El receptor D1 de dopamina modula la plasticidad de la representación del hipocampo a la novedad espacial (2008)

J Neurosci. 2008 diciembre 10; 28 (50):13390-400. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2680-08.2008.

Tran AH1, Uwano T, Kimura T, Hori E, Katsuki M, Nishijo h, O no.

Resumen

El hipocampo humano es crítico para el aprendizaje y la memoria. En roedores, las neuronas piramidales del hipocampo se disparan de forma específica para cada ubicación, formando representaciones relacionales de señales ambientales. Se ha demostrado la importancia de los sistemas glutamatérgicos en el aprendizaje y en la plasticidad sináptica neural del hipocampo. Sin embargo, el papel de los sistemas dopaminérgicos en la respuesta de la plasticidad neural del hipocampo a los estímulos espaciales nuevos y familiares no está claro. Para aclarar esta importante cuestión, registramos neuronas del hipocampo de ratones knock-out (D1R-KO) de dopamina D (1) y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) bajo la manipulación de distintas señales espaciales en un entorno familiar y novedoso. Aquí informamos que en los ratones WT, la mayoría de las células del lugar respondieron rápidamente a las manipulaciones de señales distales y proximales en entornos familiares y nuevos. En contraste, se abolió la influencia de las señales distales en la activación espacial en ratones D1R-KO. En los ratones D1R-KO, la influencia de las señales proximales se facilitó en un entorno familiar, y en un entorno novedoso la mayoría de las células del lugar tenían menos probabilidades de responder a los cambios de señales espaciales. Nuestros resultados demuestran que las neuronas del hipocampo en ratones pueden codificar de manera rápida y flexible la información sobre el espacio desde señales distales y proximales para cifrar un entorno nuevo. Esta capacidad es necesaria para muchos tipos de aprendizaje, y la falta de D1R puede alterar radicalmente esta actividad neuronal relacionada con el aprendizaje. Proponemos que D1R tiene una implicación crucial en la codificación de la información espacial en entornos novedosos, e influye en la plasticidad de las representaciones del hipocampo, que es importante en el aprendizaje espacial y la memoria.

Introducción

La formación de hipocampo (HF) en humanos y otros primates es crítica para la memoria episódica (Maguire et al., 1998; Eichenbaum et al., 1999; Rollos, 2005; Rollos y Xiang, 2005). Las lesiones o manipulaciones del HF en roedores causan déficits de aprendizaje espacial (Gasbarri et al., 1996; Whishaw et al., 1997; Wilkerson y Levin, 1999), y las grabaciones de neuronas del hipocampo en roedores han revelado que se disparan de forma específica a la ubicación (O'Keefe y Dostrovsky, 1971; Wilson y McNaughton, 1993; O'Keefe y Burgess, 1996) en asociación con señales externas e internas (Muller y Kubie, 1987; Wiener et al., 1989; Gothard et al., 1996; Hetherington y Shapiro, 1997; Shapiro et al., 1997; Knierim et al., 1998; Zinyuk et al., 2000; Lever et al., 2002; Leutgeb et al., 2005a,b) o información contextual (Gill y Mizumori, 2006), indicando un rol en la memoria espacial (Wilson y McNaughton, 1993; Leutgeb et al., 2005). Además, el HF parece proporcionar una representación neuronal del espacio físico, aunque también se han sugerido funciones más amplias (Maguire et al., 1998; Eichenbaum et al., 1999). Se cree que la representación de espacio-celda del espacio es la base de ciertas formas de aprendizaje espacial (McHugh y otros, 1996, 2007; Cho et al., 1998; Kentros et al., 1998; Eichenbaum et al., 1999; Rotenberg et al., 2000; Dragoi y otros, 2003). Se encontró que la dopamina D1 los ratones con desactivación del receptor (D1R-KO) tenían un aprendizaje espacial deficiente y una actividad espacial alterada en el núcleo accumbens (El-Ghundi et al., 1999, Tran et al., 2005). Dado que la dopamina modula la plasticidad sináptica del hipocampo (Otmakhova y Lisman, 1996; Matthies et al., 1997; Swanson-Park et al., 1999; Li et al., 2003), se plantea la hipótesis de que la adquisición de representaciones espaciales en el hipocampo se ve afectada en los ratones D1R-KO. El presente estudio probó esta hipótesis comparando la actividad de las células situadas en ratones D1R-KO y de tipo salvaje (WT) en respuesta a manipulaciones de señales espaciales en entornos familiares y nuevos.

Materiales y Métodos

Los animales

Se utilizaron diez ratones WT macho (26 – 33 g) y ratones D7R-KO 1 macho (24 – 29 g) en el presente experimento de grabación neuronal. Los ratones fueron reproducidos en un laboratorio colaborativo (Instituto Nacional de Biología Básica, Institutos Nacionales de Ciencias Naturales).

Generación de ratones D1R-KO.

El ratón dopamina D1 el gen receptor se aisló de una biblioteca de ADN genómico de ratón 129 / Sv (Stratagene) mediante hibridación con un producto de PCR 884 bp, cuyos pares de cebadores son 5′-TCC AAG GTG ACC AAC TTC TTT GT-3 ′ y 5′-CTA TAG CAT CCT AAG AGG GT CGA-3 ′. El vector de direccionamiento se construyó para eliminar toda la secuencia de codificación utilizando los siguientes fragmentos de ADN: un gen del fragmento MC1.2 de 1 kb MC2.8 promotor-toxina de la difteria (DT-A) para la selección negativa, un kN de XNUMX kb BglI-AbrilII fragmento que contiene la región corriente arriba del gen D1R de ratón, un promotor PGK de 2.3 kbEscherichia coli gen de xantina-guanina fosforribosil transferasa (gpt), un gen promotor de neomicina MC1.1 de 1 kb (neo), un kb de 6.5 AbrilII-BamFragmento HI que contiene la región no traducida 3' y la región flanqueante, y el plásmido pBluescript ( A). Células E14TG2a IV ES cultivadas (2.5 × 107 células) se transfectaron con 50 μg del vector de orientación linealizado por electroporación 500 μF capacitancia, 270 V / 1.8 mm (ECM600, BTX Electro Cell Manipulator), seguido de selección con tratamiento con G418 (250 μg / ml) después de la transfección. En total, se recogieron colonias resistentes al fármaco 120 y el ADN genómico se sometió a análisis de transferencia Southern para confirmar la recombinación homóloga. Los ratones D1R-KO se generaron utilizando las células ES recombinantes homólogas esencialmente como se describió anteriormente (Yamaguchi et al., 1996; Koera et al., 1997). Los ratones D1R-KO se sometieron a retrocruzamiento a una cepa C57BL / 6J (B6 / J) para las generaciones 10 y se mantuvieron en un fondo genético B6 / J. ADN de la cola de la descendencia se analizó por PCR usando cuatro cebadores: (cebador a) D1TET-1, 'CAG AAG ACA GGT GGA AAG CA 5' 3, (cebador b) mD1Rexon2.seq, 5 'TCC ATG GTA GAA GTG TTA GGA GCC 3 ′, (cebador c) neo10, 5 ′ ATC AGA GCA GCC GAT TGT CTG TTG 3 ′, y (cebador d) D1R3′60′, 5 ′ GTT GGA GAA GTT CTG TAA CTG TAA CTG TAX CTG La condición de la PCR fue la siguiente: desnaturalización a 3 ° C durante 94 min, seguida de ciclos 4 de 30 min a 1 ° C, 94 min a 1 ° C, 60 min a 1 ° C, una extensión final a 72 ° C para 72 min, y almacenamiento a 5 ° C. Los alelos de tipo salvaje y mutantes correspondieron a los productos de PCR de 4 y 234 bp ( B), respectivamente. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Universidad de Toyama y el Instituto Nacional de Biología Básica.

