PSMC5, una ATPasa Proteasomal 19S, regula la acción de la cocaína en el Núcleo Accumbens (2015)

Más uno. 2015 de mayo de 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno m4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Nunca8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Resumen

ΔFosB es un factor de transcripción estable que se acumula en el núcleo accumbens (NAc), una parte clave del circuito de recompensa del cerebro, en respuesta a la exposición crónica a la cocaína u otras drogas de abuso. Si bien se sabe que ΔFosB se heterodimeriza con un miembro de la familia Jun para formar un complejo de factor de transcripción activo, hasta la fecha no ha habido una exploración abierta de otros posibles socios de unión para ΔFosB en el cerebro. Aquí, mediante el uso de ensayos de dos híbridos de levadura, identificamos PSMC5, también conocido como SUG1, una subunidad que contiene ATPasa del complejo proteasómico 19S, como una nueva proteína que interactúa con ΔFosB. Verificamos tales interacciones entre ΔFosB endógeno y PSMC5 en el NAc y demostramos que ambas proteínas también forman complejos con otras proteínas reguladoras de cromatina asociadas con la activación de genes. Continuamos demostrando que la cocaína crónica aumenta los niveles nucleares, pero no citoplásmicos, de PSMC5 en el NAc y que la sobreexpresión de PSMC5 en esta región del cerebro promueve las respuestas locomotoras a la cocaína. Juntos, estos hallazgos describen un mecanismo novedoso que contribuye a las acciones de ΔFosB y, por primera vez, implica a PSMC5 en la plasticidad molecular y del comportamiento inducida por la cocaína.

Cita: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, una ATPasa Proteasomal 19S, regula la acción de la cocaína en el Núcleo Accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Editor Académico: James Edgar McCutcheon, Universidad de Leicester, REINO UNIDO

Recibido: Diciembre 10, 2014; Aceptado: Abril 7, 2015; Publicado: 11 de Mayo de 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente estén acreditados

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud, el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas, y por la Fundación Ishibashi y la Sociedad de Japón para la Promoción de la Ciencia (números KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en pugna.

Introducción

ΔFosB, un producto truncado de la FosB gen, pertenece a la familia de factores de transcripción Fos, que también incluyen c-Fos, FosB de longitud completa, Fra-1 y Fra-2. ΔFosB, al igual que otras proteínas Fos, heterodimeriza con una proteína de la familia Jun -c-Jun, JunB o JunD- para formar un complejo de factor de transcripción activo AP-1 (proteína activadora-1), que induce o reprime la expresión de genes diana específicos El1,2].

ΔFosB ha demostrado desempeñar un papel clave en la adicción a las drogas [2]. Exclusivamente entre las proteínas de la familia Fos, se acumula en el núcleo accumbens (NAc) y otras regiones cerebrales relacionadas con la recompensa después de la administración repetida de medicamentos debido a su alto nivel de estabilidad [3,4], que está mediada por la falta de dominios degron C-terminal y por la fosforilación de varias proteínas quinasas [5–7]. Dicha inducción de ΔFosB en la NAc media el aumento de las respuestas de comportamiento a las drogas de abuso. Por lo tanto, la sobreexpresión de ΔFosB en esta región del cerebro de animales adultos, ya sea mediante el uso de vectores virales o ratones bitransgenicos inducibles, aumenta la sensibilidad de un animal a los efectos de activación y recompensa locomotores de la cocaína y los opiáceos, así como la motivación de un animal para autoadministrarse. cocaína7–11]. A la inversa, la sobreexpresión de antagonistas negativos dominantes de ΔFosB causa los fenotipos de comportamiento opuestos [10–12].

