Resumen
La alteración inducida por el psicoestimulante de las espinas dendríticas en las neuronas dopaminoceptivas en el núcleo accumbens (NAcc) se ha planteado como una respuesta neuronal adaptativa que está vinculada a conductas adictivas de larga duración. NAcc se compone en gran parte de dos subpoblaciones distintas de neuronas espinosas de tamaño mediano que expresan altos niveles de receptores de dopamina D1 o D2. En el presente estudio, analizamos la densidad de la columna dendrítica después del tratamiento crónico con cocaína en distintas neuronas espinosas de tamaño mediano que contienen receptores D1 o D2 en NAcc. Estos estudios hicieron uso de ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor del receptor D1 o D2 (Drd1-EGFP o Drd2-EGFP). Después de 28 días de tratamiento con cocaína y 2 días de abstinencia, la densidad de la columna vertebral aumentó tanto en las neuronas Drd1-EGFP como en las Drd2-EGFP. Sin embargo, el aumento en la densidad de la columna vertebral se mantuvo solo en las neuronas positivas para Drd1-EGFP 30 días después de la retirada del fármaco. Cabe destacar que también se observó una mayor expresión de ΔFosB en las neuronas positivas para Drd1-EGFP- y Drd2-EGFP después de 2 días de retiro del fármaco, pero solo en las neuronas Drd1-EGFP positiva después de 30 días de retiro del fármaco. Estos resultados sugieren que el aumento de la densidad de la columna vertebral observado después del tratamiento crónico con cocaína es estable solo en las neuronas que contienen el receptor D1 y que la expresión de ΔFosB está asociada con la formación y / o el mantenimiento de las espinas dendríticas en D1, así como con las neuronas que contienen el receptor D2 en NAcc.
La vía dopaminérgica mesolímbica está compuesta por neuronas en el área tegmental ventral que inervan el núcleo accumbens (NAcc), el tubérculo olfatorio, la corteza prefrontal y la amígdala (1), mientras que las neuronas dopaminérgicas nigrostriatales en la sustancia negra (pars compacta) proporcionan una proyección ascendente al estriado dorsal (2). Los psicoestimulantes elevan las concentraciones sinápticas de dopamina en NAcc: cocaína, bloqueando la captación de dopamina de la hendidura sináptica, y la anfetamina, promoviendo la liberación de dopamina de las terminales nerviosas (3–5). La administración repetida e intermitente de psicoestimulantes da como resultado respuestas de comportamiento aumentadas (sensibilización) a los efectos estimulantes agudos de estos fármacos (6–8). La mayoría de las líneas de evidencia sugieren que los cambios adaptativos en el área dopaminérgica del área tegmental ventral-NAcc son fundamentales para las alteraciones en la plasticidad dependiente de la experiencia que subyace en el comportamiento inducido por el fármaco.
Además de la dopamina, se requiere glutamato para el desarrollo de la sensibilización del comportamiento en respuesta a los psicoestimulantes (9, 10). Las neuronas espinosas de tamaño mediano (MSN) en el estriado ventral reciben proyecciones glutamatérgicas excitadoras de la corteza prefrontal que hacen sinapsis en las cabezas de las espinas dendríticas. Los MSN también son el principal objetivo de los axones dopaminérgicos que hacen sinapsis en los cuellos de la columna vertebral (1, 11, 12). Por lo tanto, las espinas dendríticas en las MSN representan el compartimento celular donde se integran inicialmente la transmisión dopaminérgica y glutamatérgica.
La dopamina actúa sobre dos subfamilias de receptores principales, la subfamilia D1 (subtipos D1 y D5) y la subfamilia D2 (subtipos D2, D3 y D4) (13). En el cuerpo estriado dorsal, los estudios anatómicos han demostrado que los MSN estriatonigral contienen altos niveles de receptores D1 (junto con la sustancia P y la dinorfina), mientras que los MSN estriatopalidales expresan predominantemente receptores D2 (junto con encefalina) (14–17). Las proyecciones de NAcc son más complejas que en el cuerpo estriado dorsal, con la cáscara y las partes centrales de la NAcc proyectadas a distintas subregiones del pálido ventral y al área ventral tegmental y la sustancia negra (18). Mientras que los receptores D2 y la encefalina están altamente expresados en proyecciones al pálido ventral, los receptores D1 y la sustancia P se encuentran distribuidos equitativamente en las proyecciones al pálido ventral y al área ventral tegmental (19). Los estudios de agonistas y antagonistas selectivos para los receptores D1 o D2 mostraron que tanto los receptores D1 como los receptores D2 son necesarios para los cambios de comportamiento dependientes de los psicoestimulantes (20–25). Sin embargo, los roles de estos receptores parecen ser diferentes. Por ejemplo, la estimulación de los receptores D1 atenúa la búsqueda de cocaína inducida por inyecciones de cebado de cocaína y señales ambientales relacionadas con la cocaína, mientras que la estimulación de los receptores D2 facilita el restablecimiento inducido por la cocaína (26–28).
