Circuito cortical prefrontal para los comportamientos relacionados con la depresión y la ansiedad mediados por colecistoquinina: función de ΔFosB (2014)

J Neurosci. 2014 Mar 12; 34 (11): 3878 – 3887.
doi 10.1523 / JNEUROSCI.1787-13.2014

PMCID: PMC3951691

Vicent vialou,^1,^6,^7,⁸ Rosemary C. Bagot,¹ Michael E. Cahill,¹ Deveroux Ferguson,¹ Alfred J. Robison,² David m. Dietz,³ Barbara Fallon,² Michelle Mazei-Robison,² Stacy m. Ku,¹ Eileen Harrigan,¹ Catherine A. Winstanley,⁴ Tej Joshi,¹ Jian feng,¹ Olivier Berton,⁵ y Eric J. Nestler¹

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Resumen

La disminución de la actividad neuronal de la corteza prefrontal medial (mPFC) se asocia con comportamientos similares a la depresión y la ansiedad inducidos por la derrota social en ratones. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a la disminución de la actividad de la mPFC y su papel prodepresivo siguen siendo desconocidos. Aquí mostramos que la inducción del factor de transcripción ΔFosB en la mPFC, específicamente en el área prelimbica (PrL), media la susceptibilidad al estrés. La inducción de ΔFosB en PrL ocurrió selectivamente en ratones susceptibles después del estrés crónico por derrota social, y la sobreexpresión de ΔFosB en esta región, pero no en el área infralímbica (IL) cercana, aumentó la susceptibilidad al estrés. ΔFosB produjo estos efectos en parte a través de la inducción del receptor B de la colecistoquinina (CCK-B): el bloqueo de CCKB en la mPFC induce un fenotipo resiliente, mientras que la administración de CCK en la mPFC imita los efectos ansiogénicos y depresivos del estrés social. Anteriormente, observamos que la estimulación optogenética de las neuronas del mPFC en ratones susceptibles revierte varias anomalías conductuales observadas tras el estrés crónico por derrota social. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la estimulación optogenética de las proyecciones corticales rescataría los efectos patológicos de la CCK en el mPFC. Tras la infusión de CCK en el mPFC, estimulamos optogenéticamente las proyecciones del mPFC a la amígdala basolateral o al núcleo accumbens, dos estructuras subcorticales implicadas en la regulación del estado de ánimo. La estimulación de las proyecciones corticoamigdalinas bloqueó el efecto ansiogénico de la CCK, aunque no se observó ningún efecto sobre otros síntomas de la derrota social. Por el contrario, la estimulación de las proyecciones corticoaccumbens revirtió los déficits de evitación social y preferencia por la sacarosa inducidos por la CCK, pero no los efectos ansiogénicos. En conjunto, estos resultados indican que los déficits conductuales inducidos por el estrés social están mediados en parte por adaptaciones moleculares en el mPFC que involucran a ΔFosB y CCK a través de proyecciones corticales a objetivos subcorticales distintos.

Keywords: accumbens, amígdala, ansiedad, CCK, depresión, mPFC

Introducción

Varias regiones del cerebro límbicas anatómica y funcionalmente interconectadas, incluida la corteza prefrontal medial (mPFC), el hipocampo, la amígdala y el núcleo accumbens (NAc), están implicadas en la mediación de síntomas clave de depresión y ansiedad (Bremner, 1999; Drevets, 2001; Keedwell et al., 2005; Mayberg et al., 2005; Bremner, 2006, 2007; Krishnan y Nestler, 2008; Feder et al., 2009). Por ejemplo, la ausencia de retroalimentación cortical a la amígdala se correlaciona con emociones disfóricas y vuelve a niveles normales después de un tratamiento exitoso. Los efectos antidepresivos de la estimulación cerebral profunda de la corteza cingulada subgenual, un área de mPFC, están asociados con la restauración de la actividad cerebral tanto cortical como subcortical a niveles normales (Mayberg et al., 2005; Nahas et al., 2010). De manera similar, la estimulación cerebral profunda de NAc es antidepresiva y ansiolítica y se correlaciona con un metabolismo alterado en NAc, amígdala y mPFC (Schlaepfer et al., 2008; Bewernick et al., 2010; Grubert et al., 2011). Estos datos apoyan una hipótesis de la red neural de trastornos del estado de ánimo en los que los tratamientos con antidepresivos, independientemente de los mecanismos, normalizan la actividad en los circuitos subcorticales corticales y hiperactivos poco activos (Kennedy et al., 2001; Mayberg et al., 2005; Kennedy y Giacobbe, 2007; Fales et al., 2008; Fales et al., 2009; Leistedt y Linkowski, 2013).

Los modelos animales que implican la exposición crónica a estrés físico o psicológico alteran la estructura y la función de las neuronas en la corteza prefrontal medial (mPFC) ( Radley et al., 2006 ), la amígdala ( Akirav y Maroun, 2007 ), el hipocampo ( Surget et al., 2011 ) y el núcleo accumbens (NAc) ( Vialou et al., 2010 ; Christoffel et al., 2011 ). El estrés crónico por derrota social, un modelo etológicamente válido de depresión ( Berton et al., 2006 ), disminuye la actividad neuronal de la mPFC como se infiere de la expresión reducida de Zif268 y c-Fos ( Covington et al., 2005 ; Covington et al., 2010 ). Además, la estimulación optogenética de la mPFC revierte estos déficits y ejerce efectos similares a los de los antidepresivos ( Covington et al., 2010 ), lo que confirma la importancia de la mPFC en los fenómenos relacionados con el estado de ánimo. La corteza prefrontal medial (mPFC) de los roedores, al igual que en los primates, controla el comportamiento emocional en parte mediante proyecciones a la amígdala basolateral (BLA) y al núcleo accumbens (NAc) ( Vogt et al., 1992 ; Barbas y Blatt, 1995 ; Heidbreder y Groenewegen, 2003 ). Sin embargo, los mecanismos moleculares que median esta función de la mPFC siguen siendo desconocidos.

El presente estudio se centró inicialmente en ΔFosB, un factor de transcripción estable que se induce en el NAc por estrés crónico de derrota social, donde se opone a la susceptibilidad al estrés ( Vialou et al., 2010 ). Realizamos un mapeo cerebral de la inducción de ΔFosB después del estrés de derrota y encontramos, de forma similar a estudios anteriores ( Perrotti et al., 2004 ; Nikulina et al., 2008 ; Lehmann y Herkenham, 2011 ), una inducción robusta en la corteza prefrontal medial (mPFC). Sorprendentemente, encontramos que dicha inducción de ΔFosB en la mPFC promueve la susceptibilidad al estrés. Identificamos el receptor de colecistoquinina (CCK)-B como un objetivo molecular de ΔFosB en la mPFC, donde la neurotransmisión CCKérgica se ha implicado tanto en los efectos ansiogénicos como depresógenos del estrés social ( Becker et al., 2001 , 2008 ). Descubrimos que la actividad de la CCK en la corteza prefrontal medial (mPFC) es necesaria y suficiente para los efectos de ansiedad y depresión del estrés social. Además, mediante técnicas optogenéticas, demostramos acciones específicas de la CCK en subcircuitos de la mPFC: la CCK en las proyecciones mPFC-BLA media los síntomas de ansiedad, mientras que la CCK en las proyecciones mPFC-NAc media los síntomas de depresión.

