Regulación estriatal de DeltaFosB, FosB y cFos durante la autoadministración y el retiro de la cocaína (2010)

J Neurochem. Manuscrito del autor; Disponible en PMC Oct 1, 2011.
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Resumen

La exposición crónica a medicamentos induce alteraciones en los perfiles de expresión génica que se cree que subyacen en el desarrollo de la adicción a las drogas. El presente estudio examinó la regulación de la familia Fos de los factores de transcripción, específicamente cFos, FosB y ΔFosB, en subregiones del estriado durante y después de la administración de cocaína intravenosa crónica en ratas autoadministradas y con yugo. Encontramos que cFos, FosB y ΔFosB exhiben patrones de expresión regional y temporalmente distintos, con una mayor acumulación de proteína ΔFosB en el núcleo accumbens (NAc) concha y núcleo después de la administración crónica de cocaína, mientras que los aumentos de increasesFosB en el caudate-putamen (CPu) permanecen Similar con la administración aguda o crónica. En contraste, la tolerancia se desarrolló al ARNm inducido por la cocaína para ΔFosB en todas las subregiones del estriado 3 con administración crónica. La tolerancia también se desarrolló en la expresión de FosB, sobre todo en el shell NAc y CPu. Curiosamente, la tolerancia a la inducción de cFos inducida por la cocaína dependía del control volitivo de la ingesta de cocaína en las regiones ventrales pero no en el estriado dorsal, mientras que la regulación de FosB y ΔFosB fue similar en los animales autoadministrados y con yugo de cocaína. Por lo tanto, las neuroadaptaciones mediadas por osFosB en el CPu pueden ocurrir antes de lo que se pensaba previamente con el inicio del consumo de cocaína por vía intravenosa y, junto con una mayor acumulación de ΔFosB en la NAc, podrían contribuir a aumentos relacionados con la adicción en el comportamiento de búsqueda de cocaína.

Palabras clave: cocaína, autoadministración, abstinencia, estriado, Fos

Introducción

La exposición repetida a las drogas adictivas produce neuroadaptaciones en las vías de recompensa cerebral que se cree que subyacen tanto en el desarrollo de la toma compulsiva de drogas como en la persistencia del deseo y la recaída de la conducta de búsqueda de drogas en la abstinencia. Muchas de estas neuroadaptaciones resultan de la inducción de factores de transcripción y la posterior regulación de la expresión génica, que puede tener efectos potencialmente duraderos en la estructura y función neuronal (Zhang et al. 2006). La familia de factores de transcripción Fos es de particular interés, ya que los miembros de esta familia muestran patrones de inducción diferencial en las regiones del estriado después de la exposición aguda y crónica a la cocaína. Cuando la cocaína se administra de forma aguda de forma pasiva, no contingente (es decir, mediante inyección intraperitoneal (IP)) aumenta el mRNA y la proteína cFos y FosB tanto en el dorsal (caudate-putamen, CPu) como en el ventral (núcleo accumbens, NAc) estriado (Graybiel et al. 1990; Young Ring et al. 1991; Hope et al. 1992), Mientras que la tolerancia a esta respuesta se produce con la administración pasiva crónica. (Hope et al. 1992, 1994; Alibhai et al. 2007). En contraste, los niveles estriatales de ΔFosB (35-37 kDa), una variante de empalme truncada estable del FOC Gen, se elevan después de la exposición pasiva crónica pero no aguda a la cocaína. (Hope et al. 1994; Nye et al. 1995; Chen et al. 1995, 1997). Estas isoformas de ΔFosB estables pueden heterodimerizarse con diferentes proteínas de la familia Jun que cFos o FosB (Chen et al. 1995), y también pueden formar homodímeros funcionales consigo mismos (Jorissen et al. 1997), lo que sugiere que la formación diferencial de los complejos de proteína activadora-1 (AP-1) después de la cocaína crónica puede alterar la expresión génica en los sitios AP-1 de una manera que es distinta de la expresión génica producida por la exposición aguda a la cocaína (Esperanza, 1998; Kelz y Nestler, 2000). Los cambios diferenciales en los perfiles de expresión génica también se producen dependiendo de si las elevaciones de ΔFosB son a corto plazo o de larga duración, y estos cambios pueden conducir a la expresión diferencial de los comportamientos mediados por la cocaína (McClung y Nestler, 2003). Exposición crónica a otras drogas, incluyendo anfetamina, morfina,9-THC, nicotina, etanol y fenciclidina también conducen a la acumulación de isoformas estables de ΔFosB en regiones estriatales (McClung et al. 2004; Perrotti et al. 2008). Además, los hallazgos recientes sugieren una interacción negativa entre la acumulación de BFosB y los cFos inducidos por anfetamina que pueden explicar la tolerancia a la inducción de cFos después de la exposición crónica a estimulantes (Renthal et al. 2008). En conjunto, estos hallazgos han llevado a la hipótesis de que las isoformas estables de ΔFosB pueden actuar como un "cambio molecular" y facilitar la transición del uso inicial de drogas a estados biológicos más adictos (Nestler et al. 2001; Nestler, 2008).