Nosotros y otros hemos confirmado previamente, mediante el uso de ensayos de cambio de gel, que JunD y quizás otras proteínas de la familia Jun son las principales parejas de unión de ΔFosB en el cerebro in vivo [13–15]. Sin embargo, hasta la fecha, no ha habido una evaluación abierta e imparcial de los socios vinculantes de ΔFosB en el cerebro. Aquí, intentamos identificar nuevos socios de unión para ΔFosB mediante el uso de un ensayo de levadura de dos híbridos [16,17]. Nuestros datos revelaron que PSMC5, también conocido como SUG1, es un socio sólido de ΔFosB tanto in vitro como en NAc in vivo, donde se une a ΔFosB como parte de un complejo de activación de la transcripción inducida por cocaína, que también contiene CBP (proteína de unión a CREB ) y p300, ambas histonas acetiltransferasas (HAT), así como BRG1 (una proteína de remodelación de la cromatina). Continuamos para mostrar que la exposición crónica a la cocaína altera los niveles nucleares de PSMC5, una subunidad que contiene ATPasa del complejo proteasomal 19S, en la NAc y que PSMC5 a su vez controla las respuestas de comportamiento a la cocaína.

Material y Métodos

Cribado de levadura de dos híbridos

Las células de levadura MaV203 (Invitrogen Life Technologies) se cotransfectaron con pDBLeu conduciendo diferentes fragmentos de la proteína osFosB, y se subclonó una biblioteca de cerebro de ratón en pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Las células transformadas se cultivaron en medio SC sin leucina, triptófano e histidina, y contenían 10 mM de 3-aminotriazol. La unión entre los fragmentos FosB y un compañero candidato induce tres genes informadores (His3, Ura3 y LacZ), y la inducción hace que los transformantes sean capaces de sobrevivir en las condiciones de cultivo utilizadas. Los clones positivos se volvieron a probar con nuevos fragmentos pDBLeu-ΔFosB mediante ensayos de retransformación en células MaV203.

Líneas celulares

Las células de neuroblastoma de ratón Neuro 2A (ATCC) se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (ATCC), complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% a 37 ° C y CO al 5%2. Las células 1A de rata fueron un regalo de Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japón) [18] y mantenido en MEM de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies), complementado con 10% FBS a 37 ° C y 5% CO2. La transfección de células con ADN plasmídico se realizó utilizando Effectene (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Construcciones de PSMC5 y ΔFosB

Se generaron varias formas mutantes de PSMC5, cada una etiquetada con FLAG en su extremo N, para su uso en inmunoprecipitación o en experimentos de transferencia génica mediada por virus. Estos incluyen: PSMC5-K196M, PSMC5-dominio de bobina enrollada (PSMC5-ΔCC, que carece de los aminoácidos 27 – 68), PSMC5-NT (que consiste en el fragmento N-terminal de la proteína, aminoácidos 1 – 151) y el PSX -CT (que consiste en el fragmento C-terminal de la proteína, aminoácidos 5) (ver Fig 1). También utilizamos formas N-terminales marcadas con MYC de wildFosB de tipo salvaje, así como osFosB con una mutación en su dominio de cremallera de leucina (mutación de los aminoácidos 182 a 205 que se sabe que destruye la heterodimerización con proteínas de la familia Jun [6].

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Fig. 1. ΔFosB se une a PSMC5 in vitro.

 

A. Esquema de ΔFosB, ΔFosB-LZM en el que el dominio de cremallera de leucina se muta para eliminar la heterodimerización de ΔFosB con proteínas Jun, y Δ2ΔFosB que carece de los primeros aminoácidos 78 del término N de ΔFosB. B. Esquema de PSMC5, PSMC5-NT, que comprende los primeros aminoácidos 151 de PSMC5, PSMC5-CT, que carece de los primeros aminoácidos 235 de PSMC5, y PSMC5-ΔCC que carece del dominio de coiled-coil (aminoácidos XXX-XXX) . El dominio AAA corresponde a un motivo, ATPasas asociadas con diversas actividades celulares, presente en muchas ATPasas. C. 28 μg de pcDNA68-ΔFosB (carriles 2.4 – 3.1) o ΔFosB-LZM (carril 1) se cotransfectó con 4 μg de PSMC5 etiquetado con FLAG o varios mutantes de deleción en células Neuro2.4a. Dos días después de la transfección, las células se lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-FLAG y luego se sometieron a transferencia Western con anticuerpo anti-ΔFosB o anti-FLAG. Tenga en cuenta que ΔFosB, pero no ΔFosB-LZM, se une con fuerza a PSMC5 o PSMC2-NT, pero no a PSMC5-CT o PSMC5-ΔCC. Los datos que se muestran en la figura se replicaron por triplicado en cada uno de los tres experimentos separados.

