PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Resumen
Las alteraciones inducidas por la cocaína en la expresión génica causan cambios en la morfología neuronal y el comportamiento que puede ser la base de la adicción a la cocaína. Identificamos un papel esencial para la dimetilación de la lisina 3 lisina 9 (H3K9) y la lisina dimetiltransferasa G9a en la plasticidad estructural y conductual inducida por la cocaína. La administración repetida de cocaína redujo los niveles globales de dimetilación H3K9 en el núcleo accumbens. TSu reducción en la metilación de las histonas fue mediada por la represión de G9a en esta región del cerebro, que estaba regulada por el factor de transcripción inducido por la cocaína ΔFosB. Usando la mutagénesis condicional y la transferencia de genes mediada por virus, encontramos que la regulación negativa de G9a incrementó la plasticidad de la columna dendrítica de las neuronas del núcleo accumbens y aumentó la preferencia por la cocaína, estableciendo así un papel crucial para la metilación de las histonas en las acciones a largo plazo de la cocaína.
Introducción
La exposición repetida a la cocaína se caracteriza por cambios persistentes en la expresión génica y una morfología neuronal alterada dentro del núcleo accumbens (NAc), un componente clave de los circuitos de recompensa del cerebro (1–2). La remodelación de la cromatina es importante en los cambios transcripcionales aberrantes en esta región del cerebro que pueden ser la base de algunos aspectos de la adicción a la cocaína. (3–9). La regulación de la cocaína de la estructura de la cromatina en la NAc resulta, en parte, de modificaciones directas inducidas por la cocaína de la maquinaria enzimática de la cromatina, lo que lleva a cambios en la acetilación y fosforilación de las histonas (4, 7–9); sin embargo, aún no se han investigado las funciones de las enzimas que controlan la metilación de las histonas.
Un análisis reciente del promotor de todo el genoma utilizando inmunoprecipitación de cromatina acoplada a micromatrices (ChIP-Chip) identificó patrones alterados de histona represiva H3 lisina 9 (H3K9) y 27 (H3KX27) en promotores específicos del gen en el NAc posterior a la cocaína6). Por lo tanto, perfilamos numerosas lisina metiltransferasas (KMT) y desmetilasas (KDM) que se sabe que controlan la metilación H3K9 o H3K27 (Fig. 1A). Solo dos enzimas, G9a y GLP, mostraron una regulación transcripcional persistente 24 horas después de la administración repetida de cocaína, cuando la expresión de ambos genes se redujo significativamente.. Debido a que G9a y GLP catalizan específicamente la dimetilación de H3K9 (H3K9me2), su regulación por disminución por la cocaína es consistente con la disminución de los niveles globales de H3KX9me2 meucromático observado en este momentoFig. 1B). En contraste, los niveles globales de metilación heterocromática H3K27 permanecieron inalterados por la exposición repetida a la cocaína (Fig. S1 en soporte de material online.). Debido a sus altos niveles de actividad catalítica tanto in vitro y in vivo (10), nos propusimos investigar más a fondo la importancia funcional de la represión de G9a después de la exposición repetida a la cocaína en la NAc. Los niveles de proteína G9a, al igual que los niveles de su ARNm, se redujeron significativamente 24 horas después de la administración repetida de cocaína (Fig. S2). Aunque la expresión del ARNm de G9a se redujo en un 35% en el NAc, el análisis inmunohistoquímico reveló una reducción más modesta del 15% en los niveles de proteína G9a, consistente con la disminución observada del 21 en el H3K9me2 después de la administración repetida de cocaína (Fig. 1B). La expresión del ARNm de G9a también se reguló a la baja en esta región del cerebro en un 20% luego de una autoadministración repetida de cocaína (Fig. S3).
Para identificar si los cambios en H3K9me2 eucromático se correlacionan con las alteraciones de todo el genoma en la expresión de genes en la NAc, empleamos análisis de microarrays para examinar los perfiles de expresión de genes inducidos por una dosis de cocaína de prueba en animales con o sin antecedentes de exposición previa a la cocaína (ver suplemento listas de genes en Tablas S1 – S3). Los animales que habían recibido cocaína repetida mostraron un aumento dramático en la expresión de genes 1 hora después de un desafío con cocaína en comparación con los animales tratados en forma aguda (Fig. 1C). Este aumento de la expresión génica todavía se produjo en respuesta a un desafío de cocaína administrado después de la semana de retiro de la cocaína 1. De acuerdo con los informes anteriores, un pequeño porcentaje de genes (~ 10%) mostró respuestas transcripcionales desensibilizadas luego de la administración repetida de cocaína (Fig. 1C; ver Tabla S1) (5). Para investigar directamente el papel de la regulación negativa de G9a en la expresión génica aumentada observada después de la cocaína repetida, los ratones recibieron inyecciones intra-NAc de vectores del virus del herpes simple (HSV) que expresaban GFP o G9a y se trataron con solución salina o cocaína repetida para determinar si la sobreexpresión de G9a fue suficiente para bloquear el aumento repetido inducido por la cocaína de la expresión génica. De un conjunto de genes seleccionados al azar de 12 que muestran niveles elevados de expresión después de la cocaína repetida, observamos que G9a redujo significativamente la expresión aumentada del 50% de estos genes (Tabla S4).