Las anomalías de comportamiento asociadas con la adicción a los psicoestimulantes son extremadamente longevas. Por lo tanto, ha habido un interés considerable en identificar cambios inducidos por fármacos de larga duración a nivel molecular y estructural en circuitos neuronales regulados por la dopamina y el glutamato (29–32). En particular, se ha encontrado que la exposición a largo plazo a la cocaína o la anfetamina aumenta el número de puntos de ramificación dendríticas y espinas de MSN en NAcc (33–35). Se ha demostrado que estos cambios estructurales persisten hasta ≈1 – 3.5 meses después de la última exposición al medicamento (30, 35) y se ha sugerido que subyace a las alteraciones duraderas de la plasticidad sináptica asociadas con la exposición a los psicoestimulantes.
El objetivo del presente estudio fue examinar las alteraciones estructurales inducidas por la cocaína de las espinas dendríticas en subpoblaciones de MSN accumbal que expresan los receptores D1 o D2. En estos estudios, hemos utilizado ratones transgénicos bacterianos artificiales (BAC) que expresan EGFP bajo el control del promotor del receptor de dopamina D1 (Drd1-EGFP) o D2 (Drd2-EGFP) (36). Los resultados indican que, aunque inicialmente se produce un aumento de la densidad de la columna vertebral en los MSN que contienen el receptor D1 y en los MSN que contienen el receptor D2, la densidad alterada de la columna vertebral es estable solo en las neuronas que contienen el receptor D1. Además, encontramos cambios similares en la expresión del factor de transcripción ΔFosB, lo que sugiere que ΔFosB puede estar involucrado en la formación y / o mantenimiento de espinas dendríticas en D1 así como neuronas que contienen receptores D2 en NAcc.
Resultados
Análisis de MSN en ratones transgénicos Drd1-EGFP y Drd2-EGFP BAC.
El patrón de proyección de MSN de estriado dorsal y ventral en ratones transgénicos Drd1-EGFP o Drd2-EGFP BAC se ha caracterizado mediante el análisis de la expresión de GFP (36). La expresión diferencial de GFP en los MSN del estriado dorsal corresponde generalmente a la de los receptores D1 o D2 endógenos, respectivamente (36). Además, analizamos la expresión diferencial de GFP en NAcc en ratones Drd1-EGFP o Drd2-EGFP ( a y b). Aunque el ≈58% de neuronas en NAcc expresaron GFP en ratones Drd1-EGFP ( a), ≈48% de neuronas en Gc expresadas por NAcc en ratones Drd-2-EGFP ( b). Los MSN representan 90 – 95% de todas las neuronas en NAcc (12, 37). Los receptores D1 se expresan solo en MSN, y los receptores D2 se expresan en MSN y en interneuronas colinérgicas, que representan el 1 – 3% de las neuronas del estriado (37). Teniendo en cuenta estos factores, los resultados sugieren que, como mínimo, el ≈10 – 15% de MSN en NAcc probablemente exprese los receptores D1 y D2.
Análisis de espinas dendríticas en ratones Drd1-EGFP y Drd2-EGFP.
La expresión de GFP en los ratones Drd1-EGFP y Drd2-EGFP fue útil para teñir los cuerpos celulares neuronales. Sin embargo, la señal de GFP en dendritas y espinas dendríticas era demasiado débil para permitir su análisis después de la inmunotinción con anticuerpos anti-GFP. El suministro balístico mediado por partículas de los tintes fluorescentes se ha utilizado recientemente para etiquetar poblaciones neuronales de una manera rápida y eficiente (38). Se pueden marcar neuronas completas utilizando esta técnica, y el método parece ser comparable a la tinción de Golgi-Cox. Para analizar la morfología dendrítica de las neuronas en NAcc, se marcaron cortes accumbal fijos con el colorante de fluorescencia lipófilo 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) utilizando un gen pistola. Un ejemplo de un MSN teñido con DiI se muestra en c. En las condiciones utilizadas, generalmente observamos neuronas marcadas sin dendritas superpuestas de otras neuronas marcadas. A mayor aumento, se pudo observar una morfología dendrítica detallada, incluidas las espinas dendríticas ( d).
