Efecto de la sobreexpresión de ΔFosB en la señalización mediada por receptores opioides y cannabinoides en el núcleo accumbens (2011)

Neurofarmacología. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Esparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

Fuente

Departamento de Farmacología y Toxicología e Instituto de Estudios de Drogas y Alcohol, Facultad de Medicina de Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, EE. UU.

Resumen

El factor de transcripción estable ΔFosB se induce en el núcleo accumbens (NAc) por exposición crónica a varias drogas de abuso, y la expresión transgénica de ΔFosB en el estriado mejora las propiedades gratificantes de la morfina y la cocoina.mi. Sin embargo, la base mecánica de estas observaciones no se comprende completamente. Utilizamos un modelo de ratón bitransgenico con expresión inducible de ΔFosB en dopamina D (1) receptor / dinorfina que contiene neuronas del estriado para determinar el efecto de la expresión de ΔFosB en el opioide y la señalización del receptor de cannabinoides en el NAc. Los resultados mostraron que la actividad de la proteína G mediada por opioides mu y la inhibición de la adenilil ciclasa aumentaron en la NAc de ratones que expresaban ΔFosB. De manera similar, la inhibición de opiáceos kappa de la adenilil ciclasa se mejoró en los ratones que expresaban ΔFosB. En contraste, la señalización mediada por el receptor cannabinoide no difirió entre los ratones que sobreexpresaban ΔFosB y los ratones control. TEstos hallazgos sugieren que la señalización de los receptores opioides y cannabinoides se modulan de manera diferencial por la expresión de ΔFosB, e indican que la expresión de ΔFosB podría producir algunos de sus efectos a través de la señalización aumentada de los receptores opioides mu y kappa en la NAc.

Keywords: Proteína G, adenilil ciclasa, estriado
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1. Introducción

Receptores de opioides y cannabinoides CB1 receptores (CB1R) son los objetivos neurobiológicos para dos clases de drogas ampliamente utilizadas que incluyen morfina, heroína y opioides recetados, y marihuana (Δ9-tetrahidrocannabinol (THC)), respectivamente. Los efectos agudos de los opioides y los cannabinoides están mediados por receptores acoplados a proteínas G que activan principalmente Gy/o proteínas y producen respuestas efectoras aguas abajo, como la inhibición de la adenilil ciclasa (Niños, xnumx, Childers, et al., 1992, Howlett, et al., 2002). El motor, el deterioro de la memoria y los efectos psicoactivos de Δ.9-THC son producidos por CB1R (Huestis, et al., 2001, Zimmer, et al., 1999), que están ampliamente distribuidas en el cerebro, con altos niveles en los ganglios basales, el hipocampo y el cerebelo (Herkenham, et al., 1991). Los efectos analgésicos y gratificantes de la mayoría de los fármacos opioides clínicamente relevantes y abusados ​​están mediados principalmente por los receptores opioides mu (MOR) (Matthes, et al., 1996), que están enriquecidos en el sistema límbico y el tronco cerebral (Mansour, et al., 1994). El sistema mesolímbico, compuesto por proyecciones dopaminérgicas desde el área tegmental ventral (VTA) hasta el núcleo accumbens (NAc), desempeña un papel importante en los efectos gratificantes de los opioides y los cannabinoides (Bozarth y Wise, 1984, Vaccarino, et al., 1985, Zangen, et al., 2006), así como otras drogas de abuso (Koob y Volkow, 2010). Además, los sistemas opioides y cannabinoides endógenos están involucrados en los efectos gratificantes de múltiples clases de drogas psicoactivas (Maldonado, et al., 2006, Trigo, et al., 2010). Por lo tanto, es importante dilucidar los mecanismos mediante los cuales el opioide y el CB1La señalización R está regulada en la NAc.

Una cuestión central en el campo del abuso de drogas ha sido identificar proteínas que median la transición de los efectos agudos a los efectos a largo plazo de las drogas psicoactivas. El factor de transcripción AP-1 ΔFosB es particularmente interesante porque es un producto variante de empalme truncado estable de Fosb gen que se acumula tras la exposición repetida a drogas de abuso o recompensas naturales (McClung, et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler, et al., 1999). Hemos encontrado que ΔFosB se induce en el cerebro después de la exposición repetida a la morfina, Δ9-THC, cocaína o etanol, con cada droga produciendo un patrón regional único de expresión de ΔFosB (Perrotti, et al., 2008). Un hallazgo consistente entre los fármacos fue que ΔFosB fue altamente inducido en el estriado, donde los cuatro fármacos indujeron ΔFosB en el núcleo de NAc y todos excepto Δ9-THC indujo significativamente la expresión en la concha NAc y el caudado-putamen.