Para identificar los eventos transcripcionales en la parte alta que median la represión repetida de la expresión de G9a inducida por la cocaína, investigamos un posible papel para el ΔFosB, un producto de empalme altamente estable del gen inmediato inmediato FOC. ΔFosB se acumula en la NAc después de la exposición repetida a la cocaína, donde se ha relacionado con una mayor recompensa de la cocaína (11). ΔFosB puede actuar como activador transcripcional o represor dependiendo del gen objetivo involucrado (3, 5, 6, 12). Usando NSE bitransgenicotTA × tetOP-ΔFosB ratones, en los que la expresión de ΔFosB se puede inducir selectivamente en la NAc y el cuerpo estriado dorsal de animales adultos (13), examinamos el impacto de la expresión de ΔFosB en la regulación de la cocaína de H3K9me2 y KMT en la NAc. OverLa sobreexpresión de FosB fue suficiente para reducir los niveles de ambos H3K9me2 (Fig. 1D) y la expresión G9a (Fig. 1E), imitando así los efectos de la cocaína repetida. En contraste, ΔFosB no redujo la expresión de GLP en esta región del cerebro y no tuvo ningún efecto en SUV39H1 y EZH2, las principales enzimas de trimetilación para H3K9 y H3XX27, respectivamente (Fig. S4). Para confirmar estos datos utilizando un sistema de sobreexpresión de ΔFosB independiente, los ratones adultos de tipo salvaje recibieron inyecciones bilaterales intra-NAc de vectores de virus asociados a Adeno (AAV) que expresan GFP o ΔFosB. La sobreexpresión de ΔFosB mediada por virus disminuyó los niveles de expresión de G9a en esta región del cerebro (Fig. 1E).
Dicha regulación tan pronunciada y específica de G9a nos llevó a investigar si la alteración de la expresión de G9a específicamente en las neuronas NAc regula las respuestas de comportamiento a la cocaína. Los ratones de tipo salvaje recibieron inyecciones intra-NAc de vectores de HSV que expresan GFP o G9a y luego se analizaron utilizando un paradigma de preferencia de lugar condicionado imparcial con cocaína, que proporciona una medida indirecta de la recompensa de la droga. La sobreexpresión viral de G9a en neuronas NAc se confirmó después de las pruebas de comportamiento (Fig. 2A). La sobreexpresión de G9a disminuyó significativamente la preferencia por la cocaína en comparación con los animales que sobreexpresan GFP (Fig. 2B), y aumento de los niveles de H3K9me2 en el NAc (Fig. 2C). Sobreexpresión de un mutante catalíticamente muerto de G9a (G9aH1093K) (14) no afectó la preferencia de cocaína (Fig. 2B) y no afectó los niveles de H3K9me2 en esta región del cerebro (Fig. 2C).
Para seguir estudiando el papel de G9a en los efectos de comportamiento de la cocaína, y más específicamente para imitar la represión repetida de G9a inducida por la cocaína en el NAc, G9a adultofl / fl ratones14) recibió inyecciones intra-NAc de vectores de AAV que expresan Cre recombinasa o GFP como control. Caída de AAV-Cre de G9a en la NAc, que se confirmó inmunohistoquímicamente (Fig. S5), aumentó significativamente los efectos de los experimentos de acondicionamiento de cocaína en el lugar y redujo los niveles de H3K9me2 en el NAc (Fig. 2D, E). Un inhibidor farmacológico disponible comercialmente de G9a y GLP, BIX01294 (15–16), se utilizó para determinar si la inhibición de la enzima afecta de manera similar las respuestas de comportamiento a la cocaína. De hecho, la inhibición farmacológica de G9a y GLP aumentó significativamente la preferencia por la cocaína y disminuyó H3K9me2 en el NAc (Fig. 2F, G).
La administración repetida de cocaína aumenta la densidad de las espinas dendríticas en las neuronas espinosas medianas NAc (17), un proceso asociado con cambios funcionales en las sinapsis glutamatérgicas excitadoras en estas neuronas (18–19) y respuestas de comportamiento sensibilizadas al fármaco (17, 20). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la regulación a la baja de la actividad G9a en la NAc por la cocaína repetida podría mediar la capacidad de la cocaína para regular la densidad de la columna dendrítica de las neuronas NAc. Usando la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con un anticuerpo anti-G9a, identificamos varias dianas supuestas del gen G9a en la NAc, cada una de las cuales se ha relacionado previamente con la plasticidad dendrítica inducida por la cocaína (Fig. 3A) (20–26). Encontramos que la administración repetida de cocaína disminuyó significativamente la unión de G9a, así como los niveles de H3K9me2, en estos promotores de genes (Fig. 3B). En contraste, la administración de cocaína aguda reclutó rápidamente G9a para algunos de estos mismos promotores genéticos, lo que es compatible con una mayor expresión de G9a observada en la hora NAc 1 después de una dosis aguda de cocaína (Fig. S6). Aunque la unión de G9a a promotores de genes específicos se correlaciona con cambios en su expresión, sigue sin estar claro si tales eventos están mediados por niveles globales alterados de G9a en la NAc y / o por diferencias en el reclutamiento de G9a después de un ataque agudo. vs Administración repetida de la cocaína.