Luego utilizamos una combinación de marcaje DiI e inmunohistoquímica para GFP en ratones transgénicos Drd1-EGFP o Drd2-EGFP, lo cual fue posible gracias al uso de una baja concentración de detergente para la permeabilización de tejidos (ver Métodos). A través de una cuidadosa comparación de la tinción de DiI y la expresión de GFP en los cuerpos celulares de los MSN, pudimos identificar neuronas positivas para DiI y GFP o diI positivas y GFP negativas en Drd1-EGFP ( a) o Drd2-EGFP ( b) ratones. Para los siguientes estudios, analizamos la morfología dendrítica en solo neuronas positivas para DiI y GFP de ratones Drd1-EGFP o Drd2-EGFP.
El tratamiento crónico con cocaína da como resultado una mayor densidad de la columna vertebral en los MSN de Accumbal que expresan Drd1-EGFP o Drd2-EGFP.
Los ratones Drd1-EGFP o Drd2-EGFP se inyectaron repetidamente con cocaína (30 mg / kg) o solución salina durante cuatro semanas consecutivas (ver Métodos). Dos días (2WD) o 30 días (30WD) después del último tratamiento farmacológico, los cerebros se procesaron para el marcado DiI y la inmunohistoquímica como se describe anteriormente. Un estudio previo informó que el tratamiento crónico con anfetamina incrementó la densidad de la columna vertebral en dendritas distales pero no proximales de MSN en NAcc (35). Por lo tanto, limitamos nuestro análisis a las dendritas distales (es decir, aquellas con ramas de segundo o tercer orden), incluidas las regiones terminales. Cuando se analizó en 2WD, se encontró que la densidad de la columna vertebral aumentaba en los MSN positivos para Drd1-EGFP (128% del grupo de solución salina) ( a y c) y, en menor medida, en neuronas positivas a Drd2-EGFP (115% del grupo de solución salina) ( b y d). Después de 30WD, el aumento de la densidad de la columna vertebral se mantuvo en las neuronas positivas para Drd1-EGFP (118% del control de solución salina) ( a y c) pero no en las neuronas positivas para Drd2-EGFP ( b y d).
La morfología de las espinas dendríticas es variable en términos de su longitud y el ancho de la cabeza de la columna. Por lo tanto, clasificamos las protrusiones dendríticas en cuatro clases de espinas (rechoncho, hongo, delgado y filopodio) en 2WD de la cocaína (datos no mostrados). La densidad de tipo hongo (119.7 ± 4.0%, P <0.01) y espinas delgadas (120.0 ± 3.4%, P <0.01) se incrementó con el tratamiento con cocaína en los MSN Drd1-EGFP-positivos, mientras que la densidad de los rechonchos (182.4 ± 21.6%, P <0.05) y espinas en forma de hongo (122.5 ± 5.0%, P <0.01) se incrementó en los MSN positivos para Drd2-EGFP. No hubo un aumento significativo de espinas rechonchas en neuronas positivas para Drd1-EGFP o de espinas delgadas en neuronas positivas para Drd2-EGFP.
La cocaína crónica induce la expresión de BFosB en Drd1-EGFP- o Drd2-EGFP-MSN positivos en NAcc.
ΔFosB es un miembro de la familia de factores de transcripción Fos. Mientras que la administración aguda de cocaína induce una inducción rápida y transitoria de varias isoformas de Fos en NAcc, la exposición repetida a la cocaína aumenta el nivel de ΔFosB. Además, el aumento en la expresión de ΔFosB persiste en NAcc durante semanas o meses después de la interrupción de la exposición al fármaco y se ha sugerido que participa en la regulación a largo plazo de la expresión génica, incluso después de que cese la toma del fármaco (29, 39, 40).
