El ejercicio a largo plazo es un potente desencadenante para la inducción de BFosB en el hipocampo a lo largo del eje dorso-ventral (2013)

Más uno. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.

Nishijima T, Kawakami M, Kita I.

Fuente

Laboratorio de Fisiología del Comportamiento, Escuela de Graduados de Ciencias de la Salud Humana, Universidad Metropolitana de Tokio, Tokio, Japón.

Resumen

El ejercicio físico mejora múltiples aspectos de la función del hipocampo. De acuerdo con la noción de que la actividad neuronal es clave para promover las funciones neuronales, la literatura previa ha demostrado sistemáticamente que los episodios agudos de ejercicio evocan la activación neuronal en el hipocampo. Los estímulos de activación repetidos conducen a una acumulación del factor de transcripción ΔFosB, que media la plasticidad neural a largo plazo.

En este estudio, probamos la hipótesis de que la carrera de ruedas voluntaria a largo plazo induce la expresión de osFosB en el hipocampo, y examinamos los posibles efectos específicos de la región dentro de los subcampos del hipocampo a lo largo del eje dorso-ventral. Los ratones machos C57BL / 6 se alojaron con o sin rueda giratoria durante semanas 4. El funcionamiento de la rueda a largo plazo aumentó significativamente la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en todas las regiones del hipocampo medidas (es decir, en los subcampos DG, CA1 y CA3 del hipocampo dorsal y ventral). Los resultados confirmaron que la marcha de la rueda indujo la expresión específica de la región de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en la corteza, lo que sugiere que el aumento uniforme de FosB / ΔFosB dentro del hipocampo no es una consecuencia no específica de la carrera. Los datos de transferencia Western indicaron que el aumento de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB del hipocampo se debió principalmente al aumento de ΔFosB. Estos resultados sugieren que el ejercicio físico a largo plazo es un potente desencadenante de la inducción de FosB en todo el hipocampo, lo que explicaría por qué el ejercicio puede mejorar las funciones dependientes del hipocampo dorsal y ventral. Interesantemente, encontramos que la expresión de FosB / ΔFosB en la DG se correlacionó positivamente con el número de neuronas inmunoreactivas (es decir, inmaduras) de doublecortina.

Aunque los mecanismos por los cuales ΔFosB media la neurogénesis inducida por el ejercicio todavía son inciertos, estos datos implican que la neurogénesis inducida por el ejercicio es al menos dependiente de la actividad. Tomados en conjunto, nuestros resultados actuales sugieren que ΔFosB es un nuevo objetivo molecular involucrado en la regulación de la plasticidad del hipocampo inducida por el ejercicio.

Introducción

El ejercicio confiere diversos beneficios en los aspectos moleculares, estructurales y funcionales del hipocampo en roedores [1,2], algunos de los cuales fueron apoyados por estudios en humanos [3,4]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a los cambios inducidos por el ejercicio en la plasticidad del hipocampo no se comprenden suficientemente. La literatura anterior ha demostrado consistentemente que el ejercicio evoca la activación neuronal del hipocampo en roedores. Los estudios inmunohistoquímicos que utilizan c-Fos, un marcador de activación neuronal transitoria, han demostrado que tanto la ejecución forzada como la voluntaria aumentaron la expresión de c-Fos en los subcampos dentate gyrus (DG), CA1 y CA3 del hipocampo de roedores [5–7]. Además, un estudio previo en el que se utilizó la flujometría láser-Doppler (LDF) demostró que una carrera suave en la cinta rodante incrementó el flujo sanguíneo cerebral regional (rCBF), un marcador alternativo de activación neuronal, en el subcampo CA1 en ratas [8]. Los estudios inmunohistoquímicos permiten análisis detallados específicos de la región después de que el ejercicio haya cesado, mientras que LDF permite el monitoreo en tiempo real de rCBF en un área localizada durante el ejercicio. A pesar de las ventajas y limitaciones de cada estudio, estos estudios demostraron de manera similar el efecto de los episodios agudos de ejercicio sobre la actividad neuronal del hipocampo. Estos resultados sugieren un mecanismo por el cual el ejercicio regular a largo plazo promueve la plasticidad del hipocampo al desencadenar repetidamente la activación neuronal [9].