Si bien la mayoría de los estudios anteriores utilizaron tratamientos pasivos repetidos con cocaína para estudiar la expresión de las proteínas de la familia Fos, existen relativamente pocos ejemplos de esta regulación cuando la cocaína se autoadministra por vía intravenosa (IV) durante varias horas, lo cual es típico de los patrones de abuso humano. Un estudio encontró que el mRNA de cFos se eleva en el CPu después de una sesión de 30-min de autoadministración de cocaína en ratones (Kuzmin y Johansson, 1999), mientras que no se han encontrado cambios en el CPu de ratas después de cualquiera de los dos subcrónicos ( Autoadministración de cocaína (días 3) o crónica (semanas 6-12) (Daunais et al. 1993, 1995). Después de un período de abstinencia, el aumento mediado por la cocaína en la proteína cFos en la NAc se reduce en ratas con una ingesta de cocaína aumentada previamente (Ben-Shahar et al. 2004), mientras que los niveles elevados de cFos se encuentran en todo el estriado después de la exposición a las señales asociadas a la cocaína (Neisewander et al. 2000; Kufahl et al. 2009). En contraste con cFos, se ha demostrado un aumento en los niveles de proteína de ΔFosB en todo el estriado después de la autoadministración crónica de cocaína, y esta acumulación puede persistir durante al menos 1 en el día en que se retiraPich et al. 1997; Perotti et al. 2008). Sin embargo, no hay informes que comparen los cambios en la capacidad de respuesta de múltiples proteínas de la familia Fos a dicha administración intravenosa de cocaína con exposición aguda o crónica. Dadas las posibles interacciones entre ΔFosB y cFos, la capacidad de la formación diferencial del complejo AP-1 para producir efectos diferenciales en la expresión génica y el posible impacto de estas diferencias en el comportamiento mediado por la cocaína, también es importante confirmar que las alteraciones en el la expresión de cFos, FosB y ΔFosB que ocurren después de la administración no contingente también se encuentran cuando la cocaína se autoadministra voluntariamente, y para determinar cuánto tiempo pueden persistir estas alteraciones después de que finaliza la administración de la cocaína. Por lo tanto, en el presente estudio comparamos los efectos de la administración intravenosa crónica de cocaína sobre la expresión de ΔFosB, FosB y cFos en subregiones estriatales durante la administración y el retiro de la cocaína. Comparamos la regulación encontrada con la autoadministración volitiva con la regulación en animales que recibieron una cantidad y un patrón temporal idénticos de cocaína a través de infusiones con yugo no volitivo después de una exposición aguda o crónica. Dado que FosB y ΔFosB son variantes de empalme de los mismos FOC gen, también comparamos la regulación de los ARNm para FosB y ΔFosB con la regulación a nivel de proteína.

Procedimientos experimentales

Sujetos y cirugia

Ratas macho adultas Sprague-Dawley que pesaban inicialmente aproximadamente 250-300 g se alojaron en un ambiente controlado por temperatura y humedad en un ciclo de luz / oscuridad 12 h (las luces se encienden en 7: 00 AM). Los animales fueron alimentados con comida y agua. ad libitum en todo momento, con la excepción de que se mantuvieron en 85% de su peso de alimentación libre durante el entrenamiento con la prensa de palanca para pellets de sacarosa (45 mg, BioServ). El entrenamiento con la prensa de palanca se realizó en cámaras operantes ventiladas (Med Associates, Georgia, VT) hasta que se cumplieron los criterios de adquisición (pellets 100 por sesión para sesiones consecutivas de 3) bajo un programa de refuerzo de 1 de proporción fija (FR1). Los animales fueron alimentados ad libitum Por lo menos 24 h antes de la cirugía. Para la cirugía, a las ratas se les administró atropina (0.04 mg / kg, subcutánea) para ayudar a la respiración y se insertó un catéter permanente en la vena yugular derecha bajo pentobarbital sódico (50 mg / kg, IP) según los procedimientos publicados previamente (Edwards et al. 2007a). Después de la cirugía, a las ratas se les administró una inyección de penicilina (200,000 UI / kg, intramuscular) para prevenir la infección, y los catéteres se lavaron diariamente con 0.2 ml heparinizado (20 UI / ml) solución salina bacteriostática que contenía sulfato de gentamicina (0.33 mg / ml). Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud. Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern Medical Center (IACUC).

Aparatos y procedimientos de autoadministración.

Tras la recuperación de la cirugía de 1 wk, los animales se dividieron en varios grupos experimentales / tiempo de retirada (Fig. 1A), y regresó a las cámaras de prueba operantes en sesiones diarias como se describió anteriormente (Edwards et al. 2007b). Las ratas en el grupo de control no tratado se alojaron individualmente y se manejaron diariamente en sus jaulas sin exponerse al entorno de autoadministración. A las ratas en el grupo de autoadministración de cocaína (CSA) se les permitió autoadministrarse voluntariamente cocaína (0.5 mg / kg / 50 μl infusión) bajo una proporción fija de 1 (FR1) programa de refuerzo en sesiones diarias de 4 h, conducidas 6 días / semana, para un total de 18 días. Cada presión de palanca activa produjo una infusión de cocaína de 2.5 que se asoció con la iluminación de una luz indicadora sobre la palanca activa. La luz de la casa se apagó durante las infusiones de cocaína, y hubo un período de espera adicional de 12.5 después de la infusión en la que la luz de la casa permaneció apagada. La palanca de respuesta durante el período de infusión y tiempo de espera se registró, pero no tuvo ninguna consecuencia. Una palanca adicional inactiva estaba presente en las cámaras, pero responder en esta palanca no tuvo consecuencias. Las ratas en el grupo de yugo crónico (CY) se emparejaron con ratas autoadministradas activamente y recibieron infusiones pasivas de cocaína en cantidades y patrones temporales idénticos a sus parejas autoadministradas. Las ratas en el grupo de yugo agudo (AY) también se emparejaron con ratas en el grupo con CSA crónico, pero recibieron infusiones salinas pasivas en lugar de cocaína hasta el último día de la autoadministración, cuando recibieron una sola sesión de infusiones pasivas de cocaína por primera vez. hora. Finalmente, se permitió que el grupo de Saline SA se autoadministara con salina para identificar posibles cambios relacionados con la cirugía, las pruebas u otros procedimientos experimentales en comparación con los controles no tratados. Las comparaciones entre los grupos AY y CY se usaron para identificar cambios en la capacidad de respuesta de cFos, FosB o ΔFosB con exposición aguda y crónica a la cocaína, mientras que los grupos CSA y CY se compararon para identificar cambios en la expresión de cFos, FosB o ΔFosB que fueron Específicamente relacionado con la recompensa frente a los efectos farmacológicos de la cocaína. El tejido de todos los grupos de estudio se recolectó inmediatamente después de la sesión de prueba final de 4 h para comparar la regulación inducida por la cocaína de cFos, FosB y cocaFosB, y se determinó la persistencia de los cambios inducidos por la cocaína en algunos grupos de estudio con tejido recolectado 24 h o 3 semana después de la sesión de prueba final. Se utilizaron procedimientos de Western blot cuantitativo y RT-PCR en disecciones de subregiones del estriado para evitar problemas potenciales relacionados con la reactividad cruzada de anticuerpos y mejorar la sensibilidad para detectar cambios.

