(HUMANO) Las respuestas de comportamiento y estructurales a la cocaína crónica requieren un ciclo de alimentación directa que involucre a la proteína quinasa II dependiente de calcio / calmodulina en la cubierta de Nucleus Accumbens (2013)

El factor de transcripción ΔFosB y la proteína kinasa II dependiente de calcio / calmodulina enriquecida en el cerebro (CaMKIIα) se inducen en el núcleo accumbens (NAc) por exposición crónica a cocaína u otras drogas de abuso psicoestimulantes, en las que las dos proteínas median las respuestas de drogas sensibilizadas . Aunque ΔFosB y CaMKIIα regulan la expresión y función del receptor de glutamato de AMPA en NAc, la formación de la columna dendrítica en neuronas espinosas del medio NAc (MSN) y la sensibilización locomotora a la cocaína, hasta la fecha no se ha explorado ningún vínculo directo entre estas moléculas. Aquí, demostramos que ΔFosB está fosforilado por CaMKIIα en el Ser27 estabilizador de proteínas y que CaMKII es requerido para la acumulación mediada por cocaína de ΔFosB en ratas NAc.

A la inversa, mostramos que ΔFosB es necesario y suficiente para la inducción de la cocaína de la expresión del gen CaMKIIα in vivo, un efecto selectivo para D₁de tipo MSN en la subregión de shell NAc.

Además, la inducción de espinas dendríticas en NAc MSN y el aumento de la respuesta conductual a la cocaína después de la sobreexpresión de NAc de ΔFosB son dependientes de CaMKII.

De manera importante, demostramos por primera vez la inducción de ΔFosB y CaMKII en la NAc de adictos a la cocaína humana, sugiriendo posibles objetivos para futuras intervenciones terapéuticas. Estos datos establecen que ΔFosB y CaMKII se involucran en un circuito de avance directo positivo específico para el tipo de célula y el cerebro como un mecanismo clave para regular los circuitos de recompensa del cerebro en respuesta a la cocaína crónica.

Introducción

La evidencia creciente apoya la opinión de que los cambios en la expresión de genes contribuyen a los mecanismos de la adicción a las drogas (Robison y Nestler, 2011). Un mediador importante de estos cambios es ΔFosB, un factor de transcripción de la familia Fos (Nestler, 2008). La administración crónica de prácticamente cualquier droga de abuso induce la acumulación duradera de ΔFosB en el núcleo accumbens (NAc), una región límbica esencial para los comportamientos de recompensa. SEsta inducción parece específica a la clase de neurona espinosa media (MSN) que expresa los receptores de dopamina D1. La sobreexpresión inducible de ΔFosB en estos NAc MSN de tipo D1 aumenta las respuestas locomotoras y gratificantes a la cocaína y la morfina (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), incluido el aumento de la autoadministración de cocaína (Colby et al., 2003). Además, el bloqueo genético o viral de la actividad transcripcional de ΔFosB reduce los efectos gratificantes de estos fármacos (Zachariou et al., 2006), lo que indica que esta inducción sostenida de ΔFosB es un mediador crítico de los cambios duraderos inducidos en NAc por la administración crónica de medicamentos.

La estabilidad inusual de ΔFosB (en relación con todas las demás proteínas de la familia Fos) es una propiedad intrínseca de la molécula, debido al truncamiento de los dominios de degron presentes en el FosB de longitud completa (Carle et al., 2007), y un proceso regulado. ΔFosB está fosforilado in vitro y in vivo en Ser27, y esta reacción estabiliza aún más ΔFosB, ~ 10-fold, en cultivo celular y NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Aunque se ha demostrado que Ser27-ΔFosB es un sustrato para la caseína quinasa-2 in vitro (Ulery et al., 2006), su mecanismo de in vivo La fosforilación permanece desconocida.

La proteína quinasa II dependiente del calcio / calmodulina (CaMKII) es una serina / treonina quinasa altamente expresada cuyas isoformas α y β forman homo y heteroholoenzimas dodecaméricas. in vivo, y son esenciales para múltiples formas de neuroplasticidad. (Lisman et al., 2002; Colbran y Brown, 2004). CaMKIIα se induce selectivamente en cáscara NAc por la anfetamina crónica (Loweth et al., 2010), y el bloqueo farmacológico de la actividad de CaMKII en la capa de NAc reduce la sensibilización del comportamiento a la anfetamina (Loweth et al., 2008) y cocaína (Pierce et al., 1998), mientras que la sobreexpresión viral de CaMKIIα en esta subregión NAc aumenta la sensibilización locomotora y la autoadministración de anfetamina (Loweth et al., 2010). CaMKIIα puede afectar los comportamientos de recompensa a través de la modulación de las subunidades del receptor de glutamato AMPA (Pierce et al., 1998), ya que la actividad CaMKIIα se ha asociado durante mucho tiempo con la función del receptor de AMPA y la orientación sináptica en varias formas de neuroplasticidad (Malinow y Malenka, 2002).

Esta literatura demuestra varios paralelismos entre ΔFosB y CaMKII: ambos son necesarios y suficientes para los múltiples efectos conductuales de las drogas de abuso, ambos regulan las espinas dendríticas en varios tipos de células neuronales. in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), y ambos ejercen al menos algunos de sus efectos de comportamiento a través de la modulación de los receptores AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow y Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). A pesar de estos paralelos, no se conoce ningún vínculo funcional entre ΔFosB y CaMKII. Aquí, establecemos una regulación recíproca entre ΔFosB y CaMKII, y demostramos que las dos proteínas forman un bucle de avance directo específico para MSN tipo D1 en la capa de NAc que es inducida por la cocaína y regula un rango de respuestas de cocaína. in vivo.

Vaya a:

Materiales y Métodos

Experimento 1: iTRAQ Análisis proteómico de NAc Shell y Core Después del tratamiento con cocaína (Fig 1A)

A ratas adultas (8 semanas) machos se les administró 20 mg / kg de cocaína o vehículo salino IP una vez al día durante siete días. 24 hr después de la última inyección, se microdiseccionaron NAc shell y núcleo (Fig 1A) y flash congelado. Los análisis iTRAQ se realizaron como se describió anteriormente (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figura 1 y XNUMX

Inducción específica de Shell de CaMKII en NAc por la cocaína

Experimento 2: Cuantificación de los cambios de proteína en el núcleo de la rata NAc y la cáscara después del tratamiento con cocaína (Fig 1B – D)

A ratas adultas (8 semanas) machos se les administró 10 mg / kg de cocaína o solución salina IP del vehículo una vez al día durante siete días en cámaras de registro locomotor. Las respuestas locomotoras a una sola inyección de cocaína (5 mg / kg IP) se registraron en los animales tratados previamente con cocaína (llamada "crónica") y una parte de los tratados con solución salina (llamada "aguda"), y las respuestas locomotoras a la solución salina solo se registró en los restantes animales tratados con solución salina crónica (llamada "solución salina"). Los ensayos de actividad locomotora se realizaron como se describe (Hiroi et al., 1997). Brevemente, las ratas macho adultas se colocaron en cajas de registro de campo abierto 18 "× 24" PAS (San Diego Instruments) para que 30 min se habituara, se les administró una única inyección de solución salina por IP y se monitorearon durante un 30 min adicional, y se les administró una Inyección IP única de 5 mg / kg de cocaína y monitorizada para 30 mín.