Figura 1. 

Generación de los ratones D1R-KO y expresión de la proteína D1R en los cerebros de ratones WT y D1R-KO. ARepresentación esquemática del alelo WT, el vector de direccionamiento y el alelo mutante del gen D1R de ratón. Las regiones de codificación y no traducidas se muestran como cuadros cerrados y abiertos, respectivamente. Los cebadores para el genotipado por PCR (los cebadores a, b, c y d) se muestran como pequeñas puntas de flecha indicadas por a, b, c y d, respectivamente. UNA BamEl sitio HI está indicado con paréntesis cuando es relevante. La subunidad A de la toxina de la difteria (DT-A), E. coli La xantina-guanina fosforribosil transferasa (gpt) y los genes resistentes a neomicina (neo) se muestran como recuadros abiertos. B, Genotipado por PCR de ratones de tipo salvaje (D1R + / +), heterocigotos (D1R +/−) y homocigotos (D1R - / -). Los productos de PCR del alelo WT y el mutante (KO) son 234 bp y 460 bp, respectivamente. C, Western blot usando un anticuerpo D1R específico reveló que la proteína D1R estaba completamente ausente de los ratones D1R - / -.

Análisis de Western Blot.

El cerebro se homogeneizó en un tampón que contenía 100 mm Tris-HCl, pH 6.7, 1% SDS, 143 mm 2-mercaptoetanol y 1% de la mezcla de inhibidores de proteasa para células de mamíferos (Nacalai Tesque). Los lisados ​​totales (200 μg de proteína cada uno) se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida 10% SDS y se transfirieron a una membrana Immobilon-P (Millipore). La membrana se bloqueó en PBS que contenía 10% de leche desnatada (BD Biosciences) a temperatura ambiente durante 30 min y se incubó secuencialmente con anticuerpo monoclonal de rata contra D1R (Sigma, 1: dilución de cabra 1000), seguido de incubación con anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. IgG de rata (Sigma, 1: dilución 1000), o con anticuerpo de conejo contra la actina (Sigma, 1: dilución 1000), seguida de incubación con anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante contra IgG de conejo (Sigma, 1: dilución 1000). Las bandas de proteínas inmunoreactivas se detectaron de acuerdo con el protocolo del kit de detección de ECL (GE Healthcare).

Implantación de electrodos.

Los ratones se alojaron individualmente con un ciclo de luz 12 h (luces encendidas en 8: 00 AM) y tenían ad libitum Acceso a comida y agua. Los ratones recibieron al menos 1 semana después de su llegada para aclimatarse al ambiente del laboratorio antes de los procedimientos experimentales. En el día de la cirugía, los ratones se anestesiaron (pentobarbital, 40 mg / kg, ip) y se implantaron bilateralmente con electrodos de estimulación monopolar (100 μm de diámetro, acero inoxidable) para la autoestimulación intracraneal en el haz medial del forebrain a nivel del lateral lateral área hipotalámica (Franklin y Paxinos, 1997) (anterior, −2.3 mm; mediolateral, ± 0.70 – 0.75 mm; y dorsoventral, −5.3 – 5.4 mm). Se instaló un conjunto de grabación móvil que consta de tetrodos 2 de cable de nicrom trenzado 17 μm (California Fine Wire Company), o un haz de cables 8 en la parte dorsal de la región CA1 del hipocampo (Franklin y Paxinos, 1997) (1.8 mm posterior a bregma, 1.8 mm lateral a bregma y 1.4 mm por debajo de la superficie del cráneo) durante la misma cirugía. Un tornillo de joyero fijado al cráneo sirvió como electrodo de tierra en todos los ratones. El microimpulsor se fijó al cráneo con tornillos de joyero y cemento dental. Las puntas de los electrodos se bañaron en oro antes de la cirugía para reducir las impedancias a 100-300 kΩ a 1 kHz.

Aparato experimental y entrenamiento de tareas espaciales.

El aparato para el entrenamiento de tareas espaciales era un campo abierto circular (diámetro 80 cm, pared alta 25 cm); se elevó 80 cm sobre el piso en un carrito con ruedas que permitía girar y mover el campo abierto manualmente ( A). El campo abierto fue pintado de negro por dentro y delimitado por una cortina negra (180 cm de diámetro y 200 cm de altura). El techo del recinto contenía cuatro pequeños altavoces montados cerca de la circunferencia, separados 90 °, 4 bombillas incandescentes montadas individualmente cerca del borde interior de cada altavoz y una cámara de video en el centro. Por lo general, una bombilla se encendía en la posición de las tres en punto, y un altavoz emitía continuamente ruido blanco en la posición de las nueve. La bombilla encendida y el altavoz emisor sirvieron como señales distales. Se montó una pequeña bombilla de luz de 6 V en la cabeza del mouse. La cámara de video (CinePlex, Plexon) convirtió una señal de imagen de video real en una señal binaria y rastreó el movimiento horizontal de la bombilla pequeña. Una computadora de laboratorio (Dell, Precision 380) recibió la x y y Coordenadas de la posición de la cabeza del ratón en 33 cuadros / s. Los ratones fueron entrenados en una tarea de búsqueda al azar en el campo abierto ( B). Para la tarea de forrajeo, un programa delimitó áreas circulares (sitios de recompensa) con sus centros elegidos al azar dentro de un cuadrado circunscrito alrededor del campo abierto, y desencadenó la entrega de recompensas de estimulación cerebral (BSR) cuando el ratón ingresó en el sitio de recompensa. Después de un intervalo de 5, el lugar de la recompensa se movió a una ubicación diferente y se reactivó

Figura 2. 