Materiales y Métodos

Experimento 1: mapeo a nivel cerebral de la inducción de ΔFosB por estrés crónico de derrota social.

Ratones macho C57BL/6J de ocho semanas de edad fueron sometidos a estrés crónico por derrota social durante 10 días consecutivos como se describió previamente ( Berton et al., 2006 ; Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ) (ver Tabla 1 ; Fig. 1 A ). Brevemente, cada ratón fue expuesto a un ratón reproductor retirado CD1 macho agresivo y desconocido durante 5 minutos por día. Después de la interacción directa con el agresor CD1 (5 min), los animales fueron colocados en un compartimento adyacente de la misma jaula durante las siguientes 24 h con contacto sensorial, pero no físico. Los animales de control fueron alojados en jaulas equivalentes pero con miembros de la misma cepa. Las pruebas de interacción social se realizaron 24 h después del último día de derrota. La evitación social hacia un ratón macho CD1 desconocido se evaluó de acuerdo con protocolos publicados. El tiempo pasado en la "zona de interacción" (un corredor de 8 cm de ancho que rodeaba la jaula) fue medido. La segregación de ratones derrotados en subpoblaciones susceptibles y resilientes se realizó como se describió anteriormente ( Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ). Debido a que la mayoría de los ratones de control pasan más tiempo interactuando con un objetivo social que con un recinto objetivo vacío, se utiliza una proporción de interacción de 100 (tiempo igual pasado en la zona de interacción en presencia versus ausencia de un objetivo social) como punto de corte: los ratones con puntuaciones <100 se etiquetan como "susceptibles" y aquellos con puntuaciones ≥100 como "resilientes". Amplios análisis conductuales, bioquímicos y electrofisiológicos respaldan la validez de estas distintas subpoblaciones susceptibles y resilientes ( Krishnan et al., 2007 ; Wilkinson et al., 2009 ; Vialou et al., 2010 ).

Número medio (± SEM) de núcleos inmunorreactivos para FosB por mm² en las áreas del cerebro de los ratones control, susceptibles y resistentes 24 h después del estrés crónico (10 d) social

Figura 1.

La inducción de BFosB en mPFC promueve la susceptibilidad al estrés. AFotomicrografías representativas de la inmunohistoquímica ΔFosB en mPFC 24 h después del último episodio de derrota social 10. B, La inducción de ΔFosB no ocurre en GABAergic ...

Justo después de la prueba de interacción social, los ratones fueron anestesiados y perfundidos intracardíacamente con paraformaldehído al 4% en PBS. Los recuentos celulares de neuronas ΔFosB ⁺ en NAc se realizaron como se describió previamente ( Vialou et al., 2010 ). Los cerebros fueron crioprotegidos con sacarosa al 30% y se cortaron secciones coronales (30 μm) en un micrótomo de congelación y se procesaron para inmunohistoquímica. Las secciones flotantes se preincubaron en un tampón de bloqueo que contenía Triton al 0.3% y suero de cabra normal al 3%. ΔFosB se detectó utilizando anticuerpos policlonales de conejo generados contra la porción N-terminal de la proteína (1/1000 Santa Cruz Biotechnology, catálogo #sc-48) en el mismo tampón, luego se procesó con anticuerpos IgG de cabra anti-conejo biotinilados y el método del complejo avidina-biotina peroxidasa con DAB como sustrato (Vector Laboratories). Los tiempos de incubación con diaminobencidina se mantuvieron constantes para todas las condiciones (100 s). Las secciones se montaron, deshidrataron y cubrieron con cubreobjetos. Las células inmunopositivas para ΔFosB mostraron una tinción marrón específica en el núcleo y fueron cuantificadas por un observador ciego a las condiciones del tratamiento utilizando un microscopio (aumento de 20×). Se seleccionaron tres secciones cerebrales que abarcaban cada área cerebral por ratón para la cuantificación. La segregación anatómica de cada región cerebral se realizó comparando la sección con el atlas cerebral de ratón de Paxinos. Las condiciones para la inmunohistoquímica se optimizaron para reducir los niveles de fondo al mínimo, permitiendo la correcta identificación de las células positivas para ΔFosB. Se calcularon los valores medios para cada animal y se consideraron como una observación individual para el análisis estadístico. Aunque el anticuerpo utilizado reconoce tanto ΔFosB como FosB de longitud completa, sabemos por Western blot que solo ΔFosB es detectable en las condiciones estudiadas ( Perrotti et al., 2004 ; Vialou et al., 2010 ).

Experimento 2: identificación del fenotipo neuronal ΔFosB inducido por estrés social en mPFC.

Para examinar la expresión de ΔFosB en neuronas GABAérgicas corticales, utilizamos tejidos de ratones GAD2-tdTomato expuestos a estrés crónico por derrota social y teñidos para ΔFosB como se describió anteriormente (ver Fig. 1 B ). Los ratones se generaron cruzando ratones knock-in GAD2-Cre (Gad2tm2(cre)Zjh/J; número de catálogo JAX 010802) ( Taniguchi et al., 2011 ) con (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J; número de catálogo JAX 007908) que portan tdTomato controlado por floxed-stop (variante RFP).

Experimento 3: efectos sobre el comportamiento de la sobreexpresión de ΔFosB en la corteza prelímbica (PrL) e infralímbica (IL).

Se realizó cirugía estereotáxica en ratones macho adultos (8 semanas) para inyectar HSV-ΔFosB-GFP o HSV-GFP en las regiones PrL o IL de la mPFC. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (10 mg/kg) y xilacina (1 mg/kg), y se utilizaron las siguientes coordenadas estereotáxicas para la administración viral para PrL: 1.8 mm (anterior/posterior), 0.65 mm (lateral), −2.2 mm (dorsal/ventral); y para IL: 1.9 mm (anterior/posterior), 0.75 mm (lateral), −2.8 mm (dorsal/ventral) en un ángulo de 10° desde la línea media (relativa al bregma). Se administró un total de 0.5 μl de virus purificado bilateralmente durante un período de 5 min (0.1 μl/min) seguido de 5 min de descanso. Los sitios de inyección viral se confirmaron utilizando métodos histológicos estándar (véase la Fig. 1 C ). Aunque no es posible dirigir selectivamente PrL versus IL en ratones con precisión perfecta, los datos de la Figura 1 C ilustran que es muy factible dirigir predominantemente una región u otra. De hecho, los distintos efectos conductuales obtenidos al dirigir la inyección a las dos regiones (véase Resultados) corroboran este enfoque. El primer lote de ratones se utilizó exclusivamente en un experimento de derrota social submaximal (véase la Fig. 1 D ). Tres días después de la cirugía, los ratones fueron sometidos a dos derrotas consecutivas el mismo día y luego se evaluó su interacción social 24 h después. Este procedimiento de derrota submaximal ha sido validado previamente para revelar fenotipos de prosusceptibilidad después de manipulaciones genéticas ( Krishnan et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ).