Figura 1 y XNUMX  

(A) Línea de tiempo que representa la administración de cocaína y los regímenes de abstinencia (WD). Las líneas continuas indican la administración intravenosa de infusiones de cocaína (0.5 mg / kg / infusión) en animales con autoadministración crónica de cocaína (CSA) y de yugo crónico (CY) para un total ...

Colección de tejidos

Las ratas se sacrificaron por irradiación de microondas dirigida a la región de la cabeza (5 kW, 1.5 s, Murimachi Kikai, Tokio, Japón). Los cerebros se diseccionaron y se enfriaron rápidamente, y se obtuvieron punzones de tejidos bilaterales (calibre 14) del núcleo accumbens (NAc), núcleo NAc y caudato-putamen (CPu) a partir de cortes coronales de 1.5 mm en base a las coordenadas obtenidas de Paxinos y Watson (1998ilustrado en Figura 1B). Las muestras de tejido se homogeneizaron por sonicación en un tampón de lisis que contenía proteasa e inhibidores de la fosfatasa. Luego se homogeneizaron los homogeneizados durante 5 min, se colocaron en hielo y posteriormente se analizaron con Lowry para determinar las concentraciones de proteína. Luego se homogeneizaron los homogeneizados en 20 μg muestras y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.

Western blots

Las muestras de tejido se cargaron en geles de poliacrilamida 12% para su separación por electroforesis en solución salina tamponada con tris / glicina / dodecil sulfato de sodio (TGS; Bio-Rad, Hercules, CA). Después de la separación, las muestras se transfirieron por electroforesis (250 mA para 18 h) a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF; Amersham, Piscataway, NJ) y posteriormente se bloquearon en 3% de leche en polvo sin grasa y 1 x Tris / Tween solución salina tamponada (TTBS; Bio -Rad, Hercules, CA) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se incubaron luego en 1: 1000 dilución del anticuerpo primario Fra (amablemente proporcionado por el Dr. Michael Iadarola, National Institutes of Health, Bethesda, MD) en una solución de 3% leche / 1 x TTBS durante la noche a 4 ° C. Se lavaron las membranas. en 1 × TTBS (4 veces, 15 mín. cada una), e incubado en 1 × TTBS que contiene una dilución 1: 25000 de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad, Hercules, CA) para 1 en la habitación temperatura. Las membranas se lavaron de nuevo y luego se desarrollaron utilizando la detección mediada por quimioluminiscencia Pierce Super Signal West Dura (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) en Hyperfilm (ECL plus; Amersham). La localización de las bandas de proteína cFos, FosB y ΔFosB se ilustra en Figura 1C. En este estudio, elegimos examinar solo las formas estables expresadas de ΔFosB (es decir, 35-37 kDa), ya que se cree que estas formas se acumulan con el uso crónico de drogas y producen la neuroplasticidad subyacente a la adicción (Nestler et al. 2001). Scion Image (Frederick, MD) se usó para asignar inmunorreactividad absoluta a las bandas, y se usó un escáner para tomar imágenes digitales de las películas. Después de la detección, las membranas se extrajeron y se volvieron a sondear para detectar β-tubulina (1: 200000, Cell Signaling, Danvers, MA). Los niveles de β-tubulina se utilizaron como control de carga para normalizar los niveles de proteínas relacionadas con Fos.

RT-PCR

Se usó RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para determinar los cambios del ARNm de FosB y ΔFosB inmediatamente y 24 h después de la administración de cocaína. Los animales se sometieron a eutanasia por decapitación rápida y se aislaron los núcleos NAc, NAc shell y CPu como se describe (Graham et al. 2007; Bachtell et al. 2008). Las muestras individuales se homogeneizaron inmediatamente en RNA-STAT-60 (IsoTex Diagnostics Inc, Friendswood, TX) y se congelaron en hielo seco hasta que se extrajo el mRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió cloroformo a cada muestra y la capa acuosa se aisló después de la centrifugación. El ARNm total se precipitó con isopropanol en presencia de acrilamida lineal (Ambion, Austin, TX). Las muestras se centrifugaron y los sedimentos de ARNm extraídos se lavaron con etanol al 70% y se resuspendieron en agua DEPC. El ARNm total se trató con ADNasa (Ambion, Foster City, CA) y se sometió a transcripción inversa a ADNc con hexámeros aleatorios utilizando Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secuencias de cebadores utilizadas para amplificar FosB, ΔFosB y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron 5′-GTGAGAGATTTGCCAGGGTC-3 ′ y 5′-AGAGAGAAGCCGTCAGGTTG-3 ′, 5′-AGGCAGAGCTG-3 ′, 5′-AGGCAGAGCTGAT-GAGTGCC ′ GAGTC ′ Y 3′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-5 ′ y 3′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-5 ′, respectivamente. Los umbrales de ciclo (cT) se calcularon a partir de reacciones por triplicado utilizando la segunda derivada de la curva de amplificación. Los valores de cT de FosB y ΔFosB se normalizaron a los valores de cT de GAPDH (ΔcT) ya que la cocaína no regulaba la GAPDH. Los cambios de pliegue se calcularon utilizando el método ΔΔcT como se describió anteriormente (manual de Applied Biosystems).

análisis estadístico

Los niveles de cada proteína se expresaron como% de cambio de los controles no tratados para cada región del cerebro y punto de tiempo, y los grupos de estudio se compararon mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), con el nivel de significancia establecido en p <0.05. Los efectos generales fueron seguidos por comparaciones post-hoc utilizando pruebas de LSD de Fishers. Las correlaciones entre la ingesta de cocaína y los cambios en los niveles de proteínas se evaluaron mediante regresión lineal.