Configuración experimental, tareas espaciales y manipulaciones experimentales. A, Configuración experimental. Un campo abierto que contenía un mouse fue visto desde el centro superior por una cámara CCD que señaló la posición del mouse. Como señales distales, las bombillas incandescentes de luz eléctrica y los altavoces para las emisiones de ruido blanco se montaron en las cuatro posiciones periféricas del techo. Una computadora trazó el rastro del mouse y controló la entrega de recompensa desde un estimulador. BTarea de búsqueda aleatoria: un programa de computadora delimitó al azar un lugar de recompensa circular (círculo rojo pequeño y grueso). El ratón fue recompensado cuando entró en el lugar de la recompensa, que luego se hizo inactivo (pequeño círculo rojo delgado). INICIO, Ubicación del mouse al inicio de la sesión. Puntos rojos, ubicaciones de entrega de recompensa. C, Manipulaciones en el conocido campo abierto. En la sesión estándar (línea de base 1), se encendía una bombilla en la posición de las 3 en punto y un altavoz emitía continuamente ruido blanco en la posición de las 9 en punto. En la sesión de rotación distal, la posición de las señales distales se rotó 180 ° con la cámara constante. En la sesión de rotación proximal, la cámara de campo abierto se rotó 180 °, mientras que las señales distales permanecieron sin cambios. D, Manipulaciones en la novela de campo abierto. Una cámara cuadrada sustituyó al campo abierto circular. Todas las pruebas de manipulación fueron similares a las utilizadas en el campo abierto familiar. Una escala de tiempo muestra la duración de las sesiones de grabación y los intervalos entre sesiones.

Unidad de aislamiento y grabación.

El conjunto del electrodo de grabación avanzó en el HF a ∼20 μm / d. Las actividades neuronales se registraron utilizando un procedimiento de registro convencional cuando los ratones realizaron el forrajeo. Las células de espiga compleja se determinaron con los criterios descritos en estudios anteriores (Ranck, 1973; Foster y Wilson, 2006). La recopilación de datos comenzó cuando la relación señal a ruido excedió ∼4 veces en uno de los electrodos. La amplificación de la señal, el filtrado y la digitalización de las formas de onda de espiga utilizando una plataforma de análisis de componentes principales se lograron utilizando un sistema Plexon. Las señales grabadas se amplificaron 10,000 veces, se filtraron entre 0.6 y 3 kHz, se digitalizaron a una frecuencia de muestreo de 40 kHz y se almacenaron en un disco duro de computadora para la clasificación de picos fuera de línea. Las actividades neuronales digitalizadas se aislaron en unidades individuales por sus componentes de forma de onda utilizando un programa de clasificación fuera de línea (OfflineSorter, Plexon). Se dibujaron formas de onda superpuestas de las unidades aisladas para verificar la invariabilidad durante las sesiones de grabación. Cada grupo se verificó manualmente para asegurar que los límites del grupo estuvieran bien separados y que las formas de onda fueran consistentes con los potenciales de acción. Para cada grupo aislado, se construyó un histograma de intervalo entre puntos y se utilizó un período refractario absoluto de al menos 1.0 ms para excluir las unidades múltiples sospechosas. Un ejemplo de una grabación de tetrodo se muestra en Figura 3 y XNUMX.

Figura 3. 

Un ejemplo de grabación de unidades múltiples con un tetrodo aislado por un clasificador fuera de línea. A, Formas de onda superpuestas de neuronas 4 (a, b, c, d) registradas por cada electrodo (E1-E4) de un tetrodo correspondiente al análisis de conglomerados en B. B, Análisis de conglomerados. los x- y yLos ejes representan los valores máximos de las señales en los electrodos 2 y 1 de los cuatro electrodos de tetrodo, respectivamente. Cada punto representa un pico neuronal que excedió el umbral definido. Se identificaron cuatro grupos rodeados (a, b, c, d). Los grupos blancos dispersos en el centro y en las esquinas izquierda y derecha representan el ruido de línea de base y las señales de estimulación, respectivamente. Calibración: 0.8 ms, 0.5 mV.

Manipulaciones en campo abierto circular (ambiente familiar).

La actividad de las células de lugar se monitorizó en una cámara cilíndrica circular durante varias sesiones mínimas de 10, durante las cuales los ratones buscaron aleatoriamente BSR. Las neuronas se registraron en sesiones secuenciales para determinar la estabilidad de los campos de lugar entre sesiones y la cantidad de control extramaze (distal) e intramaze (proximal). Figura 2 y XNUMXC muestra el diagrama de pruebas de sesiones secuenciales. En la sesión estándar (prerotación, línea de base 1), se monitoreó la actividad neuronal mientras los ratones buscaban comida en el campo abierto circular con un altavoz que emitía continuamente ruido blanco en la posición de las 9 en punto y una bombilla eléctrica incandescente se encendía a las 3 en punto. posición del reloj. A continuación, se registraron las neuronas en sesiones de rotación de señal distal y rotación de señal proximal. En la sesión de rotación de señales distales, la posición de las señales distales se rotó 180 °, mientras que la cámara se mantuvo constante. En la rotación de la señal proximal, la cámara se rotó 180 ° mientras que las señales distales permanecieron sin cambios. Después de cada manipulación de las sesiones distales o proximales, se registró una sesión adicional con las señales distales y proximales volviendo a las condiciones estándar. Dado que se grabaron varias sesiones de forma secuencial, el ratón no se desconectaba normalmente del cable de grabación entre sesiones. No realizamos ninguna manipulación para interferir con la orientación espacial del animal. Antes y después de cada sesión de grabación, el ratón descansaba sobre una caja colocada en un pedestal fuera de la cámara de grabación durante 5 min.

Manipulaciones en la plaza a campo abierto (ambiente novedoso).