Después de esta inyección final, las ratas se decapitaron sin anestesia para evitar los efectos de los anestésicos sobre los niveles de proteína neuronal y los estados fosfatados. Los cerebros se cortaron en serie en una matriz 24 mm (Braintree Scientific) y se eliminó el tejido objetivo en solución salina tamponada con fosfato que contenía proteasa (Roche) e inhibidores de la fosfatasa (Sigma Aldrich) utilizando un punzón de calibre 1.2 para el núcleo de NAc y un punzón de calibre 14 del resto tejido para cáscara NAc (ver Fig 1A) e inmediatamente congelado en hielo seco. Las muestras se homogeneizaron mediante sonicación con luz en un tampón RIPA modificado: 10 mM Tris base, 150 mM cloruro de sodio, 1 mM EDTA, 0.1% de sodio dodecilsulfato, 1% Triton X-100, 1% de sodio desoxicolato, pH 7.4, siniestro y sintonía. como anteriormente. Después de la adición del tampón Laemmli, las proteínas se separaron en geles con gradiente de poliacrilamida 4-15% (Criterion System, BioRad), y se realizó una transferencia Western utilizando el sistema Odyssey (Li-Cor) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Experimento 3: Cuantificación de los cambios de proteína en el núcleo y la cáscara de NAc de rata después de la extracción de cocaína (Fig 1E)

A ratas adultas (8 semanas) machos se les administró 10 mg / kg de cocaína o vehículo salino IP una vez al día durante siete días. 14 días después de la inyección final, a los animales tratados con solución salina se les administró otra inyección de solución salina (llamada "solución salina), y a los animales tratados con cocaína se les administró otra inyección de solución salina (llamada retiro de día 14 o" 14d WD ") o una sola inyección de cocaína ( llamado "14d WD Chal" para el desafío). Una hora después de la inyección final, los animales se decapitaron y la transferencia Western se realizó como en Experiment 2.

Experimento 4: Cuantificación de los cambios de proteína en el núcleo y la cáscara de NAc de rata después de la autoadministración de cocaína (Fig 2A – C)

Las ratas fueron entrenadas para autoadministrarse 0.5 mg / kg / infusión de cocaína en sesiones de una hora bajo un horario de 1 de proporción fija durante nueve días. Después de nueve sesiones de referencia, las ratas se dividieron en dos grupos balanceados por el consumo de cocaína en las últimas dos sesiones. A un grupo de ratas se le permitió autoadministrarse cocaína (0.5 mg / kg / infusión) en sesiones de una hora (acceso corto, ShA) mientras que el otro grupo de ratas se autoadministró cocaína en sesiones de seis horas (acceso largo, LgA ) por diez días adicionales (sesiones de escalada).

Las secciones del cerebro se procesaron para la inmunohistoquímica según lo descrito (Perrotti et al., 2004). Los cerebros se perfundieron 18-24 hr después de la última exposición al fármaco, lo que resultó en la degradación de cualquier proteína FosB residual de longitud completa, de manera que toda la inmunorreactividad restante refleje ΔFosB. Esta degradación se confirmó mediante transferencia de Western, que no mostró tinción significativa con un anticuerpo dirigido contra el extremo C de FosB de longitud completa que no reconoce ΔFosB (datos no mostrados). Después de cortar en secciones 35 µm, el número de células inmunopositivas ΔFosB se cuantificó por un observador ciego en dos secciones a través del NAc de cada rata, y los valores medios por campo 40 × se calcularon por región para cada animal. Cada animal fue considerado una observación individual para análisis estadístico. Las regiones de interés se identificaron utilizando Paxinos y Watson (Paxinos y Watson, 2007).

La cuantificación de la inmunoreactividad CaMKIIα se realizó utilizando un sistema Licor como se describe (Covington et al., 2009). Las intensidades integradas de CaMKII y GAPDH se determinaron con el software Odyssey. Los resultados se presentan como valores de intensidad integrados por mm.² y se presentan como medio ± sem (n = 4 – 10 por grupo). Los valores para GAPDH se utilizaron como referencia para normalizar la intensidad de CaMKII para el espesor y las condiciones del corte.

Figura 2 y XNUMX

Inducción de CaMKII en caparazón NAc de ratas autoadministradas y adictos a la cocaína humana

Experimento 5: cuantificación de los niveles de proteína en humanos dependientes de la cocaína (Fig 2D)

Procedimiento

Se obtuvieron tejidos cerebrales humanos postmortem del Banco de Cerebros Suicidios de Quebec (Instituto Universitario de Salud Mental Douglas, Montreal, Quebec, Canadá). La preservación del tejido procedió esencialmente como se describe (Quirion et al., 1987). Brevemente, una vez extraído, el cerebro se coloca en hielo húmedo en una caja de espuma de poliestireno y se apresura a las instalaciones del Banco de cerebros del suicidio de Quebec. Los hemisferios se separan de inmediato mediante un corte sagital en la mitad del cerebro, el tronco del encéfalo y el cerebelo. Los vasos sanguíneos, la glándula pineal, el plexo coroideo, la mitad del cerebelo y la mitad del tronco encefálico se diseccionan típicamente del hemisferio izquierdo, que luego se corta coronariamente en cortes de 1 de cm de grosor antes de la congelación. La segunda mitad del cerebelo se corta sagitalmente en rebanadas de 1cm de espesor antes de congelar. Los tejidos se congelan instantáneamente en 2-metilbutano a −40 ° C durante ~ 60 seg. Todos los tejidos congelados se guardan por separado en bolsas de plástico a −80 ° C para un almacenamiento a largo plazo. Las regiones específicas del cerebro se diseccionan de cortes coronales congelados en una placa de acero inoxidable con hielo seco alrededor para controlar la temperatura del ambiente. Western Blot se realizó como se describe en Experiment 2.

Cohorte

La cohorte estaba compuesta por sujetos 37 masculinos y femeninos 3, con edades comprendidas entre 15 y 66 años. Todos los sujetos murieron repentinamente sin un estado agonal prolongado o una enfermedad médica prolongada. En cada caso, la causa de la muerte fue determinada por la oficina del médico forense de Quebec, y se realizó un examen toxicológico con muestras de tejido para obtener información sobre los medicamentos y el uso de sustancias ilícitas en el momento de la muerte. El grupo de sujetos estaba formado por individuos de 20 que cumplían con los criterios de SCID-I para la dependencia de la cocaína. El grupo de control estaba compuesto por sujetos 20 sin antecedentes de dependencia de la cocaína y sin diagnósticos psiquiátricos importantes. Todos los sujetos murieron repentinamente por causas que no tenían influencia directa en el tejido cerebral. Los grupos se combinaron para la edad media del sujeto, el retraso de la refrigeración y el pH. Para todos los sujetos, se realizaron autopsias psicológicas como se describió anteriormenteDumais et al., 2005), lo que nos permite tener acceso a información detallada del caso sobre antecedentes psiquiátricos y médicos, así como a otros datos clínicos y sociodemográficos relevantes. En resumen, un entrevistador entrenado condujo el Entrevista Clínica Estructurada para DSM-IV Trastornos psiquiátricos (SCID-I) con uno o más informantes de la persona fallecida. Un panel de médicos revisó las evaluaciones de SCID-I, los informes de casos, las notas del forense y los registros médicos para obtener diagnósticos psiquiátricos por consenso.