Los estudios farmacológicos mostraron que la administración conjunta de la dopamina D1 receptor (D1R) el antagonista SCH 23390 bloqueó la inducción de BFosB en el NAc y el caudato-putamen después de la administración intermitente de cocaína o morfina, lo que sugiere la posible importancia de D1Neuronas que expresan R (Muller y Unterwald, 2005, Nye, et al., 1995). El efecto de la inducción de ΔFosB en los comportamientos mediados por fármacos se ha investigado utilizando ratones bitransgenic que expresan ΔFosB en poblaciones neuronales específicas de NAc y el estriado dorsal (Chen, et al., 1998). Ratones que expresan ΔFosB en dinorfina / D1Las neuronas R positivas en el NAc y el estriado dorsal (línea 11A) muestran respuestas alteradas a las drogas de abuso, notablemente mayor sensibilidad a los efectos gratificantes de la cocaína o la morfina (Colby, et al., 2003, Kelz, et al., 1999, Zachariou, et al., 2006). Estas alteraciones ocurrieron en ausencia de cambios en los niveles de MOR o varias subunidades de proteína G. Sin embargo, los niveles de ARNm de dinorfina se redujeron en la NAc de los ratones que expresaban ΔFosB (Zachariou, et al., 2006), lo que sugiere que un objetivo de ΔFosB es un gen que codifica un péptido opioide endógeno. La inducción de BFosB también puede producir cambios de comportamiento al regular la señalización del receptor en el NAc, pero esta posibilidad no se ha investigado. Por lo tanto, los estudios actuales utilizaron el modelo de ratón bitransgenico para determinar si la sobreexpresión de ΔFosB en dinorfina / D1R que contiene neuronas del cuerpo estriado altera la actividad de la proteína G mediada por MOR y la inhibición de la adenilil ciclasa mediada por MOR y KOR en la NAc. El efecto de ΔFosB en CB1La actividad de la proteína G mediada por R también se evaluó porque9-La administración de THC induce ΔFosB en la NAc (Perrotti, et al., 2008) y se sabe que el sistema endocannabinoide regula los circuitos de recompensa cerebral (Gardner, 2005, Maldonado, et al., 2006), pero el efecto de ΔFosB en el sistema endocannabinoide no ha sido investigado.

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2. Materiales y métodos

2.1. Reactivos

[35S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-32P] ATP (800 Ci / mmol) y [3H] cAMP (26.4 Ci / mmol) se adquirió de PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, albúmina de suero bovino, creatina fosfocinasa, papaverina, imidazol y WIN-55212-2, se compraron a Sigma Aldrich (St. Louis, MO). GTPγS se adquirió de Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). DAMGO fue proporcionado por el Programa de Suministro de Medicamentos del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (Rockville, MD). El líquido de centelleo Econo-1 se obtuvo de Fisher Scientific (Norcross, GA). El fluido de centelleo de ecolita se obtuvo de ICN (Costa Mesa, CA). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma Aldrich o Fisher Scientific.

2.2. Ratones

Se generaron ratones bitransgenicos macho derivados de NSE-tTA (línea A) × TetOp-ΔFosB (línea 11) como se describe en Kelz et al. (Kelz, et al., 1999). Los ratones bitransgenicos fueron concebidos y criados en doxiciclina (100 µg en agua potable) para suprimir la expresión transgénica. A las 8 semanas de edad, se omitió doxiciclina del agua en la mitad de los ratones para permitir la expresión del transgén, mientras que los ratones restantes se mantuvieron en doxiciclina para suprimir el transgén. Los cerebros se recolectaron 8 semanas más tarde, el momento en que los efectos transcripcionales de ΔFosB son máximos (McClung y Nestler, 2003). Se utilizó una segunda línea de ratones transgénicos en la que Δc-Jun, un antagonista negativo dominante de c-Jun, se expresa en D1R / dinorfina y D2Células R / encefalinas del cuerpo estriado, hipocampo y corteza parietal (Peakman, et al., 2003). Las proteínas de la familia Jun C-Jun y relacionadas dimerizan con las proteínas de la familia Fos y se unen al sitio AP-1 de los genes objetivo para regular la transcripción. Sin embargo, el truncamiento del extremo N de c-Jun (Δc-Jun) hace que el complejo sea transcripcionalmente inactivo y capaz de obstruir la unión del ADN de los complejos AP-1 activos. Se generaron ratones bitransgenicos macho derivados de NSE-tTA (línea A) x TetOp-FLAG-Δc-Jun (línea E) como se describe en Peakman et al. (Peakman, et al., 2003). Los ratones bitransgenicos fueron concebidos y criados en doxiciclina (100 µg en agua potable) para suprimir la expresión transgénica. Las crías se destetaron a las 3 semanas, se genotiparon y se separaron en grupos, la mitad se mantuvo en agua que contenía doxiciclina y la mitad en agua potable regular para inducir la expresión de FLAG-Δc-Jun. Los cerebros se recolectaron 6 semanas más tarde, el momento en que se midieron los niveles máximos de FLAG-c-Jun (Peakman, et al., 2003). Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