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Animales

Se usaron ratones machos C11BL / 57J de nueve semanas de edad (el laboratorio Jackson) para todos los experimentos. Los animales se alojaron en un ciclo de luz-oscuridad 6-h con acceso a comida y agua ad libitum y se habituaron 1 semana antes de la experimentación. Se utilizaron dos regímenes de tratamiento de cocaína. Para estudiar los efectos bioquímicos de la cocaína, los animales recibieron 7 dosis diarias de cocaína (20 mg / kg) o solución salina, y se sacrificaron por decapitación 24 hr después de la última inyección. Este es un protocolo estándar, que se ha demostrado que produce numerosas respuestas moleculares y celulares al fármaco [7]. Para estudiar la influencia de PSMC5 en el núcleo accumbens en las respuestas de comportamiento a la cocaína, utilizamos una dosis por debajo del umbral del fármaco (7.5 mg / kg; consulte Sensibilización locomotora a continuación) basándose en la hipótesis de que PSMC5, como ΔFosB, aumentaría la sensibilidad de un animal a cocaína8]. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Mount Sinai.

Inmunoprecipitación y Western blotting.

Las células neuro 2A se transfectaron con formas salvajes o mutantes de PSMC5. Dos días después de la transfección, las células se lavaron en PBS, se lisaron en tampón RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% sodio desoxicolato, 10 mM butirato, proteasa inhibidor) . Los lisados ​​se dividieron y se incubaron con anticuerpos IgG no inmunes (Sigma) o anti-FLAG (Sigma) para 3 hr a 4 ° C. La inmunoprecipitación se realizó con perlas de proteína G (Invitrogen) como se describe [19]. Brevemente, las proteínas inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-FosB / ΔFosB (Cell Signaling Technology) basado en protocolos publicados [7]. Para los ensayos de unión de proteínas in vivo, utilizamos fracciones nucleares purificadas de NAc disecadas por punción de ratones después del tratamiento crónico con cocaína (20 mg / kg IP por día durante los días de 7, con ratones que utilizaron 24 hr después de la última inyección). La co-inmunoprecipitación de fracciones nucleares se realizó utilizando el kit Co-IP del Complejo Nuclear (Motivo Activo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: MYC o ß-actina, Tecnología de señalización celular (Danvers, MA), PSMC5 e histona H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 y BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y BANDERA M2, Sigma.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con los procedimientos publicados [20]. Los ratones se anestesiaron y se perfundieron intracardialmente con 4% de paraformaldehído en PBS. El cerebro se crioprotegió con 30% de sacarosa y luego se congeló y almacenó a -80 ° C hasta su uso. Se cortaron cortes coronales (40 μm) en un criostato y se procesaron para inmunohistoquímica. Las secciones de flotación libre se incubaron previamente en un tampón de bloqueo que contenía 0.3% Triton y 3% normal de suero de burro. El ΔFosB se detectó utilizando un anticuerpo policlonal de cabra producido contra la porción N-terminal de la proteína (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). Se detectó PSMC5 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal (aumento 60x; Zeiss).

Sensibilizacion locomotora

Todos los ratones recibieron inyecciones diarias de solución salina por IP durante los días 3 para acostumbrarlos al estrés de las inyecciones. Al día siguiente, a los ratones se les inyectó IP con solución salina o una dosis de cocaína por debajo del umbral (7.5 mg / kg; ver en Animales arriba) y se colocaron inmediatamente en cajas locomotoras nuevas. La actividad locomotora de los ratones se registró utilizando un sistema de fotobayo como roturas de haz ambulatorias para 30 mín. Estos tratamientos se repitieron diariamente durante días 3.