Experimento 6: Inmunoprecipitación de cromatina para la rata NAc (Fig 3A – C)

A ratas adultas (8 semanas) machos se les administró 10 mg / kg de cocaína o vehículo salino IP una vez al día durante siete días. 24 hr después de la última inyección, se microdiseccionaron NAc shell y núcleo. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se realizó combinando los punzones NAc bilaterales de concha o núcleo de siete ratas por grupo en el total de grupos 14 (total de animales 98, grupos de cocaína 7, grupos de solución salina 7). Los tejidos se entrecruzaron, se lavaron y se almacenaron a -80 ° C hasta el cizallamiento de la cromatina por sonicación. La cromatina cortada se incubó durante la noche con anticuerpos previamente unidos a perlas magnéticas (Dynabeads M-280, Invitrogen). Se usó IgG no inmune como control. Después de la reticulación inversa y la purificación del ADN, se utilizó qPCR para medir los niveles de ADN promotor de CaMKIIα. Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región que contiene una secuencia de consenso AP-1 localizada ~ 450 pb antes del sitio de inicio de la transcripción (Adelante: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverso: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figura 3 y XNUMX

Inducción de ΔFosB de tipo celular y región específica de CaMKIIα in vivo

Experimento 7: Medición de la transcripción de CaMKII y la expresión de proteínas con la sobreexpresión de ΔFosB específica de tipo celular (Fig 3D)

Ratones bitransgenicos macho derivados de NSE-tTA (línea A) × TetOp-ΔfosB (línea 11) y NSE-tTA (línea B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (línea 11) ratones (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) fueron concebidos y criados en 100 µg / ml de doxiciclina para suprimir la expresión de ΔFosB durante el desarrollo. Los compañeros de camada se dividieron al destete: la mitad permaneció en doxiciclina y la otra mitad se cambió a agua, y los animales se utilizaron 8 a 11 semanas más tarde, cuando los efectos transcripcionales de ΔFosB son máximos (Kelz et al., 1999; McClung y Nestler, 2003). Para los análisis transcripcionales, los ratones se decapitaron rápidamente y los cerebros se extrajeron y se colocaron en hielo. Las disecciones de NAc se tomaron con un punzón de aguja de calibre 14 y se congelaron rápidamente en hielo seco hasta que se extrajo el ARN. El aislamiento de ARN, la qPCR y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente (LaPlant et al., 2009). Brevemente, el ARN se aisló con reactivo de TriZol (Invitrogen), se purificó adicionalmente con el micro kit RNAeasy de Qiagen y se verificó la calidad con el bioanalizador de Agilent. La transcripción inversa se realizó utilizando iScript (BioRad). qPCR se llevó a cabo con un sistema de PCR 7900HT RT de Applied Biosystems con los siguientes parámetros de ciclo: 10 min a 95 ° C; Ciclos 40 de 95 ° C para 1 min, 60 ° C para 30 sec, 72 ° C para 30 sec; Calor graduado a 95 ° C para generar curvas de disociación para la confirmación de productos de PCR individuales. Los análisis inmunohistoquímicos de la expresión de la proteína ΔFosB y CaMKIIα se realizaron como se describe en Experiment 4.

Experimento 8: Efectos de los antagonistas del receptor de dopamina D1 y D2 intra-NAc sobre los cambios de proteínas mediados por la cocaína (Fig 3H)

A ratas adultas (8 semanas) machos se les administró 10 mg / kg de cocaína o vehículo salino (grupo "vehículo") IP una vez al día durante siete días. 30 min antes de cada inyección de cocaína, a las ratas se les administró por IP el antagonista del receptor D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, grupo "D1 Ant") o el grupo antagonista del receptor D2 eticlopride (0.5 mg / kg, grupo "D2 Ant") , o una inyección de control salino (grupo "cocaína"). 24 hr después de la inyección final, los animales se decapitaron y las proteínas se cuantificaron mediante transferencia de Western según Experiment 2.

Experimento 9: Efectos de la sobreexpresión de AVFosB mediada por AAV sobre la expresión de proteínasFig 4 A – C)

La cirugía estereotáxica se realizó en ratas macho adultas (8 semanas) para inyectar AAV-GFP (proteína verde fluorescente) o AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Las agujas de calibre 33 (Hamilton) se emplearon para todas las cirugías, durante las cuales se infundieron bilaterales 0.5 µl de virus purificados de alto título durante un período mínimo de 5, seguido de un período adicional de descanso posterior a la infusión de 5. Todas las distancias se miden en relación con Bregma: 10 ° ángulo, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 días después de la cirugía, a los animales se les administró una sola inyección IP de 10 mg / kg de cocaína en cámaras de monitoreo locomotor para evaluar los efectos conductuales de la sobreexpresión de ΔFosB. 24 hr después de esta inyección final, se decapitaron las ratas según Experiment 2y la microdisección del tejido se realizó bajo guía microscópica de fluorescencia para obtener tejido NAc positivo para GFP. Western Blot se realizó según Experimento 2.

Figura 4 y XNUMX

ΔFosB es necesario y suficiente para la inducción de CaMKIIα dependiente del receptor D1 mediada por cocaína en la cubierta de NAc

Experimento 10: Efectos de la sobreexpresión de ΔJunD mediada por AAV en la expresión de proteínas dependientes de cocaínaFig 4 D – F)

La inyección estereotáxica de AAV-GFP o AAV-GFP-ΔJunD se realizó según Experimento 8. 14 días después de la cirugía, a los animales se les administró 10 mg / kg de cocaína o solución salina IP una vez al día durante siete días en cámaras de registro locomotor. Se registraron las respuestas locomotoras a una sola inyección de cocaína (5 mg / kg IP) o solución salina. 24 hr después de esta inyección final, se decapitaron las ratas, se recogió el tejido y se realizaron transferencias de Western como en Experimento 9.

Experimento 11: In Vitro Ensayos de proteína quinasa (Fig 5A – D)

CaMKIIα recombinante y ΔFosB se purificaron a partir de células de insecto (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), y se realizaron ensayos de proteína quinasa (Colbran, 1993), como se describió previamente. Brevemente, CaMKII se preincubó en hielo con 2.5 µM ​​(o concentración indicada) de ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, Calmodulina 15 µM ​​y HEPES 200 mM pH 7.5. La fosforilación se inició mediante la adición de 200 µM ​​ATP con o sin [γ-³²P] ATP y se le permitió proceder por 10 min a temperatura ambiente (Figura 5A y B) o 2 min en hielo (Figura 5C y D). Los productos se resolvieron mediante transferencia de Western (Figura 5A y B) o por autorradiograma y recuento de centelleo (Fig. B – D).

Figura 5 y XNUMX

ΔFosB es un potente sustrato para CaMKIIα

Experimento 12: Identificación de la fosforilación de Ser27 ΔFosB (Fig 5E)

In vitro los ensayos de quinasa se realizaron según Experiment 11, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y las bandas correspondientes a ΔFosB se cortaron y se sometieron a espectrometría de masas en tándem. Las asignaciones de m / z de los fragmentos de iones correspondientes en todos los paneles están etiquetados en la parte superior de los picos de iones. No todos los iones de fragmentos están etiquetados debido a limitaciones de espacio. En general, el texto de las etiquetas de iones de fragmentos está coloreado en negro, excepto cuando confirman directamente o agregan evidencia a la presencia de los sitios de interés de la fosforilación, en cuyo caso están marcados en rojo. La evidencia de los productos de fragmentación de la cadena principal se presenta en la lectura de secuencia del fosfopéptido con el sitio detectado del residuo de fosforilación indicado en rojo con una única designación de letra de aminoácido. La descripción numérica de los iones de fragmentos observados también se marca en la secuencia peptídica como iones b e y. Los factores de zoom de las secciones del eje m / z para mostrar los iones de fragmentos de menor intensidad están marcados en la parte superior de cada fragmento de espectros de masas. Los iones de fragmentos mostrados en el panel H confirman la presencia de isoformas fosforiladas de Ser27, sin embargo, dentro de una mezcla de otras isoformas fosforiladas en los sitios Ser28, Ser31, Ser34 y Thr37. La presencia de los iones pa5, pa5-P, pb5 y pb5-P confirma de manera única la fosforilación del residuo Ser27.

