El reclutamiento del sistema CRF media el lado oscuro de la alimentación compulsiva (2009)

. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.

Publicado en línea 2009 Nov 9. doi  X

PMCID: PMC2785284

Resumen

Hacer dieta para controlar el peso corporal implica ciclos de privación de alimentos sabrosos que pueden promover una alimentación compulsiva. El presente estudio muestra que las ratas que se retiraron del acceso intermitente a los alimentos sabrosos exhiben una ingesta excesiva de alimentos sabrosos con un acceso renovado y un estado similar a la abstinencia afectiva caracterizado por el factor de liberación de corticotropina-1 (CRF1) conductas antagonistas-reversibles del receptor, que incluyen hipofagia, déficits motivacionales para obtener alimentos menos sabrosos y conductas de tipo ansiogénico. La retirada estuvo acompañada por una mayor expresión de CRF y CRF1 Sensibilidad electrofisiológica en el núcleo central de la amígdala. Proponemos que el reclutamiento de anti-recompensa extrahipotalámico CRF-CRF1 Los sistemas durante la abstinencia de alimentos sabrosos, análogos a la abstinencia de las drogas de abuso, pueden promover la selección compulsiva de alimentos sabrosos, la subestimación de alternativas más saludables y un estado emocional negativo cuando se evita la ingesta de alimentos sabrosos.

Palabras clave: Trastornos de la alimentación, obesidad, palatabilidad, dependencia alimentaria aceptable, abstinencia.

Las formas de obesidad y trastornos de la alimentación, similares a la adicción a las drogas, se pueden conceptualizar como condiciones crónicas de recaída con períodos alternos de abstinencia (es decir, dietas para evitar los alimentos palatables "prohibidos") y recaídas (es decir, compulsivas, a menudo incontrolables, comer de alto grado). Alimentos sabrosos) que continúan a pesar de las consecuencias negativas (). Aunque las propiedades de refuerzo positivas de los alimentos sabrosos son bien conocidas (, ), se ha prestado menos atención a sus propiedades de refuerzo negativas (–), es decir, la mayor probabilidad de una respuesta de comportamiento producida por la eliminación de un estímulo aversivo (por ejemplo, la ingesta de alimentos sabrosos para aliviar estados emocionales negativos). Los ciclos intermitentes de uso prolongado de drogas de abuso pueden llevar progresivamente a una "dependencia afectiva", observada como una necesidad de cantidades más altas y / o más regulares de la droga para mantener un punto de ajuste emocional dado, así como un estado emocional negativo al cese de ingesta de drogas, ). Esta abstinencia afectiva puede mantener el uso y motivar la recaída a través de las propiedades de refuerzo negativas de continuar y reanudar el uso de drogas, respectivamente (, ).

Los sistemas de estrés cerebral con factor de liberación de corticotropina (CRF, por sus siglas en inglés) extrahipotalámico están supuestamente involucrados en la transición del uso de drogas a la dependencia, durante la cual la ingesta de medicamentos de abuso se vuelve cada vez más motivada por estos mecanismos de refuerzo negativos en lugar de positivos. CRF desempeña un papel motivacionalmente relevante en los síndromes de abstinencia para todas las principales drogas de abuso, incluido el alcohol, la nicotina, la cocaína, los opiáceos, las anfetaminas y el tetrahidrocannabinol (, ). Por analogía, se hipotetizó que los ciclos repetidos de acceso intermitente y extendido a alimentos altamente sabrosos inducen neuroadaptaciones del sistema de IRC similares a las observadas en los modelos de dependencia de drogas (, , ).