Para examinar la inducción de ΔFosB en NAcc de ratones Drd1-EGFP o Drd2-EGFP después del tratamiento con cocaína, analizamos la expresión de FosB y GFP mediante doble marcaje ( y Tabla 1) El anticuerpo anti-FosB reconoce todas las formas de FosB, pero suponemos que el aumento de la inmunotinción representa ΔFosB (ver Métodos para mayor discusión). En ratones tratados con solución salina, el 16% de las neuronas positivas para Drd1-EGFP y el 15% de las neuronas positivas para Drd2-EGFP expresaron la inmunorreactividad a FosB con una intensidad relativamente débil ( a y b y Tabla 1). El tratamiento repetido de cocaína seguido de 2WD dio como resultado un aumento significativo en el número de neuronas positivas para Drd1-EGFP que coexpresaron ΔFosB (55% de neuronas positivas para GFP) ( c y Tabla 1). Se encontró un aumento más pequeño, pero aún significativo en la expresión de ΔFosB en las neuronas positivas para Drd2-EGFP (25% de neuronas positivas para GFP) ( d y Tabla 1). Al igual que con los cambios en la densidad de la columna vertebral, el aumento de la expresión de ΔFosB se mantuvo en las neuronas positivas para Drd1-EGFP (46% de neuronas positivas para GFP) pero no en las neuronas positivas para Drd2-EGFP (15% de neuronas positivas para GFP) después 30WD ( e y f y Tabla 1). Tenga en cuenta que el aumento de la expresión ΔFosB observado en f Está presente en las neuronas negativas de Drd2-EGFP.
Discusión
Se cree que las adaptaciones duraderas en la neurotransmisión dopaminérgica subyacen a las conductas adictivas asociadas con las drogas psicoestimulantes. En particular, se ha planteado la hipótesis de que los aumentos inducidos por psicoestimulantes en la densidad de la columna dendrítica de MSN en NAcc están vinculados a la reorganización de la conectividad sináptica (30). El NAcc se compone en gran parte de dos subpoblaciones distintas de MSN que expresan altos niveles de receptores de dopamina D1 o D2. En el presente estudio, hemos analizado la densidad de la columna vertebral en distintos MSN que contienen receptores D1 o D2 en NAcc después del tratamiento crónico con cocaína. Los resultados obtenidos muestran que, aunque inicialmente se produce un aumento de la densidad de la columna vertebral en los MSN que contienen el receptor D1 y en los MSN que contienen el receptor D2, la densidad alterada de la columna vertebral es estable solo en las neuronas que contienen el receptor D1. Además, encontramos un patrón similar de cambios en la expresión del factor de transcripción ΔFosB en MSN que contienen receptores D1 y D2.
Estos estudios hicieron uso de ratones transgénicos BAC que expresan GFP en subpoblaciones específicas de MSN bajo el control del promotor del receptor D1 o D2. Además, desarrollamos un método de etiquetado doble que combinaba la inmunohistoquímica para GFP con el etiquetado balístico de las neuronas utilizando DiI. Estudios anteriores han utilizado el método de Golgi-Cox para analizar el efecto de los psicoestimulantes en la densidad de la columna vertebral (34), y el método DiI utilizado aquí dio resultados que fueron cuantitativamente comparables. Desarrollamos el método de doble etiquetado porque la tinción de Golgi no es compatible con la inmunohistoquímica. La inmunotinción generalmente requiere permeabilización del tejido con detergentes, un proceso que generalmente conduce a la solubilización de los colorantes lipófilos de la membrana (38). Sin embargo, en nuestros estudios actuales, la inmunotinción con GFP no requirió una alta concentración de detergente para la permeabilización del tejido y, por lo tanto, podría usarse junto con el etiquetado de tinte lipófilo. Nuestro método de doble etiquetado debería ser generalmente útil para estudios de cambios estructurales en espinas dendríticas, por ejemplo cuando se usa para el análisis de líneas de ratones transgénicos BAC donde GFP se expresa en poblaciones específicas de neuronas en la corteza (36).