Resultados

Los animales en el grupo CSA a los que se les permitió autoadministrarse voluntariamente cocaína mostraron patrones estables de autoadministración de cocaína en la tercera semana de SA (días 13-18). Durante la última semana de SA, la ingesta diaria promedio de cocaína en ratas CSA y sus parejas de CY fue 46.9 (± 1.8) mg / kg / día (rango: 37-60 mg / kg / día). El último día de la prueba, las ratas CSA en el grupo de extracción con 0 h (WD) se autoadministraron 44.5 (± 2.5) mg / kg de cocaína (rango 25.5-57.5 mg / kg) y su CY recibió una cantidad idéntica de cocaína. y socios de AY.

Regulación diferencial de la proteína ΔFosB en subregiones del estriado después de la cocaína aguda o crónica

La regulación diferencial de la proteína ΔFosB se encontró en subregiones del cuerpo estriado inmediatamente después de 4 h de la administración de cocaína por vía intravenosa (0 h WD). En la capa de NAc, solo la cocaína crónica produjo aumentos significativos en los grupos CSA y CY (45-61%) en comparación con los controles no tratados (Fig. 2A, F4,60 = 4.22, p = 0.005). En el núcleo de NAc, se encontraron aumentos significativos en ΔFosB (41%) después de la exposición aguda en el grupo AY (Fig. 2B, F4,60 = 17.04, p <0.001), y se encontraron aumentos aún mayores (89-95%) después de la cocaína crónica. En contraste con la mayor acumulación de ΔFosB en el NAc con la administración crónica de cocaína, la CPu mostró aumentos similares en ΔFosB (86-102%) en los grupos de cocaína aguda y crónica (Fig. 2C, F4,78 = 19.09, p <0.001). No hubo diferencias en los aumentos de ΔFosB entre los grupos CSA y CY en ninguna subregión estriatal, lo que indica que la regulación estaba relacionada con la exposición a la cocaína independientemente del consumo voluntario de cocaína. La regulación de ΔFosB persistió durante al menos 24 h después de la cocaína crónica en la capa de NAc (F2,32 = 5.19, p = 0.02), núcleo NAc (F4,60 = 4.53, p = 0.02), y CPu (F2,34 = 12.13, p <0.001), pero volvió a los niveles iniciales después de 3 semanas. Se encontraron aumentos similares en ΔFosB cuando se compararon los grupos de cocaína con el grupo de Saline SA, excepto que los aumentos más pequeños en el caparazón de NAc de los animales AY alcanzaron significación en comparación con Saline SA, pero no con los controles no tratados. Sin embargo, no hubo una regulación significativa de ΔFosB en los animales que se autoadministraron solución salina durante el entrenamiento en comparación con los controles no tratados, lo que indica que la regulación de ΔFosB se debió a la cocaína y no a un resultado de los procedimientos quirúrgicos o de prueba.

Figura 2 y XNUMX  

Regulación de ΔFosB inmediatamente después de la administración de cocaína y en 24 hy 3 semanas WD. Los niveles de ΔFosB (35-37 kDa) se expresan como la media ± cambio porcentual SEM de los controles de homecage sin tratar (Control). Tejido de solución salina ...

Tolerancia a la regulación de la proteína FosB después de la cocaína crónica

En contraste con la regulación de ΔFosB, una sola exposición a 4 h de la administración de cocaína por vía intravenosa produjo aumentos sustancialmente mayores en la proteína FosB en todas las subregiones estriatales de 3, pero se desarrolló una tolerancia sustancial en esta respuesta después de la administración crónica de cocaína. En la capa de NAc, FosB aumentó (260%) inmediatamente después de 4 h de la administración de cocaína aguda en animales AY, pero estos aumentos se redujeron (a 142-146%) después de la administración crónica en ambos grupos CY y CSA (Fig. 3A, F4,77 = 23.16, p <0.001). Se encontraron aumentos similares en FosB (295%) en el CPu de animales AY que también se redujeron (a 135-159%) después de la administración crónica de cocaína en los grupos CY y CSA (Fig. 3C, F4,69 = 13.362, p <0.001). En el núcleo de NAc, la administración aguda de cocaína produjo aumentos menos sustanciales de FosB (164%) en los animales AY en comparación con las otras regiones del cerebro; sin embargo, estos aumentos fueron aún mayores que los producidos después de la administración crónica (109-112%) en los grupos CY y CSA (Fig. 3B, F4,57 = 20.23, p <0.001). Como se encontró con ΔFosB, la regulación de FosB después de la cocaína crónica no fue modulada por el control voluntario de la ingesta de cocaína. Sin embargo, en contraste con ΔFosB, los aumentos en la proteína FosB no persistieron tanto en la capa de NAc como en el núcleo después de 24 h, aunque los aumentos residuales (38-52%) persistieron en el CPu (F2,32 = 3.590, p <0.05). Los niveles de FosB no se vieron afectados por procedimientos quirúrgicos o de prueba en animales que se autoadministraron solución salina.

