření se zaměřením na potenciální místa CNS aktivní na začátku úkolu, na který byla tato zvířata dobře vyškolena. To by bylo v souladu s pozorováním a tezí Schultze (44), že dopaminová neuronální aktivace slouží jako marker neočekávaných podnětů nebo odměn a tato aktivace klesá v souvislosti s tréninkem. Ukázalo se však, že uvolňování striatálního dopaminu během přijímání sacharózy u trénovaných zvířat je velmi přesná a časově diskrétní událost (39). Je tedy možné, že trendy, které jsme pozorovali, by byly silně významné u větší studijní skupiny (tj. Větší statistická síla). Pozorovali jsme aktivaci NAc ve spojení s nástupem FR a PR sacharózy. Jak aktivace, tak inhibice neuronů NAc byly hlášeny ve spojení s výkonem instrumentální odměny a způsob aktivace / aktivity závisí na tréninku a prostředí a je spojen s různými složkami chování (např. Orientace, přístup, příjem) (6, 33, 50). Jak bylo uvedeno výše, měření c-Fos by nezachytilo takovou specifickou aktivitu. Carlezon navrhl, že „odměna“ je spojena především se snížením aktivity neuronů NAc, tj. Neuronů střední ostnatosti (3). To není v souladu s našimi pozorováními - podstatně zvýšená NAc c-Fos ve srovnání s manipulačními kontrolami a c-Fos-pozitivní neurony kolokalizované s GAD, konzistentní s aktivací středně ostnatých neuronů (GABAergic) - ale my jsme specificky neposoudili „inhibici NAc neuronů“ “. K aktivaci a inhibici NAc může dojít jak během instrumentálních úkolů, tak s anatomickou i časovou specificitou. Z pohledu této studie lze usoudit, že NAc je zapojen do počátku instrumentálního přijímání sacharózy, přičemž jádro NAc přispívá k motorické aktivaci a shell NAc přispívá jak k motorickým, tak motivačním aspektům úkolu.
Pozorovali jsme také aktivaci obou hlavních oblastí BNST (přední a zadní) u FR potkanů. BNST je část limbických obvodů, která moduluje neuroendokrinní odpovědi na opakované stimulační zážitky (8, 9) a ve větším smyslu je spojena s učením o opakujících se podnětech. Ačkoli jeho role byla objasněna nejobsáhlejší ve vztahu k opakovaným stresovým zážitkům, naše zjištění naznačuje širší roli pro BNST: BNST může modulovat odpovědi CNS na opakující se pozitivní, stejně jako negativní nebo stresující podněty. Protože jsme pozorovali tuto aktivaci na začátku výkonu FR, ale nikoli PR, může být nábor BNST spojen se zvýšenými odměnami sacharózy za trénink FR. Naše pozorování žádné přímé aktivace neuronů CRF naznačuje, že instrumentální odpověď na sacharózu není hlavním stresorem; exprese c-Fos v jiných neuronech PVN je však v souladu s modulací obvodů napětí (46). Ulrich-Lai a jeho kolegové ve skutečnosti uvedli, že při použití jiného způsobu stravování / krmení moduluje příjem sacharózy PVN funkci (47). Nakonec jsme pozorovali aktivaci jádra hypoglossálního nervu ve spojení s PR, ale nikoli s FR výkonem. Význam toho lze jen spekulovat; jednou z možností je, že chuťová relevance sacharózy může být zvýšena u potkanů, kteří požívají méně sacharózy.