El factor de transcripción ΔFosB, una isoforma de empalme truncada de FosB de longitud completa, es inducido por varios tipos de estímulos repetidos en regiones específicas del cerebro, donde se acumula gradualmente debido a su estabilidad única (una vida media de semanas) [10–12]. Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que los niveles elevados de ΔFosB median la plasticidad neural y conductual de larga duración asociada con estímulos particulares [11,13]. Por ejemplo, la administración crónica de drogas de abuso, como la cocaína y la morfina, comúnmente aumenta la expresión de osFosB en el núcleo accumbens, lo que representa uno de los mecanismos moleculares subyacentes al aumento de la sensibilidad a estas drogas. [11,14,15]. Sde manera similar a otros estímulos de recompensa, como la dieta alta en grasas y la experiencia sexual [16,17], lEl funcionamiento voluntario de la rueda a largo plazo también incrementó la inmunorreactividad de FosB / BFosB en el núcleo accumbens de ratas, lo que sugiere que la ejecución voluntaria es una recompensa natural para los roedores [18,19]. Sin embargo, según nuestro conocimiento, ninguna literatura ha examinado si la exposición repetida al ejercicio físico induce la expresión de BFosB en el hipocampo. Debido a que el ejercicio desencadena la activación neuronal en el hipocampo, planteamos la hipótesis de que el funcionamiento de la rueda voluntaria a largo plazo también induciría la expresión de ΔFosB en el hipocampo. Si bien los mecanismos exactos por los cuales ΔFosB regula la plasticidad del hipocampo siguen siendo inciertos, los estudios han demostrado que los ratones que carecen de FOC El gen muestra una alteración de la neurogénesis del hipocampo y un aumento del comportamiento similar a la depresión [20,21]. yoDe hecho, se sabe que el ejercicio mejora la neurogénesis y tiene propiedades antidepresivas [22–25]. yoSi nuestra hipótesis es correcta, ΔFosB sería un nuevo objetivo molecular potencial que media la plasticidad del hipocampo inducida por el ejercicio.

El hipocampo tiene un gradiente anatómico y funcional a lo largo de su eje longitudinal (dorso-ventral) [26]. El hipocampo dorsal juega un papel clave en el aprendizaje espacial y la memoria [27,28], mientras que el hipocampo ventral participa preferentemente en la regulación de las conductas emocionales [29,30]. Además, los estudios han demostrado que los estímulos fisiológicos inducen diferentes patrones de expresión de c-Fos en las porciones dorsal y ventral del hipocampo [31–33]. Porque el ejercicio mejora tanto la dorsal [34–37] y funciones dependientes del hipocampo ventral [24,25,38], es importante examinar si la ejecución voluntaria a largo plazo causa la expresión específica de la región de ΔFosB en el hipocampo.

La hipótesis principal de este estudio fue que el funcionamiento de la rueda voluntaria a largo plazo induciría la expresión de ΔFosB en el hipocampo del ratón. Esta hipótesis fue investigada por la inmunohistoquímica FosB / ΔFosB en los subcampos hipocampal dorsal y ventral, DG, CA1 y CA3, con un énfasis adicional en la identificación de la inducción específica de la región. Los resultados se confirmaron mediante Western Blot, que se utilizó para identificar la isoforma de FOC Productos genéticos inducidos en el hipocampo. También examinamos el córtex para determinar la inducción de FosB / ΔFosB específica de la región para descartar la posibilidad de que el ejercicio a largo plazo no específicamente aumentara la inmunoreactividad de FosB / ΔFosB en el cerebro. Finalmente, se investigó la asociación correlativa entre la expresión de FosB / ΔFosB y la neurogénesis como primer paso en la búsqueda de las implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio para regular la plasticidad del hipocampo.

Materiales y Métodos

1: Declaración de animales y ética.

Se compraron veinte ratones C57BL / 6 machos (semanas 8 de edad) de un criador comercial (SLC, Shizuoka, Japón). Se usaron diez ratones para el Experimento 1, y los otros diez para el Experimento 2. Los ratones se alojaron en condiciones controladas de temperatura (22 – 24 ° C) y luz (12 / 12-h ciclo luz / oscuridad, luz encendida en 0500), y se les proporcionó comida y agua. ad libitum. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental de los Animales de la Universidad Metropolitana de Tokio.

En cada experimento, al llegar, los ratones se asignaron al azar a un grupo de control (Control, n = 5) o un grupo de ejecución (Runner, n = 5). Durante la primera semana, todos los ratones se alojaron en jaulas de plástico estándar en grupos (ratones / jaula 5) para la aclimatación inicial. Luego, los ratones Runner se transfirieron a una jaula equipada con una rueda (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, EE. UU.). Porque se sabe que el aislamiento social suprime la neurogénesis inducida por el ejercicio en el hipocampo [39], Los ratones Runner se alojaron como un grupo (ratones / jaula 5) durante una semana 4 adicional. El número de rotaciones de las ruedas se registró cada mañana y el peso corporal (g) se midió semanalmente.

2: Experimento 1. Examen inmunohistoquímico de la expresión de FosB / ΔFosB y neurogénesis del hipocampo

2.1: Perfusión y procesamiento de tejidos.