Figura 3 y XNUMX  

Regulación de FosB inmediatamente después de la administración de cocaína y en 24 hy 3 semanas WD. Los niveles de proteína de FosB (46-50 kDa) se expresan como el cambio porcentual medio ± SEM de los controles de homecage no tratados (ver Figura 2 y XNUMX leyenda para las abreviaturas) ...

Atenuación de la inducción del ARNm de ΔFosB y FosB después de la cocaína crónica

La exposición aguda a 4 h de la administración de cocaína por vía intravenosa produjo aumentos similares (pliegue 11-16) en el ARNm de ΔFosB en la capa de NAc (F3,19 = 15.82, p <0.001), núcleo NAc (F3,19 = 13.275, p <0.001 y CPu (F3,11 = 5.78, p = 0.03) en comparación con los controles de Saline SA (0 h WD, Fig. 4A). Sin embargo, esta respuesta fue fuertemente reprimida en los grupos CY y CSA después de la administración crónica de cocaína en la envoltura NAc (pliegue 3-4), núcleo NAc (pliegue 4) y CPu (pliegue 3). A pesar del hecho de que la administración intravenosa de cocaína por vía intravenosa produjo mayores aumentos en la proteína FosB en comparación con ΔFosB, la administración de cocaína aguda indujo aumentos relativamente menores en el ARNm para FosB (pliegue 4-9) que para ΔFosB (pliegue 11-16) en todas las subregiones estriatales 3 (Fig. 4B). Esta respuesta fue virtualmente abolida después de la cocaína crónica en la capa de NAc (F3,19 = 26.22, p <0.001) y CPu (F3,11 = 4.24, p <0.05), aunque se mantuvieron aumentos pequeños pero significativos (2 veces) en los grupos CY y CSA en el núcleo NAc (F3,19 = 11.10, p <0.001). Los aumentos inducidos por la cocaína tanto en ΔFosB como en FosB en los animales AY no se mantuvieron después de 24 h WD en comparación con este mismo grupo de control de Saline SA. Un análisis adicional de la relación de los niveles de ARNm de FosB a ΔFosB en el punto de tiempo de 0 h WD mostró que la administración de cocaína redujo marcadamente la cantidad relativa de ARNm de FosB a ΔFosB en la capa de NAc (F3,19 = 4.79, p = 0.02), núcleo NAc (F3,19 = 4.49, p = 0.02), y CPu (F3,11 = 5.59, p = 0.03) debido a la mayor formación de la isoforma ΔFosB, e independientemente de la tolerancia sustancial a la respuesta inducida por la cocaína en ambos ARNm después de la administración crónica (Fig. 4C). No hubo diferencia significativa en estas proporciones si la cocaína se autoadministró o recibió de forma pasiva mediante infusión con yugo, y las proporciones relativas de FosB: ΔFosB volvió a la normalidad en las tres regiones del cerebro en el momento 24h WD (no se muestran los datos).

Figura 4 y XNUMX  

Regulación del ARNm para FosB y ΔFosB inmediatamente después de la administración de cocaína y en 24 h WD. La RT-PCR cuantitativa de las transcripciones para ΔFosB (A), FosB (B) y la relación FosB / ΔFosB transcripciones (C) se expresan como la media ± ...

Tolerancia del refuerzo a los cFos inducidos por la cocaína en el NAc

En contraste con la regulación de los productos genéticos de FosB que representaban una respuesta farmacológica a la cocaína independientemente de la administración pasiva o volitiva, la regulación de las cFos en las subregiones de NAc fue fuertemente influenciada por el contexto de autoadministración de la cocaína en comparación con los animales que recibieron cocaína mediante infusiones pasivas. La exposición a la cocaína aumentó los niveles de proteína cFos (109-126%) tanto en la capa de NAc como en el núcleo con administración aguda o crónica en los grupos AY y CY (Fig. 5A-B). Sin embargo, cuando las infusiones de cocaína se administraron de manera contingente a la respuesta en animales autoadministrados, esta respuesta se redujo (a 55%) en la capa de NAc (F4,60 = 9.14, p <0.001) y no logró aumentar significativamente los cFos en el núcleo NAc (F4,57 = 5.92, p <0.001). En el CPu, la tolerancia a los cFos inducidos por la cocaína se desarrolló con la administración crónica pasiva o volitiva de cocaína (Fig. 5C), y la inducción de cFos en animales AY (164%) se redujo (a 45-57%) en ambos grupos CY y CSA (F4,67 = 13.29, p <0.001), similar al desarrollo de tolerancia en la inducción de la proteína FosB en las 3 subregiones estriatales. Por tanto, la tolerancia relacionada con el refuerzo a los cFos inducidos por la cocaína se produjo específicamente en las regiones mesolímbicas del cuerpo estriado. En las 3 regiones estriatales, no se encontraron aumentos en cFos en animales que se autoadministraron solución salina y no persistieron después de 24 h WD.

Figura 5 y XNUMX  

Regulación de cFos inmediatamente después de la administración de cocaína y en 24 h WD. Niveles de proteína de cFos (52-58 kDa) en ratas de control (Control, Saline SA), en ratas que recibieron cocaína pasiva con yugo de forma aguda (AY) o crónica (CY), y en ratas sometidas a ...