Las celdas de lugar se registraron en un nuevo campo abierto al que se expuso el mouse por primera vez. El nuevo campo abierto era una cámara cuadrada (tamaño 55 x 55 cm, altura 25 cm) que reemplazó el campo abierto familiar. Se utilizaron alternativamente dos cámaras cuadradas idénticas. Las secuencias de manipulaciones en el nuevo entorno fueron similares a las utilizadas en el entorno familiar ( D). Antes de cada sesión, ya sea en el entorno familiar o nuevo, se limpió el piso con una solución 0.5% Hibitan (Sumitomo Company).

Coloque la delimitación del campo.

La división del número total de picos por el tiempo de permanencia acumulado en cada píxel durante toda la sesión produjo un mapa de velocidad de disparo. El mapa de distribución de la velocidad de activación de píxeles se representó mediante una escala de colores con un tamaño de píxeles de 2.4 × 2.4 cm. Los píxeles que el mouse no había visitado en el campo abierto se muestran en gris, y aquellos en los que el mouse visitó pero la celda nunca se disparó son píxeles blancos. Una velocidad de disparo superior a cero se clasificó en una escala ascendente, siendo las escalas de color cian, azul, verde, amarillo y rojo. Los píxeles con velocidades de disparo superiores al doble de la media se muestran como píxeles rojos. Los campos de los lugares se delinearon como grupos de píxeles con velocidades de disparo que exceden el doble del promedio de las sesiones. Un campo de lugar podría continuarse a través de cualquier borde compartido por dos píxeles que cumplan con el criterio, pero no a través de esquinas. Si uno o más píxeles vecinos cumplían con el criterio, el campo se expandió para incluir los píxeles. Cada píxel agregado se probó para detectar la presencia de un píxel vecino que cumpliera con el criterio. Cuando ningún píxel vecino cumplió con el criterio, se identificó el límite del campo. El tamaño de campo mínimo de una celda relacionada con el lugar se estableció en píxeles 9. Los parches no contiguos de píxeles adyacentes que contenían una tasa de disparo significativamente mayor se definieron como "subcampos" si cumplían con el criterio anterior de colocar campos.

Análisis de sesión estándar.

Para cada neurona relacionada con el lugar, se utilizó el gráfico de la tasa de disparo durante la sesión estándar para determinar (1) el tamaño del campo del lugar; (2) la tasa de encendido general media; (3) la velocidad de disparo promedio dentro del cuadro; (4) la tasa media de disparo en el campo; (5) la tasa de disparo máxima dentro del cuadro; (6) escasez; (7) sintonización espacial; (8) coherencia espacial; y (9) el contenido de información espacial (bits / pico). Estos análisis se realizaron utilizando métodos descritos previamente (Wiener et al., 1989; Skaggs et al., 1993; Jung et al., 1994; Hetherington y Shapiro, 1997; Shapiro et al., 1997). Los valores de estos parámetros se compararon entre los dos grupos de ratones utilizando un Student's t prueba. En resumen, el tamaño del campo de lugar se estimó como el porcentaje del campo de lugar sobre el campo visitado. La tasa media total de disparo se calculó como el número total de picos disparados dentro de una sesión dividido por el tiempo de la sesión. Las tasas medias de tiro en el campo y en el campo se determinaron como la tasa promedio de tiro de la celda dentro y fuera del campo de lugar. La velocidad de disparo máxima dentro del cuadro fue la velocidad de disparo más alta de todos los píxeles con el campo de lugar. La sintonización espacial de la celda se determinó como la relación entre la tasa de disparo promedio del campo de lugar y la tasa de disparo del campo promedio (Wiener et al., 1989). La coherencia espacial se calculó realizando la transformación z a la correlación entre la velocidad en un píxel y la velocidad media en los píxeles adyacentes. La información espacial (Inf) señalada por cada unidad (Skaggs et al., 1993) se calculó mediante la siguiente ecuación: Fórmula donde R es la tasa de disparo promedio de la sesión, ri es la tasa en pixel iy Pi Es la probabilidad de que el mouse sea detectado en pixel. i.

Rotación distal, rotación proximal, y reasignación de análisis.

Para cuantificar la rotación de los campos de lugar entre diferentes sesiones con manipulación ambiental (una rotación de las señales distales o proximales), se midió una puntuación de correlación de rotación para cada celda de lugar. Los contenedores se suavizaron recalculando la velocidad de encendido de cada contenedor como el promedio de sí mismo y los contenedores adyacentes. Para cada celda, (1) se midió la correlación producto-momento de Pearson entre la matriz de velocidad de disparo en la sesión original y la de la segunda sesión con manipulación ambiental, y luego (2) se midió la cantidad de rotación angular de los mapas de velocidad de disparo cuantificado entre el par de sesiones. Este último valor se determinó girando el mapa de velocidad de disparo de la segunda sesión en incrementos de rotación de 5 ° para determinar la posición en la que el mapa de disparo girado se correlacionó al máximo con el mapa de velocidad de disparo de la sesión original. El ángulo de rotación que produjo la correlación más alta se tomó como la cantidad que el campo de lugar había girado entre las dos sesiones, y se justificó que una celda siguiera las señales si sus campos de lugar se desplazaron> 50% del ángulo girado para la rotación de señal dada. sesión en comparación con la sesión de referencia anterior. También se calcularon las medidas para la divergencia de los campos de tiro (reasignación) en las dos cámaras. Se consideró que una celda se reasignaba si cumplía una de las siguientes condiciones: (1) la celda dejó de disparar después de ser expuesta a la nueva cámara, (2) la celda se volvió más activa en la nueva cámara que en la familiar, o (3) el campo se movió a una ubicación que no se superponga en posición y dirección con la ubicación anterior en la cámara familiar.

Pruebas de agudeza visual.

