PLoS One. 25 de noviembre de 2013;8(11):e81245. doi: 10.1371/journal.pone.0081245.
Nishijima T , Kawakami M , Kita I.
Fuente
Laboratorio de Fisiología del Comportamiento, Escuela de Graduados de Ciencias de la Salud Humana, Universidad Metropolitana de Tokio, Tokio, Japón.
Resumen
El ejercicio físico mejora múltiples aspectos de la función del hipocampo. En consonancia con la idea de que la actividad neuronal es clave para promover las funciones neuronales, la literatura previa ha demostrado consistentemente que episodios agudos de ejercicio provocan la activación neuronal en el hipocampo. Los estímulos activadores repetidos conducen a la acumulación del factor de transcripción ΔFosB, que media la plasticidad neuronal a largo plazo.
En este estudio, probamos la hipótesis de que el ejercicio voluntario prolongado en rueda induce la expresión de ΔFosB en el hipocampo y examinamos cualquier posible efecto específico de región dentro de las subregiones del hipocampo a lo largo del eje dorsoventral. Ratones macho C57BL/6 fueron alojados con o sin una rueda de ejercicio durante 4 semanas. El ejercicio prolongado en rueda aumentó significativamente la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en todas las regiones del hipocampo medidas (es decir, en las subregiones DG, CA1 y CA3 tanto del hipocampo dorsal como ventral). Los resultados confirmaron que el ejercicio en rueda indujo una expresión específica de región de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en la corteza, lo que sugiere que el aumento uniforme de FosB/ΔFosB dentro del hipocampo no es una consecuencia inespecífica del ejercicio. Los datos de Western blot indicaron que el aumento de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en el hipocampo se debió principalmente al aumento de ΔFosB. Estos resultados sugieren que el ejercicio físico a largo plazo es un potente desencadenante de la inducción de ΔFosB en todo el hipocampo, lo que explicaría por qué el ejercicio puede mejorar las funciones dependientes tanto del hipocampo dorsal como del ventral. Curiosamente, observamos que la expresión de FosB/ΔFosB en el giro dentado se correlacionaba positivamente con el número de neuronas inmunorreactivas a la doblecortina (es decir, neuronas inmaduras).
Aunque los mecanismos por los cuales ΔFosB media la neurogénesis inducida por el ejercicio todavía son inciertos, estos datos implican que la neurogénesis inducida por el ejercicio es al menos dependiente de la actividad. Tomados en conjunto, nuestros resultados actuales sugieren que ΔFosB es un nuevo objetivo molecular involucrado en la regulación de la plasticidad del hipocampo inducida por el ejercicio.
Introducción
El ejercicio confiere diversos beneficios en aspectos moleculares, estructurales y funcionales del hipocampo en roedores [ 1 , 2 ], algunos de los cuales fueron respaldados por estudios en humanos [ 3 , 4 ]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a los cambios inducidos por el ejercicio en la plasticidad del hipocampo no se comprenden suficientemente. La literatura previa ha demostrado consistentemente que el ejercicio evoca la activación neuronal del hipocampo en roedores. Estudios inmunohistoquímicos utilizando c-Fos, un marcador de activación neuronal transitoria, han demostrado que tanto la carrera forzada como la voluntaria aumentaron la expresión de c-Fos en el giro dentado (DG), CA1 y subcampos CA3 del hipocampo de roedores [ 5 – 7 ]. Además, un estudio previo utilizando flujometría láser-Doppler (LDF) ha demostrado que correr suavemente en cinta rodante aumentó el flujo sanguíneo cerebral regional (rCBF), un marcador alternativo de activación neuronal, en el subcampo CA1 en ratas [ 8 ]. Los estudios inmunohistoquímicos permiten análisis detallados específicos de la región después de que el ejercicio ha cesado, mientras que la LDF permite la monitorización en tiempo real del rCBF en un área localizada durante el ejercicio. A pesar de las ventajas y limitaciones de cada estudio, estos estudios demostraron de manera similar un efecto de episodios agudos de ejercicio sobre la actividad neuronal del hipocampo. Estos resultados sugieren un mecanismo por el cual el ejercicio regular a largo plazo promueve la plasticidad del hipocampo al desencadenar repetidamente la activación neuronal [ 9 ].