Resultados

El acceso prolongado e intermitente a los alimentos sabrosos conduce progresivamente a comer menos de las dietas preferidas cuando no se dispone de alimentos sabrosos y al comerlos de manera aceptable con un acceso renovado (–). Para probar la hipótesis de que CRF1 Los sistemas median estas adaptaciones de alimentación, ratas Wistar macho (n = 20) se les proporcionó una dieta chow ad libitum (Chow / Chow) cada semana o se les proporcionó chow ad libitum para los días 5 (fase C) seguidos de una dieta azucarada de gran sabor durante los días 2 (fase P) (Chow / palatable ) (ver Fig. S1 para el horario de la dieta y Fig. S2 para efectos de la dieta en la ingesta de alimentos y el peso corporal). Después de 7 semanas de ciclos de dieta, las ratas recibieron el CRF no peptídico1 antagonista del receptor R121919 (0, 5, 10 y 20 mg / kg, sc) en un diseño de cuadrado latino (). Los tratamientos se administraron 1 h antes de los cambios de dieta palatable a chow o de chow a dieta palatable. R121919 dependió de la dosis y redujo la ingesta de una dieta sabrosa y aumentó la ingesta de comida chow en ratas Chow / palatables (Fase de la dieta × Programa de la dieta × Dosis de fármaco: F3,54 = 7.25, P <0.001), sin alterar la ingesta de controles de pienso. R121919 disminución de la ingesta de la dieta altamente apetitosa al volver a acceder a la comida apetitosa (fase P) A). En pruebas independientes, el CRF.1 antagonista de los receptores aumentó la ingesta del chow menos palatable en ratas Chow / Palatable retiradas de la dieta palatable (fase C) ( B). Por lo tanto, al mitigar tanto la hipofagia del chow como el exceso de comida palatable, R121919 atenuó la amplitud del ciclo de ingesta (la diferencia entre la ingesta durante la primera fase P palatable y la primera retirada a la fase C del chow: Programa de dieta x Dosis de fármaco: F3,54 = 7.25, P <0.001) ( C). Apoyando un reclutamiento progresivo de CRF-CRF1 R121919 no redujo la ingesta de alimentos sabrosos después de una sola exposición a la dieta ni aumentó el consumo de comida durante una primera retirada de alimentos sabrosos (RXNUMX).Fig. S3).

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Efectos del CRF1 antagonista del receptor R121919 (−1 h pretratamiento, 0, 5, 10 y 20 mg / kg, sc) en la ingesta de alimentos acumulada de 3-h en (A) Fase P (al renovarse el acceso a los alimentos sabrosos), (B) Fase C (cuando las ratas habían sido retiradas del palatable ...

Retirarse de un acceso intermitente y extendido a alimentos sabrosos también puede aumentar el comportamiento similar a la ansiedad (). Para probar la hipótesis de que CRF1 los receptores están involucrados en los signos emocionales negativos del comportamiento que siguen a la abstinencia de alimentos sabrosos, a las ratas se les administró R121919 (0, 20 mg / kg, sc, 1-h pretratamiento) y se probaron en un diseño entre sujetos en el más elevado laberinto (), 5 – 9 h después de pasar de una dieta sabrosa a una comida para comer. Las ratas Chow / palatables tratadas con vehículo mostraron menos tiempo de brazos abiertos que los controles alimentados con chow, lo que refleja un efecto de tipo ansiogénico, durante la retirada de 7 semanas de ciclos de dieta ( A), un efecto que aún no se ha visto después de solo dos ciclos de extracción (Fig. S4). El tratamiento previo con R121919 (20 mg / kg, la dosis que modulaba tanto la ingesta de alimentos sabrosos como la ingesta de chow) bloqueó la disminución en la exploración de brazos abiertos de ratas Chow / Palatable a una dosis que no alteró el comportamiento del laberinto en los controles de chow ( Horario de la dieta × Dosis: F1,43 = 7.25, P <0.02; Una izquíerda). La administración de R121919 no modificó la actividad general medida como entradas de brazo cerrado. Por lo tanto, R121919 bloqueó el aumento del comportamiento similar a la ansiedad asociado con la abstinencia del acceso intermitente y extendido a alimentos sabrosos, sin alterar el comportamiento de los controles, lo que sugiere el reclutamiento de CRF1 .

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Efectos del CRF1 antagonista del receptor R121919 (−1 h pretratamiento, 0, 20 mg / kg, sc) en el comportamiento elevado más laberinto (n = 47) y respuesta progresiva para los alimentos menos sabrosos (n = 17) en ratas Wistar macho retiradas de alimentos sabrosos ...