2.3. Preparación de la membrana

Los cerebros se almacenaron a -80 ° C hasta el día del ensayo. Antes del ensayo, se descongeó cada cerebro y se diseccionó el NAc en hielo. Cada muestra se homogeneizó en 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (tampón de membrana) con trazos 20 de un homogeneizador de vidrio a 4 ° C. El homogeneizado se centrifugó a 48,000 × g a 4 ° C durante 10 min, resuspendido en un tampón de membrana, centrifugado nuevamente a 48,000 × g a 4 ° C durante 10 min y resuspendido en 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (tampón de ensayo). Los niveles de proteína fueron determinados por el método de Bradford (Bradford, 1976) usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.

2.4. Agonista Estimulado [35S] Enlace GTPγS

Las membranas se preincubaron durante 10 minutos a 30 ° C con adenosina desaminasa (3 mU / ml) en tampón de ensayo. Las membranas (5 – 10 µg de proteína) se incubaron luego para 2 hr a 30 ° C en un tampón de ensayo que contenía 0.1% (w / v) BSA, 0.1 nM [35S] GTPγS, 30 µM ​​GDP y adenosina desaminasa (3 mU / ml) con y sin concentraciones apropiadas de DAMGO o WIN55,212-2. La unión no específica se midió con 20 µM ​​GTPγS. La incubación se terminó por filtración a través de filtros de fibra de vidrio GF / B, seguido de lavados con 3 con 3 ml 50 enfriado con hielo Tris-HCl mM, pH 7.4. La radioactividad unida se determinó mediante espectrofotometría de centelleo líquido después de la extracción durante la noche de los filtros en fluido de centelleo Econo-1.

2.5. Ensayo de adenilil ciclasa

Membranas (5 – 25 µg proteína) se preincubaron con adenosina desaminasa como se describió anteriormente, luego se incubaron durante 15 min a 30 ° C en presencia o ausencia de forskolina 1µM, con o sin DAMGO, U50,488H o WIN55,212-XNXX, en ensayo 2 µM ​​ATP, [α-32P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (w / v) BSA, 50 µM ​​AMP cíclico, 50 µM ​​GTP, 0.2 mM papaverina, yacina de la cinceazina de la jaula de la jaula de la arca de la arca de la cúpula. / ml) en un volumen final de 5 µl. En estas condiciones, el total [α-32P] cAMP recuperado fue generalmente menor que 1% de la cantidad total de [α-32P] ATP en cada muestra. La reacción se terminó hirviendo durante 3 min y [32P] AMP cíclico se aisló mediante el método de doble columna (Dowex y alúmina) de Salomon (Salomon, xnumx). El3H] cAMP (10,000 dpm) se añadió a cada tubo antes de la cromatografía en columna como estándar interno. La radiactividad se determinó mediante espectrofotometría de centelleo líquido (45% de eficiencia para 3H) después de que se disolvieron 4.5 ml del eluato en 14.5 ml de líquido de centelleo Ecolite.

2.6. Análisis de los datos

A menos que se indique lo contrario, los datos se informan como valores medios ± SE de 4-8 experimentos separados, cada uno de los cuales se realizó por triplicado. Estimulada por la red [35S] La unión a GTPγS se calcula como la unión estimulada por agonistas menos la unión basal. La actividad neta de adenilil ciclasa estimulada por forskoline se define como actividad estimulada por forskoline - actividad basal (pmol / mg / min). El porcentaje de inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa estimulada por la forskolina se define como (actividad neta estimulada por la forskolina en ausencia de agonista - actividad estimulada por la forskolina neta en presencia de agonista / actividad neta estimulada por la forskolina en ausencia de agonista) x XUM. Todos los análisis estadísticos y de ajuste de curvas se realizaron utilizando Prism 100c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Las curvas de efecto de concentración se analizaron mediante regresión no lineal iterativa para obtener EC50 y Emax valores. La importancia estadística de los datos de concentración-efecto se determinó mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA), utilizando la dosis de agonista y la inducción de genes (activada o desactivada) como los factores principales. Significación estadística de los valores de ajuste de curva (Emax o EC50) se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas no apareada, utilizando la corrección de Welch o la transformación de raíz cuadrada de los datos cuando fue necesario para corregir las variaciones desiguales (detectadas por la prueba F) en EC50 valores.

