La abstinencia induce distintos patrones de expresión de FosB / ∆FosB en ratones suizos criados y clasificados como susceptibles y resistentes a la sensibilización locomotora inducida por etanol (2014)

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PALABRAS CLAVE

• FosB;
• DeltaFosB;
• Sensibilizacion locomotora;
• Retirar;
• Variabilidad del comportamiento;
• Ratones

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1. Introducción

El reto de la investigación neurobiológica actual en la adicción a las drogas radica en comprender los mecanismos de plasticidad neuronal que median la transición del uso recreativo a la pérdida del control conductual sobre la búsqueda y el consumo de drogas. Una de las teorías más importantes sobre la adicción a las drogas, denominada «el lado oscuro de la adicción», sugiere una progresión desde la impulsividad (relacionada con el refuerzo positivo) hasta la compulsividad (relacionada con el refuerzo negativo). Esta progresión, en un ciclo colapsado, comprende los siguientes estados: preocupación/anticipación, intoxicación por consumo excesivo y abstinencia/afecto negativo ( Koob y Le Moal, 2005 ; Koob y Le Moal, 2008; y Koob y Volkow, 2010 ). A partir de este escenario, los estudios sobre la adicción a las drogas se han centrado en los mecanismos neurobiológicos relacionados con los estados emocionales negativos que surgen tanto de la abstinencia aguda como de la prolongada. Según la teoría del «lado oscuro de la adicción», parecen producirse cambios de plasticidad persistentes y a largo plazo en los circuitos neuronales con el objetivo de limitar la recompensa. Sin embargo, estas alteraciones de la plasticidad conducen a un estado emocional negativo que surge cuando se impide el acceso a la droga. Este mecanismo proporciona un fuerte impulso motivacional para el establecimiento de la adicción, así como para su mantenimiento ( Koob y Le Moal, 2005 y Koob y Le Moal, 2008 ).

La sensibilización locomotora es un modelo animal útil basado en el hecho de que los aumentos en los efectos subjetivos de las drogas a lo largo de su exposición repetida son similares a los aumentos en los efectos locomotores estimulantes inducidos por la droga ( Vanderschuren y Kalivas, 2000 y Vanderschuren y Pierce, 2010 ). Aunque la sensibilización locomotora no imita varios comportamientos relacionados con la adicción a las drogas, sus características morfológicas y neuroquímicas temporales son paralelas a las que conducen a la transición del uso recreativo a la adicción a las drogas ( Robinson y Kolb, 1999 , Vanderschuren y Kalivas, 2000 y Vanderschuren y Pierce, 2010 ). Tradicionalmente, el protocolo de sensibilización locomotora comprende tres fases: adquisición (exposición repetida a la droga), período de abstinencia y desafío (un nuevo contacto con la droga después del período de abstinencia). Desafortunadamente, la mayoría de los estudios que utilizan la sensibilización locomotora se centraron solo en la fase de adquisición y desafío, solapándose con el período de abstinencia.

Está bien establecido que la exposición repetida a drogas de abuso ( Perrotti et al., 2008 ) y al estrés crónico ( Perrotti et al., 2004 ) aumenta la expresión del factor de transcripción fosB/deltafosB en el sistema corticolímbico. Se ha planteado la hipótesis de que la acumulación de FosB/DeltaFosB en estas regiones desempeña un papel central en la resiliencia al estrés ( Berton et al., 2007 y Vialou et al., 2010 ) y en los efectos gratificantes de la cocaína ( Harris et al., 2007 y Muschamp et al., 2012 ), el etanol ( Kaste et al., 2009 y Li et al., 2010 ) y los opioides ( Zachariou et al., 2006 y Solecki et al., 2008 ). Por lo tanto, es posible que FosB/DeltaFosB module algunos de los eventos de plasticidad neuronal relacionados con la sensibilización locomotora inducida por el etanol, así como la abstinencia que sigue a la fase de adquisición de la sensibilización locomotora.