Sobre la base de la regulación de G9a de numerosos genes relacionados con la plasticidad en la NAc, examinamos directamente si el mantenimiento de la expresión de G9a en esta región del cerebro después del tratamiento repetido con cocaína era suficiente para bloquear la formación de la columna dendrítica inducida por la cocaína. El uso de un protocolo de tratamiento de cocaína previamente demostrado para promover la inducción de la columna dendrítica en la NAc (20), examinamos la densidad de la columna vertebral en animales inyectados con HSV-GFP o HSV-G9a. De acuerdo con los hallazgos anteriores, observamos un aumento significativo en la densidad de la columna dendrítica en la NAc después del tratamiento con cocaína, un efecto que fue bloqueado completamente por la sobreexpresión de G9a (Fig. 3C). La sobreexpresión de G9a sola no fue suficiente para disminuir la densidad de la columna dendrítica NAc en ausencia de cocaína. Para complementar estos datos, G9afl / fl Los ratones recibieron inyecciones intra-NAc de HSV-Cre y la densidad de la columna vertebral se cuantificó y comparó con los animales que recibieron HSV-GFP en ausencia de cocaína. La reducción de la expresión de G9a aumentó significativamente la densidad de la columna vertebral en las neuronas espinosas del medio NAc (Fig. 3C).
Dada la evidencia de que la regulación a la baja de G9a en la NAc después de la repetida cocaína está mediada por ΔFosB, a continuación examinamos si este factor de transcripción está igualmente involucrado en la regulación de las espinas dendríticas de NAc. Aunque ΔFosB no se ha vinculado previamente de manera causal a esa plasticidad dendrítica, varios de sus objetivos, incluidas las subunidades Cdk5 y NFκB, han estado tan implicados. (20–23), y la expresión persistente de ΔFosB en las neuronas NAc se correlaciona con una mayor densidad de la columna dendrítica después del tratamiento repetido con cocaína (27). Primero, encontramos que la inducción de ΔFosB en ratones bitransgenicos en ausencia de cocaína, que regulaba a la baja la expresión de G9a y H3K9me2 (Fig. 1D, E), disminución de la unión de G9a a numerosos genes relacionados con la plasticidad, muchos de los cuales también han demostrado ser dianas directas del propio ΔFosB (Fig. 3D) (3, 6). Luego mostramos que la sobreexpresión viral de ΔFosB en la NAc incrementó significativamente la densidad de la columna dendrítica en condiciones basales, similar a la observada tras la administración repetida de cocaína (Fig. 3E). A la inversa, la sobreexpresión en la NAc de ΔJunD, una proteína mutante negativa dominante que antagoniza la actividad transcripcional de ΔFosB, bloqueó la capacidad de la cocaína repetida para aumentar la formación de la columna dendrítica en la NAc (Fig. 3C).
Nuestra observación de que ΔFosB regula la expresión de G9a en la NAc, y que ΔFosB y G9a regulan algunos de los mismos genes objetivo, nos llevó a examinar otras interacciones entre ΔFosB y G9a. Después de la cocaína aguda, cuando aumentaron los niveles de G9a, la unión de G9a a FOC el gen aumentó, mientras que después de la cocaína repetida, cuando se suprimió la expresión de G9a, la unión de G9a a FOC el gen fue disminuido (Fig. 3A). Tal disminución de la unión de G9a después de la cocaína repetida no se observó durante c-fos, donde la unión a G9a aumenta con la cocaína repetida (Fig. S7). Esto es consistente con el hecho de que, a diferencia de FOC, c-fos Es reprimido, no inducido, por exposición crónica a psicoestimulantes (5). La sobreexpresión de BFosB en ratones bitransgenicos fue suficiente para disminuir significativamente la unión de G9a a Fosb gen (Fig. 3D). Además, la sobreexpresión de G9a fue suficiente para reducir el aumento de la expresión de ΔFosB después de la administración repetida de cocaína (Tabla S4). Estos datos sugieren un ciclo autorregulador mediante el cual G9a inicialmente limita la inducción de ΔFosB por la administración aguda de cocaína. Sin embargo, como ΔFosB se acumula con la exposición repetida al fármaco, reprime G9a y, por lo tanto, potencia su propia inducción adicional.
En conclusión, hemos demostrado que la metilación de la lisina de la histona en la NAc está involucrada de manera crítica en la regulación de la expresión génica neuronal en respuesta a la cocaína. La represión de G9a y H3K9me2 después de la administración repetida de cocaína promueve la preferencia de la cocaína, en parte, a través de la activación transcripcional de numerosos genes conocidos para regular formas aberrantes de plasticidad dendrítica. Obtener una mejor comprensión de los genes regulados a través de dichos mecanismos mejorará nuestro conocimiento de las complejas bases biológicas de la adicción a las drogas y podría ayudar en el desarrollo de tratamientos más efectivos para los trastornos adictivos.