Transferencia génica mediada por virus

Utilizamos métodos ampliamente publicados para la transferencia de genes mediada por virus [7,8,11,19]. Brevemente, los plásmidos de expresión para PSMC5 o para varios de sus mutantes (ver PSMC5 y construcFosB construcciones anteriores) se subclonaron en el plásmido HSX p1005 (+) bicistrónico que expresa GFP bajo el control del promotor CMV, y PSMC5 o sus mutantes bajo ese Promotor IE4 / 5. Bajo anestesia con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), los ratones se colocaron en un instrumento estereotáxico de animales pequeños y se expuso la superficie craneal. Se utilizaron treinta y tres agujas de jeringa de calibre para infundir bilaterales 0.5 μl de un vector HSV en el NAc en un ángulo de 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) a una tasa de 0.1 μl / min. Los animales que recibieron inyecciones de HSV se dejaron recuperar durante 2 días después de la cirugía antes de la experimentación.

Estadísticas

Se utilizaron ANOVA y pruebas t de Student, corregidas para comparaciones múltiples, con significancia establecida en p <0.05.

Resultados

PSMC5: nuevo socio vinculante de ΔFosB

Realizamos experimentos preliminares para identificar un fragmento apropiado de ΔFosB que sirvió como cebo en un ensayo de dos híbridos de levadura sin autoactivar el sistema. Holo-ΔFosB indujo la actividad del gen informador por sí mismo, al igual que el fragmento de aminoácido 1-78 N-terminal de la proteína. Sin embargo, un N-terminal truncado ΔFosB (Fig 1A), denominado Δ2ΔFosB, que carece de los primeros aminoácidos 78 de la proteína, no tuvo este efecto. Por lo tanto, utilizamos Δ2ΔFosB como la proteína del cebo.

Para detectar posibles socios de enlace, utilizamos una biblioteca de cerebro de ratón subclonada en pPC86. Identificamos candidatos 11 para socios vinculantes. Aunque estas proteínas incluían a los socios de heterodimerización conocidos de ΔFosB, c-Jun y JunD (Tabla 1), el candidato más prevaleciente fue el PSMC5. Aunque fue sorprendente, este fue un hallazgo interesante, ya que en un solo informe se demostró que PSMC5 se unía a c-Fos in vitro [21]. Sin embargo, no hay informes previos de la participación de PSMC5 en la acción de la cocaína. Sin embargo, debido a la fuerza de la señal PSMC5 en el ensayo de dos híbridos de levadura, nos propusimos estudiar más a fondo las posibles interacciones ΔFosB-PSMC5.

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Tabla 1. Resultados de la detección de dos híbridos de levadura con Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Primero, para confirmar la interacción física entre ΔFosB y PSMC5, realizamos experimentos de co-inmunoprecipitación in vitro. Encontramos que el PSMC5 etiquetado FLAG (Fig 1B), transfectadas en células Neuro 2A, derribaron ΔFosB (Fig 1C). En segundo lugar, para identificar la región en PSMC5 que es responsable de su unión a ΔFosB, generamos varios mutantes PSMC5 etiquetados con FLAG (Fig 1B) y repitió el experimento de co-inmunoprecipitación. ΔFosB se eliminó de manera efectiva con los aminoácidos 151 N-terminales de PSMC5 (PSMC5-NT), pero no con el fragmento de aminoácidos 172 C-terminal de la proteína (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5 que carece de su dominio de bobina enrollada (PSMC5-ΔCC) también fue ineficaz para precipitar ΔFosB. Estos hallazgos sugieren que PSMC5 se une a ΔFosB a través de su dominio de bobina enrollada (aminoácidos 27-68). Además, el PSMC5 etiquetado con FLAG no precipitó una forma mutante de ΔFosB con un dominio de cremallera de leucina mutada (ΔFosB-LZM) (Fig 1C), lo que indica que ΔFosB se une a PSMC5 a través de este dominio o, más probablemente, que se requiere la heterodimerización de ΔFosB para la unión de PSMC5.