La abstinencia del acceso intermitente y extendido a los alimentos sabrosos también puede llevar a déficits motivacionales para obtener dietas menos preferidas, un índice potencial de comportamiento similar al hipoedónico (). De manera análoga, la respuesta a los reforzadores gustativos menos preferidos bajo programas de refuerzo de relación progresiva se ha utilizado previamente para indexar los déficits motivacionales observados durante la retirada del fármaco (). Determinar la implicación de CRF.1 Receptores, probamos los efectos de R121919 en el rendimiento de ratas con ciclos de dieta para obtener su comida menos preferida bajo un programa de proporción progresiva. Confirmando hallazgos previos (), las ratas Chow / palatables tratadas con vehículo mostraron una motivación reducida para trabajar para obtener la comida menos sabrosa, reflejada por un punto de ruptura reducido y respuestas totales emitidas en comparación con las ratas Chow / Chow () (Fig. S5). Pretratamiento con R121919 (20 mg / kg, la dosis efectiva para aumentar la hipofagia del chow, reducir la hiperfagia de los alimentos sabrosos y reducir el comportamiento de tipo ansiogénico) mitigó de manera selectiva los déficits en el rendimiento de la relación progresiva en ratas cicladas con dieta a una dosis que no fue efectiva (Punto de corte: Horario de la dieta × Droga: F1,15 = 8.17, P <0.02; respuestas totales: Programa de dieta × Medicamento: F1,15 = 9.14, P <0.01; B, izquierda). En contra de la interpretación alternativa de que R121919 facilitó el rendimiento en ratas Chow / Palatable al reducir la saciedad postoperatoria, R121919 bloqueó los déficits en la respuesta tan pronto como 5 min en la sesión (Programa de dieta × Medicamento: F1,15 = 2.55, P <0.05) ( B derecha). Por lo tanto, el CRF1 el antagonista del receptor mitigó los déficits motivacionales en la relación progresiva que responde a los reforzadores gustativos menos preferidos que se observan en animales retirados de un acceso intermitente y extendido a alimentos altamente sabrosos.

Para probar la hipótesis de que la retirada de alimentos sabrosos podría activar el sistema de CRF extrahipotalámico relacionado con el estrés, los niveles de ARNm y péptidos de CRF en el núcleo central de la amígdala se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real y RIA, respectivamente. Las ratas se sometieron a ciclos de dieta durante semanas 7 o se alimentaron con comida continuamente. Después de la anestesia y la decapitación, se recolectaron golpes cerebrales del núcleo central de la amígdala durante el retiro y después de renovar el acceso a la dieta sabrosa. La retirada de alimentos sabrosos en ratas Chow / Palatable indujo un aumento de cinco veces en la expresión del ARNm de CRF en el núcleo central de la amígdala en comparación con las ratas Chow / Chow ( A). A la inversa, el ARNm de CRF volvió a niveles de control con acceso renovado a alimentos sabrosos (F2,19 = 6.97, P <0.01). La expresión del ARNm de CRF en el núcleo central de la amígdala no cambió cuando las ratas Chow / Palatable se ciclaron solo una vez (Chow / Chow vs. Chow / Palatable: 5.5 ± 2.2 vs. 6.3 ± 1.7 ns), lo que apoya un reclutamiento progresivo de CRF- CRF1 Sistemas por la historia de la dieta, en lugar de por un efecto agudo de la dieta. Además, la expresión del ARNm de CRF no cambió en el núcleo accumbens, la corteza prefrontal o la corteza insular, lo que respalda la especificidad regional de los hallazgos (Fig. S6). Curiosamente, no se observaron cambios significativos en la expresión del ARNm de CRF en el núcleo paraventricular del hipotálamo o en la corticosterona circulante en el mismo punto de tiempo de retirada en ratas Chow / palatables (Figs. S6 y S7), sugiriendo la hipótesis de que los cambios en los sistemas de estrés CRF amígdala, en lugar de hipotalámico, justificaron las adaptaciones conductuales. Además, la inmunorreactividad del péptido CRF en el núcleo central de la amígdala de los animales retirados de la dieta palatable fue un 70% mayor que en los animales alimentados con chow, pero volvió a los niveles de control alimentados con chow con acceso a la dieta palatable (F2,24 = 4.01, P <0.01) ( B). Por lo tanto, la extracción de alimentos sabrosos activó el sistema peptídico de CRF relacionado con el estrés en el núcleo central de la amígdala, análogo a los hallazgos en modelos de abstinencia de fármacos y etanol (, ). Debido a que el acceso renovado a los alimentos sabrosos disminuyó la activación del sistema de CRF extrahipotalámico en el núcleo central de la amígdala, en donde la activación de CRF está vinculada a la ansiedad (), los resultados actuales también sugieren que los alimentos sabrosos pueden adquirir propiedades de refuerzo negativas al aliviar las consecuencias negativas afectivas de la abstinencia ().