Materiales y Métodos
Animales y tratamientos
A menos que se indique lo contrario, los ratones se alojaron de cuatro a cinco por jaula en una colonia con un ciclo de luz / oscuridad 12 (luces encendidas de 7: 00 AM a 7: 00 PM) a temperatura constante (23 ° C) con ad libitum Acceso a agua y comida. Todos los protocolos para animales fueron aprobados por IACUC en UT Southwestern Medical Center y en Mount Sinai School of Medicine.
Para los experimentos con cocaína [inmunohistoquímica, western blotting, PCR cuantitativa (qPCR), análisis de micromatrices e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)], se utilizaron ratones C8BL / 10J de 57 a 6 semana de edad. Los animales recibieron inyecciones diarias de solución salina (tratamientos salinos 7, ip), cocaína "aguda" (tratamientos salinos 6 + tratamiento 20 mg / kg cocaína-HCl, ip) o cocaína "repetida" (tratamientos 7 20 mg / kg cocaína-HCl, ip). Los ratones se sacrificaron a la hora 1 o a las horas 24 después del tratamiento final. Para los estudios de micromatrices, los animales se trataron diariamente con solución salina (15, salina, ip), cocaína 'aguda' (14, solución salina + tratamiento 1 20 mg / kg cocaína-HCl, ip), cocaína 'repetida + aguda' ( Tratamientos con 7 solución salina + tratamientos con 8 20 mg / kg cocaína-HCl, ip) o 'abstinencia repetida + cocaína aguda' (tratamientos 7 20 mg / kg cocaína-HCl + tratamientos 7 solución salina + tratamiento 1 de provocación 20 mg / kg cocaína-HCl ip) y se sacrificaron 1 hora después del tratamiento final. En experimentos de comportamiento, los ratones se alojaron individualmente después de la cirugía y se trataron con 10 mg / kg de cocaína-HCl, ip como se describe a continuación. Para el análisis de la columna dendrítica y la validación de micromatrices después de la infección por HSV-GFP y HSV-G9a-GFP, los ratones se trataron con 'solución salina' (tratamientos con solución salina 5, ip) o 'cocaína repetida' (tratamientos 5 20 mg / kg de cocaína-HCl, ip ) en el transcurso de los días 3, ya que se ha demostrado previamente que este protocolo de inyección aumenta la densidad de la columna vertebral en las neuronas del núcleo accumbens (NAc) dentro del período de tiempo de la expresión transgénica del virus Herpes simplex (HSV) (Ref. Suplementario S1). Los ratones utilizados para el análisis de la columna dendrítica se sacrificaron 4 horas después del último tratamiento.
Para inducir la eliminación local de la transcripción de G9a restringida a neuronas NAc, utilizamos ratones mutantes homocigotos para un alelo de G9a floxed, que se han descrito en detalle en otra parte (S2). La recombinación inducida por Cre produce un exón 22 a 25 de empalme fuera de marco que conduce a una desintegración mediada sin sentido de la transcripción mutada. Utilizamos ratones flotantes G9a que se cruzaron completamente con ratones C57BL / 6J. Los ratones se inyectaron de forma esterotaxica en el NAc con vectores de virus asociados a Adeno (AAV) (serotipo 2) que expresan GFP o Cre-GFP entre la edad de 7 y 10 semanas. El análisis inmunohistoquímico se utilizó para verificar la eficacia de la recombinación mediada por Cre (ver Fig. S5 suplementario). Usamos animales inyectados con AAV 21 días después de la cirugía porque la recombinación en ratones floxed G9a fue estable y máxima en este punto de tiempo, de acuerdo con los informes publicados (S3–S4). Los experimentos de sobreexpresión de G9a y ΔJunD se realizaron de manera similar utilizando vectores de virus de HSV que expresan GFP, G9a-GFP de tipo salvaje, G9aH1093K-GFP de tipo salvaje o ΔJunD-GFP (consulte S2 para detalles sobre el desarrollo de construcciones G9a). Los ratones con sobreexpresión de HSV se utilizaron 3 días después de la cirugía, ya que la sobreexpresión fue máxima en este momento, según se observó a través de la inmunohistoquímica. Debido a la naturaleza transitoria de la expresión de HSV, y la naturaleza considerablemente más estable de la expresión de AAV, se usaron vectores de HSV en experimentos que requerían una rápida expresión de transgenes a corto plazo, mientras que los vectores de AAV se usaron en experimentos que requerían períodos prolongados de expresión de transgén. Se ha demostrado que ambos vectores, en estudios previos extensos, infectan solo cuerpos de células neuronales dentro del área del cerebro inyectado, sin ninguna infección de neuronas aferentes o eferentes.
Para los experimentos de comportamiento que utilizan el inhibidor farmacológico de G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), los ratones se implantaron de forma estereotáxica con dos minibombas subcutáneas, así como cánulas de guía bilaterales, en la NAc. Las minibombas se activaron 12 horas antes de la implantación iniciando el suministro continuo (0.25 μl / hora) de cualquiera de los vehículos (5 hidroxipropil β-ciclodextrina) o medicamento durante los días 14, durante los cuales se realizaron evaluaciones de comportamiento.