Relación entre la ingesta de cocaína, cFos y ΔFosB en subregiones del estriado

Dado que las cantidades de autoadministración de cocaína variaron entre los animales individuales y sus parejas en yugo, comparamos la cantidad de consumo de cocaína con la inducción de los niveles de proteína cFos, FosB y ΔFosB mediante análisis de regresión lineal múltiple (ver Tabla suplementaria 1 para los resultados de todas las correlaciones potenciales). Hubo correlaciones significativas entre el consumo de cocaína y los niveles de cFos en ratas que recibieron administración aguda de cocaína por infusiones pasivas, y estas relaciones difirieron en las subregiones estriatales dorsal y ventral. En el núcleo de NAc, la inducción de cFos inmediatamente después de 4 h de la administración de cocaína IV aguda se correlacionó de manera fuerte y negativa con la ingesta de cocaína, mientras que se encontró una relación similar pero insignificante en la capa de NAc ( ). En contraste, la inducción de cFos se correlacionó positivamente con el consumo de cocaína en el CPu. No hubo correlaciones significativas entre el consumo de cocaína (activa o pasiva) y los niveles de proteína de FosB o orFosB en ninguna subregión estriatal. Sin embargo, hubo una fuerte correlación positiva entre los niveles de cFos y ΔFosB en la capa de NAc 24 h después de la cocaína, pero solo en animales que recibieron cocaína mediante autoadministración volitiva ( ), y a pesar del hecho de que los niveles generales de cFos no se modificaron en 24 h WD. Tendencias similares (p <0.07) para correlaciones positivas entre los niveles de proteínas cFos y ΔFosB se encontraron inmediatamente después de 4 h de autoadministración de cocaína en el núcleo NAc y en el CPu de los animales que recibieron cocaína por primera vez (grupo AY).

Figura 6 y XNUMX  

Correlación específica de la región entre el consumo de cocaína y la inmunorreactividad de cFos después de la cocaína aguda (AY). El porcentaje de aumento en la inmunorreactividad de cFos se correlaciona negativamente con la ingesta de cocaína en la sesión final en el núcleo de NAc (A) y se correlacionó positivamente ...
Figura 7 y XNUMX  

Correlación significativa entre cFos y ΔFosB en la concha NAc en animales autoadministrados. El porcentaje de aumento en la inmunorreactividad de cFos se correlaciona positivamente con la inmunorreactividad de ΔFosB después de 24 h WD en autoadministración de cocaína ...

Discusión

En el presente estudio, examinamos los efectos de la exposición intravenosa aguda y crónica a la cocaína o la autoadministración crónica en la regulación de los niveles de BFosB, FosB y cFos en las subregiones NAc shell, NAc core y CPu striatal. Estudios previos han encontrado sistemáticamente que ΔFosB aumenta solo después de la exposición repetida, y no después de la administración aguda de cocaína mediante inyecciones pasivas de cocaína por IP (Hope et al. 1994, Nye et al. 1995; Chen et al. 1995). De manera similar, encontramos que la exposición crónica a la cocaína por vía intravenosa aumentó ΔFosB en todas las subregiones estriatales examinadas, independientemente de si se administró de forma volitiva o pasiva. Sin embargo, una diferencia importante con respecto a estudios anteriores es que la administración aguda de cocaína incrementó los niveles de proteína ΔFosB tanto en el núcleo NAc como en la CPu, y se acercó a la importancia en la capa de NAc (p <0.1). Una posible explicación de esta diferencia puede ser la dosis y / o la duración de la exposición a la cocaína, ya que las ratas del grupo AY recibieron múltiples infusiones de cocaína por vía intravenosa durante una única sesión de 4 h, lo que dio como resultado una ingesta total de cocaína que varió de 25.5 a 57.5 ​​mg / kg de ancho. animales individuales, que supera con creces las dosis de 10-20 mg / kg que se suelen utilizar con una única inyección IP en bolo (Hope et al. 1994; Lee et al. 2006). Además, la cocaína se administró a través de una vía de administración IV más directa que produce mayores niveles cerebrales máximos de cocaína y dopamina que persisten durante la sesión, mientras que estos efectos generalmente disminuyen una hora después de la inyección de IP (Bradberry, 2002). Por lo tanto, la capacidad de ΔFosB para acumularse después de una exposición aguda única a la cocaína es probable que dependa tanto de la fuerza como de la duración del estímulo de cocaína utilizado en el presente estudio. En cualquier caso, el hallazgo de que ΔFosB puede acumularse después de una sola exposición a la cocaína indica que ΔFosB podría ejercer sus efectos más rápidamente de lo que se pensaba anteriormente, posiblemente como resultado de un atracón inicial de autoadministración.

Curiosamente, la cantidad de acumulación de BFosB difirió entre las regiones estriatales dorsal y ventral en el transcurso de la administración crónica de cocaína. En el núcleo de NAc, la cantidad de ΔFosB encontrada inmediatamente después del último día de administración crónica (0 h WD) fue más del doble de la cantidad que se encontró después de la administración aguda, y los aumentos más pequeños de ΔFosB en la capa de NAc alcanzaron significación solo después de la administración crónica , independientemente de si la cocaína fue autoadministrada o recibida por infusión pasiva de yugo. Los aumentos con la administración crónica de cocaína probablemente reflejan la acumulación de proteína ΔFosB altamente estable, ya que persistieron durante al menos 24 horas después de la última exposición. En contraste, los grandes aumentos en la cantidad de ΔFosB en el CPu no difirieron con la exposición aguda o crónica, lo que potencialmente refleja un techo producido por la exposición aguda en esta región del cerebro. Sin embargo, incluso en el CPu, la acumulación de proteína ΔFosB probablemente contribuyó a aumentar de manera persistente los niveles de ΔFosB después de la exposición crónica, ya que se desarrolló una tolerancia sustancial al mRNA inducido por la cocaína para ΔFosB en todas las regiones cerebrales 3 con administración crónica.