El factor de transcripción ΔFosB, una isoforma de empalme truncada de FosB de longitud completa, es inducido por varios tipos de estímulos repetidos en regiones específicas del cerebro, donde se acumula gradualmente debido a su estabilidad única (una vida media de semanas) [10–12]. Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que los niveles elevados de ΔFosB median la plasticidad neural y conductual de larga duración asociada con estímulos particulares [11,13]. Por ejemplo, la administración crónica de drogas de abuso, como la cocaína y la morfina, comúnmente aumenta la expresión de osFosB en el núcleo accumbens, lo que representa uno de los mecanismos moleculares subyacentes al aumento de la sensibilidad a estas drogas. [11,14,15]. Sde manera similar a otros estímulos de recompensa, como la dieta alta en grasas y la experiencia sexual [16,17], lEl funcionamiento voluntario de la rueda a largo plazo también incrementó la inmunorreactividad de FosB / BFosB en el núcleo accumbens de ratas, lo que sugiere que la ejecución voluntaria es una recompensa natural para los roedores [18,19]. Sin embargo, según nuestro conocimiento, ninguna literatura ha examinado si la exposición repetida al ejercicio físico induce la expresión de BFosB en el hipocampo. Debido a que el ejercicio desencadena la activación neuronal en el hipocampo, planteamos la hipótesis de que el funcionamiento de la rueda voluntaria a largo plazo también induciría la expresión de ΔFosB en el hipocampo. Si bien los mecanismos exactos por los cuales ΔFosB regula la plasticidad del hipocampo siguen siendo inciertos, los estudios han demostrado que los ratones que carecen de FOC El gen muestra una alteración de la neurogénesis del hipocampo y un aumento del comportamiento similar a la depresión [20,21]. yoDe hecho, se sabe que el ejercicio mejora la neurogénesis y tiene propiedades antidepresivas [22–25]. yoSi nuestra hipótesis es correcta, ΔFosB sería un nuevo objetivo molecular potencial que media la plasticidad del hipocampo inducida por el ejercicio.
El hipocampo tiene un gradiente anatómico y funcional a lo largo de su eje longitudinal (dorsoventral) [ 26 ]. El hipocampo dorsal juega un papel clave en el aprendizaje espacial y la memoria [ 27 , 28 ], mientras que el hipocampo ventral está preferentemente involucrado en la regulación de los comportamientos emocionales [ 29 , 30 ]. Además, los estudios han demostrado que los estímulos fisiológicos inducen diferentes patrones de expresión de c-Fos en las porciones dorsal y ventral del hipocampo [ 31 – 33 ]. Dado que el ejercicio mejora las funciones dependientes tanto del hipocampo dorsal [ 34 – 37 ] como del ventral [ 24 , 25 , 38 ], es importante examinar si la carrera voluntaria a largo plazo causa una expresión regional específica de ΔFosB en el hipocampo.
La hipótesis principal de este estudio fue que el ejercicio voluntario prolongado en rueda induciría la expresión de ΔFosB en el hipocampo del ratón. Esta hipótesis se investigó mediante inmunohistoquímica de FosB/ΔFosB en las subregiones dorsal y ventral del hipocampo (DG, CA1 y CA3), con especial énfasis en la identificación de la inducción específica de cada región. Los resultados se confirmaron mediante Western blot, que se utilizó para identificar la isoforma de los productos del gen fosB inducidos en el hipocampo. También examinamos la corteza para detectar la inducción de FosB/ΔFosB específica de cada región, con el fin de descartar la posibilidad de que el ejercicio prolongado aumentara de forma inespecífica la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en el cerebro. Finalmente, se investigó la asociación correlativa entre la expresión de FosB/ΔFosB y la neurogénesis como primer paso para buscar las implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio en la regulación de la plasticidad hipocampal.
Materiales y Métodos
1: Declaración de animales y ética.
Se adquirieron veinte ratones macho C57BL/6 (de 8 semanas de edad) de un criadero comercial (SLC, Shizuoka, Japón). Diez ratones se utilizaron para el Experimento 1 y los otros diez para el Experimento 2. Los ratones se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura (22-24 °C) y luz (ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h, con luz encendida a las 05:00), y se les proporcionó alimento y agua ad libitum . Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad Metropolitana de Tokio.
En cada experimento, al llegar, los ratones fueron asignados aleatoriamente a un grupo de control (Control, n = 5) o a un grupo de corredores (Corredores, n = 5). Durante la primera semana, todos los ratones se alojaron en jaulas de plástico estándar en grupos (5 ratones/jaula) para la aclimatación inicial. Luego, los ratones Corredores fueron transferidos a una jaula equipada con una rueda de ejercicio (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, EE. UU.). Dado que se sabe que el aislamiento social suprime la neurogénesis inducida por el ejercicio en el hipocampo [ 39 ], los ratones Corredores se alojaron en grupo (5 ratones/jaula) durante 4 semanas adicionales. El número de rotaciones de la rueda se registró cada mañana y el peso corporal (g) se midió semanalmente.