Para los experimentos de sobreexpresión de ΔFosB [western blotting, qPCR, y ChIP], NSE bitransgenic masculinotTA × tetOP–ΔFosB se utilizaron ratones (10 de una semana de edad), por lo que en ausencia del derivado de tetraciclina doxiciclina (8 semanas fuera de la doxiciclina), los animales mostraron una expresión constitutiva restringida estriatal robusta de ΔFosB (S5). La sobreexpresión de BFosB en estos ratones se confirmó a través de qPCR. Para confirmar los resultados utilizando NSE-tTA × tetOP–ΔFosB ratones, de tipo silvestre 8 de una semana de edad, los ratones C57BL / 6J fueron inyectados de forma esteroxica intra-NAc con vectores de AAV que expresan GFP o ΔFosB-GFP. Los vectores de AAV se utilizaron, en este caso, para garantizar la máxima expresión de ΔFosB en las semanas 8 posteriores a la cirugía, lo que permite una comparación directa entre los ratones con sobreexpresión de ΔFosB infectados por virus y transgénicos. La sobreexpresión viral se confirmó mediante qPCR en las semanas 8 posteriores a la cirugía (los punzones NAc de calibre 15 se diseccionaron en el lugar de la inyección). Los ratones con sobreexpresión de AAV-GFP y AAV-ΔFosB-GFP que no se usaron para la qPCR se trataron con solución salina (tratamientos con 14, solución salina, ip) o cocaína repetida (tratamientos con 14 30 mg / kg de cocaína-HCl, ip) a partir de las 6 semanas después cirugía. Los días de 4 después del tratamiento final, los cerebros se fijaron con 4% paraformaldehído, se seccionaron en un vibratome y se usaron para el análisis de la columna dendrítica.
Análisis de Western Blot
Los punzones NAc de calibre 14 se tomaron de secciones coronales de 1 mm obtenidas usando una matriz de cerebro de ratón de acero inoxidable y se sonicaron en tampón de lisis 1 M HEPES (1% SDS) que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa. 10–Las muestras de 30 μg de proteína total se sometieron a electroforesis en geles 18% SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y se incubaron con anti-H3K9me2 (ratón monoclonal, 1: 500), anti-β-tubulina (ratón monoclonal, 1: 60,000), anti-total H3 (conejo policlonal, 1) anti-GFP (utilizado para verificar la expresión viral igual en tejido punzonado) (policlonal de conejo, 5,000: 1), anti-H1000K3me27 (policlonal de conejo, 3: 1) o anticuerpos anti-actina (ratón monoclonal, 500: 1: 60,000: 4: 5: 5: 1: 15,000: XNUMX ° C (todas las membranas se bloquearon en XNUMX% de leche o XNUMX% de albúmina de suero bovino). Las membranas se incubaron luego con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (XNUMX: XNUMX–1: 60,000 dependiendo del anticuerpo primario usado) y las bandas se visualizaron utilizando el sustrato SuperSignal West Dura. Las bandas se cuantificaron con el software NIH Image J y las bandas H3K9me2 se normalizaron con actina o β-tubulina y con la histona total H3 para controlar la carga igual. La cocaína repetida no tuvo efecto en los niveles de actina (Fig. S8) o histona total 3 (Fig. S1) en el NAc. Además, la infección por HSV-G9a-GFP y HSV-G9aH1093K-GFP no tuvo ningún efecto sobre los niveles totales de β-tubulina en la NAc (Fig. S8).
Inmunohistoquímica
Los ratones se sedaron con una dosis letal de hidrato de cloral y se perfundieron con 4% de paraformaldehído antes de ser analizados por inmunohistoquímica simple o doble como se describió anteriormente (S6). Brevemente, los cerebros posfigurados se incubaron a temperatura ambiente durante la noche en 30% de sacarosa antes de seccionarlos a 35 μm (los cerebros utilizados para el análisis de la columna dendrítica se seccionaron en un vibratome en las secciones de 100 μm en ausencia de 30% de sacarosa). Las secciones de NAc que flotaban libremente se lavaron con 1X PBS, se bloquearon (3% de suero de burro normal, 0.1% tritonX, 1X PBS) y luego se incubaron con anti-GFP (pollo policlonal, 1: 8000) y / o anti-G9a (policlonal de conejo). , 1: 500) anticuerpos en solución de bloqueo. Las secciones analizadas en busca de espinas dendríticas se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-GFP en 1: 200. Después de la incubación durante la noche, las secciones de NAc se enjuagaron 3 veces durante 10 minutos con 1X PBS, seguido de incubación con Cy2 y / o Cy3 anticuerpos secundarios acoplados a fluorescentes en solución de bloqueo de 1X PBS durante 2 horas. Las secciones utilizadas para los estudios de morfología se incubaron en un anticuerpo secundario durante la noche a temperatura ambiente. La co-tinción nuclear se logró mediante la incubación de secciones en 1X PBS que contenía DAPI (1: 50,000) durante 10 minutos. Las secciones se lavaron de nuevo, seguidas de deshidratación con etanol y se montaron con DPX. Se tomaron imágenes de todas las secciones utilizando microscopía confocal.