Es notable que se observan diferencias individuales durante la transición del uso recreativo a la adicción a las drogas ( Flagel et al., 2009 , George y Koob, 2010 y Swendsen y Le Moal, 2011 ). Por ejemplo, los ratones DBA/2 J son más propensos a responder que los C57BL/6 J a la sensibilización locomotora inducida por etanol ( Phillips et al., 1997 y Melón y Boehm, 2011a ). En ratones Swiss no endogámicos, la variabilidad conductual con respecto a la sensibilización locomotora inducida por etanol fue descrita por primera vez por Masur y dos Santos (1988) . Desde entonces, otros estudios han demostrado características neuroquímicas importantes relacionadas con la variabilidad conductual en la adquisición de la sensibilización locomotora inducida por etanol ( Souza-Formigoni et al., 1999 , Abrahão et al., 2011 , Abrahão et al., 2012 , Quadros et al., 2002a y Quadros et al., 2002b ). Sin embargo, estos estudios no abordaron el impacto de la variabilidad conductual durante el período de abstinencia después de la fase de adquisición de la sensibilización locomotora. En un estudio reciente, nuestro laboratorio describió una diferencia significativa entre ratones Swiss no endogámicos sensibilizados y no sensibilizados con respecto a la expresión del receptor cannabinoide tipo 1 (CB1R) durante la abstinencia. En ese estudio, los ratones sensibilizados (pero no los no sensibilizados) mostraron una mayor expresión de CB1R en la corteza prefrontal, el área tegmental ventral, la amígdala, el cuerpo estriado y el hipocampo ( Coelhoso et al., 2013 ).

Dada la variabilidad de comportamiento bien establecida en ratones suizos consanguíneos con respecto a la sensibilización locomotora inducida por etanol, y que esta variabilidad se acompaña de características neuroquímicas distintas durante la retirada posterior, el presente estudio investigó la expresión de FosB / DeltaFosB en ratones sensibilizados y no sensibilizados al principio. (18 h) y después de 5 días de retirada.

2. material y métodos

2.1. Asignaturas

Se utilizaron ratones macho Swiss Webster no endogámicos (Colonia EPM-1, São Paulo, SP, Brasil), derivados originalmente de la línea Albino Swiss Webster del Centro para el Desarrollo de Modelos Animales en Biología y Medicina de la Universidade Federal de São Paulo. Los ratones tenían 12 semanas de edad (30–40 g) al inicio de las pruebas. Grupos de 10 ratones se alojaron en jaulas (40 × 34 × 17 cm) con lecho de virutas de madera. La colonia animal, con temperatura (20–22 °C) y humedad (50 %), se mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad (12/12 h), con las luces encendidas a las 07:00 h, con pienso para ratones y agua del grifo ad libitum, excepto durante las pruebas. Los ratones se mantuvieron en estas condiciones de alojamiento durante al menos 7 días antes del inicio del tratamiento farmacológico y las pruebas de comportamiento. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por el Comité de Ética para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad (número de protocolo: 2043/09), de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE de la UE sobre experimentación con animales ( http://ec.europa.eu/environmental/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm ).

2.2. Sensibilizacion locomotora

El protocolo de sensibilización locomotora se basó en un estudio previo de nuestro propio laboratorio ( Coelhoso et al., 2013 ). Al inicio del protocolo, todos los animales fueron inyectados intraperitonealmente (ip) con solución salina e inmediatamente evaluados en una caja de actividad automatizada (Insight, Brasil) durante 15 min para establecer la locomoción basal. Dos días después, los animales fueron inyectados diariamente con etanol (2 g/kg, 15% p/v en NaCl al 0.9%, ip — Grupo EtOH, N = 40) o solución salina (volumen similar, ip, — Grupo Control, N = 12), durante 21 días. Justo después de la primera, la séptima, la decimocuarta y la vigésima primera inyección, los animales fueron colocados en la jaula de actividad durante 15 min. La locomoción horizontal en cada situación fue medida por un sistema de análisis de comportamiento (Pan Lab, España). Como se esperaba ( Masur y dos Santos, 1988 y Coelhoso et al., 2013 ), la variabilidad conductual en la actividad locomotora al día 21 de adquisición nos permite distribuir los animales del grupo EtOH en dos subgrupos: EtOH_Alto (tomado del 30% superior de la distribución) y EtOH_Bajo (tomado del 30% inferior de la distribución). Por lo tanto, solo el 60% de los animales se incluyeron en el análisis. Esta estrategia es idéntica a las utilizadas en los estudios que investigan la variabilidad individual dentro del paradigma de sensibilización al etanol ( Masur y dos Santos, 1988 , Souza-Formigoni et al., 1999 , Quadros et al., 2002a , Quadros et al., 2002b , Abrahão et al., 2011 , Abrahão et al., 2012 y Coelhoso et al., 2013 ).