Una prueba visual modificada del acantilado (Fox, 1965; Crawley, 2000) fue utilizado para probar la agudeza visual de nuestros ratones. Una caja de madera (46 cm × 46 cm) con un plano horizontal conectado a una caída vertical (48 cm), que a su vez está conectado a un plano horizontal inferior en el nadir de la caída vertical. Un papel con dibujos de tablero de ajedrez en blanco y negro cubría la superficie de los planos horizontales y la caída vertical. Una lámina de plexiglás transparente cubría el acantilado. Se colocó una cresta de aluminio (2.54 cm de ancho y 3.8 cm de espesor) en el borde del acantilado. Ambos lados del aparato estaban muy iluminados. Los bigotes se retiraron antes de la prueba de acantilado visual para eliminar la información táctil. Se utilizaron dos grupos con cada uno de los machos adultos 10 de los ratones D1R-KO y WT. El ratón se colocó en la cresta central al comienzo de cada uno de los ensayos consecutivos de 10 (después de los ensayos de 5, el aparato se convirtió en 180 ° y se realizaron más ensayos de 5). Cuando el ratón optó por bajar a la superficie a cuadros horizontal, se consideró una respuesta "positiva", mientras que el ratón que descendía por el lado del acantilado se consideró una respuesta "negativa". El tiempo que tardó el ratón en bajar de la arista central se registró como una latencia de respuesta.

Histología.

Una vez que se estimó que los electrodos de registro avanzaban por debajo de la capa de células piramidales del hipocampo CA1, las ubicaciones de los electrodos de registro se verificaron histológicamente. Los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico (40 mg / kg ip). Se aplicó una lesión electrolítica (30 μA de corriente negativa para 15 s) a través de los electrodos de registro. El ratón se perfundió con 0.9% de solución salina seguido de 10% de solución salina tamponada. Se extrajo el cerebro y se fijó en 30% de solución salina formal durante una semana. Los cerebros se seccionaron coronalmente (50 μm) en un microtomo de congelación y se tiñeron con violeta de cresilo.

Resultados

Generación y caracterización de ratones D1R-KO.

Para interrumpir el gen D1R en células ES de ratón mediante recombinación homóloga, construimos un vector de orientación para eliminar toda la secuencia de codificación ( A). Se obtuvieron cuatro clones con el gen D1R descompuesto de colonias resistentes a 120 G418 mediante la transfección de células E14TG2a IV ES con el vector de orientación mediante análisis de transferencia Southern (datos no mostrados), y las quimeras derivadas de los clones transmitieron la mutación a través de la línea germinal. Las progenies heterocigotas se entrecruzaron para generar ratones mutantes homocigotos. Figura 1 y XNUMXB muestra el análisis de PCR para los genotipos de progenies de apareamientos heterocigotos. Se analizaron los lisados ​​totales de cerebro de ratón adulto mediante análisis de transferencia Western. La expresión de D1R estaba completamente ausente en los ratones D1R-KO en comparación con la de los ratones WT ( C). En contraste, la β-actina se expresó normalmente en el cuerpo estriado de ambos ratones D1R-KO y WT ( C).

Histología

Las posiciones de los electrodos de registro se verificaron microscópicamente y se mapearon en las secciones de tejido apropiadas, y las secciones se compararon con el atlas de cerebro de ratón. Franklin y Paxinos (1997). Todos los sitios de registro se ubicaron en la región CA1 para ambos tipos de ratones ( ).

Figura 4. 

Verificación de colocaciones de electrodos. Ubicación de las puntas de los electrodos de grabación (círculos rellenos de negro) para ratones WT (A) y ratones D1R-KO (B) utilizado para el experimento de grabación de la unidad. Las placas fueron modificadas para asemejarse a las de Franklin y Paxinos (1997). Los números al lado de cada sección corresponden a milímetros de bregma.

Células del hipocampo en ratones D1R-KO y WT en un entorno familiar

Registramos la actividad neuronal de la región CA1 en D1R-KO y sus compañeros de camada WT. Se registraron ciento ochenta y tres células de ratones WT y células 82 de ratones D1R-KO. De esas células, 99 de ratones WT mostró actividad relacionada con el lugar (por tetrodos, 77 / 99, 77.8%; por electrodos individuales, 22 / 99, 22.2%) y 52 de ratones D1R-KO mostraron actividad relacionada con el lugar (por tetrodos, 42 / 52, 80.8%; por electrodo simple, 10 / 52, 19.2%). No hubo diferencia en el número de células grabadas que muestran actividad relacionada con el lugar entre los dos grupos de ratones (WT, 99 / 183, 54.1% frente a KO, 52 / 82, 63.4%, p = 0.156, χ2 prueba). Por lo tanto, la eliminación del D1R no disminuye el número de celdas de lugar. Para las celdas de lugar, caracterizamos las propiedades básicas de disparo en la sesión estándar en el entorno familiar (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en ningún parámetro de disparo espacial entre los dos grupos de ratones (en todas las comparaciones, p > 0.05), lo que sugiere que la falta de D1R no compromete las propiedades básicas de disparo de las células de lugar en un entorno estable y bien explorado.

Tabla 1. 

Comparaciones de las propiedades de activación de las células de posición del hipocampo en ratones WT y D1R-KO en un entorno familiar

D1R-KO reduce las células de lugar que responden a señales distales en un entorno familiar

En consecuencia, examinamos la plasticidad neural de las células del lugar del hipocampo bajo manipulaciones de rotación de señales distales y proximales en la cámara de grabación circular familiar. Las respuestas de las células de lugar a las manipulaciones de las señales ambientales se categorizaron como controladas por señales distales, señales proximales, ambos tipos de señales y ninguno de los tipos de señales (Tabla 2). En ratones WT, los efectos de las señales distales predominaron sobre las señales proximales (Tabla 2), en que la mayoría de las celdas de lugar (52 / 91, 57.1%) siguieron la rotación de las señales distales ( A, 1 – 5), menos celdas de lugar (15 / 91, 16.5%) siguieron la rotación de las señales proximales ( B, 1 – 5), y un quinto (18 / 91, 19.8%) siguieron la rotación de las señales distales y proximales ( C, 1 – 5). Sorprendentemente, en ratones D1R-KO (Tabla 2), las celdas sin lugar (0 / 50, 0%) siguieron la rotación de las señales distales, pero la mayoría de las celdas de lugar registradas (40 / 50, 80%) siguieron la rotación de las señales proximales ( A,B, 1 – 5). El número de neuronas que se vieron afectadas por la rotación de señales (siguiendo las señales distal + proximal + ambas señales) en ratones D1R-KO fue menor que en ratones WT (KO, 40 / 50, 80% frente a WT, 85 / 91% , p <0.05). Estos resultados muestran que aunque el número de neuronas que cambiaron su actividad en respuesta a señales proximales aumentó en ratones D1R-KO, este aumento aún no compensó todas las respuestas, como se observó en ratones WT.

Tabla 2. 