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Efectos de la alternancia de dieta palatable en (A) ARNm de CRF yB) Expresión del péptido CRF en el núcleo central de la amígdala. Ratasn = 45) se realizaron ciclos de dieta durante semanas 7 y se recolectó el núcleo central de los punzones de la amígdala. Tanto el ARNm como el péptido de CRF ...

Para probar la hipótesis de que las ratas retiradas de alimentos sabrosos pueden mostrar una mayor sensibilidad al CRF1 modulación antagonista de la señalización del ácido γ-aminobutírico (GABA) en el núcleo central de la amígdala, que se produce durante la extracción de etanol (), examinamos el efecto de R121919 en la transmisión GABAérgica del núcleo central de las neuronas de la amígdala en una preparación de corte. Ratas Wistar macho (n = 14) se sometieron a ciclos de dieta durante semanas 7 y se sacrificaron después de cambiar a la comida menos sabrosa. La transmisión basal de GABAergic en el núcleo central de las sinapsis de la amígdala no difirió en relación con la historia de la dieta (n = Células 23) en todas las intensidades de estímulo utilizadas para evocar potenciales postsinápticos inhibidores de GABA (IPSP). Sin embargo, la superfusión mínima de 20 con R121919 (1 μM) indujo una mayor reducción en GABA evocadoA-IPSP en el núcleo central de las neuronas de la amígdala de ratas Chow / Palatable (M ± SEM: 30 ± 6%, n = Células 9) que en los controles alimentados con chow (M ± SEM: 12 ± 6%, P <0.05, n = Células 11) ( ). Después de un período de lavado mínimo de 30, los IPSP de ambos grupos volvieron a niveles similares similares a los de la línea de base. Por lo tanto, consistente con la sobreactivación de la amígdala CRF-CRF1 Sistema y efectos observados durante la extracción de etanol (), las ratas con ciclos de dieta mostraron una mayor sensibilidad a los efectos inhibidores de un CRF1 Antagonista del receptor en el núcleo central de la amígdala GAB. Transmisión alérgica.

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Efectos del CRF1 antagonista del receptor R121919 en GABAA-PIPS en el núcleo central de la amígdala después de un historial de acceso alterno a la dieta sabrosa en ratas Wistar macho (n = 14) retirado del acceso a alimentos sabrosos. (A) R121919 disminuyó significativamente ...

Discusión

Los resultados colectivos proporcionan evidencia funcional de que una historia de acceso intermitente y extendido a alimentos sabrosos conduce a neuroadaptaciones progresivas y de importancia motivacional en el CRF-CRF extrahipotalámico relacionado con el estrés.1 sistemas Específicamente, el CRF selectivo.1 El antagonista del receptor R121919 afectó de manera diferencial y selectiva la alimentación en ratas con ciclos de dieta, aumentando la ingesta regular de chow y disminuyendo la ingesta de alimentos altamente sabrosos con el acceso renovado. El CRF1 el antagonista del receptor también bloqueó selectivamente el aumento de la ansiedad y los déficits motivacionales en la respuesta al chow menos preferido que se observó durante la abstinencia de la dieta aceptable. Al retirar el acceso a la dieta sabrosa se incrementó la expresión del gen y péptido de CRF en el núcleo central de la amígdala, efectos que se eliminaron con un acceso renovado. Además, las ratas con ciclos de dieta mostraron una mayor sensibilidad a los efectos inhibidores de un CRF1 antagonista del receptor en la transmisión de GABAergic en el núcleo central de la amígdala, sugiriendo además la sobreactivación de la amígdala CRF-CRF1 sistema. La sobrealimentación de alimentos sabrosos con un acceso renovado puede ser el resultado de un aumento en la activación del sistema CRF del período de retiro recién completado, visto como un aumento de la expresión de CRF y una sensibilidad electrofisiológica a CRF1 Bloqueo de receptores en el núcleo central de la amígdala. CRF1 el tratamiento previo con antagonistas justo antes del apetitoso acceso a los alimentos se interpreta de este modo para oponerse al CRF-CRF inicialmente presente.1 Sistema de sobreactivación de la extracción El breve curso temporal de los alimentos sabrosos que se comen de otra manera se ven en animales no tratados () puede reflejar el curso del tiempo por el cual la expresión, la liberación y los efectos del péptido CRF se normalizan una vez que se recupera el acceso a los alimentos sabrosos, como se observa en el presente estudio. Por lo tanto, comer de forma intermitente dietas sabrosas puede inducir un cambio alostático en los sistemas de recompensa cerebral con el reclutamiento de CRF-CRF anti-recompensa1 Sistemas en el núcleo central de la amígdala.