Se utilizó un segundo lote de ratones para evaluar comportamientos basales de ansiedad y depresión (véase la figura 1 E-J ). Un día después de la cirugía, los ratones fueron habituados con una solución de sacarosa al 1% (p/v). Al día siguiente, los ratones podían elegir entre una botella de agua y una botella de solución de sacarosa al 1%, alternándolas diariamente. La ingesta de solución de sacarosa durante 24 h se midió durante el cuarto y quinto día después de la cirugía y se expresó como un porcentaje de la cantidad total de líquido ingerido. Los ratones fueron evaluados en las pruebas de campo abierto (día 3), laberinto elevado en cruz (día 4), interacción social (día 5 por la mañana) y natación forzada (día 5 por la tarde) según protocolos publicados ( Vialou et al., 2010 ). Hemos encontrado que, con este orden de pruebas, los resultados de las pruebas posteriores no se ven afectados por las anteriores ( Krishnan et al., 2007 ). La actividad de los ratones en el campo abierto se registró durante 5 min utilizando un sistema de seguimiento de vídeo (Ethovision) bajo condiciones de luz roja. El laberinto elevado en cruz consistía en dos pasillos rectos que se cruzaban, situados a 60 cm del suelo y divididos en dos brazos abiertos y dos cerrados. Los ratones se colocaban individualmente en el centro del laberinto y se les permitía explorar libremente cada brazo durante 5 minutos. En las pruebas de campo abierto y del laberinto elevado en cruz, el tiempo transcurrido en el centro y en los brazos abiertos, respectivamente, se utilizó como índice inverso de las respuestas relacionadas con la ansiedad. Se realizó una prueba de natación forzada de un día de duración, con una duración de 5 minutos. Un mayor tiempo de inmovilidad durante esta prueba se interpretó como un comportamiento similar a la depresión. Esta prueba de un día se ha utilizado ampliamente en ratones y se ha validado como medida de validez predictiva, dado que los fármacos antidepresivos reducen los tiempos de inmovilidad.

Finalmente, a un grupo separado de ratones se les inyectó HSV-ΔFosB intra-mOFC y se les evaluó la interacción social después de una derrota submáxima (véase la figura 1 K ).

Los vectores HSV fueron obtenidos de Rachael Neve (Instituto Tecnológico de Massachusetts). Los genes de interés (ΔFosB y GFP) están bajo el control de un promotor CMV. Estos vectores han sido ampliamente validados en publicaciones anteriores (p. ej., Maze et al., 2010 ).

Experimento 4: efectos del estrés social crónico en los niveles de receptores CCKB en mPFC.

A las 24 h después de la prueba de interacción social, los cerebros se extrajeron rápidamente y se cortaron en serie, y el mPFC se disecó rápidamente y se congeló en hielo seco (ver Fig. 2 A , B ). El aislamiento de ARN, la qPCR y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente ( Maze et al., 2010 ; Vialou et al., 2010 ). El ARN se aisló con el reactivo TriZol (Invitrogen) y se purificó posteriormente con los kits RNAeasy micro de QIAGEN. Se determinó que todas las muestras de ARN tenían valores 260/280 y 260/230 ≥1.8. La transcripción inversa se realizó utilizando iScript (Bio-Rad). La qPCR utilizando SYBR Green (Quanta) se realizó con un sistema Applied Biosystems 7900HT RT PCR con los siguientes parámetros de ciclo: 2 min a 95 °C; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 59 °C durante 30 s y 72 °C durante 33 s; y calentamiento gradual a 95 °C para generar curvas de disociación para la confirmación de productos de PCR individuales. Los datos se analizaron comparando los valores de C _t de la condición de tratamiento (ratones susceptibles o resistentes frente a ratones de control, o HSV-ΔFosB frente a HSV-GFP) con el método ΔΔC _{t (}Tsankova et al., 2006 ). Los cebadores de qPCR son los siguientes: ΔFosB, directo, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT e inverso, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG; CCKB, directo, ACCCTTTATGCGGTGATCTTTC e inverso, ATGAGCACGTTTCCGCCAA; CCK, directo, AGCGCGATACATCCAGCAG e inverso, ACGATGGGTATTCGTAGTCCTC; GAPDH, directo, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG e inverso, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA.

Figura 2.

El bloqueo del receptor de CCKB tiene un efecto antidesresante, similar al de los antidepresivos. A, La derrota social disminuye los niveles de receptores CCKB en mPFC solo en ratones resistentes (n = 8 – 10). *p <0.05, en comparación con el control (ANOVA de una vía). **p <0.05 ...

Experimento 5: efectos de ΔFosB en los niveles de receptor CCKB y cFos.

Se inyectó HSV-ΔFosB intra-PrL a los ratones. A las 72 h después de la cirugía, en el pico de sobreexpresión viral, se disecaron los sitios de inyección bajo un microscopio de fluorescencia (véase la Fig. 2 C ). El aislamiento de ARN, la qPCR y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente. Los cebadores de qPCR son los siguientes: c-fos, directo, AATCCGAAGGGAACGGAATAAGA e inverso, TGCAACGCAGACTTCTCATCT.

Experimento 6: efectos del bloqueo de ΔFosB en los niveles de receptores de CCKB inducidos por el estrés y la resiliencia.

Se inyectó bilateralmente a ratones adultos con HSV-GFP o HSV-ΔJunD en PrL (véase la figura 2 D-F ). ΔJunD es un mutante truncado en el extremo N-terminal de JunD que actúa como un antagonista dominante negativo de ΔFosB. Los ratones fueron sometidos a derrota social dos veces al día durante 5 días. Este protocolo de derrota social acelerada, acortado para coincidir con el período de máxima expresión del transgén HSV, se ha utilizado previamente y se ha demostrado que induce niveles máximos de evitación social ( Covington et al., 2011 ). A las 24 horas después del último episodio de estrés, los ratones fueron decapitados sin anestesia para evitar los efectos de los anestésicos en los niveles de proteínas neuronales. El tejido infectado se extrajo en PBS que contenía inhibidores de proteasa (Roche) y fosfatasa (Sigma-Aldrich) utilizando un punzón de calibre 15 y se congeló inmediatamente en hielo seco. Las muestras se homogeneizaron mediante sonicación suave en tampón RIPA modificado: 10 mM Tris base, 150 mM cloruro de sodio, 1 mM EDTA, 0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 1 % desoxicolato de sodio, pH 7.4, e inhibidores de proteasa y fosfatasa como se indicó anteriormente. Después de la adición del tampón de Laemmli, las proteínas se separaron en geles de gradiente de poliacrilamida al 4-15 % (Criterion System; Bio-Rad), y se realizó Western blotting utilizando el sistema Odyssey (Li-Cor) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las membranas se transfirieron con anticuerpo del receptor CCKB (1/1000, Acris, catálogo #AP01421PU-N). Otro grupo de ratones se inyectó con AAV-ΔJunD o AAV-GFP en PrL y luego, 5 semanas después de la cirugía para permitir la máxima expresión del transgén, los ratones fueron sometidos al protocolo de derrota submáxima. Se les realizó una prueba de interacción social 24 horas después de la última derrota.