Aislamiento de ARN y qPCR
Se homogeneizaron punzones NAc bilaterales de calibre 14 en Trizol y se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se purificó con RNAesy Micro columnas y la espectroscopía confirmó que las raciones de ARN 260/280 y 260/230 eran> 1.8. A continuación, se realizó una transcripción inversa del ARN usando un kit Bio-Rad iScript. El ADNc se cuantificó mediante qPCR usando SYBR Green. Cada reacción se ejecutó por duplicado o triplicado y se analizó siguiendo el método ΔΔCt como se describió anteriormente utilizando gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de normalización (S7). Ver Tabla suplementaria S5 para secuencias de cebadores de ARNm.
Análisis de microarrays de ADN
Se utilizaron cuatro grupos (réplicas biológicas independientes de 3 por grupo) para el estudio de micromatrices, totalizando los micromatrices de 12. La hora 1 después de la última inyección de cocaína, los animales se decapitaron rápidamente y los cerebros se retiraron y se colocaron en hielo. Las disecciones de NAc se tomaron utilizando un punzón de aguja de calibre 15 y se congelaron rápidamente en hielo seco hasta que se extrajo el ARN. Se combinaron los punzones bilaterales de cuatro animales por réplica, totalizando ratones 12 por grupo. El aislamiento de ARN, el procesamiento de microarrays y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente (S8). Brevemente, se aisló y purificó el ARN como se describió anteriormente y se verificó su calidad usando el bioanalizador de Agilent. La transcripción inversa, la amplificación, el etiquetado y la hibridación con matrices Illumina MouseWG-6 v2.0 se realizaron utilizando procedimientos estándar mediante el núcleo de microarrays de UT Southwestern. Los datos brutos se restaron de fondo y se normalizaron cuantiles usando el software Beadstudio. Los datos normalizados se analizaron utilizando el software GeneSpring y las listas de genes se generaron utilizando criterios de significación de un punto de corte de cambio de 1.3 veces junto con un punto de corte de valor p no estricto de p <0.05.
Mantenemos un alto grado de confianza en estos datos por varias razones. Primero, todos los animales fueron manipulados, tratados y sacrificados al mismo tiempo, en las mismas condiciones. Además, todo el procesamiento de ARN y matriz se realizó al mismo tiempo. En segundo lugar, realizamos matrices por triplicado y agrupamos múltiples animales por muestra de matrices, minimizando así las diferencias debidas a la variabilidad individual y aumentando el poder estadístico (S9). En tercer lugar, los criterios de análisis de datos utilizados para nuestro estudio están recomendados por el proyecto de control de calidad MicroArray, ya que estos criterios se han validado para proporcionar un alto grado de reproducibilidad entre sitios y reproducibilidad entre plataformas e intraplataforma (S10–S11).
Construcción de vectores virales.
Debido a las restricciones de tamaño de la inserción del vector viral, las secuencias de codificación para G9a de tipo salvaje (G9a) o G9a (G9aH1093K) catalíticamente muertas se subclonaron en el GFP de la mano de la parca del parque. el tamaño de inserción fue ~ 1005 kb, que excede el tamaño máximo de inserción para vectores AAV-9). El promotor IE3.96 / 2 controla la expresión de G4a. Los fragmentos se subclonaron en el plásmido p5 + HSV bicistrónico mediante ligaduras de extremos romos con PmeI tratado con Klenow y G9a digerido con EcoRI (de pcDNA1005) y p9 + tratado con CIP después de la digestión con EcoRI. Para la producción de HSV-ΔJunD-GFP, la secuencia de codificación de ΔJunD flanqueada por los sitios de restricción EcoRI se generó por PCR utilizando oligonucleótidos de cebador que contienen el sitio EcoRI. El producto de la PCR se ligó luego en el sitio EcoRI del vector p3.1 +. La expresión local de la recombinasa Cre en neuronas NAc se logró mediante el suministro de genes mediado por virus utilizando un vector AAV como se describe (S12). Se subclonó GFP o una fusión N-terminal de GFP a Cre en un vector AAV-2 recombinante que contiene un promotor de CMV con una secuencia de aceptor de donante de empalme y una señal de poliadenilación. Todas las inserciones de vectores se confirmaron mediante secuenciación dideoxi. Los vectores virales se produjeron utilizando un método de triple transfección, sin ayuda, como se describió anteriormente (S13). El virus purificado se almacenó a -80 ° C. La calidad viral se evaluó mediante el título infeccioso evaluado en células HEK293. Los virus AAV-ΔFosB-GFP se prepararon de manera similar. Para HSV-Cre, la expresión de Cre fue dirigida por un promotor IRES, a diferencia del promotor IE4 / 5, para minimizar la expresión de Cre y prevenir la toxicidad neuronal (ver S14 para la construcción viral). En todos los casos, se validó la sobreexpresión viral, tanto in vitro y en vivo, a través de qPCR, y se confirmó inmunohistoquímicamente que los virus mostraban expresión restringida por NAc después de la cirugía.