El número de células del lugar del hipocampo en ratones WT y D1R-KO analizó sus respuestas a los cambios en señales distales y proximales en entornos familiares y nuevos

Figura 5. 

Los efectos de los cambios en las relaciones espaciales entre las señales distales y proximales sobre la actividad relacionada con el lugar del hipocampo en ratones WT en entornos familiares (1 – 5) y novedosos (6 – 10). A, En el entorno familiar, una celda de lugar tenía un campo de disparo de lugar alrededor de la posición de las 9 en punto (1) en la sesión estándar, y su campo de lugar se desplazó a la posición de las 3 en punto (2) en la sesión de rotación distal , regresó a la misma posición (3) que en la sesión estándar en la sesión de línea base 2, sin cambio (4) en la sesión de rotación proximal, y sin cambio (5) en la sesión de regreso en la que la cámara de grabación fue devuelta a la posición normal. En el entorno novedoso, la activación específica de la ubicación de esta célula también siguió las señales distales (6–7), pero no las señales proximales (8–9). B, Una celda de lugar tenía un campo de lugar que no seguía la rotación de las señales distales (1 – 2) pero seguía las señales proximales (3 – 4) en el entorno familiar. El campo de posición de esta celda se reasignó en el entorno nuevo cuando su campo de posición apareció opuesto al entorno familiar, pero siguió la rotación de las señales proximales (8 – 9). C, Una celda de lugar tenía un campo de lugar que siguió al cambio de las señales distales (1 – 2) y las señales proximales (3 – 4) en el entorno familiar. Curiosamente, en el entorno novedoso, el campo de lugar de esta celda seguía solo las señales distales (5 – 6), no las señales proximales. Las imágenes de las bombillas y los altavoces junto a los mapas de disparo indican sus disposiciones bajo las condiciones de manipulación de las señales distales y proximales. Las flechas de rotación indican la rotación de la cámara de grabación en la sesión de rotación de señal proximal. Las tablas de escala de colores a la derecha de los mapas de disparo indican la calibración para la velocidad de disparo. Los números en negrita y entre paréntesis a la derecha de los mapas de tasa de disparo indican las tasas de disparo en el campo y en el campo, respectivamente. Los cuadrados verdes abiertos encierran los mapas de velocidad de disparo para enfatizar las sesiones en las que el campo de lugar de la celda había girado.

Figura 6. 

Los efectos de los cambios en las relaciones espaciales entre señales distales y proximales sobre la actividad relacionada con el lugar del hipocampo en ratones D1R-KO en los entornos familiar (1 – 5) y novedosos (6 – 10). A, Una celda de lugar típica tenía un campo de lugar que no seguía la rotación de las señales distales (1 – 2), pero seguía la rotación de las señales proximales (3 – 4) en el entorno familiar. En el entorno novedoso, el campo de posición de esta célula no se modificó por las manipulaciones de señal distal o proximal. BOtro ejemplo de una celda de lugar cuya actividad relacionada con el lugar no siguió la rotación de las señales distales (1 – 2) pero sí siguió la rotación de las señales proximales (3 – 4) en el entorno familiar, y esta célula respondió de manera similar. en el entorno novel (6 – 10). Tenga en cuenta que no se colocaron células en ratones D1R-KO seguidos del cambio en las señales distales. Otras descripciones son como las de Figura 2 y XNUMX.

Respuestas alteradas de células de lugar en ratones D1R-KO en el nuevo entorno

Realizamos experimentos adicionales para dilucidar la flexibilidad de las células del lugar del hipocampo en el procesamiento de estímulos ambientales en entornos novedosos y para determinar si el sistema D1R está involucrado en este proceso. Cuando se expusieron inicialmente a la nueva cámara cuadrada, de las células de lugar 86 probadas en ratones WT, las células 38 mostraron una reasignación, con las células 7 apagadas y las células 31 cambiando sus campos de disparo. De las células 26 probadas en ratones D1R-KO, las células 8 se volvieron a correlacionar, las células 3 desactivaron su activación y las células 5 cambiaron sus campos de activación. No hubo diferencias marcadas en el número de células reasignadas en el nuevo entorno entre los dos grupos de ratones (WT, 37 / 86, 44.2% vs KO, 8 / 26, 30.8%, p = 0.223), aunque más células cambiaron sus campos de activación en ratones WT (WT, 31 / 86, 36.1% vs KO, 5 / 26, 19.2%, p = 0.107). Estos resultados sugieren que la exposición a un nuevo entorno influye en varias células tanto en ratones WT como en D1R-KO. Para probar las respuestas neuronales de las células de lugar en cámaras familiares y nuevas, se requirió que los animales realizaran sesiones secuenciales de 10. En los ratones D1R-KO, para varias células, el rendimiento de los ratones durante la grabación se deterioró después de las sesiones 4-5, ya que comenzaron a detenerse con frecuencia y a ejecutarse de forma menos aleatoria, como en los círculos (Tran et al., 2005), y sus trayectorias cubrieron solo un área pequeña de la arena de grabación, que fue insuficiente para analizar los campos de lugar. Para mantener la confiabilidad de los datos con respecto a las representaciones neuronales tanto en el entorno familiar como en el ambiente, en el presente estudio solo incluimos las células grabadas durante las sesiones de 10 con un rendimiento de comportamiento suficiente, lo que significa que un número limitado de células en ratones D1R-KO se probaron en la novela ambiente.

En los ratones WT, la tendencia de las celdas de lugar a usar preferentemente las señales distales para ubicar sus campos de ubicación ( A, 6 – 10) sobre las señales proximales ( B, 6 – 10) fue más pronunciado en el entorno novedoso ( E,G; Tabla 2). Curiosamente, una pequeña fracción de neuronas había respondido previamente tanto a señales distales como proximales en el ambiente familiar ( C, 1 – 5); en el entorno novedoso, sin embargo, su disparo de ubicación específica estaba anclado a señales distales pero no proximales ( C, 6 – 10). Además, el número total de celdas de lugar que respondieron a las señales ambientales no difirió entre los entornos familiar y novedoso (Tabla 2). Estos resultados sugieren que las células ubicadas en el hipocampo en ratones WT pueden usar información ambiental para representar su ubicación en el ambiente. El hecho de que la codificación de la información de las señales distales fue predominante sobre las señales proximales en las condiciones familiares y novedosas en los ratones WT sugiere que el uso de esta información es eficaz para permitir que el animal lidie con un entorno en constante cambio. Además, algunas de las células de lugar probadas primero siguieron señales distales en el nuevo entorno y luego se ajustaron a la información proximal en el entorno familiar, o viceversa. Este resultado es consistente con una idea conocida de que existen diferentes sistemas de referencia de referencia para las neuronas del hipocampo, y que pueden ser intercambiables de manera flexible o parcialmente superpuestos en ciertas condiciones (Gothard et al., 1996; Knierim et al., 1998; Zinyuk et al., 2000).

