PLoS One. 2011; 6 (9) : e24992.
Albino J. Oliveira-Maia,1,*¤a¤b Craig D. Roberts,1 P. David Walker,2 Brooke Luo,1 Cynthia Kuhn,2 Sidney A. Simon,1,3,5 y Miguel AL Nicolelis1,3,4,5,6
Resumen
El consumo de azúcares que contienen calorías provoca respuestas conductuales apetitivas y liberación de dopamina en el estriado ventral, incluso en ausencia de maquinaria de transducción del sabor dulce. Sin embargo, no está claro si dichos efectos posingestivos relacionados con la recompensa reflejan eventos preabsortivos o posabsortivos. En apoyo de la importancia de la detección de glucosa posabsortiva, encontramos que, en pruebas de comportamiento en ratas, soluciones de glucosa de alta concentración administradas en la vena yugular fueron suficientes para condicionar un sesgo lateral. Además, una solución de glucosa de menor concentración condicionó respuestas conductuales robustas cuando se administró en la vena hepático-portal, pero no en la yugular. Además, la administración entérica de glucosa a una concentración suficiente para provocar el condicionamiento conductual resultó en un perfil glucémico similar al observado después de la administración de la solución de glucosa de baja concentración en la vena hepático-portal, pero no en la yugular. Finalmente, mediante voltamperometría cíclica de barrido rápido, observamos que, de acuerdo con los hallazgos conductuales, una solución de glucosa de baja concentración provocó un aumento en la liberación espontánea de dopamina en el núcleo accumbens al administrarse en la vena hepático-portal, pero no en la yugular. Estos hallazgos demuestran que los efectos posabsortivos de la glucosa son suficientes para las respuestas conductuales posingestivas y las respuestas dopaminérgicas de recompensa derivadas del consumo de azúcar. Además, los niveles de glucemia en el sistema venoso hepático-portal contribuyen de forma más significativa a este efecto que la glucemia sistémica, lo que sugiere la participación de un sensor visceral intraabdominal para la glucosa.
Introducción
Las consecuencias positivas postingestivas del consumo de alimentos son un determinante crítico del comportamiento alimentario [1] . De hecho, recientemente encontramos que en un paradigma conductual de dos botellas, incluso en animales en los que las vías de transducción del sabor dulce están ausentes, el consumo oral de sacarosa (un sacárido que contiene calorías), pero no de sucralosa (un edulcorante artificial no calórico), fue suficiente para el condicionamiento de preferencias laterales robustas [2] . Además, cuando dichos animales ingirieron sacarosa, se encontraron aumentos de liberación de dopamina y activación neuronal en el núcleo accumbens (NAcc). La estimulación dependiente postingestiva del sistema dopaminérgico también se ha sugerido en un estudio de imágenes funcionales en humanos, en el que se presentaron sucralosa y sacarosa en concentraciones emparejadas de intensidad de sabor, y solo esta última activó áreas dopaminérgicas del mesencéfalo [3] . La relevancia de la activación dopaminérgica para el aprendizaje dependiente post-ingestivo se ha confirmado en experimentos realizados en ratas, en los que el antagonismo del receptor de dopamina en el NAcc inhibió el desarrollo de asociaciones entre sabores no calóricos y glucosa inyectada directamente en el duodeno [4].
En cuanto a los mecanismos que conducen a los efectos de recompensa conductual de la estimulación post-ingestiva por azúcares como la sacarosa, los datos disponibles no son del todo consistentes. Un estudio ha indicado que se requiere la estimulación directa de la mucosa intestinal [5] , mientras que otros demostraron la importancia de los efectos post-absortivos mediante la inyección intravenosa de nutrientes [6] , [7] . Más recientemente, también se ha sugerido que, independientemente del gusto, la utilización de glucosa tisular es necesaria para que el consumo de glucosa provoque la liberación de dopamina en el estriado [8] . En cualquier caso, las vías de señalización post-ingestiva que conducen al condicionamiento conductual y a la liberación de dopamina siguen siendo objeto de controversia.
Aquí estábamos interesados en aclarar la participación de los mecanismos preabsortivos y postabsortivos en los efectos relacionados con la recompensa de un azúcar que contiene calorías, independientemente de su sabor. Para tal efecto, utilizamos ratas para probar las respuestas conductuales y dopaminérgicas a la administración intravenosa de glucosa en la vena yugular (YV) y la vena porta hepática (HPV). Inicialmente probamos si varias concentraciones diferentes de glucosa (5%, 22.5% y 50%), administradas en la YV, eran suficientes para condicionar un sesgo lateral en una prueba de preferencia de dos botellas. En este experimento, la sacarina se utilizó como control para la estimulación gustativa intravascular potencial. En otro experimento, dados los efectos glucémicos de los diferentes estímulos de glucosa administrados en la YV, los efectos de la glucosa al 5% administrada en la HPV se probaron en el mismo paradigma conductual. En ese experimento, el manitol se utilizó como control para los efectos osmóticos. Posteriormente, se midieron simultáneamente los efectos glucémicos de los diferentes estímulos de glucosa utilizados en estos experimentos en la sangre de la cola y del VPH, para evaluar la relevancia de los cambios en cada una de estas localizaciones para los efectos conductuales observados previamente. Finalmente, mediante voltamperometría cíclica, se midió la frecuencia transitoria de dopamina en el NAcc y se evaluaron los efectos de la infusión de una solución de glucosa al 5% en el VPH y la vena yugular.
Resultados
Para aclarar la participación de los mecanismos mucosos (intestinales) vs. postabsortivos en el condicionamiento independiente del gusto por efectos postingestivos en ratas, realizamos experimentos para probar la reversión del sesgo lateral en un paradigma conductual de dos botellas [2] . Brevemente, los animales fueron probados para el sesgo lateral en una prueba de dos botellas de agua vs. agua bajo agua y restricción leve de alimento. Para condicionar la reversión del sesgo lateral, los animales fueron expuestos luego a un protocolo de condicionamiento de 4 días con libre acceso al agua dado diariamente en lados alternos de la caja conductual. En los 2 días en que los animales fueron expuestos al lado opuesto al sesgo original, se administraron 3 ml de solución de glucosa simultáneamente al consumo de agua y contingente al comportamiento de lamido (3 µl/lamido para los primeros 1000 lamidos de agua). En los 2 días restantes, cuando los animales fueron expuestos al lado del sesgo original, se administró vehículo bajo las mismas condiciones. En algunos animales, previamente implantados con catéteres vasculares, se administraron estímulos condicionantes (glucosa o vehículo) por vía intravenosa, mientras que en otros se administraron por vía oral a través de una cánula independiente en el tubo de succión utilizado para la administración de agua (véase Métodos). En el último día de prueba, se evaluó la reversión del sesgo lateral en todos los animales mediante una prueba de dos botellas de agua contra agua (véanse los métodos y la Tabla 1 para más detalles).