Experimento 13: Cuantificación de la fosforilación de Ser27 (Fig 5F)

Los péptidos estándar fueron diseñados imitando las formas fosfo y no fosfo de Ser27 ΔFosB. Después de la síntesis y purificación, cada péptido idiotípico "pesado" se disolvió en un tampón de acetonitrilo / agua 50 / 50 y se envió para análisis de aminoácidos para determinar la concentración absoluta en la solución madre de péptidos sintéticos. Cada péptido "pesado" se infundió directamente en el espectrómetro de masas 4000 QTRAP (MS) para determinar la mejor energía de colisión para la fragmentación de MS / MS y de dos a cuatro transiciones de MRM. A continuación, los péptidos "pesados" puros se sometieron a LCMS en el 4000 QTRAP para asegurar la separación del péptido. El instrumento se ejecutó en el modo de cuadrupolo triple, con Q1 establecido en el valor m / z precursor específico (Q1 no está escaneando), y Q3 establecido en el valor m / z específico correspondiente a un fragmento específico de ese péptido. En el modo MRM, se midieron secuencialmente una serie de reacciones individuales (transiciones de ión precursor / fragmento donde la energía de colisión se sintoniza para optimizar la intensidad de los iones del fragmento de interés), y el ciclo (típicamente 1 – 2 seg) se realizó un ciclo completo Todo el tiempo de la separación por HPLC. Las transiciones de MRM se determinaron a partir de los espectros de MS / MS de los péptidos existentes. Luego se seleccionaron dos transiciones por péptido, correspondientes a los iones de fragmentos de alta intensidad, y se optimizó la energía de colisión para maximizar la intensidad de la señal de las transiciones MRM utilizando un software de automatización. Los picos resultantes de péptidos estándar y muestras de osFosB expuestas a CaMKII o control se compararon para determinar la abundancia absoluta de cada forma de péptido en la reacción. El análisis de datos en datos LC-MRM se realiza utilizando el software AB Multiquant 1.1.

Experimento 14: inducción de ΔFosB en ratones que sobreexpresan CaMKII (Figura 5G y H)

Ratones transgénicos que sobreexpresan T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) y los compañeros de camada de tipo salvaje se criaron en ausencia de doxiciclina para permitir la expresión del transgén. A los ratones adultos se les administró 20 mg / kg de cocaína o solución salina IP una vez al día durante los días 14. 24 hr después de la inyección final, los animales se decapitaron y la inmunohistoquímica y la cuantificación de la expresión de ΔFosB se realizaron como en Experiment 4.

Experimento 15: Efectos de la sobreexpresión de BFosB mediada por HSV y la inhibición de CaMKII en espinas dendríticas NAc (Fig 6A – E)

Ratones adultos machos (semanas 8) se inyectaron estereotáxicamente en NAc con HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, o HSV-GFPAC3I-ΔFosB. En estas construcciones, AC3I, un inhibidor basado en péptidos de la actividad de CaMKII, se fusiona al extremo C de GFP. GFPAC3I se clonó mediante PCR utilizando el vector pMM400 que contiene GFPAC3I como una plantilla con los siguientes cebadores: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (clampBspEIstop). El producto de PCR resultante se insertó en los vectores p3 + y p1005 + -Δ FosB utilizando los sitios NheI y BspEI. El constructo fue validado por secuenciación. Las coordenadas estereotáxicas fueron: 1005 ° ángulo, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot et al., 4.4). Perfusión y seccionamiento del cerebro se realizó según Experiment 4.

El análisis de la columna vertebral se realizó como se describe (Christoffel et al., 2011). Brevemente, los segmentos dendríticos 50-150 µm alejados del soma se seleccionaron al azar de las células infectadas con HSV que expresan GFP. Las imágenes se adquirieron en un LSM 710 confocal (Carl Zeiss) para el análisis morfológico utilizando NeuronStudio con el algoritmo de rayburst. NeuronStudio clasifica las espinas como delgadas, seta o rechoncha según los siguientes valores: relación de aspecto (1), relación de cabeza a cuello (2) y diámetro de cabeza (3). Las espinas con cuello pueden clasificarse como delgadas o de setas, y las que no tienen un cuello significativo se clasifican como rechonchas. Las espinas con cuello se etiquetan como delgadas o de setas según el diámetro de la cabeza.

Figura 6 y XNUMX

El bloqueo de la actividad de CaMKII previene los efectos morfológicos y de comportamiento de ΔFosB en NAc

Experimento 16: Efectos de la sobreexpresión de BFosB mediada por HSV y la inhibición de CaMKII en las respuestas de cocaína (Fig 6F)

Ratones adultos machos fueron inyectados con virus según Experiment 15, y las respuestas locomotoras a una sola inyección de cocaína 5 mg / kg se midieron según Experimento 9. Los datos locomotores se expresan como roturas de haz totales en 30 min después de la inyección de cocaína.

Información adicional

Alojamiento de animales

Ratas Sprague Dawley macho (250 – 275 g; Charles River Laboratories) se alojaron en parejas. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad (The Jackson Laboratory) se alojaron en un grupo con un máximo de cinco animales por jaula. Todos los animales se habituaron a la instalación de animales durante ≥1 semana antes de las manipulaciones experimentales y se alojaron en habitaciones con clima controlado (23 – 25 ° C) en un ciclo de luz / oscuridad de 12 hr (las luces se encienden en 7: 00 AM) con acceso a los alimentos y agua ad libitum. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Sociedad para la Neurociencia y el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) en Mount Sinai.

Drogas

A los medicamentos se les administró IP y se disolvieron en solución salina estéril, incluida la cocaína (5 – 20 mg / kg por 10 µl para ratones, por 1 ml para ratas, NIDA) y SCH 23390 o clorhidrato de eticlopride (0.5 mg / kg por 1 ml, Tocris) . Para la cirugía estereotáxica, los ratones se anestesiaron con un "cóctel" de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) (Henry Schein) en solución salina estéril.

Anticuerpos

CaMKIIα (total): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): señalización celular 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosfosoluciones, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software Prism 6 (GraphPad). Las pruebas t de Student se utilizaron para todas las comparaciones por pares (indicadas en Resultados donde se da el valor t), y se usaron ANOVA de una vía para todas las comparaciones múltiples (indicadas en la sección de resultados donde se da el valor F).

Vaya a:

Resultados

La cocaína crónica induce CaMKII en la capa de NAc

Muchos estudios han indicado que los MSN en la cubierta y el núcleo de NAc tienen diferentes respuestas bioquímicas y fisiológicas a la exposición crónica a drogas de abuso (Kourrich y Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) y que las dos subregiones regulan diferencialmente los comportamientos de búsqueda de drogas (Ito et al., 2004). Determinar los efectos diferenciales de la cocaína en los constituyentes proteicos de la capa de NAc. vs En el núcleo, utilizamos el etiquetado isobárico multiplexado (iTRAQ) y la espectroscopia de masas en tándem (MS / MS). A ratas adultas macho se les inyectó IP con cocaína (20 mg / kg) o solución salina diariamente durante los días 7; 24 hr después de la última inyección, se microdiseccionaron NAc shell y núcleo (Fig 1A) y flash congelado. Las proteínas en estas muestras se cuantificaron utilizando iTRAQ. Las cuatro isoformas de CaMKII mostraron grandes aumentos en la expresión después del tratamiento con cocaína que eran específicos para la capa NAc en comparación con el núcleo. Varias proteínas fosfatasas, incluidas las subunidades reguladoras y catalíticas PP1 y PP2A, que se han asociado previamente con varios sustratos de CaMKII en otros sistemas (Colbran, 2004), siguió un patrón similar. Estos hallazgos proporcionaron evidencia novedosa e imparcial de que la ruta de señalización CaMKII está regulada prominentemente por la cocaína en NAc de una manera específica de la concha.