Experimento 7: efectos de intra-mPFC CI-988, un antagonista de CCKB, en la evitación social inducida por el estrés social y la anhedonia.

Se implantaron cánulas bilaterales (distancia entre cánulas de 1.0 mm, 1.8 mm anterior, inyector −2.2 mm dorsal/ventral) dirigidas a la mPFC en ratones susceptibles (véase la Fig. 2 G , H ). Una semana después de la cirugía, se infundieron 10 ng de CI-988 directamente en la mPFC, dirigidas principalmente a la PrL. Luego se evaluó el comportamiento de interacción social de los ratones. Se midió la preferencia por la sacarosa durante las 24 h restantes. El CI-988 (Tocris Bioscience) se disolvió en solución salina, se dividió en alícuotas y se congeló. La dilución final se preparó el día del experimento. Se realizó un experimento adicional en ratones susceptibles con CI-988 administrado intraperitonealmente (2 mg/kg) 30 min antes de la prueba de interacción social.

Experimento 8: efectos del agonista de CCKB sobre la susceptibilidad al estrés social y la reversión mediante la estimulación optogenética de las proyecciones de mPFC a BLA o NAc.

AAV-CaMKII-ChR2-EYFP o AAV-CaMKII-EYFP se inyectó en la mPFC derecha, nuevamente apuntando principalmente a PrL (ver Fig. 3 A–G ). Cinco semanas después, se implantaron fibras ópticas en NAc derecha (1.4 anterior/posterior, 2.6 lateral, −4.7 dorsal/ventral en un ángulo de 25° desde la línea media) o BLA (−1.6 anterior/posterior, 3.1 lateral, −4.7 dorsal/ventral sin ángulo desde la línea media). Durante el mismo procedimiento quirúrgico se implantaron cánulas bilaterales en la mPFC (ver arriba). Las cánulas y las fibras se fijaron al cráneo con cemento dental. Luego se permitió a los ratones 1 semana para recuperarse antes del inicio de los experimentos de comportamiento. Los ratones fueron sometidos a derrota submáxima, luego se evaluó la interacción social 24 h después, seguida directamente por el laberinto elevado en cruz y por la preferencia por la sacarosa durante las 24 h restantes. Treinta minutos antes de la prueba de interacción social, a la mitad de los ratones se les infundió CCK-8 (10 ng) en la corteza prefrontal medial (mPFC), mientras que a la otra mitad se les administró el vehículo (solución salina). Los ratones se analizaron en parejas (un ratón tratado con el vehículo y otro tratado con CCK-8, con AAV-GFP o AAV-ChR2). El CCK-8 (Sigma) se disolvió en solución salina, se dividió en alícuotas y se congeló. La dilución final se preparó el mismo día del experimento.

Figura 3.

La susceptibilidad al estrés inducido por CCK-8 depende de proyecciones corticales específicas. A, En 24 h después de la derrota social submáxima y 30 min después de la infusión de CCK-8, las regiones de proyección de mPFC se estimularon con láser durante una prueba de interacción social. Infusión CCK-8 ...

Las estimulaciones ópticas se realizaron según protocolos publicados ( Covington et al., 2010 ). Se implantaron fibras ópticas (Thor Laboratories) de forma crónica y se conectaron mediante un adaptador FC/PC a un diodo láser azul de 473 nm (Crystal Lasers, BCL-473–050-M). Se utilizó un estimulador (Agilent, #33220A) para generar pulsos de luz azul. Durante todas las estimulaciones, se administraron ráfagas de 40 ms de pulsos de luz azul de 100 Hz (ancho de espiga de 9.9 ms) cada 3 s a las regiones terminales en BLA o NAc durante la duración de la prueba de interacción social únicamente, para imitar un patrón de actividad cortical en ráfagas. La intensidad de la luz de la fibra óptica se verificó antes de cada uso, utilizando un sensor de luz (Thor Laboratories, S130A), y la intensidad de la luz fue de ∼15 mW. Este protocolo de estimulación, que fue validado electrofisiológicamente con anterioridad ( Covington et al., 2010 ), no indujo convulsiones según las observaciones conductuales y la ausencia de expresión de c-Fos fuera de las regiones estimuladas optogenéticamente ( Covington et al., 2010 ).

Experimento 9: efectos del agonista de CCKB sobre la actividad neuronal de mPFC medida por los niveles de ARNm de c-Fos.

Se implantaron cánulas bilaterales en ratones adultos dirigidas a la corteza prefrontal medial (mPFC) (véase la figura 3H ) . Tras una semana de descanso, los ratones fueron sometidos a una derrota submáxima y se les administró CCK-8 24 horas después. Se tomaron muestras de la mPFC 30 minutos después de la infusión del fármaco y se prepararon para el análisis de ARNm como se describió anteriormente.

Alojamiento de animales.

Se utilizaron ratones macho C57BL/6J de ocho semanas de edad (The Jackson Laboratory). Todos los ratones se aclimataron al bioterio durante al menos una semana antes de las manipulaciones experimentales y se mantuvieron a una temperatura de entre 23 °C y 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a las 7:00 a. m.) y acceso libre a comida y agua. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Sociedad de Neurociencia y el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai.

Análisis estadístico.

Los datos mostrados se expresan como media ± SEM (representados como barras de error). Se utilizaron ANOVAs unidireccionales para comparar las medias entre ratones control, susceptibles y resilientes en análisis inmunohistoquímicos, bioquímicos y conductuales. Se utilizaron ANOVAs unidireccionales para comparar las medias entre los controles GFP y la sobreexpresión de ΔFosB en PrL o IL en las pruebas de campo abierto, laberinto elevado en cruz, natación forzada y preferencia por la sacarosa. Se utilizaron ANOVAs bidireccionales para comparar las medias entre los controles GFP, ΔFosB-PrL y ΔFosB-IL en la prueba de interacción social. Se utilizaron ANOVAs bidireccionales para comparar los efectos de CCK-8 con o sin estimulación optogenética en todos los experimentos conductuales, así como el efecto de la sobreexpresión de ΔFosB o la infusión de CI-988 en la evitación social. Cuando fue apropiado, se realizaron análisis post hoc utilizando una prueba post hoc de Bonferroni. Se utilizaron pruebas t de Student para comparar las medias del efecto de la infusión de CI-988 sobre la preferencia por la sacarosa y las pruebas de natación forzada, y del efecto de CCK-8 sobre los niveles de ARNm de c-Fos . Las diferencias entre las condiciones experimentales se consideraron estadísticamente significativas cuando p ≤ 0.05.