La mañana (0900 – 1100) después del último día del período de ejecución, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico y se perfundieron transcardialmente con solución salina fría. El cerebro se retiró rápidamente y se fijó posteriormente en 4% paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato 0.1 M (PBS, pH 7.4) durante la noche. El cerebro se crioprotegió luego en 30% de sacarosa en PBS y se congeló hasta su posterior procesamiento. Las secciones cerebrales coronales (40 μm) de un hemisferio se obtuvieron utilizando un microtomo de congelación y se recogieron en PBS con 0.01% de azida sódica.

2.2: inmunohistoquímica

Se seleccionó al azar una de cada seis series de secciones para la inmunotinción de FosB / ΔFosB. Se usó una serie adyacente para etiquetar la doblecortina (DCX), un marcador de neuronas inmaduras validado para evaluar la neurogénesis [40,41]. Después de apagar la actividad peroxidasa endógena con 1% H2O2 En PBS, las secciones de flotación libre se preincubaron con una solución de bloqueo que contenía 10% de suero de caballo normal en PBS para 2 h. Luego de los enjuagues en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo pan-FosB (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) Diluido en PBS con 0.5% Triton X-100 y 0.5% BSA (PBST) -BSA) para 24 h en 4 ° C. Otra serie de secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de cabra anti-DCX (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) en PBST-BSA para 48 h a 4 ° C. Las secciones se incubaron adicionalmente con un anticuerpo secundario biotinilado apropiado (IgG anti-conejo, 1: 1000, AP182B; IgG anti-cabra, 1: 1000, AP180B, ambos anticuerpos de EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) En PBST-BSA Para 2 h a temperatura ambiente. Luego, las secciones se trataron con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit de peroxidasa Vectastain ABC, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, EE. UU.) Para 90 min siguiendo las instrucciones del fabricante. Los antígenos se visualizaron finalmente con 0.02% 3,3-diaminobenzidina (DAB) en 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) que contenía 0.01% H2O2. Para la inmunotinción con FosB / FosB, la reacción se intensificó con sulfato de níquel amonio. Para la tinción con DCX, los núcleos celulares se contrastaron con la tinción con Nissl. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina y se colocaron cubreobjetos.

2.3: Cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / FosB utilizando un umbral de imagen

El anticuerpo pan-FosB utilizado en este estudio se generó contra una región interna compartida por FosB y la región N-terminal de ΔFosB, por lo que no se puede discriminar entre las dos isoformas. Por lo tanto, las estructuras inmunoteñidas se describieron como núcleos inmunorreactivos de FosB / ΔFosB (FosB / ΔFosB-ir). Para una cuantificación ciega imparcial, las diapositivas se codificaron antes del análisis. El atlas del cerebro del ratón [42] se usó para identificar la ubicación de las siguientes regiones de interés (ROI): capa celular de gránulos (GCL) de DG (secciones 3), capa de células piramidales de CA1 (secciones 3) y CA3 (secciones 2-3) en el hipocampo dorsal (cerrado a -2.2 mm desde el bregma); DG (secciones 2), CA1 (secciones 2) y CA3 (secciones 2) en el hipocampo ventral (cerrado a -3.4 mm desde el bregma) (Figura 4 y XNUMX, izquierda). Las secciones caudales contienen tanto la porción dorsal como la ventral del hipocampo, pero la porción ventral fue el objetivo. En la DG, las palas suprapiramidales (DGsp) e infrapiramidales (DGip) se analizaron por separado. Corteza motora (secciones 2 – 3, cerrada a -0.6 mm desde la bregma), corteza del barril somatosensorial (secciones 2 – 3, cerrada a -0.6 mm desde la bregma), corteza visual (secciones 3, cerrada a -2.9 mm mm desde la bregma), corteza auditiva (secciones 3, cerradas a -2.9 mm desde la bregma), y bulbo olfativo (secciones 3, cerradas a + 4.3 mm desde la bregma) también fueron analizadas (Figura 6 y XNUMX, izquierda).

Figura 4 y XNUMX  

Se encontró una correlación significativa entre el área de FosB / ΔFosB-ir (% ROI) obtenida por el umbral de la imagen y la densidad de los núcleos de FosB / ΔFosB-ir (núcleos / mm).2) obtenido por conteo manual.
Figura 6 y XNUMX  

Cuantificación del área FosB / ΔFosB-ir en las ROI del hipocampo.

Las imágenes digitales (2070 × 1548 píxeles) de cada ROI se tomaron utilizando un microscopio óptico (BX-51, Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD (DP-73, Olympus) y un software de imágenes (cellSens, Olympus). la ampliación objetiva de la lente fue 10 × para las ROI del hipocampo y 4 × para las ROI corticales. Para identificar la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB de moderada a fuerte (Figura 1D – G), utilizando varias secciones de antemano, tanto la configuración de adquisición de imagen (intensidad de luz, el tamaño de la parada de campo, el tiempo de exposición y el balance de blancos) como los niveles de umbral para cada uno de los componentes RGB se optimizaron para las ROI del hipocampo y la cortical. El siguiente análisis se realizó bajo las condiciones optimizadas (1). Las ROI fueron seleccionadas por un polígono de forma irregular (Figura 1A, B) (2). La imagen fue un umbral, que convirtió los núcleos FosB / ΔFosB-ir a un color rojo (Figura 1C-G) (3). El% ROI se calculó automáticamente de la siguiente manera:% ROI = (área convertida (en rojo) / área total de ROI) × 100.