Unión de PSMC5-osFosB en NAc después de la administración crónica de cocaína

Sobre la base de estos hallazgos in vitro, estudiamos si los niveles de PSMC5 en el NAc están alterados en respuesta a la administración crónica de cocaína. Encontramos por fraccionamiento subcelular y transferencia de Western que la cocaína crónica aumenta los niveles nucleares de PSMC5 en esta región del cerebro sin un cambio en los niveles citoplasmáticos (Fig 2A). Este efecto no se observó después de dosis únicas de cocaína (datos no mostrados). A continuación, examinamos la localización de PSMC5 y ΔFosB en NAc mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Analizamos ratones 24 hr después de la última dosis repetida de cocaína, un momento en el que ΔFosB es el único detectable FosB producto genético (ver Nestler 2008). Encontramos una fuerte inmunorreactividad de PSMC5 en la NAc, incluida una fuerte señal nuclear. ~ 85% de nucleFosB + núcleos co-teñidos para PSMC5 (Fig 2B). Además, realizamos experimentos de co-inmunoprecipitación en extractos de NAc y encontramos que, después del tratamiento crónico con cocaína, el anticuerpo anti-PSMC5 eliminó ΔFosB de manera efectiva (Fig 2C). En contraste, el análisis de NAc sin fármaco (después de inyecciones repetidas de solución salina) reveló que no se detectó pullFosB desplegable (datos no mostrados). Estos datos son consistentes con nuestros hallazgos en cultivos celulares y confirman que ΔFosB y PSMC5 interactúan en la NAc in vivo.

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Fig. 2. Regulación de PSMC5 en ratón NAc.

 

A. Western blot de fracciones nucleares y citosólicas de NAc de ratones tratados diariamente con solución salina o cocaína (20 mg / kg) durante 7 días, con animales analizados 24 h después de la última inyección. La cocaína aumenta los niveles nucleares pero no citosólicos de PSMC5. La histona H3 y la ß-actina, que no se vieron afectadas por la cocaína, se utilizaron como controles de carga. Los datos son la media ± SEM (n = 8–10 / grupo, * p <0.05). B. Co-localización de PSMC5 endógeno (verde) y ΔFosB (azul) en NAc de ratones tratados crónicamente con cocaína como en AC Los lisados ​​nucleares de NAc de ratón después del tratamiento crónico con cocaína se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-PSMC5 o IgG de ratón como control , y luego se transfirió Western con anticuerpo anti-FosB / ΔFosB. La figura demuestra las interacciones PSMC5-ΔFosB en NAc in vivo. Los datos de B y C se replicaron por triplicado en cada uno de los tres experimentos separados.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 mejora la expresión de ΔFosB in vitro

Dado que PSMC5 es un miembro conocido del complejo de proteasoma, probamos si regula los niveles de ΔFosB usando células 1A de rata. La sobreexpresión de PSMC5 no tuvo efecto en los niveles basales de ΔFosB, pero causó un aumento pequeño pero significativo de la inducción de ΔFosB sobre la estimulación sérica de las células (Fig 3A). Se observó una tendencia similar para FosB de longitud completa, pero el efecto no alcanzó significación estadística. A la inversa, la supresión de la expresión de PSMC5 endógena en células 1A de rata, lograda mediante el uso de ARNsi que se dirigen a PSMC5, no afectó los niveles basales de osFosB, pero inhibió fuertemente la inducción de ΔFosB por estimulación con suero (Fig 3B). Se observaron efectos similares para FosB de longitud completa. Estos datos sugieren que PSMC5 no promueve la degradación proteasomal de ΔFosB, como podría esperarse como una subunidad central del proteasoma, sino que se requiere para la acumulación máxima de FosB Productos genéticos in vitro, tal vez a través de la estabilización de las proteínas.

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Fig. 3. Regulación de PSMC5 de la expresión de FosB / FosB en células 1A de rata.