Resultados

Mapeo cerebral de la inducción de ΔFosB por estrés crónico de derrota social

Primero investigamos la inducción de ΔFosB por inmunohistoquímica en ratones control, susceptibles y resilientes, después de un curso de estrés por derrota social crónico (10 d), con un enfoque en las regiones del prosencéfalo y mesencéfalo implicadas previamente en las respuestas al estrés. Los animales fueron analizados 24 h después del último episodio de derrota. El estrés social crónico induce ΔFosB en numerosas áreas del cerebro con patrones distintos observados entre ratones resilientes y susceptibles. Como se muestra en la Tabla 1 y la Figura 1 A , IL, BLA, giro dentado del hipocampo, estriado dorsal y núcleo NAc mostraron activación preferencial en ratones resilientes; tales resultados en NAc son consistentes con hallazgos publicados ( Vialou et al., 2010 ). En marcado contraste, los ratones susceptibles mostraron una mayor inducción en PrL, septo lateral y núcleo del lecho de la estría terminal. Varias regiones del cerebro mostraron una inducción de ΔFosB comparable en ratones susceptibles y resilientes; Estas incluían la corteza orbitofrontal (COF, otra área de la CPF), la corteza del núcleo accumbens, el rafe dorsal y la sustancia gris periacueductal (SGP).

Para identificar el subtipo neuronal que muestra la inducción de ΔFosB en las regiones corticales, se sometió a ratones GAD2-tdTomato a estrés crónico por derrota social. La inmunorreactividad de ΔFosB en ratones susceptibles fue indetectable en las neuronas GABAérgicas ( Fig. 1B ) , lo que confirma hallazgos anteriores de inducción específica de ΔFosB en neuronas piramidales corticales después de otras formas de estrés crónico ( Perrotti et al., 2004 ). En ratones control no derrotados, los niveles basales de ΔFosB en todas las regiones cerebrales fueron similares a los informados en estudios previos ( Perrotti et al., 2004 , 2008 ) con niveles basales mucho más altos en el NAc y el estriado dorsal en comparación con cualquier otra región, con la única excepción del giro dentado, que mostró niveles comparables con los de las regiones estriatales ( Tabla 1 ).

ΔFosB en mPFC promueve la susceptibilidad al estrés

Para hacer un seguimiento de estos hallazgos, nos centramos en PrL porque ya habíamos demostrado que la activación optogenética de esta región ejercía efectos antidepresivos en el paradigma de la derrota social (Covington et al., 2010). Para probar las consecuencias funcionales de la inducción de ΔFosB en esta región del cerebro, hemos sobreexpresado viralmente ΔFosB en PrL de ratones de control ( C) y los sometió a un curso submáximo de estrés por derrota social, que no induce a la evitación social en animales normales. Los ratones que sobreexpresan ΔFosB en PrL fueron más susceptibles a la derrota social que los ratones de control con inyección de GFP en que mostraron una conducta de evitación social después de la derrota social submáxima (Interacción, F_(2,38) = 2.847, p > 0.05, efecto principal del virus, F_(2,38) = 6.013, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.447, p <0.05) ( D). Estos ratones también mostraron una mayor inmovilidad en una prueba de natación forzada durante el día 1 (F_(2,31) = 6.448, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.518, p <0.05) ( E), un efecto opuesto al producido por los fármacos antidepresivos. En contraste, la sobreexpresión de ΔFosB en PrL no alteró varias medidas de línea de base del comportamiento similar a la ansiedad, la preferencia de sacarosa, la interacción social o la actividad locomotora ( F – J). Juntos, estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la inducción selectiva de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles contribuye a la vulnerabilidad al estrés y sus consecuencias perjudiciales. En contraste, la sobreexpresión de ΔFosB en otra región de mPFC, IL, no tuvo ningún efecto en las conductas emocionales de referencia ni en las respuestas al estrés por derrota social ( DJ), mientras que la sobreexpresión de BFosB en la OFC medial tendió a promover la resistencia a la derrota social crónica, aunque este efecto no alcanzó significación estadística (Interacción, F_(1,31) = 1.741, p > 0.05, efecto principal del tiempo de interacción, F_(1,31) = 14.170, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.860, p <0.05 dentro del grupo GFP; t = 1.960, p <0.05 dentro del grupo ΔFosB; efecto del virus, t = 2.447, p <0.05) ( K).

ΔFosB promueve la inducción de CCKB en mPFC

Un gran cuerpo de evidencia apoya la idea de que CCK, un neuropéptido abundante en el cerebro, desempeña un papel esencial en los mecanismos neurobiológicos del estrés y la ansiedad. (Rotzinger y Vaccarino, 2003). En particular, la liberación de CCK en mPFC durante el estrés social en ratas se asocia con conductas relacionadas con la ansiedad (Becker et al., 2001). Aunque la participación de CCK en la depresión humana aún no está clara, la evidencia reciente apunta a su papel en el comportamiento de depresión inducida por la derrota social en ratas (Becker et al., 2008). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las alteraciones en los niveles de CCK o su receptor CCKB (también conocido como CCK2) en mPFC podrían contribuir a las diferencias entre ratones susceptibles y resistentes. En 48 h después del episodio final de la derrota, los niveles de ARNm de CCKB se redujeron solo en mPFC de ratones resistentes (F_(2,18) = 8.084, p <0.01; Post prueba de Bonferroni, t = 3.104, p <0.05 frente al control; t = 5.113, p <0.01 vs susceptible) ( A). No se observaron diferencias en los niveles de ARNm de CCK en ratones susceptibles o resistentes (datos no mostrados). Observamos un aumento en ΔFosB Los niveles de ARNm solo en ratones susceptibles son consistentes con los datos de proteínas reportados anteriormente (F_(2,18) = 5.246, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.336, p <0.05 frente a susceptibles; t compruébalo t₍₁₂₎ = 2.138, p <0.05 vs control) ( B). Porque ΔFosB regula la transcripción de numerosos genes (McClung y Nestler, 2003; Winstanley et al., 2007), consideramos la posibilidad de que pueda regular la expresión del ARNm de CCKB. Para abordar esta pregunta, primero sobreexpresamos ΔFosB en PrL y encontramos que esta manipulación regula al alza los niveles de ARNm de CCKB en esta región (t₍₁₂₎ = 2.012, p <0.05 frente a GFP) ( C). Curiosamente, también encontramos una disminución en c-Fos los niveles de ARNm después de la sobreexpresión de ΔFosB (t₍₁₁₎ = 3.382, p <0.01) ( C). TEstos hallazgos sugieren además que la inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles es un mecanismo activo de susceptibilidad al prevenir la supresión de CCKB observada en ratones resilientes.