Figura 1 y XNUMX  

Imágenes representativas que ilustran los pasos involucrados en el análisis de umbral de imagen de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB.

Para validar este análisis de umbral de imagen, las regiones 20 se seleccionaron al azar de diferentes áreas del cerebro con diferentes tamaños de región. Además de la cuantificación del umbral de la imagen, el número de núcleos FosB / ΔFosB-ir dentro de las regiones seleccionadas se contó manualmente y la densidad de los núcleos FosB / ΔFosB-ir se obtuvo al dividir el número de núcleos FosB / ΔFosB-ir por el medido área (mm2).

2.4: Cuantificación de neuronas inmaduras DCX-ir en el giro dentado

Las neuronas inmaduras de DCX-ir en la DG de ratones Runner eran abundantes y se superponían, lo que hacía difícil contar con precisión el número discreto de soma de DCX usando un microscopio óptico. Sin embargo, en un estudio anterior, el análisis de Sholl para la evaluación morfológica mostró que cada neurona DCX-ir tiene, en promedio, una dendrita única cuando se mide dentro de 40 μm del soma [43]. Por lo tanto, el siguiente análisis original se desarrolló para permitir la cuantificación específica de la región de las neuronas DCX-ir.

  • (1) Se proyectó una imagen del GCL en una pantalla de computadora utilizando un software de imágenes y un objetivo 40 × (2). En la imagen en vivo, se dibujó un segmento de línea (150 ± 0.1 μm) a lo largo de la mitad del GCL (Figura 2 y XNUMX) (3). Al cambiar la profundidad focal, el número de veces que se contaron las dendritas DCX-ir del segmento de línea (4). Las ROI (DGsp dorsal, dDGsp; DGip dorsal, dDGip; DGsp ventral, vDGsp; DGip ventral, vDGip) correspondieron a las regiones donde se analizó la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB (5). En cada ROI, los segmentos de línea 2 – 3 se dibujaron por sección y el número de cruces se promedió sobre las secciones de 2 – 3 por ratón. Debido a que el grosor del GCL es aproximadamente 60 – 80 μm, el número de cruces debe reflejar el número de neuronas DCX-ir dentro de la región restringida analizada.
    Figura 2 y XNUMX  

    Una imagen representativa de neuronas inmaduras DCX-ir y un segmento de línea (150 ± 0.1 μm) superpuestos para contar el número de cruces con dendritas DCX-ir.

3. Experimento 2. Identificación de la isoforma FosB / ΔFosB inducida por el funcionamiento de la rueda

3.1: Perfusión y procesamiento de tejidos.

Una cohorte adicional de ratones se trató como anteriormente en el Experimento 1. Después de 4 semanas de intervención, los ratones se perfundieron transcardialmente con solución salina fría bajo anestesia profunda. El hipocampo se diseccionó rápidamente y se congeló con nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C. Los hipocampos de cada ratón se homogeneizaron en tampón RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, EE. UU.) Que contiene proteasas inhibidores (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Alemania). Los lisados ​​se centrifugaron durante 15 min a 5000 rpm a 4 ° C y se recogieron los sobrenadantes. Las concentraciones de proteínas se midieron con un kit de ensayo de proteínas BCA (#23227, Thermo Scientific, IL, EE. UU.).

3.2: Western blotting

Se sometieron a electroforesis cantidades iguales de proteína (30 μg / carril) en un gel de poliacrilamida 10%, luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, EE. UU.). La unión no específica se bloqueó preincubando la membrana para 1 h en TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) que contenía 3% BSA. La membrana se incubó con el anticuerpo pan-FosB (1: 1000) que se usó anteriormente para la inmunohistoquímica, se disolvió en TBST que contiene 3% BSA. Después de los lavados con TBST, la membrana se incubó con anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (1: 5000 en TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de los lavados con TBST, las bandas de proteínas se visualizaron mediante incubación con quimioluminiscencia mejorada (Western Lightning Plus-ECL, Perkin Elmer, MA, EE. UU.) Y se capturaron utilizando un Mini 4000 de Quant de Image Quant (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Luego, la membrana se reprobó con el anticuerpo anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (#2275, 1: 5000 en TBS-T, Trevigen, MD, EE. UU.) Como control de carga. La densidad óptica de las bandas de proteína se cuantificó utilizando Image-J y se normalizó al nivel de GAPDH.