Después de la clasificación que define los grupos experimentales, realizamos 2 experimentos independientes de acuerdo con los criterios temporales del período de abstinencia: (i) animales sometidos a la fase de adquisición y sacrificados después de 18 h de abstinencia y (ii) animales sometidos a la fase de adquisición y sacrificados después de 5 días de abstinencia. Así, este estudio comprendió 3 grupos experimentales (Control, EtOH_Alto y EtOH_Bajo) que se dividieron en 2 subgrupos (18 h y 5 días de abstinencia) ( N = 6 por subgrupo). La elección de estas dos marcas temporales dentro del período de abstinencia se debió a los aspectos cinéticos de la expresión de FosB y DeltaFosB después de 18 h de abstinencia (como se explica en la sección de discusión), y después de 5 días de abstinencia, con base en estudios previos de nuestro Laboratorio que investigaron algunas características neuroquímicas con respecto al período de abstinencia dentro del paradigma de sensibilización locomotora ( Fallopa et al., 2012 y Escosteguy-Neto et al., 2012 ). Finalmente, para realizar correlaciones entre la sensibilización locomotora y la expresión de FosB/DeltaFosB, calculamos la puntuación de sensibilización locomotora para cada animal, mediante la fórmula: puntuación = (Locomoción en el día 21 − Locomoción en el día 1) *100/Locomoción en el día 1.

2.3. Inmunohistoquimica

Después del período de suspensión respectivo, los animales se anestesiaron profundamente con un cóctel que contenía ketamina (75 mg / kg, ip) y xilazina (25 mg / kg, ip). Después de la pérdida del reflejo corneal, se perfundieron transcardialmente con 100 ml de solución tampón fosfato 0.1 M [solución salina tamponada con fosfato (PBS)], seguido de 100 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%. Los cerebros se extrajeron inmediatamente después de la perfusión, se almacenaron en PFA durante 24 hy luego se mantuvieron en una solución de sacarosa al 30% / PBS durante 48 h. Se cortaron secciones coronales seriadas (30 µm) usando un micrótomo de congelación y se mantuvieron dentro de una solución anticongelante para ser utilizadas en los procedimientos de inmunohistoquímica mediante tinción de flotación libre.

Para la inmunohistoquímica se realizó una técnica convencional de avidina-biotina-inmunoperoxidasa. Las secciones de cerebro de todos los grupos experimentales se incluyeron en la misma corrida, siendo pretratadas con peroxidasa de hidrógeno (3%) durante 15 min y luego lavadas con PBS durante 30 min. Luego, todas las secciones se expusieron durante 30 min en un PBS-BSA .5% para evitar reacciones inespecíficas. A partir de entonces, las secciones se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario de conejo anti-FosB / DeltaFosB (1: 3,000; Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU. No cat. AV32519) en solución PBS-T (30 ml de PBS, 300 μl de Triton X-100). Posteriormente, las secciones se incubaron durante 2 h en un anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra biotinilado (1: 600; Vector, Burlingame, CA, EE. UU.) A temperatura ambiente. Luego, las secciones se trataron con complejo avidina-biotina (kit Vectastain ABC Standard; Vector, Burlingame, CA, EE. UU.) Durante 90 minutos y se sometieron a una reacción de diaminobencidina intensificada con níquel. Entre los pasos, las secciones se enjuagaron en PBS y se agitaron en un rotador. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina, se secaron, se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos.

Se analizaron las siguientes regiones encefálicas: corteza prefrontal [corteza cingulada anterior (Cg1), corteza prelimbica (PrL) y corteza infralímbica (IL)], corteza motora [primaria (M1) y secundaria (M2)], estriado dorsal [estriado dorsomedial (DmS) y estriado dorsolateral (DlS)], estriado ventral [núcleo accumbens central (Acbco) y capa (Acbsh), pálido ventral (VP)], hipocampo [capa piramidal de Cornus Ammong 1 y 3 (CA1 y CA3, respectivamente), capa granular del giro dentado (DG)], amígdala [núcleo basolateral (BlA) y núcleo central (CeA)], núcleo ventromedial del hipotálamo (VMH) y área tegmental ventral [porciones anterior (VTAA) y posterior (VTAP)] (Ver Fig. 1 ). Se utilizó un microscopio Nikon Eclipse E200 conectado a una computadora para capturar imágenes de cada sección con un aumento de ×20. Las imágenes se guardaron como archivos .tiff para el análisis posterior de la inmunorreactividad de FosB/DeltaFosB. Las células inmunorreactivas se contaron utilizando el software ImageJ (NIH Image, Bethesda, MD, EE. UU.). Las regiones cerebrales se delimitaron en cada fotografía según el Atlas del Cerebro del Ratón Estereotáxico ( Franklin y Paxinos, 1997 ). Dado que las fotomicrografías tomadas por el microscopio representan 2.5 × 10³ ^{μm² con} un aumento de 20×, la cuantificación de las células marcadas con FosB/DeltaFosB se expresa como el promedio de células inmunoteñidas por 2.5 × 10³ ^μm² . ^Los valores obtenidos en los grupos de EtOH se normalizaron con respecto a los valores de Control y se expresaron como %. (Control = 100%).