Aunque todavía algo controvertido, se cree que los receptores D1 y D2 están en gran parte separados anatómicamente a las neuronas de proyección estriatal directa (estriatonigral) e indirecta (striatopalidal), respectivamente (17, 41). La caracterización inicial de la localización de GFP en los ratones Drd1-EGFP y Drd2-EGFP fue consistente con esta conclusión (36). Además, nuestro análisis del número de neuronas GFP positivas en NAcc de ratones Drd1-EGFP y Drd2-EGFP es consistente con la conclusión de que el ≈50% de los MSN expresa solo receptores D1, ese ≈35 – 40% solo expresa receptores D2, y que ≈10 – 15% coexpresa los receptores D1 y D2. Este valor de coexpresión es similar al implícito en los estudios del estriado dorsal que combinaron el análisis parche-pinza de neuronas del estriado único con técnicas de RT-PCR para aislar y amplificar los ARNm (≈17% de coexpresión de encefalina y sustancia P) (42). Cabe señalar que nuestros estudios actuales no abordan la cuestión de la expresión de los receptores D3, D4 y D5, ni abordan la cuestión de los bajos niveles de expresión de los receptores D1 en MSN que expresan niveles altos de receptores D2 o viceversa.
Varios estudios previos han examinado la localización neuronal de la expresión de Fos inducida por psicoestimulantes y el papel de los receptores D1 y D2 (43–45). Esos estudios apoyaron la conclusión de que la inducción de Fos y ΔFosB está mediada por la activación de los receptores D1. Sin embargo, la localización celular de la expresión de Fos está influenciada por el contexto ambiental en el que se administran las drogas psicoestimulantes (46, 47). Por ejemplo, la anfetamina o la cocaína administradas en la jaula de la casa inducen genes tempranos inmediatos (incluido el Fos), preferentemente en células con sustancia P positiva que coexpresan los receptores D1. Por el contrario, estos fármacos pueden inducir la expresión de Fos en MSN que contienen receptores tanto D1 como D2 cuando se administran en un entorno nuevo. El protocolo utilizado en nuestros estudios actuales no incluía la combinación de la inyección de medicamentos con la exposición a un entorno novedoso. Sin embargo, no podemos descartar algún tipo de estrés dependiente del contexto que sea responsable de la expresión de ΔFosB en los MSN que contienen receptores D2.
Una característica notable de los resultados actuales fue el patrón paralelo de aumento de la densidad de la columna y la expresión de ΔFosB. La mayor densidad de la columna vertebral y la expresión de ΔFosB se produjeron inicialmente en los MSN que expresan Drd1-EGFP y Drd2-EGFP. Sin embargo, estos cambios fueron estables solo en las neuronas que contienen el receptor D1. Una posible explicación para la observación de que la mayor densidad de la columna vertebral y la expresión de ΔFosB se encontró de forma transitoria en las neuronas que contienen receptores D2 es que esto ocurrió en la pequeña fracción de MSN que coexpresan los receptores de dopamina tanto D1 como D2. Por lo tanto, la naturaleza transitoria de estos aumentos puede estar asociada con los efectos antagónicos de la activación del receptor D2 en las vías de señalización dependientes de D1 (48). Es de interés que los cambios en la densidad de la columna vertebral y la expresión de ΔFosB fueron reversibles, lo que puede reflejar la capacidad de las vías de señalización dependientes del receptor D2 para influir en la estabilidad de ΔFosB.
La observación de que hay cambios paralelos en la expresión de ΔFosB y la densidad de la columna vertebral es coherente con la idea de que BFosB está involucrado en la formación inicial y el mantenimiento posterior de las espinas dendríticas en las neuronas que contienen receptores D1 en NAcc. La expresión de ΔFosB se controla mediante la ruta de señalización dependiente de D1 / DARPP-32 / PP1 en los MSN (49). Varios estudios han demostrado que ΔFosB desempeña un papel importante en las acciones gratificantes y activadoras de locomotoras de los psicoestimulantes (39), probablemente influyendo en la expresión de múltiples genes que incluyen receptores de neurotransmisores, proteínas de señalización y proteínas involucradas en la regulación de la morfología neuronal (50). Sin embargo, actualmente no se conocen los mecanismos moleculares específicos involucrados en la formación crónica de la columna vertebral inducida por cocaína. Nuestros estudios anteriores han demostrado que la infusión intraacumbal del inhibidor de Cdk5 roscovitina atenúa los aumentos inducidos por la cocaína en la densidad de la columna vertebral (51). Además, Cdk5 es un gen diana descendente para ΔFosB y se ha implicado en cambios adaptativos compensatorios asociados con el tratamiento crónico de cocaína (52). Por lo tanto, la alteración en la fosforilación dependiente de Cdk5 es un mecanismo plausible subyacente a la formación de la columna vertebral inducida por la cocaína y / o la estabilidad de la columna vertebral. PAK (53), β-catenina (54), PSD-95 (55), y espinofilina (56) son sustratos para Cdk5 y todos están involucrados en la regulación de la morfogénesis de la columna vertebral (57–60). Se espera que la caracterización adicional de estos y otros sustratos Cdk5 en espinas arroje luz sobre los mecanismos involucrados en la regulación de la formación de la columna por parte de los psicoestimulantes.
