El comportamiento aversivo inducido por la inactivación optogenética de las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral está mediado por los receptores de dopamina D2 en el núcleo accumbens (2014)

Teruko Danjo,^a Kenji Yoshimi,^b Kazuo Funabiki,^a Satoshi Yawata,^a y Shigetada Nakanishi^a,1

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Las neuronas de la dopamina (DA) en el área tegmental ventral (VTA) reaccionan a los estímulos aversivos principalmente por silenciamiento transitorio. Sigue sin estar claro si esta reacción induce directamente respuestas aversivas en ratones que se comportan. Examinamos esta pregunta mediante el control optogenético de las neuronas DA en el VTA y encontramos que la inactivación de las neuronas DA dio lugar a una respuesta y aprendizaje adversos. El núcleo accumbens (NAc), el principal núcleo de salida de las neuronas VTA DA, se consideró responsable de esta respuesta, por lo que examinamos cuál de las vías fundamentales en la NAc fue fundamental para este comportamiento al utilizar el derribo del receptor D1 o D2. y descubrió que la vía específica del receptor D2 era crucial para este comportamiento.

La transmisión de dopamina (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) es fundamental para controlar tanto las conductas gratificantes como las aversivas. El silenciamiento transitorio de las neuronas DA es una de las respuestas a los estímulos aversivos, pero sus consecuencias y mecanismos neuronales con respecto a las respuestas aversivas y el aprendizaje han sido en gran parte esquivos.. Aquí, informamos que la inactivación optogenética de las neuronas VTA DA regulaba rápidamente los niveles de DA y la regulación positiva inducida de la actividad neuronal en el núcleo accumbens (NAc) según lo evaluado por la expresión de Fos. Tsu supresión optogenética de la activación de las neuronas DA evocó de inmediato las respuestas aversivas al cuarto oscuro preferido anteriormente y condujo a un aprendizaje aversivo hacia el lugar condicionado optogenéticamente. Es importante destacar que esta aversión al lugar fue abolida por el derribo de los receptores D2 de la dopamina, pero no por la de los receptores D1 en el NAc.. Por lo tanto, el silenciamiento de las neuronas DA en el VTA fue indispensable para inducir respuestas aversivas y aprender a través de los receptores D2 de la dopamina en la NAc.

La inactivación optogenética de las neuronas DA bloquea la preferencia de habitación oscura.

Para inactivar selectivamente los disparos de las neuronas DA, inyectamos un constructo viral adenoasociable inducible por Cre que codifica Arch-eGFP [Marco de lectura abierto invertido (DIO) de AAV-doble flujo (DIO) -Arch) (17) unilateralmente en el VTA de ratones tirosina hidroxilasa (TH) -Cre adultos (18) y compañeros de camada de tipo salvaje (WT) y colocaron una fibra óptica sobre el VTA (Fig. S1 A y C). Dos semanas después de la cirugía, se detectó de forma restringida Arch-eGFP en el VTA (Fig. S1B). Probamos el efecto hiperpolarizante de la proteína Arch mediante registro electrofisiológico y medimos el efecto de la estimulación óptica del VTA de ratones TH-Cre inyectados con AAV-DIO-Arch. Las grabaciones electrofisiológicas in vivo del VTA de ratones TH-Cre anestesiados revelaron que la estimulación óptica de las supuestas neuronas DA inhibió sus disparos (Fig. S2), lo que indica que la estimulación óptica hiperpolarizó suficientemente el potencial de membrana de las células DA que expresan Arch y, por lo tanto, inhibió su disparo espontáneo.