Se condicionaron dos grupos de animales utilizando 5% (n
=6) o 15% (n=5) Soluciones de glucosa administradas por vía oral. En general, los animales de estos grupos presentaron niveles de consumo más altos durante las sesiones de acondicionamiento con vehículo que durante las sesiones de glucosa, lo que podría deberse a los efectos saciantes de la administración de glucosa o a la alta privación de agua.Figura S1ALa inversión del sesgo lateral se evaluó comparando la preferencia por el lado opuesto al sesgo original de cada animal en sesiones de dos botellas antes y después del condicionamiento. Se encontraron efectos significativos para el estímulo de condicionamiento (5% vs. 15%, F=9.3, p=0.014) y sesión de prueba (pre vs. post-acondicionamiento, F=7.9, p=0.021) y una interacción cercana a la significativa entre los dos factores (F=4.2, p=0.071; ANOVA de dos vías de medidas repetidas). Sin embargo, solo se observaron aumentos significativos en la preferencia por el lado asociado con la administración de glucosa antes y después del condicionamiento en los animales condicionados con glucosa al 15 % (0.11 ± 0.06 frente a 0.8 ± 0.2, t=3.3, p<0.05), pero no aquellos acondicionados con glucosa al 5% (0.07±0.04 vs. 0.18±0.15, t=0.6, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc; Fig. 1A).
Utilizando el mismo protocolo de comportamiento, probamos los efectos de las infusiones de JV de bajo (5%, n=10), intermedio (22.5%, n=7) y alta (50%, n=11) Soluciones de glucosa. Sacarina sódica (NaSacc; 3.16%), que previamente se ha demostrado que es la concentración óptima para la estimulación intravascular del sabor dulce. [ 9 ]) se utilizó como control para la posible estimulación intravascular del gusto (n=5). De manera similar a lo encontrado en animales condicionados oralmente, en general, estas ratas tuvieron niveles de consumo más altos durante las sesiones de acondicionamiento con vehículo que durante las sesiones de glucosa o sacarina (Figura S1B). En cuanto a la inversión del sesgo lateral, encontramos efectos significativos para el estímulo condicionante (glucosa baja vs. intermedia vs. alta vs. NaSacc, F=7.8, p<0.001), sesión de prueba (pre vs. post-acondicionamiento, F=45.3, p<0.001) y la interacción entre estos factores (F=15.8, p<0.001; ANOVA de dos vías de medidas repetidas). Se encontró una inversión del sesgo lateral en los animales condicionados con infusiones de YV del 22.5% (0.18 ± 0.05 frente a 0.63 ± 0.10, t=4.7, p<0.001) y 50% de glucosa (0.13±0.05 frente a 0.82±0.07, t=9.1, p<0.001), pero no aquellos acondicionados con glucosa al 5% (0.14±0.05 vs. 0.12±0.05, t=0.3, p>0.05) o NaSacc (0.19±0.09 frente a 0.3±0.19, t=1, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc; Fig. 1B). En resumen, si bien las dos soluciones de glucosa de mayor concentración dieron como resultado una inversión del sesgo lateral, no se encontró ningún efecto para NaSacc, eliminando así el gusto intravascular como señal para estos cambios de comportamiento.
Para entender mejor el impacto glucémico de los diferentes estímulos de glucosa, a grupos separados de animales se les permitió acceso libre al agua en sesiones de comportamiento de 10 minutos de duración, mientras que 3 ml de cada una de las soluciones de glucosa utilizadas para el acondicionamiento se administraron simultáneamente al consumo de agua y dependiendo del lamido (3 µL/lamido durante los primeros 1000 lamidos de agua; 5 % oral, n=3; 15% oral, n=4; 5% JV, n=6; 22.5% JV, n=4; 50% JV, n=6) Se midió la glucemia en la sangre de la cola antes (valor basal) y en varios momentos después de la administración de glucosa (0′-40′). Con excepción de la glucosa oral al 5%, todos los estímulos provocaron un aumento significativo de la glucemia periférica (Fig. 2A, consulte nuestra página, Tabla S1 (para datos). Este efecto también se verificó para la glucosa al 5% en JV, que no condicionó la inversión del sesgo lateral, lo que demuestra que la elevación de la glucemia periférica es insuficiente para inducir cambios en el sesgo lateral. Para aclarar aún más el perfil glucémico de cada estímulo, se analizaron las medidas absolutas (mg/dL) y relativas (% basal) de la glucemia en términos de la glucemia media y máxima. En los animales a los que se administró glucosa por vía oral, no se encontraron diferencias en la glucemia relativa máxima (% basal) tras la exposición al 5% y al 15% de glucosa (117 ± 8 frente a 131 ± 9, respectivamente, t=1.1, p=0.33, prueba t no pareada; Fig. 2B). Cuando se comparó la glucemia después de una administración oral de glucosa al 15%, que fue eficaz para condicionar la reversión del sesgo lateral, con la resultante de la administración de glucosa por vía oral, se encontró un efecto principal significativo (F=37.7, p<0.0001, ANOVA unidireccional). Las comparaciones por pares revelaron diferencias con respecto a JV 22.5% (428±34, t=5.8, p<0.001) y 50% de glucosa (536±48, t=8.6, p<0.001), pero no en relación con la glucosa al 5% (170±10, t=0.8, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc; Fig. 2C). Se encontraron resultados similares para la glucemia absoluta máxima y media (Figuras S2A, B, D y E) y la glucemia relativa media (Figuras S3A y B).