4: análisis estadístico

Los cambios en el peso corporal del ratón se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías (grupo x tiempo). Se usó una prueba t no pareada para determinar las diferencias estadísticas entre los grupos (Control vs. Runner). El análisis de correlación de Pearson se utilizó para validar el análisis de inmunorreactividad de FosB / ΔFosB (conteo manual vs. umbral de imagen) y para examinar la asociación entre el nivel de expresión de FosB / ΔFosB y el número de cruces de DCX en la DG. Los datos se presentaron como media ± SEM. El umbral de significación estadística se estableció en P <0.05.

Resultados

1: Peso corporal y distancia de carrera en los Experimentos 1 y 2

Los cambios en el peso corporal de los ratones Control y Runner en los Experimentos 1 y 2 se agrupan y se muestran en Figura 3 y XNUMX. El ANOVA de medidas repetidas de dos vías indicó una interacción significativa (grupo x tiempo, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) y efecto principal del grupo F(1, 18) = 6.07, P <0.05), lo que indica un peso corporal significativamente menor en ratones Runner. La distancia de carrera por jaula se muestra en Tabla 1. Aunque la distancia de ejecución precisa de cada ratón era incierta porque los ratones estaban alojados juntos, la observación regular confirmó que todos los ratones realizaban con frecuencia el funcionamiento de la rueda. Los ratones Runner en el Experimento 2 corrieron más tiempo que los del Experimento 1, pero la distancia media de carrera (m / día / jaula) fue consistente en cada experimento.

Figura 3 y XNUMX  

Cambios en los pesos corporales de los ratones Control y Runner del Experimento 1 y 2.
Tabla 1  

Promedio de la distancia de carrera diaria para cada semana durante el período de ejecución de 4-weeks.

2: Validación de la cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / FosB utilizando el umbral de la imagen

Hubo una correlación significativa entre el área de FosB / ΔFosB-ir obtenida por el umbral de la imagen y la densidad de los núcleos de FosB / ΔFosB-ir obtenida por conteo manual (r = 0.941, P <00001, Figura 4 y XNUMX).

3: inmunorreactividad de FosB / FosB en el hipocampo

Imágenes representativas de la inmunotinción de FosB / FosB en los subcampos del hipocampo dorsal y ventral se mostraron en Figura 5 y XNUMX. En todas las ROI analizadas, la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en ratones Runner (Figura 5 y XNUMX, derecha) fue cualitativamente superior a la de los ratones de control (Figura 5 y XNUMX, centro). En los ratones Runner, el análisis cuantitativo indicó un aumento significativo en el área de FosB / ΔFosB-ir en la zona dorsal (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) y los subcampos del hipocampo ventral (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figura 6 y XNUMX).

Figura 5 y XNUMX  

Imágenes representativas de la inmunotinción de FosB / FosB en las ROI del hipocampo dorsal y ventral.

4: inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en la corteza

Imágenes representativas de la inmunotinción de FosB / ΔFosB en las ROI corticales se muestran en Figura 7 y XNUMX. El análisis cuantitativo reveló cambios dependientes de la región en la inmunorreactividad de FosB / FosB con funcionamiento a largo plazo (Figura 8 y XNUMX). En ratones Runner, el área de FosB / ΔFosB-ir fue significativamente mayor en la corteza motora (P <0.05) y la corteza somatosensorial del barril (P <0.05), pero no en la corteza visual (P = 0.662) o el bulbo olfativo (P = 0.523). En la corteza auditiva, el área FosB / ΔFosB-ir tendió hacia un aumento en los ratones Runner (P = 0.105).

Figura 7 y XNUMX  

Imágenes representativas de la inmunotinción de FosB / FosB en las ROI corticales.
Figura 8 y XNUMX  

Cuantificación del área FosB / ΔFosB-ir en las ROI corticales.

5: Neurogenesis

Imágenes representativas de la inmunotinción DCX se muestran en Figura 9 y XNUMX. En el hipocampo dorsal, la inmunorreactividad de DCX en ratones Runner (Figura 9 y XNUMX, derecha) fue cualitativamente superior en comparación con los ratones de control (Figura 9 y XNUMX, izquierda). En comparación con el hipocampo dorsal, la inmunorreactividad de DCX en el hipocampo ventral fue más débil en los ratones Control y Runner. En ratones Runner, el número de cruces fue significativamente mayor en el dDGsp (P <0.01) y dDGip (P <0.01; Figura 10 y XNUMX). En el hipocampo ventral, el número de cruces en ratones Runner tendió a aumentar, pero no hubo diferencias significativas entre los grupos (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figura 10 y XNUMX).

Figura 9 y XNUMX  

Imágenes representativas de la inmunotinción DCX-ir de la DG dorsal y ventral obtenidas de los cerebros de los ratones Control y Runner, respectivamente.
Figura 10 y XNUMX  

Cuantificación de las neuronas inmaduras DCX-ir en la DG.