Para fortalecer aún más estas observaciones, sobreexpresamos ΔJunD, un socio de unión de ΔFosB que carece de su dominio de transactivación y por lo tanto actúa como un antagonista negativo dominante, y determinamos su efecto en la expresión de CCKB inducida por el estrés. Confirmamos que el estrés crónico por derrota social incrementó los niveles de proteína CCKB en PrL de ratones susceptibles (t compruébalo t₍₁₂₎ = 2.289, p <0.05 vs control) ( D,E). Además, dicha inducción fue completamente bloqueada por la sobreexpresión de ΔJunD en esta región (F_(2,20) = 6.306, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni t = 3.615_, p <0.01) ( D,E), apoyando la hipótesis de que ΔFosB media la expresión de CCKB inducida por el estrés. Además, el bloqueo de la actividad de ΔFosB en PrL, a través de la expresión ΔJunD local, también promovió la capacidad de recuperación para vencer el estrés (t compruébalo t₍₁₆₎ = 2.114, p = 0.05 vs control) ( F). El mecanismo subyacente a la regulación a la baja de CCKB en ratones elásticos aún no se ha dilucidado.

El papel de CCKB en la resiliencia y la susceptibilidad al estrés

Para probar directamente el papel de la regulación de CCKB en PrL en la mediación de la susceptibilidad frente a la resiliencia, infundimos el antagonista selectivo del receptor CCKB CI-988 (10 ng) directamente en esta región del cerebro de ratones susceptibles. CI-988 antagoniza eficazmente los receptores CCKB in vivo porque exhibe afinidad nanomolar y alta selectividad para el subtipo de receptor CCKB (Noble et al., 1999). El bloqueo de la actividad de CCKB incrementó fuertemente la interacción social ( G) (Interacción, F_(1,20) = 7.795, p <0.05; droga F_(1,20) = 5.38, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni t = 3.615_, p <0.01). La infusión de CI-988 también revirtió el déficit en la preferencia de sacarosa observado en ratones susceptibles (t₍₈₎ = 2.681, p <0.05) ( H). Ambos resultados de comportamiento indican que el bloqueo de la acción de CCK en PrL ejerce potentes efectos similares a los antidepresivos. Curiosamente, cuando se administró por vía intraperitoneal, CI-988 fue ineficaz para revertir la evitación social (datos no mostrados).

Para probar lo contrario, esa activación de CCKB en PrL podría mediar la evitación social y la disminución de la preferencia de sacarosa inducida por el estrés crónico de la derrota social, se examinó el efecto de la infusión local de CCK-8 (10 ng), la forma predominante de CCK en el cerebro. , sobre conductas relacionadas con la depresión y la ansiedad. La dosis del fármaco se eligió en función de los resultados anteriores en la literatura (De Witte et al., 1987; Rotzinger y Vaccarino, 2003; Zanoveli et al., 2004). Los ratones fueron expuestos a estrés por derrota social submáxima 24 h antes de las pruebas de comportamiento ( A). CCK-8, infundido 30 min antes de la prueba, fue suficiente para inducir evitación social en la prueba de interacción social, así como una disminución en el tiempo pasado en los brazos abiertos en el laberinto más elevado (SI: BLA, interacción, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; efecto principal de la droga, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.957_, p <0.05; NAc: interacción, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni t = 2.816_, p <0.05; EPM: BLA, interacción, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.509_, p <0.05 efecto del fármaco; t = 2.528, p <0.05 efecto de virus; NAc, t compruébalo t₍₁₇₎ = 1.961; p <0.05 efecto del fármaco dentro del grupo eYFP) ( SER, izquierda). No se observaron diferencias en la preferencia de sacarosa ( F,G, izquierda). Finalmente, la infusión de CCK-8 no tuvo ningún efecto sobre el comportamiento (interacción social y elevación más laberinto) de ratones no vencidos no expuestos en estos ensayos (datos no mostrados). TEstos resultados demuestran que el aumento mediado por osFosB en la actividad de CCKB en PrL de ratones susceptibles, en comparación con ratones resilientes, contribuye a algunos de los déficits de comportamiento inducidos por el estrés exhibidos por estos animales.

Bloqueo de la susceptibilidad al estrés inducida por CCK por activación de proyecciones corticales a BLA versus NAc

La disminución de la actividad neuronal del mPFC se correlaciona con comportamientos similares a la depresión en ratones, y la estimulación optogenética de las neuronas del mPFC de ratones susceptibles produce efectos similares a los antidepresivos ( Covington et al., 2010 ). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la CCK podría actuar en el PrL inhibiendo la actividad neuronal y, por consiguiente, causando un comportamiento similar a la depresión. De acuerdo con esta hipótesis, observamos una disminución en los niveles de ARNm de c-Fos en el PrL en respuesta a la infusión de CCK en esta región cerebral ( t ₍₁₃₎ = 2.235, p < 0.05) ( Fig. 3H ).

A continuación, planteamos la hipótesis de que la estimulación optogenética de la mPFC ejerce sus acciones antidepresivas al oponerse a los efectos de la CCK sobre la actividad neuronal. Para probar esta hipótesis, investigamos las estructuras subcorticales que median los efectos ansiogénicos y prodepresivos de la CCK. Las neuronas piramidales de la mPFC se proyectan fuertemente al NAc y la BLA, dos estructuras límbicas implicadas en las respuestas conductuales al estrés. Se ha demostrado que la actividad alterada de ambas regiones cerebrales juega un papel esencial en la expresión de comportamientos similares a la ansiedad y la depresión ( Vialou et al., 2010 ; Tye et al., 2011 ). Por lo tanto, probamos si la estimulación de las proyecciones glutamatérgicas de PrL al NAc o a la BLA se opondría a los efectos nocivos de la microinfusión de CCK en PrL ( Fig. 3 A ). Inyectamos AAV-CaMKII-ChR2-EYFP, o AAV-CaMKII-EYFP como control, en PrL. Se sabe que el promotor CaMKII dirige la expresión viral a las neuronas piramidales glutamatérgicas en las regiones corticales. Luego dejamos pasar un tiempo suficiente (6 semanas) para que los transgenes se transportaran a las terminaciones nerviosas de estas neuronas piramidales en NAc y BLA ( Fig. 3 I ). Los ratones recibieron derrota social submaximal; 24 h después, infundimos CCK-8 en PrL y, 30 min después, se midió la interacción social durante la estimulación optogenética de las terminaciones glutamatérgicas en NAc o BLA. Inmediatamente después de la prueba de interacción social, se evaluó a los ratones en el laberinto elevado en cruz para evaluar el comportamiento relacionado con la ansiedad y luego la preferencia por la sacarosa para evaluar la anhedonia.