2: Experimento 1. Examen inmunohistoquímico de la expresión de FosB / ΔFosB y neurogénesis del hipocampo
2.1: Perfusión y procesamiento de tejidos.
La mañana (0900 – 1100) después del último día del período de ejecución, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico y se perfundieron transcardialmente con solución salina fría. El cerebro se retiró rápidamente y se fijó posteriormente en 4% paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato 0.1 M (PBS, pH 7.4) durante la noche. El cerebro se crioprotegió luego en 30% de sacarosa en PBS y se congeló hasta su posterior procesamiento. Las secciones cerebrales coronales (40 μm) de un hemisferio se obtuvieron utilizando un microtomo de congelación y se recogieron en PBS con 0.01% de azida sódica.
2.2: inmunohistoquímica
Se seleccionó aleatoriamente una serie de seis secciones para la inmunotinción de FosB/ΔFosB. Una serie adyacente se utilizó para marcar la doblecortina (DCX), un marcador de neuronas inmaduras validado para evaluar la neurogénesis [ 40 , 41 ]. Después de inactivar la actividad de la peroxidasa endógena con H 2 O 2 al 1% en PBS, las secciones flotantes se preincubaron con una solución de bloqueo que contenía suero de caballo normal al 10% en PBS durante 2 h. Después de los lavados en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo pan-FosB (1:1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) diluido en PBS con Triton X-100 al 0.5% y BSA al 0.5% (PBST-BSA) durante 24 h a 4 °C. Otra serie de secciones se incubó con anticuerpo policlonal de cabra anti-DCX (1:500, sc-8066, Santa Cruz) en PBST-BSA durante 48 h a 4 °C. Las secciones se incubaron posteriormente con un anticuerpo secundario biotinilado apropiado (IgG anti-conejo, 1:1000, AP182B; IgG anti-cabra, 1:1000, AP180B, ambos anticuerpos de EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) en PBST-BSA durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se trataron con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit de peroxidasa Vectastain ABC, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, EE. UU.) durante 90 min siguiendo las instrucciones del fabricante. Los antígenos se visualizaron finalmente con 0.02 % de 3,3-diaminobencidina (DAB) en Tris-HCl 0.1 M (pH 7.6) que contenía 0.01 % de H₂O₂ . Para la inmunotinción de FosB/ ΔFosB , la reacción se intensificó con sulfato de níquel y amonio. Para la tinción de DCX, los núcleos celulares se contratiñeron con tinción de Nissl. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina y se colocaron cubreobjetos.
2.3: Cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / FosB utilizando un umbral de imagen
El anticuerpo pan-FosB utilizado en este estudio se generó contra una región interna compartida por la región N-terminal de FosB y ΔFosB, por lo que no puede discriminar entre las dos isoformas. Por lo tanto, las estructuras inmunoteñidas se describieron como núcleos inmunorreactivos a FosB/ΔFosB (FosB/ΔFosB-ir). Para una cuantificación ciega imparcial, las diapositivas se codificaron antes del análisis. El atlas del cerebro de ratón [ 42 ] se utilizó para identificar la ubicación de las siguientes regiones de interés (ROI): capa de células granulares (GCL) del DG (3 secciones), capa de células piramidales de CA1 (3 secciones) y CA3 (2-3 secciones) en el hipocampo dorsal (cerrado a -2.2 mm del bregma); DG (2 secciones), CA1 (2 secciones) y CA3 (2 secciones) en el hipocampo ventral (cerrado a -3.4 mm del bregma) ( Figura 4 , izquierda). Las secciones caudales contienen tanto la porción dorsal como la ventral del hipocampo, pero se seleccionó la porción ventral. En el DG, se analizaron por separado las láminas suprapiramidales (DGsp) e infrapiramidales (DGip). También se analizaron la corteza motora (2-3 secciones, cerradas a -0.6 mm del bregma), la corteza somatosensorial de barriles (2-3 secciones, cerradas a -0.6 mm del bregma), la corteza visual (3 secciones, cerradas a -2.9 mm del bregma), la corteza auditiva (3 secciones, cerradas a -2.9 mm del bregma) y el bulbo olfatorio (3 secciones, cerradas a +4.3 mm del bregma) ( Figura 6 , izquierda).