6: Correlación entre la expresión de FosB / FosB y la neurogénesis

Se realizó un análisis de correlación entre el área FosB / ΔFosB-ir y el número de cruces DCX (Figura 11 y XNUMX). Debido a que cada conjunto de datos (p. Ej., DGsp dorsal en ratones de control) consta de solo pares 5, el análisis se realizó primero con todos los pares 40. Curiosamente, hubo una correlación significativa entre el área FosB / ΔFosB-ir y el número de cruces DCX (r = 0.885, P <0.0001). Además, también se identificó una correlación significativa cuando la DG dorsal (r = 0.762, P <0.05) y el DG ventral (r = 0.816, P <0.01) se analizaron por separado.

Figura 11 y XNUMX  

Asociación correlativa entre la expresión de FosB / FosB y la neurogénesis.

7: Identificación de la isoforma FosB / ΔFosB inducida por el funcionamiento a largo plazo

Finalmente, identificar la isoforma de FOC Los productos genéticos inducidos en el hipocampo en respuesta a la ejecución a largo plazo, los hipocampos de una cohorte adicional de ratones se sometieron a transferencia Western utilizando el mismo anticuerpo pan-FosB. Múltiples bandas de 35 – 37 kDa, que representan isoformas modificadas de ΔFosB [44], aumentaron significativamente en ratones Runner versus Control (Figura 12 y XNUMX, P <0.01). Por otro lado, la isoforma FosB de 48 kDa fue indetectable en cualquier grupo. Otra banda débilmente visible por encima de 25 kDa probablemente representa la isoforma Δ2ΔFosB (27 kDa). Había otras dos bandas, por encima de 50 kDa y 37 kDa, que probablemente se debían a una unión no específica. Cuando se cuantificó, no se encontraron diferencias en estas bandas no ΔFosB entre los grupos (datos no mostrados).

Figura 12 y XNUMX 

Identificación de las isoformas de las FOC Producto genético inducido por el funcionamiento a largo plazo.

Discusión

En resumen, el presente estudio realizó primero un análisis inmunohistoquímico para examinar 1) si la marcha voluntaria a largo plazo de la rueda induce la expresión de FosB / ΔFosB en el hipocampo; y 2) si existe una respuesta específica de la región a lo largo de su eje dorso-ventral.

Cuatro semanas de marcha voluntaria de la rueda indujeron un aumento significativo en la inmunorreactividad de FosB / FosB en todas las regiones del hipocampo analizadas (es decir, los subcampos DG, CA1 y CA3 de las porciones dorsal y ventral del hippocampus). Confirmamos que la isoforma 35 – 37kDa ΔFosB fue la principal FOC Producto genético que se acumula en respuesta al funcionamiento a largo plazo. Estos resultados apoyan claramente la hipótesis de que el ejercicio regular a largo plazo es un potente desencadenante para la inducción de BFosB en todo el hipocampo, y que su inducción podría ser un nuevo mecanismo molecular por el cual el ejercicio afecta a varios tipos de funciones dependientes del hipocampo dorsal y / o ventral.

1: Validación y limitaciones de la cuantificación de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB utilizando el umbral de imagen

En este estudio se adoptó una técnica de umbralización de imágenes, ampliamente utilizada en estudios inmunohistoquímicos para contar el número de células diana y para evaluar la morfología celular, para la cuantificación específica de la región de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB [15,45,46]. Se demostró una correlación significativa entre los niveles de inmunorreactividad de FosB / FosB cuantificados por el umbral de la imagen y por el conteo manual (Figura 4 y XNUMX). Sin embargo, debido a que la densidad y la superposición impidieron contar el número de núcleos de FosB / ΔFosB-ir en áreas muy densas, la correlación demostrada solo implica la precisión del método de umbral de imagen cuando las áreas de FosB / ΔFosB-ir representan <~ 40% del ROI total zona. Por lo tanto, se requiere una interpretación cuidadosa para áreas de FosB / ΔFosB-ir> 40% del área de ROI total.

En particular, en la DG de ratones Runner (Figura 4 y XNUMX), La expresión de FosB / ΔFosB fue inducida en gran medida por la marcha de la rueda y la mayoría de los núcleos de FosB / ΔFosB-ir se superponían. En estas áreas, el aumento de la inducción de la expresión de FosB / ΔFosB conduce a una mayor subestimación del nivel de expresión, independientemente del método de cuantificación utilizado (umbral de imagen o conteo manual). Sin embargo, a pesar del riesgo de subestimación, es importante tener en cuenta que el presente estudio demostró con éxito aumentos significativos en el área de FosB / ΔFosB-ir en la DG de ratones Runner. Esto sugiere que las limitaciones metodológicas no comprometen nuestros hallazgos. En cambio, la subestimación potencial aumenta la confiabilidad del hallazgo de que la ejecución a largo plazo incrementó la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en el hipocampo.