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3. Resultados

3.1. Efecto de la expresión de ΔFosB en la activación de la proteína G mediada por el receptor de opioides y cannabinoides

Para determinar si MOR- o CB1La activación de la proteína G mediada por R se alteró por la expresión transgénica inducible de ΔFosB en el NAc, estimulada por agonistas [35S] La unión a GTPγS se examinó en membranas aisladas preparadas a partir de esta región de ratones bitransgenicos que expresaban condicionalmente (ΔFosB activado) o no expresaban (ΔFosB off) el transgén eneFosB. El análogo de encefalina selectiva de MOR DAMGO se usó para activar MOR y el cannabinoide aminoalquilindol WIN55,212-2 se usó para activar CB1R. Se demostró previamente que estos ligandos eran agonistas completos en MOR y CB1R, respectivamente (Breivogel, et al., 1998, Selley, et al., 1997). No fue factible examinar la actividad de la proteína G mediada por KOR porque la señal es demasiado baja en el cerebro de roedor (Childers, et al., 1998). Los resultados mostraron la estimulación dependiente de la concentración de la actividad de la proteína G tanto por DAMGO como por WIN55,122-2 en NAc desde offFosB off y ΔFosB en ratones (Figura 1 y XNUMX). Para la actividad estimulada por DAMGO (Figura 1A), el ANOVA bidireccional de los datos de concentración-efecto reveló efectos principales significativos del estado de ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) y la concentración de DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) sin interacción significativa (p = 0.857, F = 0.387, gl = 5). El análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración-efecto reveló un DAMGO E significativamente mayormax valor en ΔFosB en ratones (Emax = 73 ± 5.2% de estimulación) en relación con ΔFosB off mouse (Emax = 56 ± 4.1% de estimulación; p <0.05 diferente de ΔFosB en ratones mediante la prueba t de Student). DAMGO EC50 los valores no fueron diferentes entre los ratones ΔFosB on y ΔFosB off (302 ± 72 nM versus 212 ± 56 nM, respectivamente, p = 0.346).

Figura 1 y XNUMX 

Efecto de la expresión de ΔFosB en agonistas estimulados [35S] GTPγS de unión en el NAc. Se ensayaron membranas de ratones que expresaban osFosB (ΔFosB on) o de control (ΔFosB off) como se describe en Métodos que utilizan concentraciones variables ...

En contraste con los resultados obtenidos con el agonista de MOR DAMGO, no se observaron diferencias dependientes del estado de FosB en la activación de la proteína G con el agonista de cannabinoides WIN55,212-2 (Figura 1B). El ANOVA bidireccional de los datos del efecto de concentración de WIN55,212-2 reveló un efecto principal significativo de la concentración de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, gl = 7), pero no del estado de ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, gl = 1) y no hubo interacción (p = 0.930, F = 0.346, gl = 7). Del mismo modo, no hubo ningún efecto del estado de ΔFosB en WIN55,212-2 Emax valores (103 ± 6% versus 108 ± 8% de estimulación en ratones onFosB dentro y fuera, respectivamente, p = 0.813 por prueba t de Student) o EC50 valores (103 ± 20 nM versus 170 ± 23 nM en los ratones de ΔFosB on y off, respectivamente, p = 0.123).

Basados ​​en la forma de las curvas y en el hecho de que nuestros estudios anteriores han mostrado curvas de concentración-efecto WIN55,212-2 bifásicas en el cerebro (Breivogel, et al., 1999, Breivogel, et al., 1998), las curvas WIN55,212-2 también se analizaron utilizando un modelo de dos sitios. El análisis de los datos promedios mostró una leve mejora en la bondad de ajuste utilizando el modelo de dos sitios (R2 = 0.933 y 0.914, suma de cuadrados = 3644 y 5463 en miceFosB con y sin mouse, respectivamente) en comparación con el modelo de sitio único (R2 = 0.891 y 0.879, suma de cuadrados = 6561 y 6628 en FosB con y sin mouse, respectivamente). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre los ratones ΔFosB dentro y fuera de los ratones, ya sea en la Emax o EC50 valores de los sitios de potencia alta o baja (Tabla complementaria 1), aunque hubo una tendencia hacia un menor EC50 valor en el sitio de alta potencia en ratones con ΔFosB activado (EC50high = 28.0 ± 10.6 nM) en comparación con aquellos con ΔFosB desactivado (EC50high = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Además, no hubo ningún efecto del estado de ΔFosB en basal [35S] GTPγS unión en membranas NAc (253 ± 14 versus 226 ± 14 fmol / mg en ratones con y sin osFosB, respectivamente, p = 0.188). Estos datos indican que la expresión transgénica inducible de ΔFosB en la NAc de ratones aumentó la activación de la proteína G mediada por MOR sin afectar significativamente a CB1Actividad de la proteína G mediada por R o basal.