Estos resultados tienen implicaciones no solo para la alimentación compulsiva, sino también para la motivación en general. La activación repetida de los sistemas hedónicos provocó procesos similares al oponente en el cerebro (es decir, reclutamiento de CRF).1 circuitos) que eran distintos de una simple pérdida de función en los sistemas de transmisión de recompensa. Tales neuroadaptaciones entre sistemas () también ocurren durante la transición a la dependencia de todas las principales drogas de abuso (, ). La generalización a los estímulos no farmacológicos en el presente estudio sugiere que los procesos motivacionales pueden perturbarse en individuos que experimentan contrastes repetidos en la intensidad de los estímulos hedónicos a lo largo del tiempo (). Adaptativamente, tales procesos pueden cambiar el comportamiento consumatorio y de búsqueda de alimentos hacia alimentos densos en energía y de alta recompensa, al tiempo que devalúan los esfuerzos para obtener alimentos (o no alimentos) menos ricos en energía y de baja recompensa, una adaptación evolutivamente útil cuando hay costos de la búsqueda de alimento (por ejemplo, exposición a depredadores, tiempo y recursos energéticos limitados). En el entorno actual, sin embargo, los mismos procesos pueden impulsar la ingesta de alimentos que promueven la obesidad a expensas de alternativas menos sabrosas, pero quizás más nutritivas.

Por lo tanto, los cambios similares a la adicción en CRF1 los sistemas pueden ayudar a conducir (i) la ingesta de alimentos sabrosos de alta densidad energética,ii) el subconsumo de alternativas más saludables, y (iii) el estado emocional negativo asociado que se produce cuando se impide el acceso a alimentos sabrosos (, , –, ). Traducido a la condición humana, la activación del sistema CRF puede promover la recaída en la obesidad y los trastornos alimentarios relacionados, así como otras secuelas motivacionales negativas de la abstinencia cíclica de alimentos sabrosos.

Materiales y Métodos

Asignaturas.

Ratas Wistar macho (n = 155, 180 – 230 g, 45 días de antigüedad) se obtuvieron de Charles River y se alojaron en una sola caja al llegar a jaulas de plástico con tapa de alambre (19 × 10.5 × 8 pulgadas) en un 12 h: 12 h ciclo de luz de reversa (10 : 00 h se apaga), vivero de humedad (60%) y temperatura controlada (22 ° C). Las ratas tuvieron acceso al alimento para roedores a base de maíz [Harlan Teklad LM-485 Dieta 7012: 65% (kcal) carbohidrato, 13% grasa, 21% proteína, energía metabolizable 341 cal / 100 g] y agua ad libitum para 1 una semana antes de la inicio de los experimentos. Procedimientos experimentales adheridos a la Guía de los Institutos Nacionales de la Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (número de publicación del NIH 85 – 23, 1996 revisado) y los “Principios del cuidado de animales de laboratorio” (http://www.nap.edu/readingroom / bookslabrats) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Scripps.

Drogas.