Nuestros hallazgos sugieren que, si bien la glucosa intravenosa fue suficiente para condicionar la inversión del sesgo lateral en una prueba de dos botellas de agua vs. agua, esto solo fue posible cuando se indujeron niveles de glucemia mucho más altos que los resultantes de la glucosa oral. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la hiperglucemia sistémica por la administración de glucosa en la yema de huevo era necesaria para activar un sensor periférico que se activa tras la administración de glucosa gastrointestinal. TEl sistema HPV tiene una ubicación óptima para dicho sensor, ya que transporta la mayor parte de la sangre rica en nutrientes desde el sistema gastrointestinal, antes de que se libere a la circulación sistémica.Para probar esta hipótesis, se realizó el mismo protocolo de acondicionamiento con glucosa al 5% administrada a través de catéteres HPV (n=10), en lugar de por vía oral o a través de la yema. Como control osmótico, se añadió otro monosacárido (de sabor dulce) (5 % de manitol). [ 10 ]) se aplicó como estímulo condicionante en un grupo alternativo de animales (n=5 Figura S1CEn este experimento, no se encontraron diferencias en el consumo durante las sesiones de acondicionamiento con vehículo, glucosa o manitol. Más bien, los animales condicionados con glucosa presentaron niveles de consumo general más altos que los condicionados con manitol.Figura S1C). Al considerar los efectos conductuales en otras sesiones de condicionamiento (Figuras S1A y S1B) Esto sugiere que, en estas condiciones, el manitol produjo un efecto aversivo contextual que se generalizó a las sesiones con vehículo. En cuanto a la inversión del sesgo lateral, se encontraron efectos significativos para el estímulo condicionante (glucosa frente a manitol, F=10.2, p=0.007), sesión de prueba (pre vs. post-acondicionamiento, F=5.2, p=0.04) y la interacción entre estos factores (F=9.5, p=0.009; ANOVA de dos vías de medidas repetidas). Además, en apoyo de nuestra hipótesis, se encontró un aumento significativo en la preferencia pre y postcondicionamiento por el lado asociado con la glucosa (0.17 ± 0.05 frente a 0.69 ± 0.12, t=4.7, p<0.001), pero no la infusión de manitol durante el acondicionamiento (0.14±0.04 frente a 0.06±0.06, t=0.5, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc, Fig. 3A). Por lo tanto, la glucosa al 5% fue eficaz para condicionar la inversión del sesgo lateral cuando se administró en el grupo de VPH (Fig. 3A), pero no la empresa conjunta (Fig. 1B). Esta variación en los efectos conductuales de la glucosa al 5% no resultó de diferencias en la glucemia sistémica según el sitio de administración, ya que la glucemia sanguínea máxima de la cola (% basal) después de la administración de HPV (171 ± 13) y JV (Fig. 1D) no fueron significativamente diferentes (t=0.07, p=0.9, prueba t no pareada; Fig. 3B; ver tabla S1 para los datos). Tampoco se encontraron diferencias en la glucemia absoluta máxima y media (Figuras S2C y F) y la glucemia relativa media (Figura S3D).
En general, estos hallazgos indican firmemente que un aumento de la glucemia por VPH, más que la glucemia sistémica, es un estímulo crítico que provoca una inversión del sesgo lateral independiente del gusto. Para comprobar mejor esta hipótesis, se inyectó a grupos separados de animales anestesiados el vehículo o las diferentes soluciones de glucosa utilizadas para el acondicionamiento, mediante catéteres insertados en el duodeno (agua, n=5; 5% glucosa, n=4; 15% glucosa, n=6), JV (solución salina, n=5; 5% glucosa, n=6; 22.5% glucosa, n=4; 50% glucosa, n=4) o VPH (solución salina, n=4; 5% glucosa, n=7). Se midió la glucemia de la cola y de la sangre del VPH al inicio (línea base) y al final (0’) de la perfusión de estímulo, y posteriormente cada 10 minutos (10’–50’). Los datos brutos se analizaron por separado para las inyecciones de vehículo y glucosa, y para la glucemia de la cola y de la sangre del VPH ( , consulte nuestra página, Tabla S2 para los datos). Como se explica para la glucemia en animales despiertos, se compararon los valores máximos y medios de glucemia (véanse los datos en Tablas S3 y S4). Para la glucemia relativa máxima (% del valor inicial), se encontró una interacción significativa entre el estímulo (JV vs. HPV vs. glucosa duodenal al 5% vs. glucosa duodenal al 15% vs. glucosa JV al 22.5% vs. glucosa JV al 50% vs. vehículo) y el sitio de muestreo de sangre (cola vs. HPV; F=11.4, p<0.001), lo que permite realizar análisis separados de la glucemia de la cola y del VPH (véase Tabla S4 para más detalles). En cualquier caso, la glucemia después de JV 5% de glucosa, considerada como un estímulo de control que no condicionó la inversión del sesgo lateral (ver Fig. 1B), se comparó con la observada después de los estímulos restantes. Fo las mediciones de sangre de la cola, solo JV 22.5% y 50% de glucosa y vehículo, pero no HPV 5% y duodenal 5% y 15% de glucosa, difirieron significativamente de JV 5% de glucosa (Fig. 4C). Sin embargo, para las mediciones de sangre del VPH, la glucosa duodenal al 5%, el único otro estímulo de glucosa que no condicionó la inversión del sesgo lateral (ver Fig. 1A), también fue el único estímulo que no difirió significativamente de la glucosa al 5% JV (Fig. 4D). Por lo tanto, de acuerdo con nuestros hallazgos previos, el VPH, pero no la glucemia sistémica, medida en ratas anestesiadas, refleja con precisión la inversión del sesgo lateral observada tras el condicionamiento en animales despiertos. Esta similitud entre los efectos conductuales y la respuesta glucémica máxima del VPH no se observó para la glucemia media (Tabla S4), lo que sugiere que los efectos conductuales relevantes de la administración de glucosa se deben a niveles episódicos altos de glucemia, más que a cambios sostenidos en la misma. Se obtuvieron resultados similares al comparar los niveles absolutos de glucemia (mg/dl). (Tabla S3).
Estudios previos han demostrado que la liberación de dopamina puede ser provocada en el núcleo accumbens, en respuesta al suministro gastrointestinal de azúcares, independientemente de su sabor. [ 2 ], [ 4 ], [ 11 ]. Por lo tanto, nos interesaba comprender si la liberación de dopamina en esta área se vería afectada de manera diferente por la administración de glucosa al 5% por parte de JV frente a HPV. FSe utilizó voltamperometría cíclica ast-scan para identificar eventos de liberación espontánea de dopamina o “transitorios”. [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ] en la cubierta del núcleo accumbens de ratas anestesiadas (n=12) (ver métodos). Tras obtener registros basales durante 6 a 8 minutos, se infundió glucosa al 5 % en la vena yugular (VJ) a las ratas o glucosa al 5 % o vehículo en la vena papiloma humano (VPH). La frecuencia transitoria basal (3.4 ± 0.7 transitorios/min), la duración (520 ± 68 ms) y la amplitud (30 ± 3 nM) fueron similares a las descritas en animales despiertos. [ 12 ], [ 14 ], [ 15 ] (consulta: Figs. 5A y B Para registros representativos). Además, una vez medidos los cambios inducidos por la glucosa, se administró cocaína (15 mg/kg) a todos los animales para demostrar los efectos de la inhibición de la recaptación de dopamina en estas condiciones. Se observó que la cocaína aumentó la frecuencia y la duración de los transitorios, sin afectar la amplitud (Fig. S5).