Cirugía estereotáxica
Bajo anestesia con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), los ratones se colocaron en un instrumento estereotáxico de animales pequeños y se expuso la superficie craneal. Se utilizaron treinta y tres agujas de jeringa de calibre para inyectar bilaterales 0.5 μl de virus en el NAc en un ángulo de 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) a una velocidad de 0.1 μl / min. Los animales que recibieron inyecciones de HSV se dejaron recuperar durante 2 días después de la cirugía, mientras que los ratones utilizados para las pruebas de comportamiento que recibieron vectores de AAV se dejaron recuperar durante 20 días antes de ser sometidos a un acondicionamiento del lugar. Estos tiempos son consistentes con los períodos de máxima expresión de transgén mediada por virus para los dos vectores. Para las infusiones de BIX01294, cada una de las dos mini-bombas se colocó por vía subcutánea en la parte posterior del ratón. Las colocaciones de las cánulas se lograron perforando dos pequeños orificios craneales por encima de la NAc, y mediante la entrega de la cánula desde bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Se permitió que los ratones se recuperaran de la cirugía de 4 a 5 días antes de comenzar el procedimiento de acondicionamiento del lugar para la cocaína como se describe a continuación.
Preferencia de lugar condicionado
El procedimiento de acondicionamiento del lugar se realizó como se describió anteriormente, con las siguientes modificaciones (S7). Brevemente, 3 días después de las infusiones intra-NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP o HSV-GFP, los ratones se colocaron en las cámaras de acondicionamiento, que constan de tres entornos distintos. Los ratones que mostraron una preferencia significativa por cualquiera de las dos cámaras de acondicionamiento fueron excluidos del estudio (<10% de todos los animales). Luego, los grupos de acondicionamiento se equilibraron para ajustar cualquier sesgo de la cámara que aún pueda existir. En los días siguientes, los animales fueron inyectados con solución salina y confinados en una cámara por la tarde durante 30 minutos y luego inyectados con cocaína (10 mg / kg, ip) y confinados durante 30 minutos a la otra cámara por la noche durante 2 días (dos salina y dos maridajes de cocaína). El día de la prueba, los ratones se volvieron a colocar en el aparato sin tratamiento durante 20 minutos y se probaron para evaluar qué lado preferían. Las respuestas locomotoras a la cocaína se evaluaron mediante interrupciones del haz en las cámaras emparejadas de cocaína para garantizar la eficacia del tratamiento antidrogas. Para los experimentos de CPP de AAV y BIX01294, se empleó un protocolo ligeramente modificado. Los animales fueron inyectados nuevamente con solución salina o cocaína (10 mg / kg, ip) y confinados en cámaras específicas durante sesiones de 30 minutos, pero en cambio solo fueron acondicionados una vez al día durante 4 días, seguido de la prueba el día 5 (los animales fueron acondicionados por la noche y se alternaron tratamientos de acondicionamiento). Para todos los grupos, se evaluó la locomoción inicial en respuesta a la solución salina para asegurar que la locomoción no se viera afectada por el tratamiento viral o inhibidor.
Autoadministración intravenosa de cocaína.
Se obtuvieron ratas macho Long-Evans adolescentes, que pesaban 230-250 g al comienzo del experimento. Fueron alojados en un ambiente controlado por humedad y temperatura en un ciclo de luz / oscuridad 12 de hora invertida (luces apagadas en 9: 00 am) con ad libitum Acceso a comida y agua. A las ratas se les permitió aclimatarse en su nuevo entorno y se manipularon diariamente durante 1 una semana antes del inicio del experimento. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Mount Sinai. El equipo de autoadministración se equipó con rayos infrarrojos para medir el comportamiento locomotor. La autoadministración se llevó a cabo como se describe anteriormente (S15-S16) con catéteres implantados en la vena yugular derecha bajo anestesia con isoflurano (2.4-2.7%). Los catéteres se lavaron con 0.1 ml de una solución salina que contenía 10 U de heparina y ampicilina (50 mg / kg). Después de una semana de recuperación de la cirugía, el entrenamiento de autoadministración comenzó durante la fase oscura del ciclo de luz / oscuridad. Se permitió a los animales un acceso diario de 3 horas a la cocaína (0.75 mg / kg / infusión) bajo un programa de refuerzo de proporción fija-1 (FR1), en el que 1 pulsación activa de la palanca resultó en una única infusión de fármaco. Las ratas estabilizaron su consumo de cocaína después de 6 días (<15% de variación en la tasa de respuesta durante 3 días consecutivos, con al menos 75% respondiendo con la palanca reforzada). 24 horas después de la sesión final de autoadministración, las ratas se decapitaron rápidamente, los cerebros se extrajeron rápidamente y se procesaron para el aislamiento de ARN y qPCR.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Los punzones NAc frescos se entrecruzaron con formaldehído y se prepararon para ChIP como se describió anteriormente (S17-S18) Con modificaciones menores. Brevemente, se recolectaron los punzones NAN de calibre 4 14 por animal (animales 5 agrupados por muestra), se reticularon con 1% de formaldehído y se apagaron con glicina 2 M antes de congelar a −80 ° C. 1 el día anterior a la sonicación de la muestra, se prepararon perlas magnéticas IgG anti-conejo / ratón (según el anticuerpo de precipitación) incubando las perlas magnéticas apropiadas con anti-G9a (grado de ChIP policlonal de conejo) o anti-H3K9me2 (grado de ChIP monoclonal de ratón) Anticuerpos durante la noche a 4 ° C bajo rotación constante en solución de bloque. La sonicación del tejido y la cizalladura de la cromatina se llevaron a cabo como se describió anteriormente (S17). Después de la sonicación, se transfirieron concentraciones iguales de cromatina a nuevos tubos y se guardó ~ 5% de los productos finales para que sirvieran como controles de "entrada". Después del lavado y la resuspensión minuciosos de las mezclas de perla / anticuerpo conjugado, se agregaron volúmenes iguales de mezclas de anticuerpo / perla (~ 7.5 μg de anticuerpo / muestra) a cada muestra de cromatina y se incubaron durante ~ 16 horas con rotación constante a 4 ° C. Las muestras se lavaron adicionalmente y se entrecruzaron a la inversa a 65 ° C durante la noche antes de la purificación del ADN utilizando un kit de purificación de PCR. Después de la purificación del ADN, las muestras se sometieron a qPCR y se normalizaron a los controles de "entrada" apropiados como se describió anteriormente (S17). También se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones normales de IgG de ratón usando un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón para controlar el enriquecimiento apropiado de la amplificación de la señal. Se utilizó adenina fosforribosiltransferasa (APRT) como control negativo para los experimentos de sobreexpresión de cocaína y ΔFosB. Ver Tabla suplementaria S5 para secuencias cebadoras promotoras.