Al usar estos ratones, a continuación examinamos si la inactivación óptica de las neuronas DA en el VTA podría servir como una señal aversiva para el aprendizaje del comportamiento. Los ratones poseen una tendencia innata a preferir un ambiente oscuro (19). Diseñamos un aparato de comportamiento en el que los ratones podían explorar libremente el cuarto oscuro y abrir un espacio brillante ( A). Después de la habituación, los ratones WT permanecieron preferencialmente en el cuarto oscuro con o sin estimulación óptica en el cuarto oscuro (Fig. S1D), asegurando que la estimulación óptica en sí no influyera en su comportamiento en el cuarto oscuro, que prefiere. Programamos el experimento de comportamiento de los animales para probar el efecto de la inactivación óptica de las neuronas DA en su comportamiento (Fig. S1E). Después de la habituación y la prueba previa, se condicionó a los ratones mediante la estimulación óptica de las neuronas DA en el VTA cuando se quedaron en la habitación oscura. Incluso durante el primer minimo de acondicionamiento de 5, los ratones TH-Cre se mantuvieron fuera del cuarto oscuro preferido anteriormente y evitaron sucesivamente el cuarto oscuro durante el acondicionamiento ( B). Los ratones TH-Cre no invirtieron su evitación contra el cuarto oscuro a pesar de que no recibieron estimulación óptica en la prueba posterior ( C). Estos datos indican que la hiperpolarización de las neuronas DA no solo indujo un comportamiento aversivo transitorio sino que también sirvió como una señal para el aprendizaje aversivo contra el cuarto oscuro y también demuestra que la desactivación de las neuronas DA desempeñó un papel causal tanto en el comportamiento aversivo transitorio como en el aprendizaje aversivo prolongado.

  

Higo. 1.

La inactivación optogenética de las neuronas DA bloquea la preferencia en la sala oscura de los ratones de comportamiento libre. (A) Una ilustración del aparato utilizado en la prueba de preferencia de cuarto oscuro. Se permitió que los ratones se movieran libremente alrededor de la habitación oscura y el espacio brillante. (B) Curso del tiempo ...

Regulación descendente optogenética de los niveles de DA en el NAc.

A continuación, investigamos si la inactivación de las neuronas DA en el VTA modificaba la concentración de DA en su principal región de orientación, la NAc. Medimos los niveles de DA en el NAc mediante voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) en ratones TH-Cre anestesiados que se habían inyectado con AAV-DIO-Arch en su VTA. Los niveles de DA en la NAc se elevaron rápidamente mediante la estimulación eléctrica del VTA, y la liberación evocada de DA se redujo significativamente mediante la estimulación óptica simultánea del VTA (Fig. S3). Luego probamos si la estimulación óptica de VTA podría reducir el nivel tónico de DA en el NAc. En las mismas configuraciones experimentales, observamos que el nivel de DA en el NAc se redujo transitoriamente por la estimulación óptica de la VTA por 20 ( ), que es consistente con la reacción del FSCV reportada contra los estímulos aversivos (20). Estos datos demuestran que la estimulación óptica del VTA fue lo suficientemente efectiva como para inactivar las neuronas DA del VTA y disminuir el nivel de DA en la NAc durante el experimento conductual.

  

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La inactivación óptica de las neuronas DA en el VTA reduce el nivel de DA en el NAc. (A) Promedio de respuestas de DA a la estimulación óptica en la NAc medida por FSCV. La línea verde indica la duración de la estimulación óptica (n = 7 – trazas 11). (B) Promediado ...

Regulación al alza de la expresión génica de Fos por inactivación óptica de las neuronas DA en el VTA.