La estimulación optogenética de las proyecciones glutamatérgicas de PrL a NAc revirtió por completo la evitación social inducida por la CCK-8 intra-PrL (interacción, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, sin efecto de fármaco en el grupo ChR2) ( C). En contraste, dicha estimulación de PrL a NAc no tuvo ningún efecto en el comportamiento similar a la ansiedad medido en el laberinto más elevado ( E); sin embargo, tal estimulación incrementó la preferencia de sacarosa en comparación con los ratones no estimulados (interacción, F_(1,20) = 5.77, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.998_, p <0.05 efecto de estimulación en animales tratados con CCK-8) ( G).

Se observó un patrón de comportamiento muy diferente con la estimulación optogenética de proyecciones glutamatérgicas de PrL a BLA. Dicha estimulación no impidió la evitación social inducida por la infusión CCK-8 intraprol PrL (interacción, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; efecto principal de la droga, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; ningún efecto en el grupo estimulado, t compruébalo t₍₁₂₎ = 2.054, p <0.05) ( B). Sin embargo, la estimulación de los aferentes de BLA ejerció un efecto de tipo ansiolítico como lo indica el aumento del tiempo empleado en los brazos abiertos del laberinto más elevado (interacción, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.528, p <0.05 efecto del virus en los grupos tratados con CCK-8) ( D). La estimulación de las proyecciones glutamatérgicas a BLA no tuvo un efecto significativo en la preferencia de sacarosa (interacción, F_(1,22) = 2.08, p > 0.05) ( F).

Discusión

Los resultados del presente estudio proporcionan evidencia de adaptaciones moleculares que ocurren en la corteza prefrontal medial (PrL) y que subyacen a la susceptibilidad al estrés social. Mostramos la inducción de ΔFosB en esta subregión de la corteza prefrontal medial (mPFC) después del estrés crónico por derrota social, donde la sobreexpresión de ΔFosB promueve la susceptibilidad al estrés. Identificamos el receptor CCKB como un gen diana regulado por ΔFosB en la PrL, que aparentemente induce la proteína CCKB en ratones susceptibles y previene la regulación negativa de la expresión de CCKB que ocurre selectivamente en ratones resilientes. Demostramos además que la infusión de un agonista de CCK en la PrL promueve anomalías conductuales similares a la depresión y la ansiedad en respuesta al estrés social, mientras que el bloqueo de la actividad del receptor CCKB en esta región de ratones susceptibles bloquea estos efectos. A continuación, utilizamos herramientas optogenéticas para identificar los microcircuitos involucrados en las acciones proansyneriosas y prodepresivas de la CCK en la PrL. Aunque las proyecciones glutamatérgicas cortico-NAc median los déficits de recompensa evidenciados por la evitación social y la menor preferencia por la sacarosa, este microcircuito no influye en los efectos ansiogénicos de la CCK infundida en la PrL. Por el contrario, las proyecciones corticales a la BLA median la manifestación de conductas relacionadas con la ansiedad, pero no tienen efecto sobre la evitación social inducida por el estrés social ni sobre los déficits en la preferencia por la sacarosa. En conjunto, estos datos demuestran que las alteraciones en la función de la PrL tras el estrés crónico por derrota social median numerosos déficits conductuales a través de proyecciones subcorticales específicas.

ΔFosB: mapeo de una red de estrés límbico y rol en mPFC

La inmunohistoquímica de ΔFosB identifica neuronas afectadas por estrés crónico con resolución de célula única y se ha utilizado para mapear circuitos neuronales regulados por estrés ( Perrotti et al., 2004 ; Nikulina et al., 2008 ; Lehmann y Herkenham, 2011 ). Utilizamos esta metodología para mostrar que el estrés crónico por derrota social induce ΔFosB en varias áreas cerebrales con patrones distintos entre grupos resilientes y susceptibles, con algunas regiones mostrando inducción solo en ratones resilientes, otras solo en ratones susceptibles y otras en ambas condiciones ( Tabla 1 ). Trabajos previos demostraron que la inducción de ΔFosB en NAc o PAG ventral promueve la resiliencia al estrés crónico y contribuye a las respuestas antidepresivas ( Berton et al., 2007 ; Vialou et al., 2010 ).

La inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles, junto con hallazgos previos que indican que la estimulación optogenética de esta región ejerce efectos antidepresivos ( Covington et al., 2010 ), nos impulsó a estudiar la influencia de ΔFosB en esta región cortical. A diferencia de los hallazgos en NAc y PAG ventral, encontramos que ΔFosB en PrL promueve la susceptibilidad al estrés crónico por derrota social y produce un efecto similar a la depresión en la prueba de natación forzada, sin afectar el comportamiento similar a la ansiedad ni la preferencia por la sacarosa. En contraste con PrL, no encontramos ningún efecto de la sobreexpresión de ΔFosB en la IL cercana. Un estudio reciente encontró niveles elevados de ΔFosB en IL en ratones resilientes e implicó a esta subregión en la resiliencia al estrés social ( Lehmann y Herkenham, 2011 ). Por lo tanto, se necesitan más estudios para abordar los roles diferenciales de estas dos subregiones de la mPFC, que han demostrado producir efectos opuestos en otros dominios conductuales ( Sierra-Mercado et al., 2011 ; Burgos-Robles et al., 2013 ; Richard y Berridge, 2013 ). Anteriormente informamos que los humanos deprimidos muestran niveles más bajos de ΔFosB en el NAc examinado post mortem ( Vialou et al., 2010 ), mientras que se han mostrado niveles más altos de ΔFosB en la PFC dorsolateral (área de Brodmann 46) de humanos deprimidos ( Teyssier et al., 2011 ). Otras regiones corticales no fueron examinadas en el último estudio. En cualquier caso, estos hallazgos en conjunto respaldan las anomalías específicas de la región en la expresión de ΔFosB en la depresión humana, donde el factor de transcripción ejerce efectos muy diferentes sobre la vulnerabilidad al estrés. Sería interesante en futuros estudios examinar la influencia de ΔFosB en numerosas otras regiones del cerebro donde se induce ( Tabla 1 ) sobre las respuestas al estrés.