Se tomaron imágenes digitales (2070 × 1548 píxeles) de cada ROI utilizando un microscopio óptico (BX-51, Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD (DP-73, Olympus) y software de imágenes (cellSens, Olympus). La magnificación de la lente del objetivo fue de 10× para las ROI del hipocampo y de 4× para las ROI corticales. Para identificar la inmunorreactividad FosB/ΔFosB de moderada a fuerte ( Figura 1D–G ), utilizando varias secciones previamente, se optimizaron tanto los ajustes de adquisición de imágenes (intensidad de luz, tamaño del diafragma de campo, tiempo de exposición y balance de blancos) como los niveles de umbral para cada uno de los componentes RGB para las ROI del hipocampo y la corteza. El siguiente análisis se realizó bajo las condiciones optimizadas (1). Las ROI se seleccionaron mediante un polígono de forma irregular ( Figura 1A, B ) (2). La imagen fue umbralizada, lo que convirtió los núcleos FosB/ΔFosB-ir a un color rojo ( Figura 1C-G ) (3). El %ROI se calculó automáticamente de la siguiente manera: %ROI = (área convertida (en rojo)/área total de ROI) × 100.
Para validar este análisis de umbralización de imágenes, se seleccionaron aleatoriamente 20 regiones de diferentes áreas del cerebro con diferentes tamaños de región. Además de la cuantificación de umbralización de imágenes, se contó manualmente el número de núcleos FosB/ΔFosB-ir dentro de las regiones seleccionadas y se obtuvo la densidad de núcleos FosB/ΔFosB-ir dividiendo el número de núcleos FosB/ΔFosB-ir por el área medida (mm² ).
2.4: Cuantificación de neuronas inmaduras DCX-ir en el giro dentado
Las neuronas inmaduras DCX-ir en el DG de ratones Runner eran abundantes y se superponían, lo que dificultaba el recuento preciso del número de somas DCX-ir mediante microscopía óptica. Sin embargo, en un estudio previo, el análisis de Sholl para la evaluación morfológica mostró que cada neurona DCX-ir tiene, en promedio, una sola dendrita cuando se mide dentro de los 40 μm del soma [ 43 ]. Por lo tanto, se desarrolló el siguiente análisis original para permitir la cuantificación específica de regiones de neuronas DCX-ir.
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(1) Se proyectó una imagen del GCL en una pantalla de computadora utilizando un software de imágenes y un objetivo 40 × (2). En la imagen en vivo, se dibujó un segmento de línea (150 ± 0.1 μm) a lo largo de la mitad del GCL (Figura 2 y XNUMX) (3). Al cambiar la profundidad focal, el número de veces que se contaron las dendritas DCX-ir del segmento de línea (4). Las ROI (DGsp dorsal, dDGsp; DGip dorsal, dDGip; DGsp ventral, vDGsp; DGip ventral, vDGip) correspondieron a las regiones donde se analizó la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB (5). En cada ROI, los segmentos de línea 2 – 3 se dibujaron por sección y el número de cruces se promedió sobre las secciones de 2 – 3 por ratón. Debido a que el grosor del GCL es aproximadamente 60 – 80 μm, el número de cruces debe reflejar el número de neuronas DCX-ir dentro de la región restringida analizada.
Una imagen representativa de neuronas inmaduras DCX-ir y un segmento de línea (150 ± 0.1 μm) superpuestos para contar el número de cruces con dendritas DCX-ir.
3. Experimento 2. Identificación de la isoforma FosB / ΔFosB inducida por el funcionamiento de la rueda
3.1: Perfusión y procesamiento de tejidos.
Una cohorte adicional de ratones se trató como anteriormente en el Experimento 1. Después de 4 semanas de intervención, los ratones se perfundieron transcardialmente con solución salina fría bajo anestesia profunda. El hipocampo se diseccionó rápidamente y se congeló con nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C. Los hipocampos de cada ratón se homogeneizaron en tampón RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, EE. UU.) Que contiene proteasas inhibidores (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Alemania). Los lisados se centrifugaron durante 15 min a 5000 rpm a 4 ° C y se recogieron los sobrenadantes. Las concentraciones de proteínas se midieron con un kit de ensayo de proteínas BCA (#23227, Thermo Scientific, IL, EE. UU.).
3.2: Western blotting
Se sometieron a electroforesis cantidades iguales de proteína (30 μg / carril) en un gel de poliacrilamida 10%, luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, EE. UU.). La unión no específica se bloqueó preincubando la membrana para 1 h en TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) que contenía 3% BSA. La membrana se incubó con el anticuerpo pan-FosB (1: 1000) que se usó anteriormente para la inmunohistoquímica, se disolvió en TBST que contiene 3% BSA. Después de los lavados con TBST, la membrana se incubó con anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (1: 5000 en TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de los lavados con TBST, las bandas de proteínas se visualizaron mediante incubación con quimioluminiscencia mejorada (Western Lightning Plus-ECL, Perkin Elmer, MA, EE. UU.) Y se capturaron utilizando un Mini 4000 de Quant de Image Quant (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Luego, la membrana se reprobó con el anticuerpo anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (#2275, 1: 5000 en TBS-T, Trevigen, MD, EE. UU.) Como control de carga. La densidad óptica de las bandas de proteína se cuantificó utilizando Image-J y se normalizó al nivel de GAPDH.