2.4. análisis estadístico

Inicialmente, se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para verificar la normalidad de la distribución de todas las variables. Los resultados conductuales se analizaron mediante ANOVA de una vía para medidas repetidas, considerando como factor los 5 periodos de sensibilización locomotora: basal, día 1, día 7, día 14 y día 21. Los resultados histológicos se analizaron mediante ANOVA de dos vías, considerando como factores: periodo de abstinencia (18 h y 5 días) y grupo experimental (Control, EtOH_Alto y EtOH_Bajo). Las variables no paramétricas se estandarizaron en puntuaciones Z para disminuir la dispersión de los datos y posteriormente se aplicaron en el ANOVA de dos vías, como se describió previamente. Se utilizó la prueba post-hoc de Newman-Keuls cuando fue necesario. Finalmente, investigamos posibles correlaciones entre las células positivas para FosB/DeltaFosB y las puntuaciones de sensibilización locomotora. Estas correlaciones se calcularon solo para los núcleos donde se habían encontrado diferencias estadísticas entre los grupos experimentales. Dado que estas diferencias se limitaron a los 5 días de abstinencia (véase la sección de resultados), los valores de FosB/DeltaFosB considerados en estas correlaciones se refieren a este período específico de abstinencia. El nivel de significancia se estableció en 5 % ( p < 0.05).

3. Resultados

3.1. Sensibilizacion locomotora

ANOVA para medidas repetidas detectó diferencias significativas en el factor de grupo [F_(2,32) = 68.33, p <0.001], en el período de protocolo [F_(4,128) = 9.13, p <0.001] y la interacción entre ellos [F_(8,128) = 13.34, p <0.001]. No hubo diferencias en la locomoción basal, y ambos grupos de EtOH tuvieron aumentos similares en la locomoción en el primer día de adquisición, en comparación con el grupo de control (p <0.01). Sin embargo, EtOH_High (pero no EtOH_Low) presentó un aumento progresivo de la actividad locomotora a lo largo de la fase de adquisición (p <0.01, en relación a los grupos Control y EtOH_Low, en el último día de adquisición; p <0.01 en relación a su actividad locomotora en el primer día de adquisición) ( Figura 2). Estos datos corroboraron los resultados del estudio original ( Masur y dos santos, xnumx) y de nuestro informe anterior ( Coelhoso et al., 2013) con respecto a la variabilidad del comportamiento en ratones suizos criados en exceso sometidos a sensibilización locomotora inducida por etanol.

3.2. Expresión de FosB / DeltaFosB

Las fotomicrografías ilustrativas de la inmunorreactividad de FosB/DeltaFosB se muestran en la Fig. 3 y los valores normalizados se muestran en las Fig. 4 , Fig. 5 , Fig. 6 y Fig. 7. El ANOVA de dos vías detectó diferencias significativas en M1, M2, DmS, DlS, Acbco, Acbsh, VP y VTA (para valores no normalizados de la inmunorreactividad de FosB/DeltaFosB y análisis estadísticos de todas las estructuras, véanse la Tabla Suppl1 y la Tabla 1 , respectivamente). En las estructuras donde se pudieron observar diferencias estadísticas, hubo cuatro patrones diferentes de expresión de FosB/DeltaFosB. En el primero, observado en M1 y M2, hubo un aumento en la expresión de FosB/DeltaFosB en el quinto día de abstinencia de etanol solo en el grupo EtOH_High (en comparación con los valores de EtOH_High a las 18 h de abstinencia, así como con los grupos Control y EtOH_Low a los 5 días de abstinencia) (ver Fig. 4 ). En el segundo patrón, observado en el VTAA, la expresión de FosB/DeltaFosB aumentó a los 5 días de abstinencia de etanol solo en el grupo EtOH_Low (en comparación con los valores de EtOH_Low a las 18 h de abstinencia, así como con el grupo Control a los 5 días de abstinencia) (ver Fig. 5 ). En el tercer patrón, observado en DmS, Acbco y Acbsh, la expresión de FosB/DeltaFosB aumentó a los 5 días de abstinencia de etanol en ambos grupos EtOH_High y EtOH_Low (en comparación con sus respectivos valores a las 18 h de abstinencia), sin embargo, solo el grupo EtOH_Low difirió del grupo Control (ver Fig. 6 ). Finalmente, en el cuarto patrón, observado en DlS y VP, la expresión de FosB/DeltaFosB aumentó a los 5 días de abstinencia de etanol en ambos grupos EtOH_High y EtOH_Low (en comparación con sus respectivos valores a las 18 h de abstinencia), aunque este aumento fue estadísticamente más expresivo en EtOH_Low que en EtOH_High, y solo el grupo EtOH_Low difirió del grupo Control (ver Fig. 7 ).