El cambio de comportamiento causado por la inactivación condicionada de las neuronas DA en el VTA sugirió que la estimulación óptica alteró directamente la actividad neural y dio como resultado un cambio en el rendimiento del comportamiento. Entonces, investigamos a continuación las regiones en las que la actividad neural se elevaba por la inactivación condicionada de las neuronas DA mediante el examen de la expresión de Fos, un gen temprano inmediato. Poco después de realizar el acondicionamiento en la prueba de la habitación oscura, los ratones se procesaron rápidamente para determinar la cantidad de expresión de Fos mediante análisis de hibridación cuantitativo in situ ( y Fig. S4). La NAc, la región que recibe una gran cantidad de proyecciones dopaminérgicas del VTA, mostró una cantidad significativamente mayor de expresión de Fos en los ratones TH-Cre ( ). Esta regulación al alza también se detectó en el lado contralateral de la estimulación óptica, que supuestamente fue causada por una pequeña cantidad de infección viral en ese lado. Sin embargo, la regulación al alza fue mucho mayor en el lado ipsilateral que en el lado contralateral de la estimulación óptica, lo que sugiere que la inactivación óptica de las neuronas DA regulaba directamente la actividad neural de la NAc. El aumento de la expresión de Fos también se observó en otras regiones del cerebro, como el septum, las regiones periventriculares del estriado, la amígdala basolateral (BLA) y el hipotálamo lateral, pero no en la habénula lateral o la corteza prefrontal medial (mPFC); Fig. S4). Estos resultados indican que las regiones activadas por la inactivación óptica de las neuronas DA no se restringieron a las regiones objetivo directas de las neuronas VTA DA, sino que incluyeron las regiones que podrían activarse indirectamente de una manera dependiente del circuito neuronal. Esta observación sugiere que la inactivación óptica de las neuronas DA modificó la actividad neuronal en todo el circuito y no solo podría provocar una reacción aversiva, sino que también desencadena otras funciones cerebrales como la ansiedad, el miedo y las respuestas al estrés (21).

  

Higo. 3.

Expresión relacionada con la actividad del gen Fos inducida por inactivación de neuronas DA optogenética. (A–C) Fotografías representativas de la expresión de Fos (amarillo) en el NAc. Se tomaron imágenes del lado estimulado de un ratón TH-Cre (A), de los no estimulados ...

La señalización DA a través de D2R es crítica para la aversión a lugares condicionados inducidos optogenéticamente.

La mayoría de las señales dopaminérgicas del VTA se transmiten a los MSN en los receptores NAc a través de DA, D1R y D2R. D1R se expresa casi exclusivamente en MSN que expresan la sustancia P (codificada por el gen Tac1), y D2R se expresa predominantemente en MSN que expresan encefalina (codificada por el gen Penk); cada tipo de MSN constituye las vías directas e indirectas, respectivamente, en el NAc (3). Como la afinidad para DA es mucho mayor para el D2R (orden nM) que para el D1R (orden µM) (22, 23), se cree que una reducción en los niveles de DA da como resultado la inactivación de G_iD2R acoplado, pero no tiene un efecto apreciable en el D1R (3, 24), regulando por tanto la actividad neural específicamente en la vía indirecta. Además, la activación de Fos se observó más prominentemente en las células que expresaban Penk o Drd2 (D2R) que en las células que expresaban Tac1 o Drd1a (D1R) (Fig. S5). Basados ​​en estas observaciones, planteamos la hipótesis de que la señalización DA a través de D2R podría desempeñar un papel importante en el condicionamiento aversivo observado.

Para probar esta hipótesis, realizamos la prueba de aversión de lugar condicionada (CPA) de tres cámaras (Fig. S6). Preparamos un aparato de comportamiento que contiene dos cámaras con circunstancias prácticamente idénticas y un pequeño pasillo. Esta condición ambiental imparcial en la prueba de CPA nos permitió examinar más a fondo si la inactivación de las neuronas VTA DA es capaz de inducir una reacción aversiva y de aprendizaje, además de bloquear la preferencia del cuarto oscuro. Cuando se permitió que los animales se movieran libremente alrededor de todo el aparato, la mayoría se quedó en dos cámaras sin ninguna diferencia de comportamiento típica en la prueba previa. El acondicionamiento óptico se realizó luego emparejando la estimulación óptica con una cámara fija. Incluso cuando se usó cualquiera de las cámaras para el acondicionamiento, los ratones TH-Cre evitaron persistente y significativamente permanecer en la cámara acondicionada ópticamente durante el acondicionamiento y en la prueba posterior (Fig. S6 B–E). El análisis estadístico validó una reducción significativa en el tiempo de permanencia de los ratones TH-Cre en la cámara acondicionada ópticamente en la prueba posterior en comparación con el tiempo de permanencia para los ratones WT (Fig. S6F).