Para validar este hallazgo de manera más cuantitativa, tratamos ratas como antes con cocaína (a dosis variables) o solución salina y medimos las respuestas locomotoras a una dosis de cocaína (5 mg / kg) o solución salina. La exposición repetida a 10 mg / kg de cocaína dio lugar al patrón típico de sensibilización locomotora (Fig 1B). Otros estudios con este régimen de dosificación revelaron, mediante el uso de Western blotting, que la cocaína repetida induce CaMKIIα selectivamente en NAc shell 24 hr después de la inyección final de cocaína (Fig 1C y D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Además, la fosforilación del sustrato canónico de CaMKII Ser831 de la subunidad GluA1 del receptor AMPA se incrementó significativamente en la capa NAc y no en el núcleo (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), mientras que el CaMKIIα Thr286 tenía autofosforilación de CaMKIIα. tendencia significativa hacia la inducción en cáscara solamente (Fig 1D). Varios otros receptores de glutamato no se vieron afectados. En contraste con estas medidas de CaMKII, las mismas muestras de tejido mostraron la inducción de ΔFosB en ambas capas (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) y núcleo (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) de la NAc (Fig 1C y D), consistente con hallazgos previos (Perrotti et al., 2008).

Dado que varios estudios anteriores sobre la regulación de la cocaína de los receptores AMPA analizaron animales después de ~ 14 días de retiro de la cocaína crónica (ver Discusión), repetimos estos análisis bioquímicos en este momento. Encontramos que, 14 días después de la inyección final de cocaína, ΔFosB permanece elevado en NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), mientras que ni CaMKII ni la fosforilación de GluA1 SerxNUMX se mantiene (Fig 1E). Sin embargo, 1 hr después de una dosis única de 10 mg / kg de prueba de cocaína, los niveles de CaMKII total (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) y de GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) la fosforilación se eleva a un grado similar al encontrado después de la exposición crónica inicial a la cocaína (Fig 1E). Estos datos indican que las neuronas de cáscara NAc están preparadas para la inducción de CaMKII durante períodos prolongados de abstinencia, tal vez a través de la preparación directa del promotor del gen CaMKII (ver Discusión). Además, el hecho de que la inducción de ΔFosB sea más persistente que la inducción de CaMKII sugiere la existencia de mecanismos adicionales, ya sean basados ​​en cromatina o de otra manera, que ejerzan un “freno” en la regulación de CaMKII, como se describe en la Discusión.

Para fortalecer aún más estas observaciones, exploramos modelos de autoadministración de cocaína, que involucran la ingesta voluntaria de drogas. A las ratas adultas se les dio acceso corto o largo a la cocaína; como se esperaba (Ahmed y Koob, 1998), solo las condiciones de acceso prolongadas llevaron a una escalada de la autoadministración del medicamento (Fig 2A). ΔFosB fue inducido en mayor medida por mucho tiempo. vs acceso corto a la cocaína tanto en la capa NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) como en el núcleo (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Por el contrario, CaMKIIα se indujo en NAc shell solo por el acceso prolongado a la cocaína (Fig 2B y C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Es interesante comparar el consumo promedio diario de cocaína en animales de acceso corto (~ 12 mg / kg IV), animales de acceso largo (~ 70 mg / kg IV) y animales administrados por experimentador (10 mg / kg), y pregunte por qué este último provoca una inducción robusta de ΔFosB y CaMKII mientras que el acceso corto no lo hace. Esta discrepancia probablemente se deba a las diferencias en los niveles máximos de cocaína (la cocaína administrada por el experimentador se administra como un solo bolo IP, mientras que la cocaína autoadministrada se administra a través de múltiples dosis intravenosas), o por la duración de la exposición al fármaco (días 7 para el experimentador administración, 19 días para la autoadministración).

A pesar de la extensa literatura sobre ΔFosB y CaMKII en la acción de la cocaína, no hay estudios de estas proteínas en los usuarios humanos de cocaína. Aquí, presentamos la primera evidencia de que los niveles de ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) y CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) se incrementan en NAc de humanos dependientes de la cocaína (Fig 2D, Tabla 1). Estos datos indican que nuestro examen de la inducción de ΔFosB y CaMKII por la cocaína en roedores NAc es clínicamente relevante para la adicción a la cocaína humana.

Tabla 1

Caracterización de muestras de adictos a la cocaína humana y grupo control pareado.

ΔFosB regula la transcripción CaMKII de forma selectiva en MSN de tipo D1 de NAc Shell

El hallazgo de que tanto CaMKII como ΔFosB están regulados al alza por la cocaína en el roedor NAc nos llevó a determinar si ΔFosB podría regular la transcripción del gen CaMKII. Anteriormente habíamos reportado CaMKIIα como un posible objetivo para ΔFosB en un análisis de microarrays imparcial de NAc (McClung y Nestler, 2003), pero este hallazgo no se validó más en ese estudio. Primero utilizamos ChIP cuantitativo (qChIP - ChIP seguido de PCR cuantitativa) para determinar si ΔFosB se une al promotor del gen CaMKIIα en NAc de ratas macho adultas, y encontramos sorprendentemente que esta unión aumenta significativamente, por la administración de cocaína crónica, en la cáscara ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), pero no el núcleo, subregión (Fig 3A). Para comprender mejor los mecanismos relacionados con esta diferencia específica de la subregión en la unión de ΔFosB al promotor CaMKIIα, utilizamos qChIP para caracterizar el estado de las modificaciones de histonas en esta región genómica. Estudios previos demostraron la inducción de cocaína de la acetilación de H3 en el promotor CaMKIIα en el total de NAc de ratón (Wang et al., 2010). En contraste, encontramos que la cocaína disminuye la acetilación de H3 en el promotor CaMKIIα de forma selectiva en el núcleo de NAc (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), sin cambios aparentes en la cubierta, consistentes con alteraciones de cromatina específicas de la subregión más allá de la unión de ΔFosB. q CHIP para la marca represiva, H3 lisina 9 dimetilada (H3K9me2), reveló tendencias de disminuciones tanto en la subregión como en las subregiones centrales (Fig 3C).

Para determinar si ΔFosB regula la transcripción de CaMKIIα in vivo, utilizamos dos líneas de ratones bitransgenicos que sobreexpresan ΔFosB de manera indescriptible específicamente en D1 vs MSN de tipo D2 de una manera controlada por la administración de doxiciclina en agua potable (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Los ratones adultos machos que sobreexpresan ΔFosB solo en MSN de tipo D1 tuvieron niveles significativamente mayores de ARNm de CaMKIIα en NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), un efecto no visto en ratones que sobreexpresan ΔFosB predominantemente en D2-type MSN (Fig 3D). El aumento en el ARNm de CaMKIIα, inducido por la expresión de ΔFosB en los MSN de tipo D1, estuvo acompañado por un aumento concomitante en la proteína CaMKIIα en la cáscara de NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) y núcleo (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Higos 3E y F). Estos datos demuestran que ΔFosB es capaz de impulsar la expresión del gen CaMKIIα en MSN de tipo D1 en ambas subregiones, aunque Figura 3B sugiere que los cambios en la cromatina mediada por la cocaína en el promotor CaMKIIα (p. ej., reducción de la acetilación) evitan que ΔFosB aumente CaMKII en la subregión central después de la cocaína.