Con respecto a los cambios en la frecuencia transitoria después de la administración de glucosa, el ANOVA de dos vías de medidas repetidas reveló un efecto principal significativo para el tiempo (línea base vs. 1–5 min vs. 6–10 min vs. 11–15 min vs. 16–20 min; F=2.7, p=0.044) pero no para el grupo de tratamiento (glucosa JV frente a glucosa HPV frente a solución salina HPV; F=1.6, p=0.26) y una interacción significativa entre factores (F=2.4, p=0.036, Fig. 5CDada la interacción significativa entre los factores, se realizaron comparaciones adicionales del efecto del tiempo por separado para cada grupo de tratamiento. Para los grupos de solución salina para VPH y glucosa para VJ, el efecto del tiempo no fue significativo (F=0.5, p=0.75 y F=0.61, p=0.66 respectivamente) y la comparación en cada período de tiempo con respecto al valor basal respectivo tampoco fue significativa (t < 1.1 y t < 1.5 respectivamente, p > 0.05 para todos). Sin embargo, para el grupo de glucosa en el VPH, se encontró un efecto significativo del tiempo (F=3.9, p=0.031; ANOVA unidireccional de medidas repetidas) y, en comparación con el valor inicial, la frecuencia transitoria fue mayor durante los primeros 5 minutos después del inicio de la infusión (t=3, p<0.05) pero no en los períodos de tiempo restantes (t<1.7, p>0.05 para todos; pruebas t de Bonferroni post-hoc; ver Tabla S5 para más detalles). No se encontraron efectos para el tiempo, el grupo de tratamiento ni su interacción con respecto a la duración o amplitud transitoria (Fig. S4). En estos animales, también se determinó la glucemia en la sangre de la cola antes y 20 minutos después del inicio de las infusiones de JV o HPV, lo que muestra, como se esperaba, que las diferencias observadas en la frecuencia transitoria después de la infusión de glucosa no se deben a diferencias en la glucemia sistémica (Fig. 5D). Así, de acuerdo con los datos de comportamiento y glucemia presentados, a una concentración más baja (5%), la glucosa aumentó significativamente la frecuencia transitoria de dopamina cuando se infundió en el VPH, pero no en el YV.
Discusión
En este estudio demostramos que los mecanismos postabsortivos participan en los efectos conductuales y dopaminérgicos relacionados con la recompensa de la glucosa, independientemente de los aspectos hedónicamente positivos de su sabor. Primero encontramos que, en ratas, las soluciones de glucosa de alta concentración administradas en el JV fueron suficientes para condicionar un sesgo lateral ( Fig. 1B ). Sin embargo, esto solo fue posible en concentraciones de glucosa que resultaron en una glucemia mucho mayor que la resultante del consumo oral de glucosa, en concentraciones que también fueron suficientes para condicionar sesgos laterales ( Fig. 2 ). Para aclarar esta inconsistencia, se realizaron experimentos adicionales para comparar los efectos de la glucosa administrada en el JV y el HPV, ya que este último es el primer sitio de acumulación de glucosa después de la absorción en el intestino [16] . En este sentido, encontramos que, a una concentración más baja, las soluciones de glucosa condicionaron sesgos laterales robustos cuando se administraron en el HPV, pero no en el JV ( Fig. 3A ). En apoyo de este hallazgo, la administración entérica de glucosa a una concentración suficiente para provocar condicionamiento conductual ( Fig. 1A ) resultó en un perfil glucémico similar al observado después de la administración de la solución de glucosa de baja concentración en el HPV, pero no en el JV ( Fig. 4 ). Finalmente, la administración de una solución de glucosa de baja concentración en el HPV, pero no en el JV, causó un aumento en la frecuencia de transitorios de dopamina en la corteza del núcleo accumbens, según lo medido por voltametría cíclica de barrido rápido ( Fig. 5 ). En general, estos hallazgos respaldan que los efectos postabsortivos de la glucosa son suficientes para las respuestas conductuales postingestivas y relacionadas con la recompensa dopaminérgica que resultan del consumo de azúcar, y los niveles de glucemia en el sistema HPV contribuyen de manera más significativa a este efecto que la glucemia sistémica.
La participación diferencial de los factores orales y postingestivos en el control de la conducta alimentaria ha sido bien caracterizada. [ 1 ]Los controles postingestivos de la ingesta de alimentos se reconocieron principalmente como influencias inhibitorias (es decir, la saciedad), pero se dedicó menos investigación a los efectos postingestivos positivos de la ingesta de alimentos. [ 17 ]Si bien varios autores tempranos demostraron que la inyección intragástrica de nutrientes puede servir como un reforzador conductual adecuado [ 18 ], [ 19 ]Este hallazgo fue controvertido y se atribuyó a fugas en el sistema de canulación gástrica. [ 1 ], [ 20 ]De hecho, la mayoría de los autores desarrollaron trabajos que demuestran que los nutrientes inyectados directamente en el estómago condicionarán la preferencia por un sabor asociado. [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], y sólo recientemente descubrimos que, en ratones sin transducción funcional del sabor dulce en las células receptoras del gusto, el consumo oral de sacarosa fue suficiente para el condicionamiento de preferencias laterales robustas, independientemente de cualquier señal oral. [ 2 ]. Aquí, el procedimiento conductual desarrollado previamente en ratones [ 2 ] Se adaptó para su uso en ratas y demostramos que podía usarse para medir el condicionamiento conductual resultante del consumo entérico de glucosa (Fig. 1A).
Aunque la literatura sobre controles postingestivos positivos de la ingesta de alimentos tiene ya casi 60 años, las señales periféricas subyacentes a estos efectos, en particular las de la glucosa, siguen siendo controvertidas [5] . Los experimentos con administración parenteral de soluciones de glucosa en ratas o conejos, para probar sus efectos como señal para el condicionamiento postingestivo positivo, han tenido resultados tanto positivos [7] , [26] , [27] , [28] , [29] como negativos [30] , [31] , [32] . Aquí hemos demostrado un efecto dosis-respuesta en la capacidad de la glucosa para condicionar el comportamiento, cuando se administra en el JV ( Fig. 1B ). Estos resultados proporcionan una explicación razonable para las discrepancias previas con la administración de glucosa en el JV, ya que se habían obtenido hallazgos positivos con concentraciones más altas de glucosa (30%) [7] que las utilizadas en experimentos con resultados negativos (10%) [31] , [32].
En ratas, el HPV se propuso previamente como un sitio importante para la detección de señales postabsortivas que apoyan el condicionamiento postingestivo apetitivo [6] . En un estudio posterior realizado en ratas privadas de alimento, no se encontró que las inyecciones de glucosa en el HPV condicionaran las preferencias de sabor, lo que llevó a la propuesta de que la estimulación intestinal por nutrientes es necesaria para que las infusiones en el HPV condicionen el comportamiento [5] . Aquí encontramos que, incluso en ratas privadas de alimento, la infusión de glucosa en el HPV fue suficiente para condicionar un sesgo lateral ( Fig. 3A ). En comparación con los experimentos negativos mencionados anteriormente [5] , estos resultados no pueden explicarse por el uso de concentraciones de glucosa más altas (5% usado aquí frente a su 10%), sino que pueden ser consecuencia de diferencias en la velocidad de infusión (no menos de 0.3 mL/min aquí frente a 0.083 mL/min). Además, de acuerdo con hallazgos previos [6] , la infusión de la misma concentración de glucosa en el JV no tuvo tales efectos ( Fig. 1B ). Por lo tanto, si bien nuestros datos no pueden excluir la importancia de la estimulación intestinal de nutrientes para el condicionamiento post-ingestivo apetitivo, muestran claramente que no es necesaria y que los factores post-absortivos, que actúan periféricamente en el sistema HPV, son suficientes para tales efectos conductuales.