2: Inducción uniforme de ΔFosB dentro del hipocampo a largo plazo

El hipocampo tiene gradientes anatómicos y funcionales a lo largo de su eje longitudinal [26], así que para el presente estudio se analizó por separado la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en las porciones dorsal y ventral del hipocampo. Los datos demostraron que la ejecución a largo plazo aumentó de manera uniforme la expresión de FosB / ΔFosB en todas las ROI del hipocampo medidas. Esta inducción uniforme de la inmunorreactividad de FosB / FosB puede ser causada no específicamente por cambios metabólicos sistémicos asociados con la ejecución a largo plazo. Sin embargo, es importante tener en cuenta que hubo aumentos específicos de la región de la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en la corteza. Este resultado está respaldado por hallazgos recientes que muestran que un ataque agudo de cinta rodante incrementó el flujo sanguíneo cerebral regional en el hipocampo, pero no en el bulbo olfativo [8]. Además, Rhodes et al. (2003) demostró que los días 7 de marcha voluntaria de la rueda indujeron la expresión de c-Fos en el DG y CA2 / 3 del hipocampo (no se midió el CA1) y en la corteza sensorial, pero no en la corteza visual [47]. En conjunto, estos estudios sugieren que la inducción uniforme de la expresión de FosB / FosB en el hipocampo no es una consecuencia inespecífica de la ejecución a largo plazo. Curiosamente, Hawley et al. recientemente informó que el estrés crónico impredecible incrementó la expresión de FosB / FosB en la dorsal, pero no en el ventral, DG del hipocampo de rata [48]. Con más investigación, los distintos patrones de inducción de FosB / ΔFosB, como los provocados por el ejercicio o el estrés, proporcionarán una visión continua de los impactos dependientes del estímulo en el hipocampo.

Se sabe que el anticuerpo pan-FosB primario utilizado en este estudio reconoce todas las isoformas de las proteínas FosB. En el análisis de transferencia Western, encontramos que las únicas isoformas que aumentaron en el hipocampo después de una ejecución prolongada fueron las isoformas modificadas de ΔFosB (35 – 37 kDa), las únicas isoformas estables entre las proteínas de la familia Fos [11]. Este hallazgo está de acuerdo con el trabajo previo que utiliza el anticuerpo pan-Fos para demostrar que 35-37 kDa ΔFosB es la proteína de la familia Fos predominante inducida en la corteza frontal por el estrés crónico [44]. Por lo tanto, el aumento en la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB del hipocampo inducida aquí por el funcionamiento a largo plazo probablemente refleja el nivel de ΔFosB.

Se sabe menos sobre los efectos específicos de la región del ejercicio en los aspectos moleculares y estructurales del hipocampo. Sin embargo, numerosos estudios de comportamiento indican un gran potencial para las mejoras inducidas por el ejercicio en las funciones del hipocampo dorsal y ventral. Se ha demostrado que el ejercicio mejora el aprendizaje espacial y la memoria [34–38] y el procesamiento espacial y contextual depende principalmente del hipocampo dorsal [27,28]. En contraste, también se sabe que el ejercicio ejerce propiedades ansiolíticas y antidepresivas [24,25,38] y estas respuestas emocionales están predominantemente reguladas por el hipocampo ventral [29,30]. La inducción uniforme de ΔFosB a largo plazo observada en este estudio sugiere que alguna forma de cambios neuroplásticos ocurrió en todo el hipocampo. Esto explicaría por qué el ejercicio puede afectar las funciones dependientes del hipocampo dorsal y ventral.

3: análisis específico de la región de la neurogénesis inducida por el ejercicio

Una disociación funcional de la neurogénesis entre el hipocampo dorsal y ventral también ha recibido una atención creciente [49]. En este estudio, aprovechando las características morfológicas de las neuronas inmaduras DCX-ir [43], contamos el número de intersecciones entre las dendritas DCX-ir y un segmento de línea dibujado a lo largo del medio del GCL. Esta medición no proporcionó el número total de neuronas DCX-ir en la DG, pero permitió la cuantificación específica de la región necesaria para realizar un análisis de correlación con los datos de expresión de FosB / ΔFosB (ver más abajo). Tras la ejecución a largo plazo, el número de neuronas DCX-ir aumentó significativamente en la DG dorsal, pero no en la ventral. Esto sugiere que el ejercicio podría estimular la neurogénesis más sorprendentemente en la parte dorsal en comparación con la porción ventral de la DG. Sin embargo, estudios previos han reportado resultados contradictorios en los cuales la marcha de la rueda incrementó la neurogénesis en la DG tanto dorsal como ventral [50,51]. En el presente estudio, el número de cruces DCX-ir en la DG ventral tendió a aumentar con la ejecución, aunque el pequeño tamaño de la muestra (ratones 5 por grupo) podría haber limitado la capacidad de detectar una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. Por lo tanto, es probable que sea prematuro descartar la posibilidad de que la marcha voluntaria de la rueda pueda estimular la neurogénesis del hipocampo ventral. Se necesitan más estudios detallados para comprender la especificidad regional de la neurogénesis inducida por el ejercicio en relación con su proceso de múltiples etapas (proliferación celular, diferenciación, migración y supervivencia).