Métodos
Los animales
Los ratones portadores de un transgén EGFP bajo el control de los receptores de dopamina D1 o D2 fueron generados por el proyecto transgénico Gensat BAC (36). Los ratones transgénicos utilizados en este estudio tenían 4-5 semanas de edad y estaban en un fondo Swiss-Webster. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad 12: 12-h y se alojaron en grupos de 2-5 con alimento y agua disponibles ad libitum. Todos los protocolos para animales se ajustaron a la Guía de Institutos Nacionales de la Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rockefeller.
Tratamiento farmacológico.
Se informó que el tratamiento crónico con cocaína (30 mg / kg, diario) produce un aumento robusto en la densidad de la columna vertebral de los MSN tanto en el núcleo como en la cáscara de NAcc de la rata, pero una dosis más baja (15 mg / kg) aumentó la densidad de la columna solo en la cáscara (61). Por lo tanto, utilizamos la dosis más alta de cocaína para inducir la modificación estructural en ambas partes de NAcc. Los ratones recibieron una inyección (ip) de 30 mg / kg de cocaína-HCl (o solución salina) cada día durante 5 días consecutivos, seguidos de días sin inyección de 2, y este procedimiento se repitió durante 4 semanas consecutivas. Las inyecciones se realizaron en la jaula de la casa. 2WD o 30WD, los cerebros de ratones se procesaron para el marcado DiI y / o inmunohistoquímica.
Etiquetado balístico con el tinte fluorescente DiI.
Los ratones se anestesiaron con 80 mg / kg de pentobarbital sódico y se perfundieron transcardialmente con 5 ml de PBS, seguido de una perfusión rápida con 40 ml de 4% de paraformaldehído en PBS (20 ml / min). Los cerebros se extrajeron rápidamente del cráneo y se fijaron posteriormente en 4% paraformaldehído para 10 min. Las rodajas de cerebro (100 μm) se marcaron mediante suministro balístico de colorante fluorescente DiI (Molecular Probes) como se describe en la ref. 38. Se desarrolló un método combinado de etiquetado DiI con inmunohistoquímica con una baja concentración de detergente. Las secciones marcadas con DiI se permeabilizaron con 0.01% Triton X-100 en PBS durante 15 min y luego se incubaron en 0.01% Triton X-100 y 10% de suero normal de cabra en PBS durante 1 para minimizar el etiquetado no específico. Las secciones de tejido se incubaron luego con 1% de suero normal de cabra / 0.01% Triton X-100 y anticuerpo anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) para 2 a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron en una dilución 1: 1,000 de FITC- Anticuerpo secundario conjugado (Molecular Probes). Las secciones se colocaron en portaobjetos de microscopio y se cubrieron con medio de montaje. El método de etiquetado balístico permitió un análisis detallado de la estructura de la columna dendrítica, y los resultados obtenidos fueron comparables cualitativa y cuantitativamente con estudios previos que utilizaron el método de impregnación de Golgi-Cox en cortes de cerebro de rata (34). Sin embargo, a diferencia de estudios anteriores, rara vez observamos espinas de dos cabezas en neuronas teñidas con DiI. Esta diferencia puede deberse a la sensibilidad de los métodos de tinción o la variabilidad del ratón (este estudio) en comparación con el tejido de rata (34).
Inmunohistoquímica.