Es importante tener en cuenta que la glucosa y otros nutrientes presentes en el intestino serán absorbidos, lo que resultará en un mayor aumento en los niveles de nutrientes en sangre en el VPH que en la circulación sistémica. [ 16 ]Este efecto presumiblemente será aditivo al de la inyección de nutrientes en el VPH, lo que presenta una explicación razonable para la asociación previamente observada entre la presencia de nutrientes en el intestino y la capacidad de las infusiones de VPH para condicionar el comportamiento. [ 5 ], [ 6 ]Por lo tanto, al comparar los efectos conductuales de las infusiones de nutrientes entéricos, de virus de la víscera derecha (VJ) y/o de virus del papiloma humano (VPH), es importante medir directamente los niveles de nutrientes en sangre resultantes de estas infusiones. Sin embargo, solo unos pocos estudios que investigan los efectos positivos de la administración intravenosa de glucosa han incluido mediciones de glucemia sistémica, con resultados dispares. [ 27 ], [ 31 ], [ 33 ], y ninguno incluyó estas mediciones en sangre de VPH. Aquí demostramos, tanto en ratas despiertas como anestesiadas, que las mediciones de glucemia en sangre de la cola no explicaron por completo los efectos conductuales diferenciales de las infusiones de glucosa entérica, de VJ y de VPH.Figs. 2, ,3B,3B, 4A, 4C, S2 y S3; Tablas S1, S2, S3 y S4). Sin embargo, cuando se realizaron mediciones en la sangre de VPH de animales anestesiados, se encontró que la glucemia máxima era un buen correlato de la capacidad de las soluciones de glucosa para condicionar los sesgos secundarios (Figuras 4B y 4D; Tablas S2, S3 y S4Esto no se aplicó a la glucemia media, lo que refleja que la inyección intravenosa de glucosa no produjo un perfil glucémico completamente fisiológico, y también sugiere que los efectos conductuales observados de la administración de glucosa dependían más de los niveles más altos de glucemia que de las elevaciones sostenidas de la misma. En cualquier caso, estos hallazgos respaldan la importancia de la carga de glucosa posabsortiva en el VPH para el condicionamiento apetitivo posingestivo, mostrando, de manera importante, que esto es cierto incluso cuando los nutrientes se administran en el intestino, en lugar de directamente en el VJ o el VPH.
También se han realizado experimentos para investigar los efectos negativos (es decir, saciantes) de los nutrientes inyectados en el HPV en varias especies. Como se describe para el condicionamiento positivo, se han observado resultados inconsistentes (véanse las revisiones en [6] y [34] ). La razón de estas diferencias se ha atribuido a diversos factores, como el estado nutricional del animal, el protocolo de infusión del HPV y los diferentes paradigmas de prueba [34] . De hecho, es probable que la mayoría de estos factores influyan en el nivel de nutrientes en el HPV, lo que sugiere que este factor podría ser la base de los efectos saciantes de las infusiones intravenosas de nutrientes, como se describe aquí para el condicionamiento conductual positivo.
En los experimentos de comportamiento con infusiones de glucosa en la JV o HPV, también se utilizaron soluciones de control para diferenciar entre los efectos debidos al carácter nutricional de la glucosa y los que podrían resultar de la estimulación del gusto o de cambios en la osmolalidad. Para los experimentos de infusión en la JV, se utilizó una solución de sacarina sódica, a una concentración que previamente se demostró que era óptima para la estimulación intravascular del gusto dulce [9] . Para las infusiones en la HPV, se utilizó manitol ya que, a concentraciones iguales a la glucosa, este monosacárido de sabor dulce causa cambios similares en la osmolalidad plasmática, pero tiene efectos metabólicos mínimos [10] . A diferencia de la glucosa, tanto la sacarina como el manitol no condicionaron cambios de sesgo lateral después de la infusión en la JV o HPV respectivamente, eliminando el gusto y la osmolalidad plasmática como el mecanismo subyacente a esos efectos de comportamiento ( Figs. 1B y 3A ). Estos controles importantes respaldaron nuestros hallazgos previos de condicionamiento conductual independiente del gusto con sacarosa en ratones [2] , y también los primeros informes de condicionamiento instrumental y de preferencia de lugar resultantes de la administración intragástrica e intravenosa de nutrientes, en ausencia de señales orosensoriales u olfativas [18] , [19] , [26] , [27].
El papel de la dopamina en la mediación de las características apetitivas de los alimentos ha sido previamente bien establecido. [ 35 ]La elevación de los niveles de dopamina en el núcleo accumbens (NAcc) se produce tras el consumo de azúcares que contienen calorías, como la sacarosa. [ 36 ], [ 37 ], y se ha demostrado que tanto el sabor dulce como la estimulación postingestiva son suficientes para este efecto. [ 2 ], [ 38 ], [ 39 ]Sin embargo, los mecanismos postingestivos que conducen a la liberación de dopamina en el NAcc tras el consumo de azúcares siguen sin estar claros. En apoyo de la importancia de la estimulación preabsortiva, se ha demostrado que la hormona intestinal grelina estimula la liberación de dopamina en el mesoaccumbens. [ 40 ]También se ha presentado evidencia de controles posabsortivos de la liberación de dopamina estriatal, pero los hallazgos informados son algo equívocos. [ 8 ], [ 41 ], [ 42 ]Es importante destacar que los efectos de la glucemia en la homeostasis de la dopamina estriatal se han atribuido a las neuronas glucosadoras del cerebro. [ 41 ], en particular porque se ha descubierto que se producen aumentos en los niveles de dopamina en el cuerpo estriado dorsal cuando se infunde glucosa directamente en la sustancia negra. [ 43 ]Aquí, utilizando voltamperometría cíclica, encontramos que la infusión de glucosa al 5 % en el VPH, pero no en el YV, resultó en un aumento de los eventos transitorios de dopamina (Figuras 5A–C), provocando al mismo tiempo un aumento similar y fisiológicamente relevante de la glucemia periférica en ambos casos (Higos. 3B, 4A, 4C y y5D).5DEste hallazgo confirma que las señales de glucosa posabsortiva son suficientes para provocar la liberación de dopamina en el NAcc, lo que demuestra también, por primera vez, que estos efectos posabsortivos dependen del aumento de la glucemia en el VPH, y no de la detección directa en el cerebro o de mecanismos alternativos, como el gusto intravascular. Los efectos dopaminérgicos diferenciales de la glucosa al 5% administrada en el VJ y el VPH son particularmente relevantes, dado que son paralelos a los efectos diferenciales de estos tratamientos sobre el comportamiento.Higos. 1B y y3A)3A) y la glucemia por VPH (Figuras 4B y 4D), lo que sugiere que este último puede ser el factor explicativo subyacente de los efectos conductuales y neuroquímicos de la administración de glucosa.