 

A. Se transfectaron células de rata 1A con 4 µg de PSMC5 o ADN de control. La sobreexpresión de PSMC5 no tuvo efecto sobre los niveles de expresión basal de la proteína FosB o ΔFosB según lo determinado por Western blot, pero produjo un aumento pequeño pero significativo en la inducción de ΔFosB por estimulación sérica (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Se transfectaron células de rata 1A con 5 pmol de dos ARNip o ARN mezclado (control). Ambos ARNip disminuyeron eficazmente los niveles de proteína PSMC5 en comparación con las condiciones de control (ARNip n. ° 1, 23 ± 5% del control; ARNip n. ° 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). La caída de PSMC5 no tuvo ningún efecto sobre los niveles basales de FosB o ΔFosB, pero atenuó la inducción de FosB y ΔFosB por estimulación sérica (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB y PSMC5 forman complejos con CBP, p300 y BRG1 en NAc

Para comprender mejor los mecanismos transcripcionales por los cuales PSMC5 podría influir en la función de BFosB, investigamos posibles parejas de unión adicionales para las dos proteínas en el NAc en condiciones crónicas tratadas con cocaína. Hay un informe de que PSMC5 se une a la CBP, una HAT, y aumenta la acetilación de la histona H3 en el promotor proximal MHC-II en células HeLa [22]. Además, los ratones que son deficientes en CBP muestran una sensibilidad de comportamiento reducida a la cocaína, así como una acetilación de histonas reducida en el FosB promotor [23]. Por lo tanto, probamos si PSMC5 podría unirse con ΔFosB como parte de complejos que también contienen CBP y quizás otros activadores transcripcionales.

Primero demostramos que ΔFosB derribó efectivamente tanto a CBP como a p300, un HAT relacionado, en células Neuro2A (Fig 4A). En contraste, la forma mutante de cremallera de leucina de ΔFosB, como se esperaba, no exhibió esta actividad. De manera similar, PSMC5 redujo efectivamente CBP y p300 (Fig 4B). Curiosamente, este efecto también se observó en PSMC5-ΔCC, que no eliminó ΔFosB, lo que indica que PSMC5 interactúa con CBP y p300 a través de otros dominios de la proteína e independientemente de su unión a ΔFosB.

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Fig. 4. ΔFosB y PSMC5 interactúan con CBP, p300 y BRG1 in vitro e in vivo.

 

A. Las células Neuro2A se transfectaron con 2.4 μg de ΔFosB etiquetado MYC o ΔFosB-LZM etiquetado MYC. Los extractos celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CBP o anti-p300, y los precipitados se sometieron a transferencia de Western con el mismo anticuerpo o con anticuerpo anti-MYC. Tanto CBP como p300 interactúan con ΔFosB y tales interacciones requieren una cremallera de leucina intacta. B. Las células Neuro2A se transfectaron con 2.4 μg de PSMC5 etiquetado con FLAG o PSMC5-ΔCC etiquetado con FLAG. Los extractos celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CBP o anti-p300, y los precipitados se sometieron a transferencia de Western con el mismo anticuerpo o con anticuerpo anti-FLAG. Tanto CBP como p300 interactúan con PSMC5 y tales interacciones no requieren el dominio CC. C. Los lisados ​​nucleares de NAc de ratón después del tratamiento crónico con cocaína se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-CBP o anti-p300. La transferencia Western posterior de los precipitados resultantes con anticuerpo anti-FosB / /FosB mostró interacciones endógenas entre ΔFosB y CBP / p300. D. Partes alícuotas de los mismos lisados ​​nucleares se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-BRG1 o anti-PSMC5, seguido de transferencia de Western de precipitados con anticuerpo anti-FosB / ΔFosB o anti-BRG1. Los resultados muestran interacciones endógenas entre ΔFosB y BRG1, y BRG1 y PSMC5. E. Ilustración esquemática del complejo de activación transcripcional compuesto de odFosB: heterodímeros JunD que interactúan con CBP / p300, BRG1 y PSMC5.

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Para confirmar que estas interacciones también ocurren in vivo, administramos cocaína crónicamente para inducir niveles de MCFosB y PSMC5 nuclear, luego extractos de NAc inmunoprecipitados con anticuerpos anti-CBP o anti-p300. De acuerdo con nuestros datos de cultivo celular, la inmunoprecipitación de CBP o de p300 eliminó effectivelyFosB (Fig 4C). Probamos si BRG1, una subunidad central del complejo de remodelación de la cromatina SWI-SNF, también podría unirse a ΔFosB y PSMC5, según nuestro descubrimiento anterior de que BRG1 es reclutado para ciertos genes objetivo de ΔFosB en concierto con su activación en NAc después de la cocaína crónica [24]. Encontramos que la inmunoprecipitación de BRG1 redujo ΔFosB en extractos de NAc, y que la inmunoprecipitación de PSMC5 también coprecipitó el BRG1 endógeno coprecipitado (Fig 4D). En conjunto, estos resultados sugieren que ΔFosB-PSMC5 forma complejos en NAc que también incluyen CBP / p300 y BRG1 (Fig 4E).