Debido a que nuestros datos de ratones transgénicos indicaron que la inducción de ΔFosB de la expresión del gen CaMKII es específica de los MSN de tipo D1 en NAc, a continuación buscamos determinar si la regulación positiva de CaMKII dependiente de cocaína requiere la activación del receptor de dopamina D1. A ratas macho adultas se les administró cocaína crónica o solución salina como antes, pero 30 minutos antes de cada inyección, las ratas del grupo de cocaína recibieron una inyección IP de solución salina, el antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) o el antagonista del receptor D2 eticloprida. (0.5 mg / kg). Los animales se analizaron 24 horas después de la última inyección de cocaína. El Western blot reveló que el antagonista D1, pero no el D2, bloqueó completamente el aumento de ΔFosB mediado por cocaína (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), como se informó anteriormente (Nye et al., 1995), así como en CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G y H). Estos datos apoyan la hipótesis de que la cocaína se compromete con un aumento mediado por ΔFosB en la expresión del gen CaMKII específicamente en MSN de tipo D1 de NAc shell. Sería importante en estudios futuros demostrar directamente este efecto específico de tipo celular de la cocaína en la expresión de CaMKII dentro de esta región del cerebro.

ΔFosB es necesario y suficiente para la inducción de cocaína de CaMKII en NAc Shell

Para complementar el uso de ratones bitransgenicos, a continuación estudiamos el papel de ΔFosB en la mediación de la inducción de cocaína de CaMKIIα mediante el uso de la transferencia de genes mediada por virus en ratas. Inyectamos bilateralmente partículas virales adenoasociadas (AAV) en la concha NAc de ratas macho adultas (donde la concha puede ser selectivamente dirigida) para sobreexpresar ΔFosB más GFP o GFP solo. Luego, a los animales se les administró una sola inyección IP de 10 mg / kg de cocaína. Los animales que sobreexpresan ΔFosB / GFP mostraron una respuesta locomotora aumentada en comparación con los animales que sobreexpresan GFP solo (Fig 4A). Después de 24 hora después de la inyección única de cocaína, se extirpó tejido NAc positivo para GFP de estos animales mediante disección bajo una fuente de luz fluorescente. Transferencia de Western de este tejido (Fig 4B y C) revelaron una fuerte sobreexpresión de BFosB, así como un aumento significativo en la proteína CaMKIIα total en comparación con los animales GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), similar a la inducción observada con la administración crónica de cocaína. Además, la autofosforilación de CaMKIIα en Thr286 (indicativa de la activación de la enzima) se incrementó por la sobreexpresión de BFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), al igual que la fosforilación del sustrato CaMKII, Ser831 de GluA1 (p = XUM); 0.0540; df = 2.012), imitando de nuevo las acciones de la cocaína crónica (Fig 1C y D). Tjuntos, estos datos proporcionan evidencia adicional de que la expresión de ΔFosB en la concha NAc es suficiente para la sensibilización locomotora a la cocaína y para la inducción y activación de CaMKII en esta subregión.

Utilizamos un enfoque similar para determinar si ΔFosB también es necesario para la inducción de CaMKIIα mediada por cocaína en la capa de NAc. Se utilizó AAV para sobreexpresar una proteína JunD truncada, denominada ΔJunD, que es un regulador negativo de la activación transcripcional de ΔFosB (Winstanley et al., 2007) más GFP o GFP solo. Dos semanas después, cuando la expresión del transgén es máxima, a los animales se les administró cocaína (10 mg / kg) o solución salina diariamente durante 7 días, y se analizaron las respuestas locomotoras a una exposición a la cocaína (5 mg / kg) 24 hr después de la última inyección crónica (Fig 4D). La sobreexpresión de unDunD evitó la sensibilización locomotora a la cocaína y también impidió la inducción y activación de CaMKIIα en la cáscara de NAc (Fig. 4E y F; p = 0.0437; F = 2.997; df total = 38), que indica que la actividad transcripcional de ΔFosB es necesaria para la inducción de CaMKIIα mediada por cocaína en esta subregión. Curiosamente, encontramos que ΔJunD redujo los niveles de ΔFosB en condiciones tanto salinas como tratadas con cocaína (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), lo que aumenta la posibilidad de que ΔFosB dependa de la actividad de AP-1 para sus propios niveles de expresión.

CaMKII fosforila ΔFosB en Ser27

Usar in vitro En los ensayos de proteína quinasa, determinamos que el ΔFosB purificado es un sustrato robusto para CaMKIIα. Incubación de los suyos₆-ΔFosB con CaMKIIα y ATP causó un cambio ascendente en la movilidad electroforética de ΔFosB (Fig 5A); Las varias bandas resultantes sugirieron múltiples sitios de fosforilación. Similar in vitro Ensayos de quinasa utilizando [γ-³²P] ATP mostró la incorporación de fosfato radiomarcado en las bandas ΔFosB desplazadas (Fig 5B), demostrando la fosforilación directa de la proteína. Generamos un anticuerpo fosfo-específico para el Ser27 de ΔFosB previamente caracterizado (Ulery et al., 2006). Si bien este anticuerpo no produce una señal contra extractos de cerebro que contengan ΔFosB fosforilado con Ser27 (datos no mostrados), pudimos detectar la fosforilación de Ser27 en el in vitro ensayo de quinasa utilizando CaMKII (Fig 5B). Los análisis cinéticos de la fosforilación de CaMKII de ΔFosB indican que es un sustrato potente para la quinasa (Fig 5C), con una aparente K_M de 5.7 ± 2.0µM y K_GATO de 2.3 ± 0.3min^-1. Estos resultados son comparables a muchos bien caracterizados. in vivo sustratos de CaMKII (Colbran y Brown, 2004). Además, determinamos que CaMKII fosforila ΔFosB con una estequiometría de 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), lo que indica que hay al menos tres sitios de fosforilación de CaMKII dentro del His₆-FosB proteína, de acuerdo con Fig 5A.

Para investigar los sitios individuales de fosforilación, empleamos análisis de MS de muestras de nuestros in vitro Ensayos de quinasa. Fig 5E demuestra la fosforilación de ΔFosB en el Ser27 previamente caracterizado y en varios sitios adicionales (datos no mostrados). Dada la caracterización funcional previa de Ser27, nos enfocamos en este sitio mediante la generación de péptidos sintéticos marcados que imitan los estados fosfósicos y no fosfósicos de Ser27, luego utilizamos cantidades conocidas de estos péptidos como estándares en los análisis MRM de ΔFosB antes y después in vitro fosforilación por CaMKII. Cuantificación subsiguiente (Fig 5F) confirma que Ser27 es un potente sustrato para CaMKII. Estos resultados indican que, entre los múltiples residuos fosforilados dentro de ΔFosB, Ser27 es un sustrato particularmente eficaz para CaMKII.