3.2. Efecto de ΔFosB sobre la inhibición mediada por receptores opioides y cannabinoides de la adenilil ciclasa

Para evaluar el efecto de la expresión transgénica inducible de ΔFosB en la modulación de la actividad del efector corriente abajo por MOR y CB1R, la inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa estimulada por forskolina 1 µM ​​se examinó en membranas de NAc. Además de MOR- y CB1La inhibición mediada por R de la actividad de la adenilil ciclasa, los efectos de la actividad KOR también se examinaron utilizando el agonista completo selectivo de KOR U50,488 (Zhu, et al., 1997), porque los resultados anteriores mostraron que el ARNm de dinorfina era un objetivo de ΔFosB en el modelo bitransgenic (Zachariou, et al., 2006). Los resultados mostraron que DAMGO, U50,488 y WIN55,212-2 produjeron cada uno inhibición dependiente de la concentración de la actividad de la adenilil ciclasa tanto en offFosB off como en ΔFosB en ratones (Figura 2 y XNUMX). ANOVA de dos vías de datos de concentración-efecto DAMGO (Figura 2A) revelaron efectos principales significativos del estado de ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) y la concentración de DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), pero ninguna interacción significativa (p = 0.441, F = 0.986 , gl = 6). El análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración-efecto de DAMGO reveló una CE de DAMGO significativamente más baja50 valor en ΔFosB en ratones (101 ± 11 nM) en comparación con ΔFosB en ratones (510 ± 182 nM, p <0.05 por prueba t de Student). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en DAMGO Emax valores (20.9 ± 1.26% frente a 19.8 ± 1.27% de inhibición en ratones onFosB on y off, respectivamente, p = 0.534).

Figura 2 y XNUMX 

Efecto de la expresión de ΔFosB en la inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa en el NAc. Se ensayaron membranas de ratones que expresaban osFosB (ΔFosB on) o de control (ΔFosB off) como se describe en Métodos en presencia de 1 µM ...

La inhibición de la adenilil ciclasa mediada por KOR también difirió en función de la expresión transgénica inducible de ΔFosB (Figura 2B). El ANOVA bidireccional de los datos de concentración-efecto de U50,488 mostró efectos principales significativos del estado de ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) y la concentración de U50,488 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , sin interacción significativa (p = 0.833, F = 0.289, gl = 3). El análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración-efecto reveló un mayor U50,488 Emax valor de ΔFosB en ratones (18.3 ± 1.14% de inhibición) en comparación con ΔFosB sin ratones (12.5 ± 2.03% de inhibición; p <0.05 diferente de ΔFosB en la prueba t de Student), sin diferencias significativas en U50,488 EC50 valores (310 ± 172 nM versus 225 ± 48 nM en los ratones de ΔFosB on y off, respectivamente, p = 0.324).

En contraste con los efectos observados con MOR y KOR, no hubo un efecto significativo de la expresión de ΔFosB transgénica inducible en la inhibición de la adenilil ciclasa por el agonista de cannabinoides WIN55212-2 (Figura 2C). El ANOVA bidireccional de los datos de efecto de concentración de WIN55,212-2 mostró un efecto significativo de la concentración de fármaco (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), pero no del estado de ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) ni hubo interacción significativa (p = 0.714, F = 0.343, gl = 2). Además, no hubo efecto del estado de ΔFosB sobre la actividad de adenilil ciclasa basal o estimulada por forskolina en ausencia de cualquier agonista. La actividad basal de adenilil ciclasa fue 491 ± 35 pmol / mg / min en ΔFosB en ratones en comparación con 546 ± 44 en ΔFosB fuera de ratones (p = 0.346 mediante la prueba t de Student). Asimismo, la actividad de la adenilil ciclasa en presencia de forskolina 1 µM fue 2244 ± 163 pmol / mg / min en ΔFosB en ratones frente a 2372 ± 138 pmol / mg / min en ratones ΔFosB off (p = 0.555).