R121919 se sintetizó como se describe en Chen et al. (). R121919 es una alta afinidad (Ki = 3.5 nM) CRF selectivo1 Antagonista con propiedades fisicoquímicas superiores a muchas otras CRF.1 antagonistas (p. ej., disminución de logP y logD, mayor solubilidad en agua) (). Para la prueba, R121919 se solubilizó primero en 1 M HCl (10% del volumen final), luego se diluyó a un vehículo final de 20% (peso / vol) 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Sigma-Aldrich), titulado por detrás con NaOH a pH 4.5. La solución R121919 se administró sc (sc) en un volumen de 2 mL / kg.

Ad Libitum Dieta Alternativa.

Después de la aclimatación, las ratas se dividieron en dos grupos para la ingesta de alimentos, el peso corporal y la eficiencia de alimentación de los días anteriores 3-4. Un grupo recibió una dieta chow ("Chow") ad libitum 7 días a la semana (Chow / Chow), y un segundo grupo recibió chow ad libitum para los días 5 cada semana, seguidos de los días 2 de acceso ad libitum a los más sabrosos. , sabor a chocolate, dieta alta en sacarosa ("palatable"; Chow / palatable). La dieta sabrosa es una dieta basada en AIN-50A, nutricionalmente completa, con sabor a chocolate y alta en sacarosa (76% kcal) que es comparable en proporciones de macronutrientes y densidad de energía a la dieta chow [TestDiet; Fórmula 5TUL con sabor a chocolate: 66.8% (kcal) carbohidrato, 12.7% grasa, 20.5% proteína, energía metabolizable kNUMX kcal / g; formulado como pellets de alimentos de precisión 3.48-mg para aumentar su preferencia (, )]. Para mayor brevedad, los primeros días de 5 (solo chow) y los últimos días de 2 (chow o palatable según el grupo experimental) de cada semana se denominan en todas las experiencias como fases C y P. Las dietas nunca estuvieron disponibles al mismo tiempo. La dieta Chow fue una dieta Harlan Teklad LM-485 7012 [65% (kcal) carbohidrato, 13% grasa, 21% proteína, energía metabolizable 341 cal / 100 g] o 5TUM dieta formulada como 4- a 5-g pellets extruidos [XUM] % (kcal) de carbohidratos, 65.5% de grasa, 10.4% de proteína, energía metabolizable 24.1 cal / 330 g; TestDiet]. Al igual que en estudios previos, Harlan Teklad LM-100 Chow se usó en la alimentación y en experimentos elevados de laberinto más (), mientras que TestDiet 5TUM chow () se utilizó en la relación progresiva, ARNm de CRF, contenido de péptidos de CRF, RIA de corticosterona y experimentos electrofisiológicos.

Como se publicó anteriormente (), las preferencias de dieta relativas, calculadas como el porcentaje de ingesta diaria (kcal) de la primera dieta en relación con la segunda dieta, fueron las siguientes: 5TUL Dieta de chocolate (dieta azucarada palatable) vs. Harlan LM-485 chow (M ± SEM) preferencia 90.7 ± 3.6%) y 5TUL Dieta de chocolate (dieta azucarada sabrosa) vs. 5TUM Chow Diet (preferencia de M ± SEM 91.2 ± 3.7%).

Elevado más laberinto.

La prueba de laberinto plus elevado se realizó como se describe en Cottone et al. (). Las ratas Chow / palatables se sometieron a ciclos de dieta durante al menos 7 semanas y luego se trataron previamente con vehículo o con 20 mg / kg de R121919 (−1 h, sc) y se probaron con 5-9 h después de pasar de la dieta aceptable a la comida (P → Fase C). Las ratas de control Chow / Chow se probaron simultáneamente en un diseño entre sujetos (n = 47). La dieta Chow estuvo disponible ad libitum hasta el momento de la prueba. Para más detalles, ver el Texto SI.

Relación Progresiva de Listas de Refuerzos para Alimentos.