La administración aguda de cocaína intravenosa también aumentó los niveles de proteína FosB de longitud completa, con mayores aumentos en la capa de CPu y NAc que en el núcleo de NAc. Sin embargo, el ARNm para FosB fue inducido por casi 10 veces en la capa de NAc y menos de 5 veces en el núcleo de CPu y NAc. Se desarrolló una tolerancia sustancial a la capacidad de la cocaína para inducir tanto el ARNm como la proteína para FosB con la administración crónica, aunque se mantuvo una menor inducción de la proteína FosB y podría competir con ΔFosB por los compañeros de unión de AP-1. La relación relativa de ARNm de FosB / ΔFosB también se redujo con la administración aguda de cocaína debido a una inducción relativamente mayor de ΔFosB, en consonancia con informes anteriores que utilizan anfetamina (Alibhai et al. 2007). En contraste con los hallazgos anteriores con tratamientos repetidos con anfetaminas, la reducción en la proporción relativa de ARNm de FosB / ΔFosB por la cocaína aguda se mantuvo después de la administración crónica, lo que refleja la inducción residual relativamente más alta de ΔFosB que de FosB.

El hecho de que los niveles de ΔFosB aumentan incluso después de los patrones de uso agudo de cocaína y la duración de la administración más típica del uso de drogas por vía intravenosa en humanos tiene implicaciones importantes para el proceso de adicción. Por lo tanto, ΔFosB podría contribuir a la actividad de unión de AP-1 con el uso inicial de cocaína si las dosis adecuadas fueran autoadministradas. Sin embargo, ΔFosB competiría tanto con FosB como con cFos por la actividad de unión de AP-1, lo que llevaría a una expresión génica en sentido descendente y una neuroplasticidad distinta de la administración crónica cuando elevatedFosB se eleva con cFos y FosB sustancialmente reducidos. Por lo tanto, el ΔFosB puede tener mayores efectos después de la administración crónica de cocaína debido a una mayor acumulación en el estriado ventral y una menor competencia por los compañeros de unión de AP-1 en el estriado dorsal y ventral. Dado que la sobreexpresión específica de estriado de strFosB aumenta la motivación para la cocaína (Colby et al. 2003), tal rápida acumulación de ΔFosB con la exposición inicial a la cocaína podría perpetuar el consumo de cocaína en etapas muy tempranas del proceso de adicción. Además, dicha expresión prominente y generalizada de ΔFosB en todo el estriado con exposición aguda alteraría la actividad de unión de AP-1 de una manera que podría facilitar la formación de hábitos compulsivos a través del compromiso temprano de los circuitos estriatales dorsales (Belin y Everitt, 2008).

Teniendo en cuenta la estabilidad de las isoformas de BFosB, los niveles de ΔFosB se mantuvieron notablemente elevados 24 horas después de la última sesión de administración de cocaína, en consonancia con estudios previos que utilizaron la administración de cocaína intravenosa crónica (Pich et al. 1997; Perotti et al. 2008). Otros estudios que utilizaron la administración pasiva de experimentación de inyecciones de cocaína por IP encontraron que la acumulación de ΔFosB puede persistir durante las semanas de abstinencia de 1-2 (Hope et al. 1994; Brenhouse y Stellar, 2006; Lee et al. 2006), aunque no encontramos evidencia de estos cambios 3 semanas después del cese de la administración de cocaína. Juntos, estos estudios sugieren que la acumulación de ΔFosB puede persistir durante períodos de abstinencia relativamente cortos (<3 semanas) y contribuir directamente al consumo continuo de cocaína, pero puede no contribuir directamente a una mayor propensión a la recaída en la abstinencia prolongada. Sin embargo, se ha detectado inmunorreactividad de ΔFosB en neuronas estriatales que contienen el receptor D1 después de 30 días de abstinencia de cocaína repetida en ratones (Lee et al. 2006). Dicho muestreo específico de la célula puede ser más sensible a la acumulación de ΔFosB residual que el análisis de tejido completo utilizado en el presente estudio, o quizás los cambios de ΔFosB simplemente persisten más en ratones que en ratas. También es posible que ΔFosB induzca una cascada de eventos transcripcionales que conduzcan a cambios morfológicos de larga duración, como la formación de la columna dendrítica en neuronas estriatales que contienen D1 (Lee et al. 2006; Maze et al. 2010). En este sentido, varios objetivos de ΔFosB, incluidos Cdk5 y NFκB, aumentan después de la cocaína crónica, y estos factores pueden modificar los circuitos del núcleo accumbens a través de cambios en la función y / o función neuronal estructural (Ang et al. 2001; Benavides y Bibb, 2004; Nestler, 2008). Por lo tanto, es posible que la acumulación sostenida de ΔFosB durante la retirada no sea necesaria por su impacto duradero en el futuro comportamiento de toma o búsqueda de drogas, sino que podría representar un "cambio molecular" que desencadena múltiples procesos celulares que facilitan la transición a más Estados biológicos adictos (Nestler et al. 2001).