Para confirmar que los cambios en la expresión de FosB / DeltaFosB se debieron a la abstinencia y no a la exposición al etanol, se realizaron correlaciones entre la puntuación de la sensibilización locomotora y las células inmunolabladas con FosB / DeltaFosB en el día 5 del retiro en los núcleos mencionados anteriormente (M1, M2, Acbco, Acbsh, DmS, DlS, VP, VTAA). Como era de esperar, no hubo correlaciones significativas para ninguno de estos núcleos (M1 - r² = 0.027862, p = 0.987156; M2 - r² = 0.048538, p = 0.196646; Acbco - r² = 0.001920, p = 0.799669; Acbsh - r² = 0.006743, p = 0.633991; DmS - r² = 0.015880, p = 0.463960; DlS - r² = 0.023991, p = 0.914182; VP - r² = 0.002210, p = 0.785443; VTAA - r² = 0.001482, p = 0.823630).

4. Discusión

Los resultados observados en el presente estudio sugieren que el aumento de la expresión de FosB/DeltaFosB observado en el paradigma de sensibilización locomotora inducida por etanol probablemente esté relacionado con la abstinencia más que con la exposición crónica a la droga. Sin embargo, la variabilidad conductual en el desarrollo de la sensibilización locomotora estuvo acompañada de patrones distintos de expresión de FosB/DeltaFosB durante la abstinencia. El papel de la corteza motora, el área tegmental ventral y el estriado en la adquisición y expresión del paradigma de sensibilización locomotora está bien establecido ( Vanderschuren y Pierce, 2010 ). Además, la desregulación de la vía mesolímbica es una de las características neurobiológicas centrales del período de abstinencia, junto con la aparición de la amígdala extendida ( Koob y Le Moal, 2005 y Koob y Le Moal, 2008 ). Sin embargo, solo unos pocos estudios han explorado el período de abstinencia del paradigma de sensibilización locomotora. Nuestros resultados revelaron cambios interesantes en la expresión de FosB/DeltaFosB en la corteza motora, el área tegmental ventral y el cuerpo estriado durante este período.

El ADNc de FosB codifica la expresión de proteínas de 33, 35 y 37 kDa. La exposición a estímulos agudos induce una fuerte expresión de la proteína Fos de 33 kDa y una expresión discreta de las proteínas Fos de 35 y 37 kDa. En consecuencia, bajo activación aguda, la expresión predominante de FosB está relacionada con la proteína de 33 kDa ( McClung et al., 2004 y Nestler, 2008 ). Existe otra diferencia notable entre estas proteínas: solo las proteínas de 35 a 37 kDa son isoformas altamente estables. Debido a esta alta estabilidad, estas formas truncadas de FosB, también llamadas DeltaFosB, se acumulan en el cerebro y se expresan en gran medida en respuesta a estímulos crónicos, como tratamientos con fármacos psicotrópicos, convulsiones electroconvulsivas crónicas y estrés ( Kelz y Nestler, 2000 , Nestler et al., 2001 y McClung et al., 2004 ). Como consecuencia, DeltaFosB se ha considerado un interruptor molecular sostenido que media formas de plasticidad neuronal y conductual de larga duración. Curiosamente, un estudio elegante que utilizó líneas de ratones que expresaban diferencialmente FosB y DeltaFosB mostró que FosB es esencial para la mejora de la tolerancia al estrés y también neutraliza la correlación entre la sensibilización locomotora inducida por psicoestimulantes y la acumulación de DeltaFosB en el estriado ( Ohnishi et al., 2011 ). Por lo tanto, ambas proteínas podrían desempeñar funciones importantes en el protocolo experimental utilizado en el presente estudio. Cabe destacar que el anticuerpo FosB utilizado reconoce tanto FosB como DeltaFosB. Dado que FosB disminuye a niveles basales dentro de las 6 h después de un estímulo agudo ( Nestler et al., 2001 ) y DeltaFosB se acumula después de exposiciones repetidas a estímulos, decidimos sacrificar a los animales 18 h después de la fase de adquisición, para evitar posibles sesgos del tratamiento con etanol sobre la expresión de FosB. No obstante, para mayor precisión técnica, en el presente estudio nos referiremos a la expresión de FosB/DeltaFosB. Es importante destacar que esta estrategia se ha utilizado en otros estudios, incluyendo aquellos que emplearon el mismo anticuerpo primario descrito aquí ( Conversi et al., 2008 ; Li et al., 2010 ; Flak et al., 2012; y García-Pérez et al., 2012 ). En consecuencia, además de estas limitaciones experimentales, analizaremos nuestros resultados considerando el papel de DeltaFosB en la plasticidad neuronal.