Los animales fueron anestesiados y perfundidos como se describe anteriormente. Los cerebros se retiraron y almacenaron durante la noche en 4% paraformaldehído a 4 ° C. Los cerebros se transfirieron a 30% de sacarosa en una solución de PBS para la crioprotección. Se cortaron secciones coronales (12 μm) en un microtomo de congelación (Leica) y luego se procesaron para inmunohistoquímica. Luego se permeabilizaron secciones de cerebro en 0.3% Triton X-100 en PBS durante 15 min y se enjuagaron dos veces en PBS. Las secciones se preincubaron en 10% de suero de cabra normal en PBS para 1 h a 37 ° C, se expusieron a anticuerpos primarios (diluidos en 1% de suero de cabra normal en PBS) durante la noche a 4 ° C, luego se enjuagaron con PBS e incubaron con producto secundario. Anticuerpos para 1 h en 37 ° C. Se usaron los siguientes anticuerpos: conejo anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), ratón anti-NeuN (Chemicon), conejo anti-GFP, IgG anti-conejo conjugada con FITC y rodamina IgG anti-ratón conjugado (sondas moleculares). Para el etiquetado triple (ΔFosB, NeuN y GFP), las secciones del cerebro se inmunocontenieron primero con anticuerpo anti-pan FosB y anticuerpo anti-NeuN y luego se incubaron con anticuerpos secundarios (IgG anti-conejo conjugada con rodamina e IgG anti-ratón conjugada con cian). ). Se procesaron adicionalmente secciones de cerebro teñidas dobles para la inmunotinción con GFP utilizando la tecnología de marcaje Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). El anticuerpo anti-pan-FosB se elevó al extremo N de FosB y reconoce ΔFosB y FosB de longitud completa (62). Sobre la base de estudios previos que demostraron que osFosB pero no FosB u otros antígenos relacionados con Fos se expresan de forma estable después del tratamiento crónico con cocaína, asumimos que los aumentos de larga duración en la inmunorreactividad representan una expresión estable de ΔFosB. Sin embargo, se desconoce la identidad de la señal inmunorreactiva de FosB observada en ratones tratados con solución salina. Análisis estadístico en Tabla 1 utilizado el estudiante t .
Análisis de la columna dendrítica.
Se eligieron MSN individuales en el NAcc para el análisis de la columna vertebral en función de varios criterios. (i) Hubo una superposición mínima o ninguna con otras células marcadas para garantizar que los procesos de diferentes células no se confundieran. (ii) Al menos tres dendritas primarias debían ser visibles para que las células se usaran para el análisis. (iii) Se examinaron las dendritas distales (dendritas terminales o cercanas a la dendrita terminal). Se analizaron las dendritas de ambos MSN en el núcleo y la cáscara del NAcc. Aunque observamos MSN con espinas dispersas (espinosas tipo II), analizamos solo MSN densamente espinosas (espinosas tipo I). Para calcular la densidad de la columna, se trazó una longitud de dendrita (> 20 μm de largo) utilizando un microscopio confocal (Zeiss LSM 510) con una lente de inmersión en aceite (× 40). Todas las imágenes de dendritas se tomaron a diferentes z Niveles (0.5 – 1 μm intervalos de profundidad) para examinar la morfología de las espinas dendríticas. Todas las mediciones se realizaron con el software de análisis de imágenes Metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA). El análisis estadístico utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
Las protuberancias de las dendritas se clasificaron en cuatro tipos según su longitud como se describe en las referencias. 63 y 64. Las protuberancias de clase 1, también llamadas protuberancias rechonchas, tenían una longitud de <0.5 μm, carecían de una cabeza de columna grande y no parecían tener cuello; la clase 2, o espinas en forma de hongo, tenían entre 0.5 y 1.25 μm de largo y se caracterizaban por un cuello corto y una cabeza de espina grande; la clase 3, o espinas delgadas, variaba entre 1.25 y 3.0 μm y tenía el cuello de la columna alargado con cabezas pequeñas; la clase 4, o extensiones filopodiales, eran protuberancias filamentosas largas que carecían de una cabeza espinal discernible.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por la subvención DA10044 (para PG y ACN) del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos y por la Fundación Simons, la Fundación Peter J. Sharp, la Fundación Picower y la Fundación FM Kirby.
Abreviaturas
- NAcc
- núcleo accumbens
- MSN
- neurona espinosa de tamaño mediano
- BAC
- cromosoma artificial bacteriano
- Drd1
- D1 receptor de dopamina impulsado por el promotor
- Drd2
- D2 receptor de dopamina impulsado por el promotor
- DiI
- 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato
- 2WD
- 2 días después del último tratamiento farmacológico.
- 30WD
- 30 días después del último tratamiento farmacológico.
Referencias
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