TEl presente estudio encontró que la acumulación de ΔFosB mediada por cocaína no está influenciada por el control volitivo de la ingesta de cocaína en animales autoadministrados, consistente con estudios previos que utilizaron procedimientos inmunohistoquímicos y múltiples drogas de abuso. (Perotti et al. 2008; Pich et al. 1997). Esto indica que los aumentos inducidos por la cocaína en ΔFosB y FosB están probablemente relacionados con la respuesta farmacológica a la cocaína u otros eventos posteriores de la señalización del receptor monoaminérgico. En contraste con ΔFosB, Encontramos que el desarrollo de la tolerancia a los cFos inducidos por la cocaína fue sustancialmente influenciado por el control volitivo sobre el consumo de cocaína en la NAc, pero no en la CPU. Por lo tanto, la tolerancia a los cFos inducidos por la cocaína en la NAc no se produjo en animales que recibieron cocaína de forma pasiva mediante infusión crónica de yugo en comparación con la infusión de yugo agudo.. Estos hallazgos difieren notablemente de los numerosos informes de tolerancia a los cFos inducidos por psicoestimulantes en el NAc cuando los medicamentos se administran mediante inyección pasiva de IP (Hope et al. 1994; Nye et al. 1995; Chen et al. 1995, 1997; Alibhai et al. 2007). Dado que la tolerancia a los cFos en animales autoadministrados con cocaína es paralela a varios estudios con inyecciones repetidas de IP, la falta de tolerancia con la administración intravenosa crónica de yugo puede estar relacionada con el estrés asociado con las inyecciones múltiples e impredecibles de cocaína con yugo (Goeders 1997). La pérdida de tolerancia en el estriado ventral en lugar del dorsal sería consistente con un efecto selectivo en los circuitos límbicos involucrados en las respuestas motivacionales y emocionales. Además, si bien la tolerancia a la inducción de cFos ocurrió en animales autoadministrados con cocaína, se mantuvo un aumento sustancial del ∼50% en la proteína cFos en la capa de NAc inmediatamente después de su sesión final de autoadministración, y una tendencia (p <0.1) para cFos también se produjeron aumentos en el núcleo. Las razones de esta discrepancia probablemente reflejen diferencias entre la inyección IP y las infusiones intravenosas múltiples durante un período de 4 h, como se discutió anteriormente. La inducción residual de cFos en el NAc después de la autoadministración crónica de cocaína es un hallazgo novedoso que obliga a reconsiderar su papel en el proceso de adicción, por el cual los complejos AP-1 que contienen cFos, ΔFosB y FosB coexistirían en cierta medida después de la exposición crónica. .

Dada la evidencia reciente de que cFos está directamente regulado por la acumulación de osFosB en el cuerpo estriado dorsal (Renthal et al. 2008), es interesante que los cFos inducidos por la cocaína en el CPu fueran paralelos a los aumentos de ΔFosB con la exposición aguda a la cocaína. Una posibilidad es que la acumulación de ΔFosB con la administración aguda ocurra demasiado tarde en la sesión de 4 h para afectar la inducción de cFos, mientras que su presencia de 24 h después de la cocaína en animales tratados crónicamente impide la inducción de cFos con la exposición posterior a la cocaína. Esta idea es consistente con una tendencia (p = 0.067) para una correlación positiva moderada entre los niveles de cFos y ΔFosB en el CPu con la administración de cocaína aguda (0 h WD). Esta noción también es consistente con la fuerte correlación positiva entre la inducción de cFos y la ingesta de cocaína en el CPu de animales de yugo agudo. Estos hallazgos sugieren que, de manera similar a ΔFosB, la respuesta de cFos puede reflejar la dosis de cocaína que se recibió. Sin embargo, en la NAc, la mayor acumulación de ΔFosB con la administración crónica de cocaína en yugo no puede explicar la falta de tolerancia en la respuesta de cFos en estos animales. Además, aunque la tolerancia a la inducción de cFos fue evidente en animales autoadministrados, la fuerte correlación positiva entre los niveles de cFos residual y ΔFosB en la cáscara de NAc después de la retirada de 24 h no admite una interacción negativa entre cFos y ΔFosB en el estriado ventral. Otra diferencia con los datos de CPu es que los cFos en el núcleo de NAc se correlacionaron negativamente en lugar de hacerlo de manera positiva con la ingesta de cocaína inmediatamente después de la administración aguda de cocaína, lo que podría reflejar una taquifilaxis dentro de la sesión que ocurre con una exposición a dosis más altas en el estriado ventral.

En general, los hallazgos del presente estudio indican que cFos, FosB y ΔFosB experimentan distintos patrones regionales de expresión después de la administración de cocaína intravenosa aguda y crónica. Estos patrones de expresión dependen únicamente de la duración y la cantidad de exposición a las drogas, y la tolerancia a los cFos inducidos por la cocaína depende en gran medida de la autoadministración voluntaria de la cocaína. Los resultados también muestran que ΔFosB puede acumularse con la administración de cocaína aguda y crónica mediante inyección intravenosa, apoyando la idea de que la acumulación de BFosB puede ser importante en los procesos tempranos que promueven un mayor comportamiento de búsqueda de cocaína y contribuyen al desarrollo de la adicción a la cocaína. En última instancia, será importante comprender cómo ΔFosB puede influir indirectamente en el ansia persistente de drogas en el retiro a través de influencias relativamente a corto plazo en la expresión de genes durante el uso de la cocaína y los primeros períodos de retiro. Los esfuerzos para identificar los diversos objetivos posteriores y sus efectos en la morfología y / o función neuronal en última instancia, aclararán el papel de ΔFosB y otros antígenos relacionados con Fos en la expresión de la conducta adictiva.

Material suplementario

Tabla de Supp S1

Tabla complementaria 1. Resultados de correlación general para análisis de regresión lineal. Los tres paneles de la izquierda contienen correlaciones entre la ingesta de cocaína y los niveles de cFos (panel superior), FosB (panel central) o ΔFosB (panel inferior). Los tres paneles de la derecha contienen correlaciones entre cFos y ΔFosB (panel superior), cFos y FosB (panel central), y FosB y ΔFosB (panel inferior). Las regiones cerebrales relativas y los puntos de tiempo WD se muestran para cada análisis individual, junto con los valores r y p correspondientes. * p <0.05, T0.1> p> 0.05.

AGRADECIMIENTOS

Los autores declaran no tener conflictos de interés con respecto a este trabajo. Este trabajo fue apoyado por NIH subvenciones DA 10460 y DA 08227, y por la cátedra Wesley Gilliland en investigación biomédica.

Abreviaturas utilizadas

  • UPC
  • caudado-putamen
  • NAc
  • núcleo accumbens
  • AY
  • yugo agudo
  • CY
  • yugo crónico
  • CSA
  • autoadministración de cocaína
  • WD
  • retiro
  • IV
  • intravenoso
  • IP
  • intraperitoneal.

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