CaMKII media la acumulación de cocaína de ΔFosB en la capa de NAc

Como CaMKII puede fosforilar ΔFosB in vitro en un sitio que mejora dramáticamente su estabilidad in vitro y in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), determinamos si la actividad CaMKII controla los niveles de BFosB en NAc in vivo. Para abordar esta pregunta, primero usamos una línea de ratón que sobreexpresa un mutante independiente de calcio de CaMKIIα (T286D) en varias regiones del cerebro, incluida la NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Inyectamos a los compañeros de camada adultos y adultos de la misma edad con 20 mg / kg de cocaína o solución salina una vez al día durante los días de 14, y luego analizamos los animales un día después de la inyección final. Encontramos que los niveles basales de ΔFosB aumentaron en los animales mutantes en la concha NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), pero no en el núcleo (Fig 5G y H). Sorprendentemente, la inducción de ΔFosB dependiente de la cocaína se bloqueó en los animales mutantes tanto en la concha como en el núcleo, lo que sugiere que, aunque el CaMKII puede regular directamente la estabilidad de la ΔFosB en la concha de NAc, también puede estar más arriba de la ΔFosB en vías activadas por la cocaína en ambas subregiones. .

La actividad CaMKII es necesaria para la plasticidad estructural y conductual mediada por fosB

La inducción de cocaína de las espinas dendríticas en NAc MSN es una de las mejores adaptaciones inducidas por fármacos establecidas en esta región del cerebro, y dicha inducción de la columna vertebral se ha correlacionado con respuestas conductuales sensibilizadas al fármaco (Robinson y Kolb, 2004; Russo et al., 2010) y se informa que son selectivos para MSN de tipo D1 (Lee et al., 2006). Hemos demostrado recientemente que la inducción de la cocaína de espinas dendríticas en NAc depende de ΔFosB y su programa de transcripción aguas abajo (Maze et al., 2010). Aunque existe una extensa literatura sobre la participación de CaMKII en la morfología de la espina dendrítica y la inducción en otras regiones del cerebro y sistemas experimentales (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), su papel en la formación de la columna vertebral NAc MSN no ha sido estudiado. Por lo tanto, determinamos si la actividad de CaMKII es necesaria para la inducción mediada por osFosB de espinas dendríticas MSN utilizando la sobreexpresión mediada por HSV del péptido AC3I inhibidor de CaMKII fusionado a GFP, una construcción que se mostró anteriormente para inhibir la actividad de CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). La sobreexpresión viral de ΔFosB en el caparazón de NAc de ratones adultos indujo un aumento significativo en la densidad de la columna dendrítica MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig. 6A y B) como se informó anteriormente (Maze et al., 2010), y este aumento se debió principalmente a los tipos de espinas delgadas (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) y regordetas (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) (ambas consideradas espinas inmaduras) (Fig 6C – E). No se observó ningún efecto en espinas más maduras con forma de hongo. Sin embargo, cuando se coexpresó GFP-AC3I, se eliminó completamente la inducción de espinas de ΔFosB (Fig 6A – E), lo que indica que la actividad CaMKII es necesaria para la inducción de ΔFosB de espinas dendríticas en la concha NAc.

Luego, utilizamos las mismas herramientas virales para determinar si la actividad de CaMKII es necesaria para los efectos de ΔFosB en la sensibilidad de comportamiento a la cocaína. 72 hr después de la inyección viral en NAc shell, los animales recibieron una única inyección de 5 mg / kg de cocaína y se registró su actividad locomotora. Como se mostró anteriormente con una sobreexpresión de AAV más extendida de ΔFosB (Fig 4A), La sobreexpresión mediada por HSV de ΔFosB aumentó la sensibilidad locomotora a la cocaína (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Al igual que con la inducción de espinas dendríticas, la inhibición de la actividad de CaMKII por la coexpresión de GFP-AC3I bloqueó completamente el aumento mediado por ΔFosB en la sensibilidad a la cocaína, lo que indica que la actividad de CaMKII es necesaria para las alteraciones inducidas por osFosB en los efectos de comportamiento de la cocaína.

Vaya a:

Discusión

El presente estudio delinea un nuevo mecanismo de alimentación hacia adelante en el que la cocaína induce osFosB en NAc, que aumenta la transcripción del gen CaMKIIα selectivamente en NAc shell. CaMKIIα posteriormente fosforila y estabiliza ΔFosB, lo que conduce a una mayor acumulación de ΔFosB y a una mayor inducción de CaMKIIα (Fig 6G). Los niveles de escalada simultánea de las dos proteínas durante la exposición crónica a la cocaína contribuyen de manera esencial a sensibilizar las respuestas de comportamiento a la droga. Esta es una hipótesis particularmente atractiva, ya que se demostró previamente que tanto el ΔFosB como el CaMKII son necesarios para el aumento de las respuestas de comportamiento a la cocaína. (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), y replicamos este hallazgo para ΔFosB en shell NAc específicamente usando un enfoque viral (Higos 4 y Y66).

Aunque la sobreexpresión de ΔFosB transgénica en MSN de tipo D1 puede impulsar la inducción de CaMKII tanto en la cáscara de NAc como en el núcleo de los animales sin uso de cocaína, en el contexto de la cocaína, la acumulación de ΔFosB endógeno, que se produce en ambas subregiones, conduce la inducción de CaMKII específicamente en la cáscara de NAc . Esta diferencia podría relacionarse con los niveles más altos de ΔFosB inducido en nuestro modelo bitransgenic, sin embargo, también podría reflejar la capacidad de la cocaína para alterar diferencialmente el promotor CaMKIIα en la cáscara vs los MSN principales promueven la unión de ΔFosB en el primero o lo excluyen en la última subregión. De hecho, nuestros datos de ChIP, que revelan una desacetilación mediada por cocaína de las histonas en el promotor del gen CaMKIIα solo en el núcleo de NAc, respaldan la posible participación de un mecanismo de cromatina. De acuerdo con esta hipótesis, la sobreexpresión de BFosB en MSN de tipo D1 fue capaz de impulsar la inducción de CaMKIIα en el núcleo de NAc en ausencia de cocaína (Fig 3F), lo que sugiere que hay modificaciones activas del promotor CaMKIIα que impiden esta inducción durante la exposición crónica a la cocaína. La regulación del paisaje de la cromatina en el promotor CaMKII también podría explicar por qué la CaMKII es inducida por una dosis de desafío de cocaína en la capa de NAc de ratas crónicas que extraen cocaína (Fig 1E) pero no de animales sin droga (Fig 1D). Esto podría representar un efecto epigenético de "cebado de genes" de ΔFosB (Robison y Nestler, 2011), y por lo tanto podría ser un mecanismo molecular de la incubación del ansia de cocaína (Pickens et al., 2011). Sin embargo, para que este cambio de cromatina esté relacionado causalmente con la incubación del deseo, tendría que aumentar con el tiempo. Será interesante determinar si este es el caso, y estudiar si otros genes muestran una regulación específica de subregión dependiente de FosB de la cocaína. También es importante tener en cuenta que el bucle de avance que describimos no conduce a una acumulación infinita de CaMKII o ΔFosB (Fig 1E); Descubrir el "freno" molecular responsable de esto es un objetivo importante de estudios futuros.