Está bien establecido que la exposición crónica a medicamentos aumenta la expresión de FosB / DeltaFosB en varias regiones del cerebro (Nestler et al., 2001 y Perrotti et al., 2008). Curiosamente, en el presente estudio, ni los ratones sensibilizados con etanol ni los no sensibilizados con etanol se diferenciaron de los ratones tratados con solución salina crónica en cuanto a la expresión de FosB / DeltaFosB 18 h después de la fase de adquisición. Además, no hubo correlaciones significativas entre la expresión de FosB / DeltaFosB y las puntuaciones de sensibilización locomotora. Esta divergencia podría explicarse, al menos parcialmente, por las diferencias encontradas en el protocolo experimental. Por ejemplo, considerando la exposición al etanol, en dos estudios se utilizó el paradigma de libre elección de dos botellas en 15 sesiones de bebida intermitente (Li et al., 2010) o dieta líquida nutricionalmente completa autoadministrada durante 17 días (donde los animales consumen etanol en dosis que oscilan entre 8 y 12 g / kg / día) (Perrotti et al., 2008). En otro estudio, aunque los autores se refieren al tratamiento crónico, el protocolo consistió solo en exposiciones a etanol 4 (Ryabinin y Wang, 1998). Por lo tanto, los protocolos utilizados en otros lugares son totalmente distintos del utilizado aquí, que consistió en 21 días de tratamiento en los que un experimentador administraba inyecciones diarias de etanol. A pesar de estas diferencias, hay varios estudios que involucran inyecciones intraperitoneales que informan aumentos en la expresión de FosB / DeltaFosB después de protocolos de sensibilización locomotora inducida por psicoestimulantes (Brenhouse y Stellar, 2006, Conversi et al., 2008 y Vialou et al., 2012) y opioides (Kaplan et al., 2011). Sin embargo, los protocolos de sensibilización locomotora en esos estudios involucran mucho menos que las exposiciones a medicamentos 21, y en algunos de ellos, el medicamento se administró de manera intermitente. En contraste, nuestro protocolo usó el mismo tratamiento descrito en estudios previos que incluyeron inyecciones diarias de etanol 21 (Masur y dos santos, xnumx, Souza-Formigoni y otros, 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011 y Abrahão et al., 2012). Existe evidencia de que aunque la administración crónica de cocaína promueve la acumulación de la expresión de DeltaFosB en el núcleo accumbens, también promueve la tolerancia a la inducción del mRNA de DeltaFosB en el estriado ventral y dorsal (Larson et al., 2010). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la falta de diferencias en nuestros grupos experimentales en la fase de adquisición podría deberse a una tolerancia con respecto a la inducción de FosB / DeltaFosB, ya que en el presente protocolo hubo un período mayor de fase de adquisición en comparación con los períodos utilizados para psicoestimulantes y opioides. en otros estudios.

Estudios realizados con ratones knockout y transgénicos demostraron que los ratones mutantes FosB presentan una respuesta conductual aumentada a la cocaína, como efectos locomotores estimulantes y preferencia de lugar condicionada. Además, la expresión de DeltaFosB basal e inducible por cocaína está ausente en estos ratones mutantes ( Hiroi et al., 1997 ). Por el contrario, los ratones transgénicos con sobreexpresión inducible de DeltaFosB muestran una mayor sensibilidad a los efectos gratificantes de la cocaína y la morfina ( Muschamp et al., 2012 ). Estos resultados proporcionaron evidencia directa de una estrecha correlación entre DeltaFosB y el proceso de recompensa. Además de la exposición repetida a drogas, el estrés crónico también aumenta la expresión de DeltaFosB en los circuitos corticolímbicos ( Perrotti et al., 2004 ). Curiosamente, los ratones transgénicos que sobreexpresan DeltaFosB son menos sensibles a los efectos prodepresivos del agonista de los opioides kappa, conocido por inducir disforia y efectos similares al estrés en roedores ( Muschamp et al., 2012 ). Por lo tanto, además del proceso de recompensa, DeltaFosB también desempeña un papel fundamental en los aspectos emocionales del fenómeno. En este contexto, la abstinencia también podría desencadenar la expresión de FosB/DeltaFosB, dado que el estrés es un componente clave de la abstinencia de drogas. Esta perspectiva concuerda con nuestros resultados, ya que no se observaron correlaciones entre la expresión de FosB/DeltaFosB y las puntuaciones de sensibilización, y además, el aumento en la expresión de FosB/DeltaFosB se observó únicamente al quinto día de abstinencia.