4: Implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio para regular la plasticidad del hipocampo

Finalmente, como primer paso para reconocer las implicaciones funcionales de la inducción de ΔFosB inducida por el ejercicio en el hipocampo, examinamos la relación de la inmunoreactividad de FosB / ΔFosB con los cruces de DCX-ir en la DG tanto dorsal como ventral y encontramos una correlación positiva significativa entre Las dos variables. Aunque los mecanismos exactos por los cuales ΔFosB regula la neurogénesis inducida por el ejercicio siguen siendo inciertos, un estudio reciente demostró que FOCratones nulos, que carecen de FosB, ΔFosB, y Δ2ΔFosB (todos los FOC productos), exhibieron déficits en la neurogénesis del hipocampo basal, incluida la disminución de la proliferación de células progenitoras neuronales, aumento de la migración ectópica de las neuronas del recién nacido y estructuras anormales de la DG [20]. Sin embargo, estas alteraciones no se observaron en FOC(d / d) ratones, que carecen de FosB, pero no de ΔFosB / Δ2ΔFosB. Curiosamente, en FOCRatones nulos, expresión de algunos genes relacionados con la neurogénesis, incluyendo VGF (Factor de crecimiento nervioso inducible por VGF) y Gal (Galanin prepropeptide) fueron regulados a la baja [20]. Dado que VGF y GAL son moléculas secretoras, una propuesta que promete considera que las neuronas que expresan ΔFosB pueden regular la neurogénesis a través de la actividad autocrina / paracrina [20].

Además, se debe tener en cuenta que la región en la que se induce ΔFosB al correr espacialmente se superpone con la región donde la actividad neurogénica es alta. Este hallazgo sugiere que la neurogénesis inducida por el ejercicio depende de la actividad como mínimo. La activación neuronal es clave para mantener y mejorar la función del sistema nervioso central [9], a través de mecanismos que incluyen la expresión y liberación de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) [52,53], captación de suero del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) a través de la barrera hematoencefálica [54,55], supresión de la apoptosis [56], y regulación de la motilidad mitocondrial [57]. Por lo tanto, el presente estudio sugiere que el ejercicio a largo plazo desencadenó una activación neuronal repetida, evidente en el aumento de la expresión de ΔFosB, que contribuye a mejorar la plasticidad del hipocampo, potencialmente a través de estos múltiples mecanismos descritos anteriormente.

El presente estudio solo evaluó la neurogénesis inducida por el ejercicio y su asociación con la expresión de FosB / ΔFosB en la DG. Sin embargo, también se indujo la inmunorreactividad de FosB / ΔFosB en los subcampos CA1 y CA3. Aunque se requieren estudios adicionales para comprender mejor los roles funcionales de la expresión de ΔFosB inducida por el ejercicio dentro de estos subcampos, la literatura previa ofrece una posibilidad prometedora. Guan et al. (2011) demostró que la ablación específica de la quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5) en las neuronas piramidales CA1 o CA3 afectaba la consolidación o recuperación de la memoria, respectivamente [58]. Curiosamente, el Cdk5 es el objetivo descendente de ΔFosB [59] y participa en la regulación de la plasticidad sináptica [60]. Por lo tanto, la expresión de ΔFosB inducida por el ejercicio podría participar en la regulación de la plasticidad sináptica a través de la activación de Cdk5 en los subcampos CA1 y CA3.

Conclusión

Si bien se sabe que los episodios agudos de ejercicio inducen la expresión de proteínas génicas tempranas inmediatas en el hipocampo, el presente estudio proporciona la primera evidencia de que el ejercicio regular a largo plazo induce significativamente la expresión de osFosB en todo el hipocampo. Lola inducción uniforme de ΔFosB apoya la comprensión actual de que el ejercicio es una intervención no farmacológica efectiva capaz de mejorar múltiples funciones del hipocampo. Junto con la correlación significativa entre la expresión de FosB / ΔFosB y la neurogénesis, estos datos son provocativos e indican la necesidad de estudios adicionales que describan el papel de ΔFosB en la mediación de los efectos del ejercicio sobre la función del hipocampo, incluida la neurogénesis.

Declaración de financiación

Este estudio fue apoyado por una Subvención en Ayuda para Jóvenes Científicos del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a TN (#23700775). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Los artículos de PLoS ONE se proporcionan aquí por cortesía de Biblioteca Pública de Ciencias