Las funciones conocidas de ΔFosB y CaMKII en varios sistemas experimentales y regiones cerebrales convergen en muchos niveles (Fig 6F). Ambas moléculas están íntimamente relacionadas con el crecimiento de la columna dendrítica: CaMKII interactúa con el citoesqueleto de actina (Okamoto et al., 2009), regula el tamaño de la cabeza de la columna vertebral (Matsuzaki y otros, 2004), y es necesario y suficiente para los aumentos inducidos por plasticidad en los filopodios y el número de sinapsis en cultivos de cortes organotípicos del hipocampo (Jourdain et al., 2003), while ΔFosB es necesario y suficiente para la formación de la espina dendrítica inducida por la cocaína en las MSN de NAc (Maze et al., 2010). Además, ambas moléculas se han asociado con la regulación de los receptores de glutamato AMPA. CaMKII no regula los niveles totales de subunidades del receptor AMPA, sino que impulsa la inserción de los receptores AMPA en las sinapsis y aumenta la conductancia del canal AMPA mediante la fosforilación de GluA1 en Ser831 en neuronas piramidales del hipocampo en cultivo y in vivo (revisado enMalinow y Malenka, 2002; Colbran y Brown, 2004)). Este aumento del tráfico de GluA1 a la sinapsis también se ha implicado en la acción crónica de la cocaína (Boudreau y Wolf, 2005). Además, las respuestas de comportamiento a la activación del receptor AMPA en NAc se potencian por la sobreexpresión de CaMKIIα de una manera dependiente del receptor de dopamina D1 (Singer et al., 2010). Se ha demostrado que la sobreexpresión a largo plazo de DΔNUMX de ΔFosB induce la transcripción de GluA1 en NAc (Kelz et al., 1999), que reduce las respuestas de AMPA mediadas a través de GluA1, mientras que aquí mostramos que la sobreexpresión de BFosB a corto plazo, así como la exposición a cocaína a corto plazo, no tienen efecto en esta subunidad (Fig 1). Sin embargo, recientemente hemos encontrado que la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo reduce las respuestas AMPA en MSN de tipo D1 en NAc (Grueter et al., 2013). Estos datos sugieren mecanismos temporalmente distintos que podrían constituir una serie de neuroadaptaciones a la cocaína dependientes del tiempo que subyacen a diferentes aspectos de la progresión de la adicción que aún no se conocen bien. A nivel de comportamiento, tanto CaMKII como ΔFosB son necesarios para la sensibilización locomotora a la cocaína (ver arriba), y ambos son necesarios para la autoadministración sostenida de cocaína en roedores (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), lo que sugiere que las dos proteínas son importantes para las adaptaciones conductuales a corto y largo plazo a la exposición al fármaco, aunque a través de mecanismos subyacentes en parte distintos. Presumiblemente, ΔFosB y CaMKII regulan tales adaptaciones complejas de comportamiento a través de cambios en la función sináptica NAc, aunque se necesita mucho más trabajo para vincular directamente los fenómenos sinápticos con el cambio de comportamiento.

La holoenzima CaMKII interactúa simultáneamente con una variedad de proteínas asociadas a sinapsis (Robison et al., 2005) que se piensa que regulan su orientación a la densidad postsináptica (PSD), un fenómeno que se sugiere es importante para la plasticidad sináptica. En particular, recientemente se demostró que la interacción de CaMKII con la subunidad GluN2B del receptor de glutamato tipo NMDA regula tanto la plasticidad sináptica como el aprendizaje (Halt et al., 2012). Mientras que el péptido AC3I imita el dominio autoinhibitorio de CaMKII y, por lo tanto, inhibe la actividad catalítica de la enzima, también bloquea múltiples interacciones proteína-proteína (Strack y otros, 2000; Robison et al., 2005). Por lo tanto, los efectos conductuales y morfológicos de HSV-GFP-AC3I aquí reportados podrían ocurrir a través de una fosforilación reducida de las proteínas diana CaMKII, cambios en la focalización CaMKII, o un cambio en el papel estructural propuesto de CaMKII en las sinapsis (Lisman et al., 2002).

La restricción del bucle ΔFosB-CaMKII propuesto a la cáscara NAc es de especial interés, ya que un trabajo reciente ha demostrado varias diferencias fisiológicas entre la cáscara NAc y el núcleo en respuesta a la administración de cocaína, una noción confirmada por nuestros datos imparciales iTRAQ (Tabla S1) . Los MSN con cáscara NAc muestran una depresión en la capacidad de cocción después de la cocaína crónica que se mantiene durante semanas, mientras que los MSN centrales de los mismos animales muestran un aumento transitorio (1 – 3 día) en la capacidad de cocción que regresa a los niveles basales dentro de 2 semanas (Kourrich y Thomas, 2009). Además, numerosas proteínas sinápticas están reguladas diferencialmente en la capa NAc vs núcleo de animales expuestos a cocaína crónica, incluyendo GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Como la anfetamina crónica induce CaMKIIα específicamente en la capa de NAc (Loweth et al., 2010), no es sorprendente que encontremos un efecto similar con la cocaína. Sin embargo, como la cocaína crónica induce el ΔFosB tanto en la capa de NAc como en el núcleo (Perrotti et al., 2008), y como mostramos que la inducción de CaMKIIα en la cáscara es dependiente de FosB, nuestros hallazgos proporcionan una nueva evidencia de distintos mecanismos de transcripción en el promotor CaMKIIα entre estas dos subregiones, que son responsables de la inducción selectiva de CaMKIIα en la cáscara.

Una gran parte del trabajo reciente se ha centrado en delinear las diferencias entre los MSN NAc de tipo D1 y D2. Aunque los receptores D1 y D2 están involucrados en los efectos gratificantes de la cocaína (Yo, 2010), un trabajo reciente demuestra que la activación optogenética de MSN tipo D1 aumenta las respuestas de comportamiento a la cocaína, mientras que la activación MSN tipo D2 tiene el efecto opuesto (Lobo et al., 2010). En línea con estos hallazgos, los ratones knockout para el receptor D1 son deficientes en la adquisición de autoadministración de cocaína (Caine et al., 2007), mientras que los nocauts D2 no son (Caine et al., 2002). La administración agonista de D1 directamente en NAc desencadena el comportamiento de búsqueda de cocaína en paradigmas de reincorporación (Yo, 2010). Curiosamente, este efecto requiere aumentos dependientes del receptor D1 en la actividad de CaMKII en la capa NAc, pero no en el núcleo (Anderson et al., 2008), un resultado que encaja perfectamente con el bucle ΔFosB-CaMKII específico de D1 y shell propuesto aquí.

Anteriormente informamos que la caseína quinasa-27 puede fosforilar Ser2 en ΔFosB (Ulery et al., 2006), sin embargo, establecemos aquí que CaMKII fosforila ΔFosB en este y otros sitios con una cinética y estequiometría mucho mayores y puede replicar la M aparente más alta_r observado para ΔFosB (Fig 5A) con exposición a la cocaína in vivo (Nestler, 2008). Ya sabemos que la fosforilación de Ser27 aumenta la estabilidad de ΔFosB y la actividad transcripcional (Ulery et al., 2006; Ulery y Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). El trabajo futuro ahora se centrará en la identificación y las consecuencias funcionales de los nuevos sitios de fosforilación de ΔFosB indicados en el presente estudio.

El bucle de avance descrito aquí proporciona un nuevo mecanismo plausible mediante el cual la administración repetida de cocaína conduce a anomalías progresivas en la NAc. Como tal, esta vía bioquímica puede proporcionar un objetivo importante para futuras intervenciones terapéuticas en trastornos adictivos. Debido a que CaMKII es ubicuo y se requiere para muchas funciones neuronales y de comportamiento basales, se ha evitado el uso directo de los inhibidores de CaMKII como tratamiento para la adicción. Nuestros datos sugieren que una orientación más sutil del mecanismo de inducción de CaMKII, que es específica para un tipo de célula individual y una subregión del circuito de recompensa del cerebro, podría proporcionar un objetivo terapéutico que evitaría las complicaciones de la inhibición sistémica de CaMKII.

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Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (EJN), el Centro de Proteómica NIDA-Yale DA018343 (AJR y EJN) y la Fundación Hartwell (AJR). Los autores desean agradecer a Gabby Rundenko por el generoso don de ΔFosB purificado y Roger Colbran por el generoso don de CaMKIIα purificado.

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