Curiosamente, en algunas estructuras, se observaron aumentos de FosB/DeltaFosB tanto en el grupo EtOH_High como en el EtOH_Low, aunque más expresivos en el primer grupo, lo que sugiere que estos aumentos podrían tener diferentes consecuencias funcionales, según su intensidad. Esta hipótesis podría explicarse por varios roles funcionales distintos de FosB/DeltaFosB. Por ejemplo, las ratas expuestas crónicamente a la cocaína mostraron una mayor expresión de DeltaFosB en el núcleo accumbens durante el período de abstinencia, un efecto correlacionado positivamente con la preferencia por la cocaína, pero negativamente con la preferencia por la novedad. Además, el estrés durante la abstinencia aumenta la respuesta conductual a los psicoestimulantes al aumentar la expresión de DeltaFosB en las neuronas corticolímbicas ( Nikulina et al., 2012 ). Por lo tanto, DeltaFosB podría predecir la desregulación del procesamiento hedónico que ocurre durante la abstinencia prolongada ( Marttila et al., 2007 ). Por otro lado, tanto la resiliencia al estrés como las respuestas antidepresivas están relacionadas con una mayor expresión de DeltaFosB en el estriado ( Vialou et al., 2010 ). Por lo tanto, especulamos que el aumento de FosB/DeltaFosB en el estriado en el grupo EtOH_High podría haber potenciado los efectos gratificantes del etanol, confiriendo una mayor susceptibilidad a exposiciones posteriores a la droga. Por otro lado, un aumento más intenso de FosB/DeltaFosB observado en el grupo EtOH_Low podría haber disminuido la sensibilidad tanto a la disforia como a los efectos del estrés, minimizando los efectos de refuerzo negativo de la exposición posterior a la droga y, en consecuencia, explicando una mayor resistencia en este grupo. Curiosamente, esta paradoja tenía una base neuroquímica. Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobreexpresan FosB en las neuronas GABAérgicas de espinas medianas del núcleo accumbens tenían niveles aumentados de receptores opioides mu y kappa ( Sim-Selley et al., 2011 ), y esos receptores aumentan e inhiben respectivamente el tono mesolímbico ( Manzanares et al., 1991 y Devine et al., 1993 ). Además, la expresión del tipo celular también podría cambiar drásticamente las consecuencias funcionales del aumento de FosB/DeltaFosB. En un elegante estudio que utilizó ratones que sobreexpresaban DeltaFosB en neuronas que expresaban D1 o D2 en el núcleo accumbens reveló que DeltaFosB en las neuronas D1 (pero no en las D2) mejora las respuestas conductuales a la cocaína ( Grueter et al., 2013 ).

Curiosamente, en lo que respecta a la corteza motora, se observó un aumento en la expresión de FosB/DeltaFosB únicamente en el grupo EtOH_High, y este aumento se limitó al quinto día de abstinencia. La ausencia de aumento a las 18 horas de abstinencia podría explicarse por un posible mecanismo de tolerancia en la expresión de FosB/DeltaFosB en esta región tras la exposición crónica al etanol. Además, nuestros resultados sugieren que se producen cambios neuroquímicos activos en la corteza motora durante el periodo de abstinencia, a pesar de que los animales no fueron manipulados durante este periodo. Esto resulta interesante, ya que esta plasticidad podría desempeñar un papel, al menos parcialmente, en el mantenimiento de la sensibilización locomotora. Aunque la hiperlocomoción sostenida después de varios días de abstinencia no se estudió aquí, hay varios estudios, incluidos algunos previos de nuestro laboratorio, que muestran que los ratones sensibilizados (pero no los no sensibilizados) tenían una locomoción mejorada cuando se les administró etanol después de un período de abstinencia determinado ( Masur y dos Santos, 1988 , Souza-Formigoni et al., 1999 , Quadros et al., 2002a , Quadros et al., 2002b , Abrahão et al., 2011 , Abrahão et al., 2012 , Fallopa et al., 2012 y Coelhoso et al., 2013 ).