Hledání sacharózy a přijímání sacharózy by mělo být považováno za multimodální zážitek, dynamický v čase, protože požití by mělo za následek periferní signály související s kalorickým obsahem sacharózy, jakož i návyky a alliestézii v rámci relace (25). Zatímco se náš výzkum zaměřil na vliv periferních endokrinních signálů, tj. Inzulínu a leptinu, na modulaci odměny za jídlo, jejich účinky mohou být naopak přímo zprostředkovány centrálně prostřednictvím vysílačů a neuropeptidů, které hrají roli v krátkodobém nebo dlouhodobém horizontu krmení nebo odměna za jídlo (viz diskuse v č. 14). Současná studie poskytuje vhled do toho; pozorovali jsme nějakou aktivaci neuronů, které exprimují buď MCH nebo orexin, dva neuropeptidy, které jsou orexigenní. Tato zjištění mohou ve skutečnosti podceňovat roli MCH nebo orexinu v potravinové odměně, protože imunocytochemie u krys bez kolchicinu nepochybně omezila vizualizaci obou těchto neuropeptidů. Identifikace aktivovaných orexinových neuronů v LH je celkově konzistentní s četnými studiemi implikujícími orexinové neurony v krmení, odměně za jídlo a obecnější stimulační odměně (např. 5, 7, 29). Pozorovali jsme aktivaci peFLH orexinových neuronů. Aston-Jones a jeho kolegové (5) rozebrali role různých populací LH orexinových neuronů v odměňování a zapojili peFLH orexinové neurony do vzrušení, na rozdíl od odměny per se. Naše zjištění tedy naznačuje roli LH orexinu ve vzrušení a snad orientaci na aktivní páku nebo narážky na přijímání sacharózy.
Do budoucna stojí za jedinečnost nebo zobecnitelnost sacharózy jako odměňujícího podnětu. Zbývá určit, zda vzorec včasné aktivace CNS, který zde uvádíme, je specifický pro jídlo jako stimul, nebo zobecňuje na jiné odměňující podněty. Jak bylo uvedeno výše, zejména u úkolu FR, lze očekávat, že požití řady odměn sacharózy bude mít metabolické důsledky, s modulací uvolňování hormonů (například cholecystokinin, ghrelin, inzulín) a změnami periferní a CNS nervové aktivace. Neočekává se, že by tyto změny hrály přímou roli v časných vzorcích aktivace CNS, které jsme měřili, ale mohou hrát roli při učení o sacharózové odměně během tréninku. Neuropeptidy, jako je orexin, mohou být opět kriticky zapojeny.
Naše studie představuje, podle našich znalostí, první demonstraci aktivace specifických středních hypothalamických jader na začátku samo-podávání sacharózy, včetně PVN, zapojených do homeostázy a stresové reakce, a ARC, která je kritická pro energetickou homeostázu, snímání živin a regulace příjmu potravy. Důležité je, že jsme pozorovali aktivaci mediálního hypotalamu a NAc ve spojení s počátkem PR, což naznačuje, že jak homeostatická, tak i některá limbická místa hrají roli při zahajování podávání sacharózy. Další limbické obvody mohou být získány později v časovém bodě úlohy.
Perspektivy a význam
Zatímco, historicky, studie motivačního a odměnového chování by nejsilněji zapříčinily limbické obvody CNS, získalo se velké množství důkazů, které zdůrazňují kritickou funkční interakci mezi limbickými a energetickými homeostázovými obvody. Současná studie nyní naznačuje pravděpodobný význam specifických mediálních jader hypotalamu v motivované práci na sacharóze. Extrapolací z této studie mohou budoucí studie zhodnotit, zda je nezbytná role mediálního hypotalamu a zda je jeho aktivace zapojena do motivovaného hledání jiných odměn, jako jsou drogy zneužívání. Zjištění této studie navíc zdůvodňují studium změn motivovaného chování za okolností souběžně se změnou mediální fyziologie hypotalamu, jako je obezita.
GRANTY
Tento výzkum byl podporován Národními ústavy zdravotnictví Grant DK40963. Dr. Dianne Figlewicz Lattemann je vedoucí vědecká pracovnice ve vědeckém výzkumu, Biomedicínský laboratorní výzkumný program, Ministerstvo veterinárních záležitostí Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Dr. Sipols je podporován lotyšskou vědeckou radou Grantem 04.1116.
Poděkování
Děkujeme Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius a JE Blevins za radu a užitečné diskuse.
REFERENCE
;