3.3. Efecto de ΔcJun sobre la inhibición mediada por receptores opioides y cannabinoides de la adenilil ciclasa

Debido a que la expresión transgénica inducible de ΔFosB mejoró la transducción de la señal inhibitoria de MOR y KOR a la adenilil ciclasa en la NAc, fue interesante determinar si un inhibidor negativo dominante de la transcripción mediada por FosB modularía la señalización del receptor opioide de una manera opuesta. Para abordar esta cuestión, se examinó la inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa estimulada por forskolina por DAMGO y U50,488 en membranas preparadas a partir de la NAc de ratones bitransgenic que expresan condicionalmente ΔcJun. Los resultados no mostraron ningún efecto significativo de la expresión de ΔcJun en la inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa por MOR o KOR (Figura 3 y XNUMX). El ANOVA bidireccional de las curvas de concentración-efecto de DAMGO mostró un efecto principal significativo de la concentración de DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), pero no del estado ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) y no hubo interacción significativa (p = 0.982, F = 0.176, gl = 6). Del mismo modo, no hubo diferencia significativa en Emax o EC50 valores entre ratones con ΔcJun en (Emax = 23.6 ± 2.6%; CE50 = 304 ± 43 nM) o ΔcJun apagado (Emax = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; CE50 = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Se observaron resultados similares con U50,488, de manera que el ANOVA bidireccional de las curvas de efecto de concentración mostró un efecto significativo de concentración (p <0.0001, F = 11.94, gl = 6), pero no del estado ΔcJun (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) y no hubo interacción significativa (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Asimismo, no hubo diferencias significativas en Emax o EC50 valores entre ratones con ΔcJun en (Emax = 14.8 ± 2.9%; CE50 = 211 ± 81 nM) o apagado (Emax = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; CE50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Figura 3 y XNUMX 

Efecto de la expresión de ΔcJun en la inhibición de la actividad de la adenilil ciclasa en el NAc. Se incubaron membranas de ratones ΔcJun-expressing (ΔcJun on) o control (ΔcJun off) en presencia de DAMGO (A), U50,488H (B) o WIN55,212-2 ...

La expresión de ΔcJun tampoco afectó significativamente la inhibición de la adenilil ciclasa en el NAc por el agonista cannabinoide. El ANOVA bidireccional de las curvas de efecto de concentración de WIN55,212-2 mostró un efecto principal significativo de la concentración de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, gl = 6), pero no del genotipo (p = 0.066, F = 3.472, gl = 1) y no hubo interacción significativa (p = 0.973, F = 0.208, gl = 6). Asimismo, no hubo diferencias significativas en WIN55,212-2 Emax valores (13.0 ± 2.3% y 13.6 ± 0.9% de inhibición en ratones ΔcJun on versus off, respectivamente, p = 0.821) y / o EC50 valores (208 ± 120 nM y 417 ± 130 nM en ΔcJun on versus off mouse, respectivamente, p = 0.270). Por lo tanto, aunque hubo una ligera tendencia hacia la disminución de la potencia de WIN55,212-2 en ratones que expresaban ΔcJun, el transgén no alteró significativamente la inhibición de cannabinoides de la adenilil ciclasa. Además, no hubo ningún efecto del estado de JcJun en la actividad de la adenilil ciclasa estimulada por forskoline o basal. La actividad basal de adenilil ciclasa fue 1095 ± 71 pmol / mg / min y 1007 ± 77 pmol / mg (p = 0.403) en ratones con ΔcJun activado o desactivado, respectivamente. La actividad de la adenilil ciclasa estimulada por 1 µM ​​forskoline fue 4185 ± 293 pmol / mg versus 4032 ± 273 pmol / mg (p = 0.706) en ratones con ΔcJun on o off, respectivamente.

3.4. Discusión

Los resultados de este estudio revelaron una activación aumentada de la proteína G mediada por MOR e inhibición de la adenilil ciclasa en la NAc de ratones con expresión transgénica inducible de ΔFosB en dinorfina / D1R que contiene neuronas. La inhibición mediada por KOR de la actividad de la adenilil ciclasa también se incrementó en la NAc de los ratones que expresaban ΔFosB, lo que sugiere que la ΔFosB regula el sistema opioide endógeno en la NAc. El DAMGO Emax el valor fue mayor para estimulado por MOR [35S] unión GTPγS, y su EC50 el valor fue menor para la inhibición de la adenilil ciclasa, en ratones con sobreexpresión de ΔFosB en comparación con los ratones control. Estos hallazgos sugieren la posibilidad de una reserva del receptor para la modulación efectora pero no la activación de la proteína G en las condiciones de ensayo examinadas. El hallazgo de que la inhibición máxima de la adenilil ciclasa por el agonista KOR se vio afectada por la expresión de osFosB sugiere una baja reserva de receptores para la respuesta mediada por KOR, consistente con los bajos niveles de sitios de unión de KOR en el cerebro de ratón (Unterwald, et al., 1991). En contraste, CB1La actividad de la proteína G mediada por R y la inhibición de la adenilil ciclasa no se vieron afectadas por la expresión de ΔFosB, sugiriendo que los sistemas opioides y cannabinoides difieren en su respuesta a ΔFosB en estas neuronas NAc.