Figura 7. 

Los diagramas de dispersión de los valores de correlación espacial frente a los ángulos de rotación que produjeron valores de correlación máximos entre pares de sesiones para células de posición de hipocampo en ratones WT y D1R-KO. Los ángulos de rotación se representan en la abscisa, y los valores de correlación espacial entre pares de sesiones se representan en la ordenada; los diamantes rellenos de azul son para ratones WT y cuadrados rojos para ratones D1R-KO. ANUNCIOEn el entorno familiar, había dos subpoblaciones de células de lugar en ratones WT en las que los campos de lugar estaban influenciados por señales distales (distribuidas alrededor de 180 °, sesión estándar frente a sesión de rotación distal) (A) y señales proximales (distribuidas alrededor de 180 °, sesión de línea de base 2 frente a sesión de rotación proximal) (C), con la influencia de las señales distales predominantes sobre las señales proximales. Para los ratones D1R-KO, las células sin lugar cambiaron sus campos de lugar mediante la rotación de las señales distales (alrededor de 0 °) (A), y la mayoría de las células cambiaron sus campos de lugar mediante la rotación de las señales proximales (C). E – H, En el ambiente novedoso, el efecto predominante de las señales distales (E) sobre las señales proximales (GTodavía se veía y era más pronunciado en ratones WT. En los ratones D1R-KO, solo unas pocas células respondieron a la rotación de las señales distales (E) y señales proximales (G), y muchas células no siguieron los cambios de señal distal o proximal en el nuevo entorno.

En los ratones D1R-KO, no hubo lugar de células influenciadas por las señales distales en el entorno nuevo ( A,B, 6-10; E; Tabla 2). Este resultado puede deberse a algunos cambios en las funciones cognitivas en relación con el entorno externo causados ​​por la falta de D1R (Kentros et al., 2004). Curiosamente, en los ratones D1R-KO, una fracción más pequeña de las células de lugar siguió la rotación de las señales proximales en el entorno nuevo, aunque la mayoría de las células de lugar siguieron la rotación de las señales proximales en el entorno familiar. Es notable que el número de celdas de lugar que respondieron a ninguna de las claves en el nuevo entorno aumentó (Tabla 2). Estos resultados sugieren que las células ubicadas en los ratones D1R-KO parecen responder con menor probabilidad a las manipulaciones de las señales distales, y que la codificación suficiente de señales proximales puede requerir una exposición más prolongada al entorno para adaptar esta información a la actividad del hipocampo.

La existencia de receptores de dopamina en la retina ha sido reportada previamente (Djamgoz et al., 1997; Nguyen-Legros et al., 1999; Courtière et al., 2003). Su presencia plantea una preocupación con respecto a la agudeza visual de los ratones D1R-KO. Por lo tanto, realizamos una prueba de agudeza visual para ratones (Fox, 1965; Crawley, 2000). No se encontraron diferencias en el número de respuestas positivas y latencias en la respuesta entre los dos tipos de ratones (Tabla 3) (Respuesta positiva: WT, 90 / 100 vs KO, 87 / 100, p = 0.51; latencia: WT, 170.1 ± 12.8 vs KO, 181.8 ± 11.8 s, p = 0.49), que muestra que la perceptibilidad visual en los ratones D1R-KO no era marcadamente deficiente en comparación con la de los ratones WT.

Tabla 3. 

Resultados de la prueba de acantilado visual en ratones WT y D1R-KO

Discusión

Para probar la hipótesis de que D1R modula las representaciones espaciales en el hipocampo en respuesta a los cambios ambientales, registramos células de posición de hipocampo en ratones D1R-KO y WT con manipulaciones de señales ambientales. Los ratones D1R-KO pueden tener un número de células de posición del hipocampo con propiedades de disparo básicas intactas en una sesión estándar comparable con la de los ratones WT. Anteriormente hemos encontrado una reducción en el tamaño de campo de lugar promedio de la actividad relacionada con el lugar en el núcleo accumbens (NAc) en ratones D1R-KO (Tran et al., 2005). Por lo tanto, aunque el HF y el NAc están interconectados y ambos son innovados por sistemas dopaminérgicos, los efectos de la modulación D1R en las representaciones espaciales en estas dos estructuras pueden procesarse de manera distintiva. Manipulaciones farmacológicas del sistema D1R (Gill y Mizumori, 2006) han demostrado que la confiabilidad y la especificidad de las células de hipocampo de rata se alteran solo mediante la combinación de una D1 Antagonista con un cambio de contexto. En la sesión estándar en nuestro experimento, hubo una eliminación de D1R, pero el contexto fue estable, con el resultado de que las propiedades básicas de activación de las neuronas de HF en ratones D1R-KO no se modificaron, lo cual es consistente con el hallazgo en ratas. En el entorno familiar, los ratones tenían una experiencia previa sustancial, que estabilizaba la confiabilidad de las celdas de lugar, y esto puede ser más importante para la navegación espacial que el tamaño de los campos de lugar per se. Sin embargo, cuando se manipularon las señales ambientales, encontramos alteraciones intrigantes en la plasticidad dependiente del contexto en ratones D1R-KO, como se describe.