Aunque se han reportado transitorios espontáneos de dopamina en ratas despiertas [ 44 ], [ 45 ], observamos que, hasta donde sabemos, este es el primer informe en ratas anestesiadas (Figuras 5A y 5B). Sin embargo, encontramos que las tres características utilizadas para describir los transitorios (frecuencia, duración y amplitud) son bastante similares a las reportadas en ratas despiertas. [ 14 ], [ 15 ], [ 44 ], [ 46 ], [ 47 ]Además, incluso en ratas anestesiadas, la frecuencia transitoria respondió tanto a la infusión de glucosa en el VPH (Fig. 5C) y a la administración intraperitoneal de cocaína (Figura S5A). Experimentos previos con voltamperometría cíclica habían descrito respuestas dopaminérgicas del NAcc a la sacarosa intraoral. [ 47 ] o sacarina [ 39 ] Infusión. En comparación con estos estudios voltamperométricos previos, informamos aumentos sostenidos en la frecuencia transitoria durante un período de minutos después de la infusión intravenosa de glucosa, en lugar de las respuestas durante unos pocos segundos que ocurren después de la presentación del estímulo oral. [ 46 ], [ 48 ]De manera similar a lo descrito previamente para la nomifensina [ 15 ] y cocaína [ 45 ] administración, también encontramos que la inyección de 15 mg/kg de cocaína provocó un aumento de la frecuencia transitoria de dopamina NAcc (Figura S5A) y duración (Figura S5B). Sin embargo, no encontramos efectos para la amplitud transitoria (Figura S5C). Por lo tanto, los efectos de los psicoestimulantes son similares en ratas despiertas y anestesiadas. Investigar los efectos sobre los transitorios en roedores anestesiados puede ser más apropiado en contextos donde el ambiente y el condicionamiento son factores de confusión indeseados.
El NAcc, donde medimos los transitorios de dopamina, no es una estructura homogénea. Hay dos subdivisiones principales, el núcleo del NAcc y la corteza del NAcc, para las cuales se han reportado diferencias funcionales en el procesamiento de recompensa y la cinética de liberación de dopamina [49] , [50] . Los datos de voltametría reportados aquí fueron medidos con electrodos implantados en la subregión de la corteza. De hecho, los efectos que observamos después de la inyección de cocaína ( Fig. S5A ) están de acuerdo con hallazgos previos, mostrando que la cocaína aumenta la frecuencia transitoria en esta subregión, pero no en el núcleo del NAcc [51] . Se ha propuesto que la transmisión de dopamina dentro de la corteza del NAcc participa en el procesamiento primario de recompensa en respuesta tanto a psicoestimulantes [49] , [51] como a estímulos orales ingestivos [39] , mientras que se cree que la liberación de dopamina en el núcleo del NAcc tiene un papel más específico en la respuesta a señales predictivas de recompensa en el contexto de asociaciones aprendidas [39] , [49] . Ahora demostramos que la infusión de glucosa HPV provoca un aumento de la frecuencia de transitorios de dopamina en la corteza del NAcc, un efecto que, como sugieren los efectos del antagonismo de los receptores de dopamina en la misma área, podría ser relevante para el aprendizaje de la preferencia de sabor inducido por las consecuencias postorales de los carbohidratos [4] . En cualquier caso, se necesita más investigación para explorar la participación del núcleo del NAcc en las respuestas postabsortivas a los azúcares.
Investigaciones anteriores habían sugerido que los mecanismos de detección y transducción de dulces que se encuentran en las células gustativas de la lengua también están presentes en el intestino y son un regulador postingestivo crítico del apetito por los azúcares. [ 52 ]Sin embargo, nosotros y otros hemos demostrado que los edulcorantes no nutritivos también activan estos mecanismos. [ 52 ], no condicionar el lado [ 2 ] o sabor [ 53 ] preferencias. Además, aunque los mecanismos de detección y transducción de sabores son defectuosos, tanto Trpm5 KO [ 2 ] y T1R3 KO [ 53 ] Los ratones desarrollarán preferencias condicionadas por los azúcares nutritivos. Los resultados aquí descritos respaldan que un factor posabsortivo, dependiente de los cambios glucémicos en el VPH, y no de forma sistémica, contribuye a los efectos conductuales positivos y a los efectos dopaminérgicos del NAcc resultantes del consumo de azúcares. Si bien estos resultados contradicen la importancia de un mecanismo preabsortivo, no se puede descartar dicho mecanismo y, de hecho, existe evidencia de que los factores mucosos y posabsortivos podrían cooperar en el condicionamiento posingestivo. [ 5 ]En cualquier caso, la naturaleza de los factores posabsortivos del VPH dependientes de la glucosa aún está por determinar. Una posibilidad es la participación de la insulina, sobre todo porque se ha demostrado que esta hormona es relevante para la respuesta dopaminérgica a la hiperglucemia. [ 41 ]Otro posible mecanismo interviniente es la captación neta de glucosa hepática, ya que depende de los niveles de insulina. [ 54 ] y aumenta cuando se administra glucosa en el VPH, en comparación con la infusión periférica [ 55 ]También se ha demostrado una relación entre el estado energético del hígado, medido en términos de concentración de ATP en los hepatocitos, y la ingesta de alimentos. [ 56 ]En última instancia, estos factores también podrían explicar hallazgos recientes que demuestran que la utilización de glucosa es necesaria para el condicionamiento conductual y los efectos dopaminérgicos del consumo de glucosa. [ 8 ]El mecanismo de transmisión de señales del hígado al cerebro tampoco está claro. Una hipótesis es la transmisión neuronal, posiblemente a través de neuronas aferentes vagales sensibles a la glucosa. [ 57 ]Sin embargo, no se ha demostrado que la lesión de las aferencias neuronales vagales y no vagales abdominales bloquee las preferencias gustativas condicionadas por la administración enteral de polímeros de glucosa. [ 58 ], [ 59 ], [ 60 ]Otra alternativa, que ha sido menos explorada [ 61 ], es que los factores humorales, posiblemente producidos por el hígado y/o el páncreas, se liberan en el torrente sanguíneo y actúan directamente en el cerebro para modular la ingesta de alimentos. [ 62 ].