El programa de refuerzo de proporción progresiva para alimentos se realizó como se describe en Cottone et al. (). Los animales recibieron ad libitum A / I chow (5 g gránulos extruidos) en sus jaulas durante todo el experimento a menos que se especifique lo contrario. Los refuerzos de los alimentos fueron pellets de precisión de Chow de 45-mg, idénticos en composición a la dieta de chow de jaula casera extruida. Las sesiones terminaron cuando los sujetos no completaron una proporción para 14 min, con la última proporción completada definida como punto de interrupción. Las ratas Chow / palatables se sometieron a ciclos de dieta durante al menos 7 semanas y luego se trataron previamente con R121919 (−1 h, sc) en el momento de cambiar de una dieta aceptable a una comida (fase P → C). Las ratas de control Chow / Chow se probaron simultáneamente en un diseño entre sujetos (n = 17). Las dosis de R121919 (0, 20 mg / kg de peso corporal, sc) se administraron en un diseño equilibrado dentro de los sujetos en dos ciclos de dieta. Para más detalles, ver el Texto SI.

PCR cuantitativa en tiempo real.

Ratasn = 20) fueron sometidos a ciclos de dieta durante 7 semanas, anestesiados y decapitados durante las dos condiciones de dieta (días 5 y 7 de cada ciclo semanal). Los cerebros se extrajeron rápidamente y se cortaron coronalmente en una matriz cerebral, y se recogieron punciones del núcleo central de la amígdala, el núcleo accumbens, la corteza insular y la corteza prefrontal en una etapa helada. Se preparó ARN total a partir de cada punzón cerebral utilizando un protocolo estándar para la extracción de ARN de tejidos animales. El ARN total (1 µg) se transcribió entonces de forma inversa en presencia de Oligo (dT) 20 según las instrucciones del fabricante. Las reacciones cuantitativas de RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen de 20 μL utilizando cebadores 0.5 μM y MgCl 4 mM2. Los resultados se analizaron mediante métodos de segunda derivación y se expresaron en unidades arbitrarias, normalizadas a los niveles de expresión del gen de referencia, CypA. Todas las reacciones de RT-PCR para una secuencia dada se realizaron dentro de la misma ejecución. Para más detalles, ver el Texto SI.

Extracción de ácido peptídico y CRF RIA.

Ratasn = 25) se sometieron a ciclos de dieta durante al menos 7 semanas, se anestesiaron y se decapitaron durante las dos condiciones de la dieta (días 5 y 7 de cada ciclo semanal). Los cerebros se extrajeron rápidamente y se cortaron coronariamente en una matriz cerebral, y el núcleo central de los punzones de la amígdala se recolectó en una etapa helada. La extracción con ácido peptídico siguió un procedimiento ya establecido (). La inmunorreactividad de tipo CRF tisular se cuantificó con un RIA en fase sólida sensible y específico adaptado de Zorrilla et al. (). Para más detalles, ver el Texto SI.

Corticosterona RIA.

Ratasn = 12) se sometieron a ciclos de dieta durante al menos 7 semanas, y se tomaron muestras de sangre de la cola durante las dos condiciones de dieta (días 5 y 7 de cada ciclo semanal). Los niveles plasmáticos de inmunorreactividad similar a la corticosterona se determinaron con un kit RIA disponible comercialmente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MP Biomedicals, Inc.) (). Para más detalles, ver el Texto SI.

Estudios electrofisiológicos

Preparación de la rebanada.

El núcleo central de las rodajas de amígdala se preparó como se describió anteriormente (, ) de ratas (n = 7 / grupo) que había sido sometido a ciclos de dieta durante al menos 7 semanas, anestesiado y decapitado 2-3 h después de haber sido retirado de los alimentos sabrosos. Los cerebros se retiraron rápidamente y se colocaron en líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) gaseado con 95% O2 y 5% CO2. Los cortes se cortaron, se incubaron en una configuración de interfaz durante aproximadamente 30 min, y se sumergieron completamente y se superfundieron continuamente con aCSF caliente y gaseado. Se agregaron medicamentos al aCSF desde soluciones madre para obtener concentraciones conocidas en el superfusato. En las tasas de superfusión 2-4 mL / min utilizadas, las concentraciones de fármaco alcanzan el 90% de la concentración del reservorio dentro de 2 min.

Electrofisiología.