Un mecanismo por el cual la inducción de ΔFosB en PrL podría contribuir al comportamiento similar a la depresión es a través de la supresión de la actividad de PrL. Se ha demostrado que ΔFosB suprime las respuestas de glutamato AMPA y la expresión de c-Fos en las neuronas espinosas medianas de NAc ( Renthal et al., 2008 ; Vialou et al., 2010 ; Grueter et al., 2013 ). De igual modo, encontramos una disminución en la expresión de c-Fos después de la sobreexpresión de ΔFosB en PrL. Por lo tanto, la inducción de ΔFosB en PrL podría ser responsable de la reducción de la actividad neuronal observada en esta región después del estrés crónico por derrota social. Se esperaría que tal tono disminuido de PrL sobre sus objetivos subcorticales, como BLA y NAc, aumentara la expresión del miedo y la incapacidad para extinguir las respuestas emocionales al estrés ( Fales et al., 2008 , 2009 ). Además, las lesiones del mPFC inducen respuestas de estrés sensibilizadas y déficits en la extinción del miedo ( Holson, 1986 ; Silva et al., 1986 ; Diorio et al., 1993 ; Milad y Quirk, 2002 ), lo que sugiere que el deterioro del mPFC inducido por el estrés, mediado en parte a través de la inducción de ΔFosB, podría contribuir a la depresión y otros trastornos relacionados con el estrés ( Choi et al., 2012 ).

Papel de CCK en la vulnerabilidad al estrés

Proporcionamos evidencia de que el receptor CCKB es un objetivo de ΔFosB, de modo que la inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles es uno de los mecanismos a través de los cuales ΔFosB ejerce sus efectos prodepresivos en esta región. Aunque las acciones específicas de CCK en los circuitos de la corteza prefrontal medial (mPFC) siguen sin estar claras, en roedores la CCK se localiza dentro de las interneuronas GABAérgicas ( Somogyi et al., 1984 ). Se cree que suprime la actividad de las neuronas piramidales corticales al aumentar la liberación local de GABA y actuar directamente sobre los receptores CCKB expresados por las neuronas piramidales ( Yaksh et al., 1987 ; Benoliel et al., 1992 ; Pérez de la Mora et al., 1993 ; Gallopin et al., 2006 ). Por lo tanto, la neurotransmisión CCKérgica podría contribuir a la reducción de la actividad de PrL observada anteriormente.

CCK es un agente ansiogénico, y la administración sistémica de agonistas de CCKB induce ataques de pánico en voluntarios sanos. Los pacientes predispuestos a ataques de pánico se vuelven hipersensibles después de la exposición a CCK ( de Montigny, 1989 ; Bradwejn et al., 1991 ). Varios estudios han confirmado los efectos ansiogénicos de CCK en roedores ( Rotzinger y Vaccarino, 2003 ). La liberación de CCK en mPFC durante el estrés por derrota en ratas se asocia con comportamientos relacionados con la ansiedad ( Becker et al., 2001 ); las subregiones PrL e IL no se diferenciaron en este estudio. Más recientemente, el bloqueo sistémico y crónico de CCKB con CI-988 ejerció efectos similares a los antidepresivos en ratas ( Becker et al., 2008 ). CI-988 normalizó el tiempo de inmovilidad en la prueba de natación forzada. También previno la hiperactividad del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, redujo el volumen del hipocampo y la proliferación celular, y disminuyó la preferencia por la sacarosa normalmente provocada por la derrota social. En este estudio, confirmamos estos resultados al demostrar un efecto similar al de un antidepresivo tras la infusión de CI-988 en la corteza prefrontal medial (PrL) de ratones susceptibles, si bien una única inyección sistémica no reprodujo este efecto.

Además de las acciones agudas de la CCK en la PrL, identificamos niveles reducidos de ARNm de CCKB en ratones resilientes, lo que podría ser una adaptación molecular subyacente a la resiliencia. De hecho, las alteraciones en el tono CCKérgico, específicamente en los niveles de CCKB, constituyen un mecanismo importante para la expresión de la ansiedad. Los ratones transgénicos que sobreexpresan CCKB en el prosencéfalo muestran respuestas de ansiedad y miedo aumentadas ( Chen et al., 2006 ). Nuestro hallazgo de niveles alterados de CCKB entre ratones resilientes y susceptibles podría contribuir a las diferencias fenotípicas en la ansiedad y el comportamiento depresivo. Aquí, demostramos que la PrL es un sustrato anatómico crítico para los efectos ansiogénicos y prodepresivos de la CCK en el contexto del estrés social. Sin embargo, varias otras regiones cerebrales están involucradas en las acciones conductuales de la CCK, incluyendo BLA, hipocampo, NAc y PAG ( De Witte et al., 1987 ; Belcheva et al., 1994 ; Noble y Roques, 1999 ; Zanoveli et al., 2004 ; Rezayat et al., 2005 ). Además, encontramos un aumento en los niveles de proteína CCKB, pero no en los niveles de ARNm, en la corteza prefrontal medial de animales susceptibles. Estos hallazgos subrayan que, aunque los niveles de ARNm a menudo se correlacionan con los niveles de proteína, este no es necesariamente el caso ( Gygi et al., 1999 ).

Nuestros experimentos optogenéticos demuestran que el aumento de la actividad de las proyecciones glutamatérgicas desde la PrL al NAc o a la BLA antagoniza los efectos de la CCK en la PrL. Se necesitan más estudios para establecer que este efecto de la estimulación optogenética está mediado por las mismas neuronas de la PrL que son controladas por la CCK. Curiosamente, nuestros datos revelan funciones distintas de estos dos microcircuitos en la mediación de diferentes dominios de anomalías conductuales. La proyección cortico-NAc controla la anhedonia y la recompensa; el hecho de que regule la evitación social confirma que este síntoma es más un reflejo de una disminución de la motivación y la recompensa por el comportamiento social y no de un aumento de la ansiedad social. Esta conclusión es consistente con la incapacidad de las benzodiazepinas para corregir esta anomalía ( Berton et al., 2006 ), y con la reciente demostración de que la estimulación de la mPFC del NAc aumenta la recompensa y la motivación por las drogas de abuso ( Britt et al., 2012 ). Por el contrario, la proyección cortico-BLA controla los síntomas relacionados con la ansiedad, lo que concuerda con una amplia bibliografía en roedores y humanos (véase más arriba).

En conclusión, los resultados del presente estudio identifican un patrón de regiones cerebrales límbicas implicadas en animales susceptibles y resilientes, y demuestran alteraciones en la PrL que promueven la susceptibilidad. Estas alteraciones implican la inducción de ΔFosB y su inducción del receptor CCKB . Por el contrario, el bloqueo de las acciones de CCK en la PrL promueve efectos antidepresivos y ansiolíticos. También establecemos las dianas subcorticales de estas neuronas piramidales corticales que median estas acciones, con un circuito cortico-NAc esencial para los comportamientos relacionados con la depresión, y un circuito cortico-BLA esencial para los comportamientos relacionados con la ansiedad. Si bien los estudios clínicos de antagonistas de CCKB en pacientes deprimidos en la década de 1990 no arrojaron resultados prometedores, los presentes hallazgos sugieren la importancia de reconsiderar el potencial terapéutico de dichos agentes en subgrupos de pacientes expuestos a altos niveles de estrés.

Notas a pie de página

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental (EJN) y la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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