Luego intentamos especificar los subtipos de receptores de DA implicados en este comportamiento aversivo, suprimiendo específicamente cada uno de los receptores de DA en la NAc ( y Fig. S7). Diseñamos y validamos vectores lentivirales que contienen RNA de horquilla corta (shRNA) específico para cada receptor DA con expresión constitutiva de mCherry. Tres semanas después de inyectar el lentivirus en la NAc, la expresión robusta de mCherry se localizó en la NAc ( B). La eliminación efectiva de la expresión del ARNm de cada receptor se confirmó mediante un análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (Fig. S7A). La medición de los niveles de proteína a través de Western Blot también reveló que la inyección de cada uno de los lentivirus redujo selectivamente su producto de proteína objetivo sin afectar la expresión del otro subtipo de receptor de DA ( C y Fig. S7 B–G). Los lentivirus que expresan shD1R y shD2R disminuyeron su nivel de proteína objetivo a 46.2 ± 1.1% y 38.4 ± 4.9%, respectivamente, en comparación con el nivel para el virus de control ( C). Estos resultados verificaron que los vectores lentivirales que expresaban shRNA específicos para D1R y D2R suprimían selectiva y suficientemente sus ARN diana y regulaban a la baja la cantidad de los productos proteicos respectivos. También confirmamos que la expresión mediada por virus de mCherry no se detectó en el VTA, excluyendo la posibilidad de que el shRNA mediado por lentivirus afectara directamente al VTA.

  

Higo. 4.

La señalización DA a través de D2R es crítica para el CPA inducido optogenéticamente. (A) Una ilustración que muestra el procedimiento quirúrgico. El lentivirus que codifica shRNA para D1R o D2R se inyectó de manera bilateral en la NAc. AAV-DIO-Arch se inyectó unilateralmente en el ...

Usando estos lentivirus que contienen shRNA, probamos qué tipo de receptor de DA era responsable del comportamiento aversivo inducido por la inactivación optogenética de las neuronas DA. Inyectamos lentivirus que contenían ARNsh o lentivirus de control en el NAc bilateral junto con AAV-DIO-Arch en el VTA izquierdo de los ratones TH-Cre. La fibra óptica también se insertó sobre el VTA ( A). Cuando la prueba de CPA de tres cámaras se realizó tres semanas después de la cirugía, los ratones TH-Cre inyectados con lenti: shD1R-mCherry todavía mostraron un CPA explícito contra la cámara emparejada de estimulación óptica comparable a la de los ratones TH-Cre inyectados con control de lentivirus (lenti: mCherry). En contraste, los ratones TH-Cre inyectados con lenti: shD2R-mCherry no pudieron mostrar un CPA obvio durante el acondicionamiento ( D). El déficit de aprendizaje exclusivo de los ratones TH-Cre inyectados con lenti: shD2R-mCherry se verificó aún más mediante el análisis del aprendizaje aversivo en la prueba posterior ( E). Estos resultados demuestran que el comportamiento aversivo en el lugar condicionado por la inactivación de la neurona DA se evocó específicamente a través de D2R, y no a través de D1R, en la NAc.

Asignaturas.

Tirosina hidroxilasa: ratones knock-in IRES-Cre (TH-Cre) (EM: 00254) (18) se obtuvieron del European Mouse Mutant Archive. Todos los animales experimentales habían sido retrocruzados a la cepa C57BL / 6J durante más de generaciones de 10. Los ratones se aparearon con los ratones C57BL / 6J WT y se alojaron con un ciclo estándar de luz 12-h luz / 12-h y se les dio alimento y agua ad libitum. Cre⁺ y Cre^- Se utilizaron ratones de las mismas camadas (3 – 6 mo de edad) para los experimentos. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de animales de Osaka Bioscience Institute bajo las directrices de experimentos con animales.