El efecto de ΔFosB en la señalización mediada por receptores opioides es consistente con nuestro informe anterior de que la expresión de ΔFosB en el estriado alteró los efectos agudos y crónicos de la morfina (Zachariou, et al., 2006). Un hallazgo de ese estudio fue que los ratones con expresión transgénica de ΔFosB en dinorfina / D1Las neuronas estriadas R fueron más sensibles a la morfina en lugar del acondicionamiento que los controles. Además, este efecto fue imitado por la expresión mediada por virus de ΔFosB por inyección específica del sitio en el NAc. Estas observaciones concuerdan con los resultados actuales que muestran una señalización MOR mejorada en la NAc.

Anteriormente identificamos la codificación del gen. dynorphin como objetivo de ΔFosB, y propuso que la reducción de dynorphin sería coherente con las propiedades gratificantes mejoradas de la morfina en ratones bitransgenic ΔFosB (Zachariou, et al., 2006). Los resultados actuales muestran que la inhibición mediada por KOR de la adenilil ciclasa en la NAc se potencia en los ratones que expresan BFosB, lo que podría reflejar un aumento compensatorio en la sensibilidad de KOR después de una reducción de la dinorfina. Estudios anteriores han demostrado que el KOR estaba regulado al alza en ciertas regiones del cerebro de ratones knockout para la prodinorfina, incluida la NAc (Clarke, et al., 2003).

En contraste con ΔFosB, la expresión transgénica inducible de ΔcJun, el mutante truncado negativo dominante de la pareja de unión de osFosB cJun, no alteró la inhibición de la adenilil ciclasa por los agonistas de MOR o KOR. Estos resultados sugieren que los niveles basales de expresión de BFosB, que son relativamente bajos, no desempeñan un papel significativo en el mantenimiento de la señalización del receptor opioide en este nivel de transducción de señales en la NAc. El hecho de que el efecto gratificante condicionado de la morfina se redujo en la expresión ΔcJun en nuestro estudio anterior (Zachariou, et al., 2006) sugiere que la inducción de morfina de ΔFosB durante el procedimiento de acondicionamiento es importante para regular las respuestas de comportamiento al fármaco o que los efectos transcripcionales de ΔFosB distintos de los que afectan la señalización proximal por los receptores opioides podrían influir en la recompensa de los opioides. En cualquier caso, los resultados del presente estudio muestran claramente que, cuando la expresión de ΔFosB se eleva por encima de los niveles basales en dinorfina del estriado / D1Las neuronas que expresan R, hay un aumento robusto en el acoplamiento de MOR y KOR a la inhibición de la adenilil ciclasa en la NAc.

Los mecanismos por los cuales la señalización mediada por MOR y KOR se ven mejorados por la sobreexpresión de BFosB no están claros, pero anteriormente hemos demostrado que los niveles de MOR, evaluados por [3La unión de H] naloxona, no es diferente en el NAc de ΔFosB en ratones frente a fuera (Zachariou, et al., 2006). El mismo estudio encontró que GαiLos niveles de proteína 1 y 2 no se vieron afectados en esta región por la expresión de ΔFosB. Sin embargo, los análisis de matriz de expresión de genes anteriores mostraron que Gαo El ARNm fue regulado al alza en NAc de ΔFosB en ratones (McClung y Nestler, 2003). Será de interés en futuros estudios examinar exhaustivamente el efecto de la expresión de ΔFosB transgénica en la expresión de la subunidad de la proteína G a nivel de la proteína, así como en la expresión de muchas proteínas moduladoras de la proteína G.