La representación del hipocampo puede alterarse por modificación de la potenciación a largo plazo (LTP) (Rotenberg et al., 2000; Dragoi y otros, 2003), y esta plasticidad sináptica puede ser modulada por la dopamina (Otmakhova y Lisman, 1996; Matthies et al., 1997; Swanson-Park et al., 1999; Li et al., 2003) y la novedad espacial (Li et al., 2003). La codificación completa de señales espaciales puede ser crucial para que las celdas de lugar reconozcan rápidamente el diseño del entorno, lo que a su vez puede contribuir a la integración con la información idiotética. Esta capacidad puede ser importante para el aprendizaje espacial, especialmente en entornos novedosos. La ausencia de D1R dificultó la integración del flujo de información de la señal espacial, lo que resultó en una disminución en el número de celdas de lugar que respondieron a los cambios en las señales espaciales en el nuevo entorno. Sin embargo, la representación del entorno por parte de las células del lugar del hipocampo puede estabilizarse mediante otros flujos de información derivados de otras fuentes, como las señales idiotéticas (Gothard et al., 1996; Whishaw et al., 1997; Knierim et al., 1998; Zinyuk et al., 2000; Stuchlik et al., 2001) utilizado en la integración de caminos (Gothard et al., 1996; Whishaw et al., 1997; McNaughton y otros, 2006), con la participación de otros sistemas de neurotransmisores como los sistemas glutamatérgicos (McHugh y otros, 1996; Cho et al., 1998; Kentros et al., 1998; McHugh y otros, 2007). Esta plasticidad neural puede requerir una exposición más prolongada al medio ambiente. Con una falta de d1 En esta modulación, esta plasticidad neural en ratones D1R-KO podría vincularse preferentemente a señales idiotéticas (p. ej., el integrador de ruta) en comparación con señales distales del entorno. Las celdas de lugar del hipocampo son parte de un circuito más amplio para la representación dinámica de la autoubicación (Moser et al., 2008), y ahora se sabe que interactúan con las células de la cuadrícula en la corteza entorrinal (Brun et al., 2002; Hafting et al., 2005; Sargolini et al., 2006; Fyhn et al., 2007). Las celdas de la cuadrícula pueden proporcionar los elementos de un mapa neuronal basado en integración de ruta (McNaughton y otros, 2006; Moser et al., 2008). Quizás sin D1R, las celdas regresen a un "mapa" predeterminado basado principalmente en la integración de la ruta, lo que hace que el número de celdas de lugar que siguen a las señales proximales predomine en el entorno familiar.

Codificación novedosa espacial de las neuronas del hipocampo, un fenómeno que se ajusta a lo que muchos otros autores llaman "remapping" (Leutgeb et al., 2005b) y se cree que es una habilidad dependiente de D1R (Li et al., 2003), puede influir en la plasticidad sináptica dependiente (Li et al., 2003) no solo por el efecto directo del agotamiento de D1R sino también por el efecto de esto en otros sistemas neuromoduladores (Levine et al., 1996; Mele et al., 1996; Swanson-Park et al., 1999). Tales cambios comprometen la representación de las neuronas del hipocampo, lo que resulta en una alteración en la cognición espacial (Kentros et al., 2004; Stuchlik y Vales, 2006) o deficiencias en el aprendizaje espacial que requieren el uso de señales espaciales y la memoria de lugares (El-Ghundi et al., 1999; Tran et al., 2005). Además, Kentros et al. (2004) También se encontró que la aplicación de D1/D5 Los agonistas y antagonistas de receptores en ratones de tipo salvaje aumentaron o disminuyeron la estabilidad del campo en el lugar. Junto con los resultados de Gill y Mizumori (2006) y los del presente estudio, estos datos implican el papel de la neuromodulación dopaminérgica en la formación de la representación del hipocampo. Algunos otros estudios han demostrado menos deterioro en el aprendizaje espacial en ratas manipuladas con D1R (Wilkerson y Levin, 1999), y las manipulaciones de otros sistemas neuromoduladores, como los receptores NMDA, pueden causar alteraciones en las tareas espaciales y la inestabilidad de las células del lugar (McHugh y otros, 1996, 2007; Cho et al., 1998; Kentros et al., 1998; Rotenberg et al., 2000) en un entorno sin cambios, lo que sugiere que las funciones del hipocampo pueden depender de algo más que el sistema D1R en un entorno familiar. Los resultados de respuestas y latencias positivas iguales en una prueba de agudeza visual sugirieron que las alteraciones en la representación espacial en el presente estudio podrían surgir de funciones cognitivas en lugar de déficits en la percepción visual.

Nuestros resultados apoyan la noción de que la integración de información de puntos de referencia espaciales e indicaciones idiotéticas en las células puede implicar la interacción mutua de los sistemas dopaminérgicos y otros neuromoduladores, incluidos los sistemas glutamatérgicos (McHugh y otros, 1996, 2007; Mele et al., 1996; Kentros et al., 1998) en el hipocampo y entre los sistemas de procesamiento de información (Sawaguchi y Goldman-Rakic, 1991; Wilkerson y Levin, 1999; Durstewitz y otros, 2000; Tran et al., 2005), como la dopamina puede modular la corriente NMDA (Mele et al., 1996; Durstewitz y otros, 2000) y la plasticidad del hipocampo, y esta modulación está relacionada con la estabilidad de la memoria de trabajo (Sawaguchi y Goldman-Rakic, 1991; Durstewitz y otros, 2000). En este contexto, llegamos a la conclusión de que D1R desempeña un papel importante en la detección de la novedad espacial codificada por las representaciones espaciales de las células del lugar del hipocampo, un requisito previo para el aprendizaje espacial. El presente trabajo junto con otros estudios recientes (Gasbarri et al., 1996; Matthies et al., 1997; Otmakhova y Lisman, 1996; El-Ghundi et al., 1999; Swanson-Park et al., 1999; Wilkerson y Levin, 1999; Tran et al., 2002, 2005; Li et al., 2003; Kentros et al., 2004; Gill y Mizumori, 2006; Stuchlik y Vales, 2006) debería ayudar significativamente a revelar los mecanismos subyacentes a la participación de la dopamina en el aprendizaje y la memoria, desde el nivel molecular hasta el neuronal y el comportamiento.

Notas a pie de página

  • Recibido en junio 12, 2008.
  • Revisión recibida octubre 10, 2008.
  • Aceptado octubre 10, 2008.

  • Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, Subvención de Ayuda para la Investigación Científica (Subvención 18700312 a AHT), Investigación de Base para Ciencia y Tecnología Evolutivas, Ciencia y Tecnología de Japón y Canon Fundación en Europa. Agradecemos al Dr. Edmund T. Rolls (Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido) por sus valiosos comentarios sobre este manuscrito, y al Dr. Toshikuni Sasaoka (Instituto Nacional de Biología Básica, Okazaki, Japón) por su asistencia técnica.

  • La correspondencia debe dirigirse a Taketoshi Ono, Sistema de Ciencias Emocionales, Universidad de Toyama, Sugitani 2630, Toyama 930-0194, Japón. [email protected]

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