Pruebas de comportamiento.

Durante todas las pruebas de comportamiento, los ratones se conectaron con una fibra óptica y se les permitió moverse por todo el aparato. El movimiento de los ratones se controló para que pudieran moverse sin ningún obstáculo, incluso cuando estaban conectados con una fibra óptica en sus cabezas. La posición de un mouse fue detectada por una cámara de video suspendida sobre el aparato de comportamiento y analizada por un programa hecho a medida utilizando el software Labview.

Voltametría cíclica in vivo de barrido rápido.

Los experimentos de FSCV se realizaron utilizando el método descrito en estudios anteriores (35–37). Los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina / xilazina como se describe en Materiales y Métodos SI y colocados en un marco estereotáxico. Una fibra óptica utilizada para estimular las neuronas DA que expresan el arco se ubicó cerca del electrodo de estimulación. El optrode estimulante se colocó en el VTA (de bregma: anterior-posterior, −3.2 mm; lateral, 0.5 mm; y dorsal-ventral, 3.5 mm) y se bajó a intervalos de 0.25-mm. Un microelectrodo de fibra de carbono (300 µm de longitud) para registro voltamétrico se redujo en el NAc (de bregma: anterior-posterior, 1.0 mm; lateral, 1.0 mm; y dorsal-ventral, 3.5 mm). Las mediciones voltimétricas se realizaron cada 100 ms aplicando una forma de onda triangular (−0.4 V a + 1.3 V a −0.4 V frente a Ag / AgCl, a 400 V / s) al microelectrodo de fibra de carbono. Se utilizó un potenciostato hecho a medida para el aislamiento de la forma de onda y la amplificación de corriente. La liberación de DA se evocó mediante la estimulación eléctrica de las neuronas DA mediante el uso de la estimulación de pulsos 24 (100 µA, 5 ms de duración, 30 Hz). Se aplicó una estimulación óptica de las neuronas DA (532 nm, power5 mW de potencia en la punta de la fibra) para los 10 que inician los 5 antes del inicio de una estimulación eléctrica. Los microelectrodos de fibra de carbono se calibraron en una solución con concentraciones conocidas de DA (0.2 µM, 0.5 µM ​​y 1.0 µM). Todos los datos de voltametría se analizaron mediante programas personalizados utilizando el software Labview y Matlab. La reducción en los niveles de DA por estimulación óptica se resolvió con el análisis de componentes principales, utilizando las formas de onda de DA obtenidas de las estimulaciones VTA eléctricas para separar las señales de dopamina35, 36).

Análisis estadístico.

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad PRISM 5.0 (software GraphPad). Los datos fueron analizados por medidas repetidas ANOVA (Figs. 1B, , 4D,4Dy Fig. S6 D y E) o ANOVA de una vía (Figs. 1C, , 3D,3D, 4 C y Ey Figs. S4 K–M, S6Fy S7A), y se realizaron análisis post hoc utilizando la prueba de Bonferroni. Todas las marcas / columnas y barras representaron la media y ± SEM, respectivamente.

Otros procedimientos experimentales que incluyen preparación e inyección de virus, registro electrofisiológico y análisis inmunohistoquímico y de ARNm se describen detalladamente en Materiales y Métodos SI.

Agradecemos a E. Boyden por la construcción Arch, a R. Matsui por su asesoramiento técnico en la producción y purificación de lentivirus, ya Y. Hayashi por su asesoramiento técnico en la programación del análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por Research Grants-in-Aid 22220005 (a SN), 23120011 (a SY y SN), 24700339 (a TD) y 25871080 (a SY) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón y una subvención de Takeda Science Foundation (a SN).

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Este artículo contiene información de apoyo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.