Es interesante que la expresión de ΔFosB no mejoró CB1Señalización mediada por R en el NAc. Es posible que alteraciones en CB.1La señalización de R se produce en una población discreta de neuronas que se oculta en toda la preparación de NAc. Por ejemplo, la administración de Δ9- El THC indujo significativamente ΔFosB en el núcleo, pero no en la cáscara, del NAc (Perrotti, et al., 2008). yoDe hecho, se ha demostrado que desafía con Δ9-THC después de la administración repetida de Δ9-THC aumentó la liberación de dopamina en el núcleo de NAc, pero disminuyó la liberación en la cáscara (Cadoni, et al., 2008). También es importante tener en cuenta que la línea 11A de ratones bitransgenicos expresa ΔFosB solo en dinorfina / D1R neuronas espinosas medianas positivas del estriado, pero CB1R se expresan en ambas dinorfinas / D1R y encefalina / D2R neuronas del estriado positivas (Hohmann y Herkenham, 2000), así como en terminales de aferentes corticales (Robbe, et al., 2001). La expresión del regulador negativo dominante de la transcripción mediada por ΔFosB, ΔcJun, tampoco tuvo un efecto significativo en la señalización del receptor de cannabinoides, aunque ΔcJun se expresa de forma indistinta en ambos D1 y D2-con poblaciones de neuronas espinosas medias en estos ratones (Peakman, et al., 2003). Sin embargo, es posible que la expresión basal de ΔFosB sea lo suficientemente baja para que ΔcJun no afecte a la señalización del receptor, como lo sugieren los resultados con MOR y KOR. También es posible que CB1La señalización R se mejora modestamente por la expresión basal de ΔFosB, de modo que el aumento de la expresión de ΔFosB o el bloqueo de sus acciones con ΔcJun solo tuvo efectos leves que no alcanzaron el nivel de significación estadística. El soporte indirecto para esta interpretación se puede ver comparando WIN55,212-2 EC50 valores entre ratones que expresan ΔcJun contra ΔFosB. La relación de la WIN55,212-2 EC50 valor de la inhibición de la adenilil ciclasa en ratones con expresión inducida de ΔcJun a su EC50 el valor para la activación de la proteína G en ratones con expresión inducida de ΔFosB fue 4.0, mientras que la misma proporción en ratones sin inducción de cualquier transgén fue 1.2.

Alternativamente, los cannabinoides pueden inducir la expresión de ΔFosB sin ningún efecto directo en CB1R señalización. En este escenario, los cannabinoides podrían modular la capacidad de respuesta a los efectos psicoactivos de otras drogas a través de la regulación transcripcional mediada por BFosB. yoDe hecho, la administración de Δ9-THC produce sensibilización cruzada a los opioides y anfetaminas (Cadoni, et al., 2001, Lamarque, et al., 2001), consistente con esta hipótesis. Además, se informó que la administración repetida del agonista de cannabinoides CP55,940 incrementa la activación de la proteína G mediada por MOR en la NAc, de forma similar a los ratones que expresan ΔFosB de forma inducible en el presente estudio (Vigano, et al., 2005). El efecto de expressionFosB expresión en Δ9-Los comportamientos mediados por THC no se han evaluado, pero los resultados actuales no excluyen una interacción. Los resultados de este y nuestro estudio anterior (Zachariou, et al., 2006) muestran las alteraciones inducidas por BFosB en MOR y KOR / dinorfina en el estriado. Los efectos gratificantes de Δ9-THC, según la preferencia de lugar, se eliminan en los ratones nulos MOR, mientras que la eliminación de KOR se atenúa Δ9-THC lugar aversión y reveló Δ9-THC preferencia de lugar (Ghozland, et al., 2002). Del mismo modo, condicionó el lugar aversión a Δ9-THC está ausente en el knockout pro-dinorfina en comparación con los ratones de tipo salvaje (Zimmer, et al., 2001). Estos datos sugieren que Δ9-THC podría ser más gratificante después de la inducción de ΔFosB y la consiguiente inducción de la señalización de MOR con reducciones en la expresión de la dinorfina.

En resumeny, los resultados de este estudio mostraron que la expresión de ΔFosB en D1Las neuronas del estriado positivas para R / dinorfina mejoraron la señalización mediada por MOR y KOR a nivel de la inhibición mediada por la proteína G de la actividad de la adenilil ciclasa en el NAc. Este hallazgo es consistente con los estudios que han demostrado un papel para el sistema opioide endógeno en la recompensa (Trigo, et al., 2010), y proporcionan un mecanismo potencial para los efectos mediados de BFosB en la recompensa. En contraste, CB1La señalización mediada por R en el NAc no se vio afectada significativamente por la expresión de osFosB estriatal en las condiciones examinadas, aunque se requieren estudios adicionales para determinar el efecto de la inducción de ΔFosB en el sistema endocannabinoide.

Reseña de la investigación

  • La señalización de MOR se mejora en el núcleo accumbens de ratones que expresan ΔFosB
  • La inhibición de KOR de la adenilil ciclasa también se potencia en ratones que expresan ΔFosB
  • Expresión de ΔFosB no altera CB1Señalización R en el núcleo accumbens.
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Material suplementario

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Agradecimientos

Los autores agradecen a Hengjun He, Jordan Cox y Aaron Tomarchio por la asistencia técnica con el [35S] ensayos de unión a GTPγS. Este estudio fue apoyado por USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) y P01 DA08227 (EJN).

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Notas a pie de página

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