4: análisis estadístico
Los cambios en el peso corporal de los ratones se analizaron mediante un ANOVA bidireccional de medidas repetidas (grupo × tiempo). Se utilizó una prueba t de Student para muestras independientes para determinar las diferencias estadísticas entre los grupos (Control vs. Corredor). El análisis de correlación de Pearson se utilizó para validar el análisis de inmunorreactividad de FosB/ΔFosB (conteo manual vs. umbralización de imagen) y para examinar la asociación entre el nivel de expresión de FosB/ΔFosB y el número de cruces de DCX en el DG. Los datos se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). El umbral de significación estadística se estableció en P < 0.05.
Resultados
1: Peso corporal y distancia de carrera en los Experimentos 1 y 2
Los cambios en el peso corporal de los ratones Control y Runner en los Experimentos 1 y 2 se agrupan y se muestran en la Figura 3. El ANOVA de medidas repetidas de dos vías indicó una interacción significativa (grupo × tiempo, F (4, 72) = 13.6, P < 0.001) y un efecto principal del grupo F (1, 18) = 6.07, P < 0.05), lo que indica un peso corporal significativamente menor en los ratones Runner. La distancia de carrera por jaula se muestra en la Tabla 1. Aunque la distancia de carrera precisa de cada ratón era incierta porque los ratones estaban alojados juntos, la observación regular confirmó que todos los ratones realizaban frecuentemente carreras en la rueda. Los ratones Runner en el Experimento 2 corrieron más que los del Experimento 1, pero la distancia de carrera media (m/día/jaula) fue constante a lo largo de cada experimento.
2: Validación de la cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / FosB utilizando el umbral de la imagen
Hubo una correlación significativa entre el área FosB/ΔFosB-ir obtenida mediante umbralización de imagen y la densidad de núcleos FosB/ΔFosB-ir obtenida mediante conteo manual (r = 0.941, P < 00001, Figura 4 ).
3: inmunorreactividad de FosB / FosB en el hipocampo
En la Figura 5 se muestran imágenes representativas de la inmunotinción de FosB/ΔFosB en los subcampos del hipocampo dorsal y ventral . En todas las ROI analizadas, la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en los ratones Runner ( Figura 5 , derecha) fue cualitativamente mayor que en los ratones Control ( Figura 5 , centro). En los ratones Runner, el análisis cuantitativo indicó un aumento significativo en el área FosB/ΔFosB-ir tanto en el subcampo del hipocampo dorsal (DGsp: P < 0.01; DGip: P < 0.01; CA1: P < 0.05; CA3: P < 0.05) como en el ventral (DGsp: P < 0.01; DGip: P < 0.05; CA1: P < 0.05; CA3: P < 0.05; Figura 6 ).
4: inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en la corteza
En la Figura 7 se muestran imágenes representativas de la inmunotinción de FosB/ΔFosB en las ROI corticales . El análisis cuantitativo reveló cambios dependientes de la región en la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB con el ejercicio prolongado ( Figura 8 ). En los ratones corredores, el área FosB/ΔFosB-ir fue significativamente mayor en la corteza motora ( P < 0.05) y en la corteza somatosensorial de barriles ( P < 0.05), pero no en la corteza visual ( P = 0.662) ni en el bulbo olfatorio ( P = 0.523). En la corteza auditiva, el área FosB/ΔFosB-ir tendió a aumentar en los ratones corredores ( P = 0.105).
5: Neurogenesis
En la Figura 9 se muestran imágenes representativas de la inmunotinción de DCX . En el hipocampo dorsal, la inmunorreactividad de DCX en los ratones Runner ( Figura 9 , derecha) fue cualitativamente mayor en comparación con los ratones Control ( Figura 9 , izquierda). En comparación con el hipocampo dorsal, la inmunorreactividad de DCX en el hipocampo ventral fue más débil tanto en los ratones Control como en los Runner. En los ratones Runner, el número de cruces fue significativamente mayor en el dDGsp ( P < 0.01) y el dDGip ( P < 0.01; Figura 10 ). En el hipocampo ventral, el número de cruces en los ratones Runner tendió a aumentar, pero no hubo diferencias significativas entre los grupos (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figura 10 ).