En resumen, estos hallazgos respaldan la afirmación de que los efectos postabsortivos de la glucosa son suficientes para inducir respuestas conductuales apetitivas hacia el consumo de azúcar, y que los niveles de glucemia en el sistema HPV contribuyen de manera más significativa a este efecto que la glucemia sistémica. Además, estos efectos ocurren independientemente del gusto, la estimulación de la mucosa postingestiva y la osmolalidad plasmática. Asimismo, esta es la primera demostración de que la administración de glucosa en el sistema HPV es suficiente para inducir transitorios de dopamina estriatal, un efecto que podría subyacer a los efectos conductuales positivos de este tratamiento. Dados los drásticos efectos conductuales de la cirugía de derivación gastrointestinal para la reducción de peso [63] , [64] , con posibles efectos sobre los niveles de nutrientes en el sistema HPV, creemos que los mecanismos aquí descritos podrían desempeñar un papel en la etiología y el tratamiento de la obesidad humana, lo que justifica una investigación más profunda y exhaustiva tanto en modelos animales como humanos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (número de protocolo A329-07-12).
Materias
Se obtuvieron ciento cuarenta y cuatro ratas macho Long-Evans y 12 ratas macho Sprague-Dawley de Charles Rivers Laboratories (Raleigh, NC) y se alojaron individualmente en jaulas de plexiglás. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y los experimentos se llevaron a cabo en la fase de luz del ciclo. En el momento de cada experimento, los animales tenían entre 3 y 6 meses de edad y no habían estado expuestos a los estímulos utilizados. Los experimentos preliminares demostraron que, en las condiciones necesarias para realizar experimentos con inyecciones intravenosas, solo se podían obtener tasas de lamido estables cuando el acceso oral al agua se restringía a las sesiones de comportamiento. Por lo tanto, se proporcionó alimento para roedores Purina y agua ad libitum , excepto durante la duración de las pruebas de comportamiento, cuando los animales fueron privados de alimento durante la noche y tuvieron acceso al agua solo durante la tarea de comportamiento. En los experimentos realizados en animales anestesiados, se les restringió el alimento y el agua aproximadamente 24 horas antes del experimento. En aquellos animales cuyo peso corporal descendió por debajo del 85% del valor inicial, se suspendió la restricción de alimentos y agua y los animales fueron excluidos del experimento.
Los estímulos
Todas las soluciones infundidas (d-glucosa – 5%, 15%, 22.5% y 50%; d-manitol – 5%; sacarina sódica – 3.16%) se prepararon diariamente en agua desionizada o NaCl al 0.9% y se mantuvieron a temperatura ambiente. También se utilizó agua desionizada y una solución de NaCl al 0.9%, que se denominan «vehículo». El agua desionizada también se administró por vía oral, al igual que, en otro conjunto de experimentos, soluciones de glucosa al 5% y al 15% preparadas en agua desionizada. La d-glucosa, el d-manitol, la sacarina sódica, el agua desionizada y el NaCl se denominan en el artículo glucosa, manitol, sacarina, agua y solución salina, respectivamente. Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y eran de grado reactivo.
Cateterismo de la vena porta yugular y hepática (VPH)
Se implantaron catéteres de poliuretano (Strategic Applications, Inc., Libertyville, IL) en la vena yugular derecha de 75 ratas y en la vena porta hepática de 35. Algunos animales fueron cateterizados fuera del centro (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), mientras que otros fueron cateterizados internamente mediante el mismo procedimiento. Brevemente, los animales fueron anestesiados con halotano al 5%, seguido de una inyección intraperitoneal o intramuscular de xilazina (5-20 mg/kg) y ketamina (75-100 mg/kg). Se administraron dosis suplementarias cuando fue necesario. Para la cateterización yugular, se realizó una pequeña incisión para exponer la vena yugular derecha. Se ligó el extremo craneal de la vena y se colocó una ligadura suelta caudalmente para aislar una sección de 5 mm del vaso. Para la cateterización portal, se realizó una incisión en la línea media abdominal, se extrajo el ciego y se identificó la vena mesentérica. De manera similar, se ligó el extremo distal de la vena y se colocó una ligadura suelta proximalmente para aislar una sección del vaso. En cualquier caso, se insertó un catéter en una incisión hecha entre las ligaduras y se aseguró en su lugar atando la ligadura suelta alrededor del vaso cateterizado. Luego se realizó una pequeña incisión en la región escapular y el catéter se tunelizó subcutáneamente y se exteriorizó a través de esta incisión. Se probó la permeabilidad y el catéter se llenó con una 'solución de bloqueo' (500 UI/mL de heparina en glucosa al 50%) y se selló con un tapón. Se realizó un bolsillo subcutáneo en la piel craneal y se insertó el exceso de longitud del catéter en el bolsillo. Finalmente, el sitio de la incisión del vaso y la incisión de la piel del área escapular se cerraron con clips para heridas. Se permitió que los animales se recuperaran durante 3 a 5 días después de la cirugía antes de iniciar otros procedimientos experimentales. Antes de estos procedimientos, la solución de bloqueo del catéter fue reemplazada por heparina 50 UI/mL en solución de NaCl al 0.9%, que también se utilizó para mantener la permeabilidad en experimentos de comportamiento que se llevaron a cabo durante varios días.
Configuración del comportamiento
Todas las pruebas de comportamiento se realizaron en cajas de comportamiento de Med Associates (Med Associates Inc., St. Albans, VT), cada una encerrada en una cámara ventilada e insonorizada, como se describió anteriormente [65] . Brevemente, las cámaras estaban equipadas con dos ranuras para tubos bebederos en una de las paredes. El acceso a los tubos bebederos podía bloquearse mediante puertas controladas por computadora y las ranuras estaban equipadas con lamedores de haz utilizados para la detección de lamidos (Med Associates Inc., St. Albans, VT). Cada tubo bebedero contenía dos cánulas de acero inoxidable de calibre 20 que estaban conectadas a columnas de cromatografía de 50 ml (Kontes Flex-Columns; Fisher Scientific, Hampton, NH) donde se encontraban las soluciones de estímulo. Los recipientes de las soluciones estaban ubicados fuera de las cámaras insonorizadas y se mantenían en una posición elevada para promover el flujo del líquido por gravedad. Solenoides controlados por computadora (Parker Hannifin Corporation, Fairfield, NJ) regulaban el flujo de líquido de manera que, dentro de los 10 ms posteriores a la detección de un lamido, una de las válvulas se abría y administraba aproximadamente 3 µL de líquido. Se utilizó una bomba de jeringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT) para permitir la inyección intravascular de soluciones durante las tareas conductuales. La bomba se activaba 10 ms después de detectar un lamido, lo que resultaba en una inyección de aproximadamente 3 µL de la solución contenida en la jeringa conectada a la bomba. De esta manera, la velocidad de infusión se ajustaba a la frecuencia de lamido (aproximadamente 7 Hz) y el volumen de líquido ingerido era aproximadamente igual a la cantidad infundida.