Análisis de la columna dendrítica
Para estudiar el papel de G9a en la regulación de la morfología neuronal in vivo, utilizamos métodos descritos previamente con las siguientes modificaciones (S1). Tres días después de la inyección de HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (todos los virus se utilizaron en ratones C57Bl / 6J de tipo salvaje) o HSV-Cre-GFP (utilizado en G9afl / fl ratones), cuando la expresión viral fue máxima, los ratones se perfundieron, los cerebros se sometieron a crioprotección y luego se seccionaron a 100 μm en un vibratome. Las secciones se inmunotinieron luego utilizando un anticuerpo contra GFP como se describe anteriormente (ver Inmunohistoquímica). Para evaluar los efectos de la sobreexpresión y knockout de G9a en los números de la columna vertebral, así como el efecto de la sobreexpresión ΔJunD, medimos el número de espinas en las neuritas de 1-2 por neurona igual a 299 μm de dendritas secundarias de un medio NAc que expresa GFP Neuronas espinosas (MSNs). Dado que los MSN son morfológicamente distintos de otras poblaciones neuronales en el NAc, así como los informes anteriores que indican que el HSV infecta principalmente las neuronas que expresan DARPP-32 en esta región del cerebro (S19), confiamos en que los MSN se evaluaron exclusivamente en estos estudios. Para cada animal, examinamos las neuronas ~ 6 – 8 en animales 3 – 4 por grupo (grupos 7), después de lo cual se obtuvo un valor promedio para cada animal para el análisis estadístico. Los experimentos diseñados para examinar los efectos de la sobreexpresión de ΔFosB en la densidad de la columna vertebral NAc se realizaron de manera similar a la descrita anteriormente, con la excepción de que los vectores AAV se utilizaron para expresar GFP o ΔFosB-GFP durante períodos de tiempo prolongados (8 semanas). Todas las imágenes de HSV se capturaron utilizando un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite 100X (las imágenes de AAV se capturaron con un objetivo de inmersión en aceite 63X). Las imágenes se adquirieron con el conjunto de orificios en la unidad arbitraria 1 y un tamaño de trama 1024 × 1024. La longitud dendrítica se midió utilizando el software NIH Image J, y el experimentador principal contó los números de la columna vertebral a ciegas, ya que los portaobjetos se codificaron antes del escaneo experimental. Se calculó el número promedio de espinas por 10 μm de dendrita.
análisis estadístico
Se realizaron ANOVA de una y dos vías para determinar la importancia de la preferencia de lugar condicionada y el análisis de la columna dendrítica con más de dos grupos. Las pruebas t de Student se usaron para otras comparaciones que incluyen qPCR, Western Blot, análisis de columna dendrítica comparando HSV-GFP con HSV-Cre en G9afl / fl ratones, análisis de microarrays (ver más arriba) y experimentos de inmunoprecipitación de cromatina. Las pruebas t de Student planificadas se utilizaron después de un análisis ANOVA bidireccional de la densidad de la columna dendrítica después de la sobreexpresión de ΔFosB con la confirmación de los efectos principales significativos del tratamiento farmacológico y el virus. Todos los valores incluidos en las leyendas de las figuras representan la media ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Análisis estadísticos detallados para Figs. 1–3 en el texto principal se encuentran en: Leyendas detalladas de las figuras incluyendo estadísticas.
Notas a pie de página
Certifico que ninguno de los materiales incluidos en el manuscrito titulado Papel esencial de la histona metiltransferasa G9a en la plasticidad inducida por la cocaína han sido publicados anteriormente o están bajo consideración en otros lugares, incluso en Internet.
Todo el trabajo relacionado con el uso de animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales y de IACUC tanto en el Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas como en la Escuela de Medicina Mount Sinai.
referencias y notas
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