La sobreexpresión de PSMC5 aumenta las respuestas locomotoras a la cocaína

La unión prominente de PSMC5 con ΔFosB en NAc nos llevó a investigar si el aumento de los niveles de PSMC5 en esta región del cerebro regula las respuestas de comportamiento a la cocaína. Generamos un vector del virus del herpes simple (HSV) que sobreexpresa PSMC5 de tipo salvaje o uno de sus mutantes y validó los vectores en NAc in vivo (Fig 5A). La expresión de PSMC5 mediada por virus predomina en el núcleo celular (Fig 5B). Los ratones que sobreexpresan PSMC5 de tipo salvaje no mostraron respuestas alteradas a las dosis iniciales de cocaína, pero mostraron una activación locomotora incrementada en respuesta a dosis repetidas de cocaína en comparación con los ratones de control que expresan GFP. En contraste, los ratones que sobreexpresan una forma mutante de PSMC5 que carece de su dominio de bobina enrollada (PSMC5-ΔCC) no mostraron este efecto (Fig 5B). Curiosamente, la sobreexpresión de PSMC5-K196M, que carece de la actividad ATPasa de la proteína de tipo salvaje, también potencia las respuestas locomotoras de la cocaína.

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Fig. 5. La sobreexpresión de PSMC5 en NAc aumenta las respuestas locomotoras a la cocaína.

 

A. Expresión transgénica representativa mediada por HSV en NAc medial. AC, comisura anterior. Las subregiones de núcleo y capa de NAc se indican en la figura. B. Aumentos más altos representativos (60x) de tinción inmunohistoquímica de PSMC5 en neuronas NAc después de la inyección de HSV-PSMC5 que muestran que la proteína es predominantemente nuclear, según se marca con la tinción DAPI. C. Los ratones recibieron inyecciones bilaterales de HSV en NAc seguidas de inyecciones IP diarias de dosis por debajo del umbral de cocaína (7.5 mg / kg). Las respuestas locomotoras se muestran en respuesta a la primera y última de las 3 dosis diarias del fármaco. La sobreexpresión de PSMC5 o PSMC5-K196M aumenta las respuestas locomotoras a la cocaína repetida, un efecto que no se observa con PSMC5-ΔCC. No hubo un efecto significativo de los transgenes sobre las respuestas locomotoras a las dosis iniciales de cocaína. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 según la prueba posthoc de Dunnett.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Discusión

Los resultados del presente estudio revelan un nuevo mecanismo mediante el cual ΔFosB media sus efectos en el cerebro y un nuevo mecanismo involucrado en la acción de la cocaína. Mediante el uso de un enfoque imparcial, un ensayo de levadura de dos híbridos, identificamos PSMC5 como un nuevo socio de unión para ΔFosB. Validamos este hallazgo tanto en células cultivadas in vitro como en NAc in vivo mediante la demostración de la unión sólida de PSMC5-ΔFosB. Es importante destacar que los niveles nucleares de PSMC5 se inducen en NAc por la administración crónica de cocaína. Además, demostramos que la unión de PSMC5-ΔFosB se produce en concierto con varias otras proteínas activadoras de la transcripción, a saber, CBP y p300 (dos HAT) y BRG1 (un componente clave de los complejos de remodelación de la cromatina SWI-SNF). Juntos, nuestros hallazgos apoyan la hipótesis de que PSMC5 es parte del complejo de activación transcripcional que se contrata al menos a ciertos genes inducidos por ΔFosB durante un curso de administración crónica de cocaína (Fig 4E). Consistente con esta hipótesis es el hallazgo adicional de que la sobreexpresión de PSMC5 en NAc, como la sobreexpresión de ΔFosB en sí, promueve respuestas de comportamiento a la cocaína. Sería interesante en estudios futuros el seguimiento de estas observaciones in vivo con la caracterización de las interacciones PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 mediante el uso de ensayos de reporteros in vitro.