Finalmente, cabe destacar que solo el grupo EtOH_Low mostró una mayor expresión de FosB/DeltaFosB en la porción anterior (pero no posterior) del área tegmental ventral. Estas porciones tienen proyecciones y perfiles neuroquímicos distintos, y su participación en el proceso de recompensa depende de varios factores ( Ikemoto, 2007 ). Por ejemplo, la autoadministración de etanol en ratas está relacionada con la porción posterior, pero no con la ventral, del área tegmental ventral ( Rodd-Henricks et al., 2000 y Rodd et al., 2004 ). Además, el sistema endocannabinoide, así como los receptores GABA-A, dopaminérgicos D1-D3 y serotoninérgicos 5HT3, desempeñan un papel importante en la conducta de búsqueda de etanol ( Linsenbardt y Boehm, 2009 , Rodd et al., 2010 , Melón y Boehm, 2011b y Hauser et al., 2011 ). Sin embargo, el GABA-B en la porción anterior del área tegmental ventral es importante en términos de los efectos gratificantes ( Moore y Boehm, 2009 ) y estimulantes de la locomoción ( Boehm et al., 2002 ) del etanol. Además, los receptores nicotínicos colinérgicos en la porción anterior están involucrados en el aumento de los niveles de dopamina accumbens inducido por el etanol ( Ericson et al., 2008 ). Por lo tanto, independientemente del perfil distintivo de estas porciones, es posible que los cambios observados en el grupo EtOH_Low en las porciones anteriores puedan estar relacionados con el proceso de recompensa. La exposición crónica a la cocaína, pero no a la morfina crónica ni al estrés crónico, aumenta la expresión de DeltaFosB en el área tegmental ventral, específicamente en una población de células de ácido gamma-aminobutírico (GABA) ( Perrotti et al., 2005 ). Este hecho podría explicar los niveles normales de FosB/DeltaFosB durante la abstinencia observados en el área tegmental ventral de los ratones EtOH_High, independientemente de la supuesta experiencia de alto estrés en este período. Además, estos datos corroboran, al menos parcialmente, la hipótesis de que el aumento de la expresión de FosB/DeltaFosB durante la abstinencia en EtOH_Low podría caracterizarse como una respuesta adaptativa.

Las diferencias individuales observadas durante la transición del uso recreativo a la adicción a las drogas son notables ( Flagel et al., 2009 , George y Koob, 2010 y Swendsen y Le Moal, 2011 ). En consecuencia, es imperativo estudiar las características neurobiológicas relacionadas con la variabilidad individual. La sensibilización conductual es un modelo animal comúnmente utilizado para investigar las características neurobiológicas de la adicción a las drogas. La base de este modelo es que los efectos subjetivos de las drogas aumentan con su exposición repetida. Una vez adquirida, la sensibilización locomotora es duradera y está en relación temporal directa con cambios morfológicos y neuroquímicos en la vía mesolímbica y varios núcleos encefálicos relacionados con la emocionalidad y el comportamiento motor ( Robinson y Kolb, 1999 y Vanderschuren y Pierce, 2010 ). Un estudio pionero realizado por Masur y dos Santos (1988) demostró que existe una gran variabilidad conductual en ratones suizos no endogámicos con respecto a la sensibilización locomotora inducida por etanol. Desde entonces, otros estudios han demostrado una correlación importante entre las características neuroquímicas y la variabilidad conductual, principalmente aquellas relacionadas con los sistemas dopaminérgico ( Abrahão et al., 2011 , Abrahão et al., 2012 y Souza-Formigoni et al., 1999 ) y glutamatérgico ( Quadros et al., 2002a y Quadros et al., 2002b ). Además, un estudio previo de nuestro laboratorio utilizando el paradigma de sensibilización locomotora inducida por etanol mostró que los ratones sensibilizados (pero no los no sensibilizados) presentaron un aumento notable en el receptor cannabinoide tipo 1 (CB1R) durante el período de abstinencia ( Coelhoso et al., 2013 ). Aquí identificamos diferentes patrones de expresión de FosB/DeltaFosB durante la abstinencia entre los grupos EtOH_High y EtOH_Low.

En resumen, la variabilidad del comportamiento observada en la fase de adquisición de la sensibilización locomotora inducida por etanol se acompaña de una plasticidad neuronal distinta durante el período de abstinencia. Curiosamente, nuestros resultados sugieren que los diferentes patrones de expresión de FosB / DeltaFosB detectados en ratones sensibilizados y no sensibilizados están más relacionados con el período de abstinencia que con la exposición crónica al fármaco, probablemente debido a la tolerancia de la transcripción de FosB / DeltaFosB inducida por fármacos.

Los siguientes son los datos complementarios relacionados con este artículo.

Referencias

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• Artículo

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• Artículo

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  Citando artículos (19)
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• Artículo

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  Citando artículos (13)
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  Citando artículos (141)
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• Zachariou et al., 2006
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  Citando artículos (138)

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• Autor para correspondencia en: Rua Cesário Mota Jr, 61, 12 andar, São Paulo, SP 01221-020, Brasil. Tel./fax: + 55 11 33312008.
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• Estos autores igualmente participaron en el presente estudio.