6: Correlación entre la expresión de FosB / FosB y la neurogénesis
Se realizó un análisis de correlación entre el área FosB/ΔFosB-ir y el número de cruces DCX ( Figura 11 ). Dado que cada conjunto de datos (p. ej., DGsp dorsal en ratones control) consta de solo 5 pares, el análisis se realizó primero con los 40 pares. Curiosamente, hubo una correlación significativa entre el área FosB/ΔFosB-ir y el número de cruces DCX (r = 0.885, P < 0.0001). Además, también se identificó una correlación significativa cuando el DG dorsal (r = 0.762, P < 0.05) y el DG ventral (r = 0.816, P < 0.01) se analizaron por separado.
7: Identificación de la isoforma FosB / ΔFosB inducida por el funcionamiento a largo plazo
Finalmente, para identificar la isoforma de los productos del gen fosB inducidos en el hipocampo en respuesta al ejercicio prolongado, los hipocampos de una cohorte adicional de ratones se sometieron a Western blot utilizando el mismo anticuerpo pan-FosB. Múltiples bandas de 35–37 kDa, que representan isoformas modificadas de ΔFosB [ 44 ], aumentaron significativamente en los ratones corredores en comparación con los ratones control ( Figura 12 , P < 0.01). Por otro lado, la isoforma FosB de 48 kDa fue indetectable en ambos grupos. Otra banda débilmente visible por encima de 25 kDa probablemente representa la isoforma Δ2ΔFosB (27 kDa). Hubo otras dos bandas, por encima de 50 kDa y 37 kDa, que probablemente se debieron a una unión no específica. Al cuantificarlas, no se encontraron diferencias en estas bandas no ΔFosB entre los grupos (datos no mostrados).
Discusión
En resumen, el presente estudio realizó primero un análisis inmunohistoquímico para examinar 1) si la marcha voluntaria a largo plazo de la rueda induce la expresión de FosB / ΔFosB en el hipocampo; y 2) si existe una respuesta específica de la región a lo largo de su eje dorso-ventral.
Cuatro semanas de ejercicio voluntario en rueda indujeron un aumento significativo de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en todas las regiones del hipocampo analizadas (es decir, las subregiones DG, CA1 y CA3 de las porciones dorsal y ventral del hipocampo). Confirmamos que la isoforma ΔFosB de 35–37 kDa fue el principal producto del gen fosB que se acumuló en respuesta al ejercicio prolongado. Estos resultados respaldan claramente la hipótesis de que el ejercicio regular a largo plazo es un potente desencadenante de la inducción de ΔFosB en todo el hipocampo, y que dicha inducción podría ser un nuevo mecanismo molecular mediante el cual el ejercicio afecta a diversos tipos de funciones dependientes del hipocampo dorsal y/o ventral.
1: Validación y limitaciones de la cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB utilizando el umbral de imagen
En este estudio se adoptó una técnica de umbralización de imágenes, ampliamente utilizada en estudios inmunohistoquímicos para contar el número de células diana y evaluar la morfología celular, para la cuantificación específica de la región de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB [ 15 , 45 , 46 ]. Se demostró una correlación significativa entre los niveles de inmunorreactividad de FosB/ΔFosB cuantificados mediante umbralización de imágenes y mediante recuento manual ( Figura 4 ). Sin embargo, debido a que la densidad y la superposición impidieron contar el número de núcleos FosB/ΔFosB-ir en áreas de alta densidad, la correlación demostrada solo implica la precisión del método de umbralización de imágenes cuando las áreas FosB/ΔFosB-ir representan < ~40% del área total de la ROI. Por lo tanto, se requiere una interpretación cuidadosa para las áreas FosB/ΔFosB-ir > 40% del área total de la ROI.
En particular, en el DG de los ratones Runner ( Figura 4 ), la expresión de FosB/ΔFosB se indujo notablemente al correr en la rueda, y la mayoría de los núcleos FosB/ΔFosB-ir se superponían. En estas áreas, el aumento de la inducción de la expresión de FosB/ΔFosB conlleva una mayor subestimación del nivel de expresión, independientemente del método de cuantificación utilizado (umbralización de imagen o recuento manual). Sin embargo, a pesar del riesgo de subestimación, es importante señalar que el presente estudio demostró con éxito aumentos significativos en el área FosB/ΔFosB-ir en el DG de los ratones Runner. Esto sugiere que las limitaciones metodológicas no comprometen nuestros hallazgos. Por el contrario, la posible subestimación aumenta la fiabilidad del hallazgo de que correr a largo plazo incrementó la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en el hipocampo.