Registramos el núcleo central de las neuronas de la amígdala con micropipetas afiladas utilizando el modo de pinza de tensión o corriente discontinua. Mantuvimos la mayoría de las neuronas cerca de su potencial de membrana en reposo. Los datos se adquirieron con un preamplificador y se almacenaron para un análisis posterior utilizando el software pClamp. GABA farmacológicamente aisladaA Potenciales postsinápticos inhibidores mediados por receptores (GABAA-IPSPs) se evocaron mediante la estimulación local dentro del núcleo central de la amígdala a través de un electrodo de estimulación bipolar mientras se superfunden los bloqueadores del receptor de glutamato CNQX y APV y GABAB receptor bloqueador CGP 55845A. Para determinar los parámetros de respuesta para cada celda, realizamos un protocolo de entrada-salida. Se aplicó un rango de corrientes, comenzando en el umbral de corriente requerido para obtener un IPSP hasta el voltaje requerido para obtener la amplitud máxima. Normalizamos tres intensidades de estímulo de pasos iguales (umbral, medio máximo y máximo) como 1 – 3 ×. Los pasos de corriente de hiperpolarización y despolarización (incrementos de 200-pA, duración de 750-ms) también se aplicaron para generar curvas de voltaje-corriente (VI). Cuantificamos las amplitudes de IPSP evocadas y las respuestas de VI mediante el uso del software Clampfit. Todas las medidas fueron tomadas antes de la superfusión con el CRF selectivo.1 antagonista del receptor R121919 (1 μM), durante su superfusión (20 min), y después del lavado (30 min). Para más detalles, ver el Texto SI.

Estadísticas.

Las comparaciones de grupo utilizaron Student's t-pruebas (comparaciones de dos grupos) o análisis de varianza (ANOVA) (al menos comparaciones de tres grupos), esta última interpretada por un simple análisis de efectos principales o comparaciones de Newman-Keuls después de efectos omnibus significativos (P <0.05). Los datos del experimento de alimentación se analizaron mediante ANOVA mixtos de tres vías con el programa de dieta como factor inter-sujetos y la dosis y fase de dieta como factores intra-sujetos. Los datos del experimento de laberinto en cruz elevado se analizaron mediante ANOVA de dos vías con el programa de dieta y la dosis como factores entre sujetos. Para el programa de proporción progresiva del experimento de refuerzo, el punto de ruptura y las respuestas totales se analizaron mediante ANOVA mixtos bidireccionales con el programa de dieta como factor entre sujetos y la dosis como factor intra-sujetos. El curso temporal de la respuesta durante los primeros 5 minutos se analizó mediante ANOVA mixtos de tres vías con el programa de dieta como factor entre sujetos y la dosis y el tiempo como factores intraindividuales. Los datos de los estudios electrofisiológicos se analizaron con un ANOVA inter-sujetos o un ANOVA intra-sujetos con medidas repetidas, según fuera apropiado. Los datos del RIA de corticosterona se analizaron mediante ANOVA mixto bidireccional con Diet Schedule como factor inter-sujetos y Diet Phase como factor intra-sujeto. Los paquetes estadísticos utilizados fueron Instat 3.0, Prism 4.0 (GraphPad), Systat 11.0 y SPSS 11.5 (SPSS).

 

Material suplementario

Información de soporte: 

Expresiones de gratitud.

Agradecemos a Mike Arends por la asistencia editorial, a Mary Gichuhi por la asistencia administrativa, ya Bob Lintz, a Jeanette Helfers, a Stephanie Dela Cruz, ya Molly Brennan por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales DK70118, DK26741 y P30DK56336; Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas DA023680; Instituto Nacional de Abuso de Alcohol y Becas de Alcoholismo AA016731 y AA015566; Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Donación de Accidentes Cerebrovasculares IT32NS061847-01A2; Instituto Nacional de Envejecimiento Beca AG028040; Subvención del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre HL088083; la Fundación Médica Ellison; y el Centro Pearson para la Investigación de Alcoholismo y Adicciones. Una parte de este trabajo fue apoyada por los Programas de Investigación Intramural del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas y el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo. Este es el número del manuscrito 19807 del Instituto de Investigación Scripps.

Notas a pie de página

 

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

 

 

Este artículo es un envío directo PNAS.

 

 

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Referencias

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