La participación de PSMC5 en la acción de la cocaína es completamente novedosa. Identificado inicialmente como miembro de una gran familia de ATPasas que forman parte del proteasoma, a lo largo de los años se ha demostrado que PSMC5 interactúa con varios factores de transcripción, incluidos c-Fos, p53, receptores de hormonas nucleares y constituyentes del complejo de transcripción basal [25], sin embargo, pocos estudios funcionales se han realizado a lo largo de los años [26]. Su acción mejor establecida es promover la actividad de los factores de transcripción de MYC en células cultivadas [27]. La implicación de PSMC5 en los mecanismos transcripcionales ha sugerido un papel potencial para la actividad proteasomal de ubiquitinación en la regulación de la transcripción de genes, pero la participación de PSMC5 en dicha regulación permanece virtualmente sin probar hasta la fecha [28,29].

Se sabe muy poco acerca de la función de PSMC5 en el cerebro. Un estudio anterior demostró la expresión generalizada del ARNm de PSMC5 en todo el cerebro [30], pero su actividad funcional no ha sido estudiada. Nuestros hallazgos ahora provocan investigaciones adicionales de esta interesante proteína para comprender mejor su papel en la regulación de la transcripción de genes y su relación con la función proteasomal de ubiquitinación en el cerebro. La unión de PSMC5 a ΔFosB está mediada por el dominio de bobina enrollada de PSMC5. Además, la capacidad de PSMC5 para promover respuestas locomotoras a la cocaína, aunque requiere el dominio de bobina enrollada, no requiere la actividad ATPasa que es intrínseca a la proteína. Estos resultados plantean la posibilidad de que, al menos en nuestro sistema, la actividad principal de PSMC5 pueda estar mediada a través de su unión a ΔFosB y otras proteínas reguladoras de la transcripción y no a través de su actividad relacionada con el proteasoma. Se necesita más trabajo para probar directamente esta y otras posibilidades alternativas. La hipótesis de que la sobreexpresión mediada por virus de PSMC5 incrementó las respuestas locomotoras a la cocaína a través de las interacciones con ΔFosB es plausible, a pesar del uso de un régimen de tratamiento con cocaína 3 día, porque se sabe que se acumulan niveles apreciables de ΔFosB en el cerebro dentro de este marco de tiempo [3].

Los presentes hallazgos demuestran aún más la utilidad de utilizar enfoques experimentales imparciales y abiertos en el estudio de las bases moleculares de la regulación cerebral. Nuestra atención inicial a PSMC5 se basó únicamente en su unión prominente a ΔFosB en un ensayo de dos híbridos de levadura, sin embargo, parece ser un componente importante de los cambios transcripcionales que se reclutan en NAc por la administración repetida de cocaína. Un enfoque mejor de las investigaciones actuales es una mejor comprensión de los mecanismos detallados por los cuales los niveles nucleares de PSMC5 son inducidos por la cocaína y, a su vez, por los cuales PSMC5 contribuye a los complejos de activación transcripcional inducidos por la cocaína. Mientras tanto, nuestro ensayo de levadura de dos híbridos reveló varios socios de unión putativos adicionales de ΔFosB (Tabla 1) que también ahora justifican un examen directo en modelos de cocaína. En conjunto, este trabajo está contribuyendo a una comprensión cada vez mayor de los complejos mecanismos moleculares a través de los cuales la cocaína altera la función de NAc.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas, y por la Fundación Ishibashi y la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (números KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Contribuciones de autor

Concebido y diseñado los experimentos: YHO YNO EJN. Realizó los experimentos: YHO YNO PJK RN. Analicé los datos: YHO YNO EJN. Reactivos contribuidos / materiales / herramientas de análisis: TN MO OY AN RN TT. Escribió el papel: YHO EJN.

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