2: Inducción uniforme de ΔFosB dentro del hipocampo a largo plazo
El hipocampo tiene gradientes anatómicos y funcionales a lo largo de su eje longitudinal [ 26 ], por lo que para el presente estudio se analizó por separado la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en las porciones dorsal y ventral del hipocampo. Los datos demostraron que correr a largo plazo aumentó uniformemente la expresión de FosB/ΔFosB en todas las ROI del hipocampo medidas. Esta inducción uniforme de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB podría ser causada de manera no específica por cambios metabólicos sistémicos asociados con correr a largo plazo. Sin embargo, es importante señalar que hubo aumentos específicos de región de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en la corteza. Este resultado está respaldado por hallazgos recientes que muestran que una sesión aguda de correr en cinta aumentó el flujo sanguíneo cerebral regional en el hipocampo, pero no en el bulbo olfatorio [ 8 ]. Además, Rhodes et al. (2003) demostraron que 7 días de carrera voluntaria en rueda indujeron la expresión de c-Fos en el DG y CA2/3 del hipocampo (no se midió CA1) y en la corteza sensorial, pero no en la corteza visual [ 47 ]. En conjunto, estos estudios sugieren que la inducción uniforme de la expresión de FosB/ΔFosB en el hipocampo no es una consecuencia inespecífica de la carrera a largo plazo. Curiosamente, Hawley et al. informaron recientemente que el estrés crónico impredecible aumentó la expresión de FosB/ΔFosB en el DG dorsal, pero no en el ventral, del hipocampo de la rata [ 48 ]. Con una investigación más profunda, los distintos patrones de inducción de FosB/ΔFosB, como los provocados por el ejercicio o el estrés, proporcionarán información adicional sobre los impactos dependientes del estímulo en el hipocampo.
El anticuerpo pan-FosB primario utilizado en este estudio reconoce todas las isoformas de las proteínas FosB. Mediante análisis de Western blot, observamos que las únicas isoformas que aumentaron en el hipocampo tras un ejercicio prolongado fueron las isoformas modificadas de ΔFosB (35–37 kDa), las únicas isoformas estables entre las proteínas de la familia Fos [ 11 ]. Este hallazgo concuerda con trabajos previos que utilizaron anticuerpos pan-Fos para demostrar que ΔFosB (35–37 kDa) es la proteína predominante de la familia Fos inducida en la corteza frontal por estrés crónico [ 44 ]. Por lo tanto, el aumento de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB en el hipocampo inducido por el ejercicio prolongado probablemente refleja el nivel de ΔFosB.
Se sabe menos sobre los efectos específicos del ejercicio en las regiones del hipocampo, tanto en aspectos moleculares como estructurales. Sin embargo, numerosos estudios conductuales indican un gran potencial para las mejoras inducidas por el ejercicio en las funciones del hipocampo dorsal y ventral. Se ha demostrado que el ejercicio mejora el aprendizaje y la memoria espacial [ 34–38 ] , y el procesamiento espacial y contextual depende principalmente del hipocampo dorsal [ 27 , 28 ]. Por otro lado, también se sabe que el ejercicio ejerce propiedades ansiolíticas y antidepresivas [ 24 , 25 , 38 ], y estas respuestas emocionales están reguladas predominantemente por el hipocampo ventral [ 29 , 30 ]. La inducción uniforme de ΔFosB por la carrera prolongada observada en este estudio sugiere que se produjeron cambios neuroplásticos en todo el hipocampo. Esto explicaría por qué el ejercicio puede afectar funciones dependientes tanto del hipocampo dorsal como del ventral.
3: análisis específico de la región de la neurogénesis inducida por el ejercicio
Una disociación funcional de la neurogénesis entre el hipocampo dorsal y ventral también ha estado recibiendo creciente atención [ 49 ]. En este estudio, aprovechando las características morfológicas de las neuronas inmaduras DCX-ir [ 43 ], contamos el número de intersecciones entre las dendritas DCX-ir y un segmento de línea trazado a lo largo del medio de la GCL. Esta medición no proporcionó el número total de neuronas DCX-ir en el DG, pero permitió la cuantificación específica de la región necesaria para realizar un análisis de correlación con los datos de expresión de FosB/ΔFosB (ver más adelante). Después de correr durante mucho tiempo, el número de neuronas DCX-ir aumentó significativamente en el DG dorsal, pero no en el ventral. Esto sugiere que el ejercicio podría estimular la neurogénesis de manera más notable en la porción dorsal en comparación con la ventral del DG. Sin embargo, estudios previos han informado resultados contradictorios en los que correr en rueda aumentó la neurogénesis tanto en el DG dorsal como en el ventral [ 50 , 51 ]. En el presente estudio, el número de cruces DCX-ir en el giro dentado ventral tendió a aumentar con el ejercicio, aunque el pequeño tamaño de la muestra (5 ratones por grupo) podría haber limitado la capacidad de detectar una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. Por lo tanto, es probable que sea prematuro descartar la posibilidad de que el ejercicio voluntario en rueda pueda estimular la neurogénesis en el hipocampo ventral. Se necesitan estudios más detallados para comprender la especificidad regional de la neurogénesis inducida por el ejercicio en relación con su proceso multifásico (proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular).
4: Implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio para regular la plasticidad del hipocampo
Finalmente, como primer paso para reconocer las implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio en el hipocampo, examinamos la relación de la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB con los cruces de DCX-ir en el DG dorsal y ventral y encontramos una correlación positiva significativa entre las dos variables. Aunque los mecanismos exactos por los cuales ΔFosB regula la neurogénesis inducida por el ejercicio siguen siendo inciertos, un estudio reciente demostró que los ratones fosB -nulos, que carecen de FosB, ΔFosB y Δ2ΔFosB (todos los productos de fosB ), exhibieron déficits en la neurogénesis basal del hipocampo, incluyendo una menor proliferación de células progenitoras neuronales, una mayor migración ectópica de neuronas recién nacidas y estructuras anormales del DG [ 20 ]. Sin embargo, estas alteraciones no se observaron en los ratones fosB ( d/d ), que carecen de FosB, pero no de ΔFosB/Δ2ΔFosB. Curiosamente, en ratones fosB nulos, la expresión de algunos genes relacionados con la neurogénesis, incluidos Vgf (factor de crecimiento nervioso inducible VGF) y Gal (prepropéptido de galanina), se redujo [ 20 ]. Dado que VGF y GAL son moléculas secretoras, una propuesta prometedora considera que las neuronas que expresan ΔFosB pueden regular la neurogénesis a través de la actividad autocrina/paracrina [ 20 ].
Además, cabe señalar que la región donde se induce ΔFosB mediante la carrera se superpone espacialmente con la región donde la actividad neurogénica es alta. Este hallazgo sugiere que la neurogénesis inducida por el ejercicio depende mínimamente de la actividad. La activación neuronal es clave para mantener y mejorar la función del sistema nervioso central [ 9 ], a través de mecanismos que incluyen la expresión y liberación del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) [ 52 , 53 ], la captación del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) sérico a través de la barrera hematoencefálica [ 54 , 55 ], la supresión de la apoptosis [ 56 ] y la regulación de la motilidad mitocondrial [ 57 ]. Por lo tanto, el presente estudio sugiere que el ejercicio a largo plazo desencadenó una activación neuronal repetida, evidente en el aumento de la expresión de ΔFosB, que contribuye a mejorar la plasticidad del hipocampo, potencialmente a través de estos múltiples mecanismos descritos anteriormente.
El presente estudio solo evaluó la neurogénesis inducida por el ejercicio y su asociación con la expresión de FosB/ΔFosB en el DG. Sin embargo, la inmunorreactividad de FosB/ΔFosB también se indujo en las subregiones CA1 y CA3. Si bien se requieren más estudios para comprender mejor las funciones de la expresión de ΔFosB inducida por el ejercicio en estas subregiones, la literatura previa ofrece una posibilidad prometedora. Guan et al. (2011) demostraron que la ablación específica de la quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5) en las neuronas piramidales CA1 o CA3 afectó la consolidación o recuperación de la memoria, respectivamente [ 58 ]. Curiosamente, la Cdk5 es el objetivo descendente de ΔFosB [ 59 ] y está involucrada en la regulación de la plasticidad sináptica [ 60 ]. Por lo tanto, la expresión de ΔFosB inducida por el ejercicio podría estar involucrada en la regulación de la plasticidad sináptica a través de la activación de Cdk5 en las subregiones CA1 y CA3.
Conclusión
Si bien se sabía que el ejercicio intenso inducía la expresión de proteínas de genes de respuesta temprana inmediata en el hipocampo, el presente estudio aporta la primera evidencia de que el ejercicio regular a largo plazo induce significativamente la expresión de ΔFosB en todo el hipocampo. Esta inducción uniforme de ΔFosB respalda la comprensión actual de que el ejercicio es una intervención no farmacológica eficaz capaz de mejorar múltiples funciones hipocampales. Junto con la correlación significativa entre la expresión de FosB/ΔFosB y la neurogénesis, estos datos son reveladores e indican la necesidad de realizar más estudios que diluciden el papel de ΔFosB en la mediación de los efectos del ejercicio sobre la función hipocampal, incluida la neurogénesis.
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Referencias