Condicionamiento a los efectos postingestivos
Protocolo general
Para probar si las ratas desarrollan sesgos laterales condicionados por la glucosa en un paradigma de dos botellas, 72 animales fueron expuestos a un protocolo de condicionamiento similar al que usamos previamente en ratones. [ 2 ]Para cada animal, se determinó el sesgo lateral en un 10 minutos de duración Prueba con agua suministrada a ambos lados de la caja de comportamiento (prueba de dos botellas de agua vs. prueba de agua). Una vez establecido un sesgo lateral claro, los animales fueron expuestos durante 4 días a 30 minutos de duración Sesiones de acceso libre al agua, presentadas diariamente en lados alternos de la caja (sesiones de entrenamiento de elección forzada con una botella). El primer y tercer día, se presentó el agua en el lado opuesto al sesgo lateral inicial y se administraron simultáneamente 3 ml de un estímulo de condicionamiento al agua durante las primeras 1000 lamidas (es decir, 1000 × 3 µL).=3 ml). En el segundo y cuarto día, se presentó agua en el sesgo lateral inicial y se administraron simultáneamente 3 ml de vehículo (solución salina o agua, ver detalles a continuación) al agua durante las primeras 1000 lamidas. Normalmente, las primeras 1000 lamidas ocurrían en un máximo de 8 minutos. Después del entrenamiento, se probó la reversión del sesgo lateral en 10 minutos de duración Pruebas de dos botellas de agua vs. agua. En estos experimentos, 8 animales no completaron el protocolo de acondicionamiento debido a una enfermedad o pérdida excesiva de peso, y en otros 5 animales se observó un error en el protocolo. Los datos de estos 13 animales se excluyeron del análisis.
Estímulos de condicionamiento
En 11 animales, el condicionamiento se realizó con el vehículo (agua) y soluciones de glucosa (6 ratas con 5% y 5 ratas con 15%), administradas oralmente durante el lamido de agua. En 33 animales, el condicionamiento se realizó con infusiones del vehículo (agua o solución salina – no se encontraron diferencias según el subtipo de vehículo, datos no mostrados) y sacarina (5 ratas) o soluciones de glucosa (10 ratas con 5%, 7 ratas con 22.5% y 11 ratas con 50%) administradas a través de catéteres en la vena yugular . En 15 animales, el condicionamiento se realizó con infusiones de manitol al 5% (5 ratas) o glucosa al 5% (10 ratas) administradas a través de catéteres en la vena porta . En aquellos animales en los que el condicionamiento se realizó utilizando catéteres venosos, antes de las sesiones de prueba y condicionamiento, el animal fue anestesiado con isoflurano al 5% y el catéter se conectó a una jeringa que se colocó en la bomba de infusión.
Mediciones de glucosa en sangre
Animales despiertos
Inicialmente, las ratas fueron entrenadas para beber en sesiones diarias de 10 minutos con acceso libre al agua. Una vez estabilizados los niveles de consumo, se realizó una sesión de prueba donde, durante las primeras 1000 lamidas de agua, se administró un estímulo específico (∼3 mL) por vía oral o infundido, simultáneamente con el lamido. En 7 animales, se administraron soluciones de glucosa (3 ratas al 5% y 4 ratas al 15%) por vía oral. En 20 animales, se administraron soluciones de glucosa mediante catéteres en la vena yugular (6 ratas al 5%, 4 ratas al 22.5% y 6 ratas al 50%) o catéteres en la vena porta (4 ratas al 5%). El día de la prueba, se tomó sangre de la cola para determinar la glucemia antes e inmediatamente después de la exposición a la cámara de prueba (respectivamente, al inicio y a los 0 minutos), y también a intervalos de 10 minutos después de que el animal regresara a su jaula (10, 20, 30 y 40 minutos). La glucemia se midió con un glucómetro portátil (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE. UU.; nivel máximo de detección de 500 mg/dl).
Animales anestesiados
Las ratas ingenuas fueron anestesiadas utilizando halotano al 5% seguido de una inyección intramuscular de 50 mg/kg de pentobarbital, que ha demostrado ser una de las estrategias anestésicas con pequeños efectos sobre la glucemia. [ 66 ]Se administraron dosis suplementarias siempre que fue necesario. Se realizó una incisión abdominal media. En 15 ratas sin cirugía previa, se puncionó la pared estomacal y se insertó un catéter de polietileno con su extremo en el duodeno, aproximadamente a 2 cm del píloro. Las 30 ratas restantes habían recibido previamente catéteres yugulares o porta. Se midieron los niveles de glucosa en sangre de la cola a intervalos de 5 a 10 minutos. Una vez estabilizada la glucemia en sangre de la cola, se registró una glucemia basal (0′) tanto para la sangre de la cola como para la de la vena porta. Para la recolección de sangre portal, se identificó la vena porta hepática cerca del hilio hepático y se utilizó una aguja de calibre 31 para recolectar de 0.05 a 0.1 ml de sangre. Posteriormente, se inyectaron 3 ml de un estímulo específico de forma continua durante 8 minutos con una bomba de jeringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT), para simular las condiciones durante las sesiones de entrenamiento conductual. De los animales con catéteres duodenales, a 5 ratas se les inyectó vehículo (agua), a 4, glucosa al 5% y a 6, glucosa al 15%. En las 11 ratas con catéteres en la vena porta, se inyectó vehículo (solución salina; n=4) o se administró glucosa al 5% (n=7) Las 19 ratas restantes tenían catéteres en la vena yugular y recibieron vehículo (solución salina; n=5) o soluciones de glucosa (5%, n=6; 22.5%, n=4; 50%, n=4) Posteriormente, se recogieron muestras de sangre de la cola y de la vena porta a intervalos de 10 minutos durante un máximo de 1 hora, comenzando 10 minutos después del inicio de las infusiones (10', 20', 30', 40', 50' y 60'). La glucemia en sangre de la cola y de la vena porta se midió como se describió anteriormente.
Voltametría cíclica de barrido rápido
Los electrodos
Se prepararon microelectrodos de fibra de carbono a partir de fibras de carbono T-300 de 7 µm de diámetro (Amoco, Greenville, SC) como se describió previamente [67] . Cuando fue necesario, se añadió epoxi a la interfaz vidrio/fibra para mejorar el sellado. Aproximadamente 50–100 µm de fibra quedaron expuestos más allá del sellado vidrio/carbono. Todos los electrodos se sumergieron en 2-propanol con carbón activado Norit-A durante al menos 10 min antes de su uso. Después de bajar a la profundidad inicial en el núcleo accumbens, los electrodos se acondicionaron mediante ciclos durante 15 min a 60 Hz con una forma de onda triangular (−0.4 V a 1.3 V vs Ag/AgCl a 400 V/seg) y luego durante otros 15 min a la frecuencia utilizada para la recolección de datos, 10 Hz [68] . Se utilizaron alambres de plata clorurada como electrodos de referencia y todos los potenciales se informaron vs Ag/AgCl.
Electroquímica
Para la voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV), se utilizó un instrumento electroquímico UEI (Instalación de Electrónica del Departamento de Química de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte). Se utilizaron placas National Instruments (PCI-6052 y PCI-6711E) y el software TH-1 (ESA, Chelmsford, Massachusetts) para la generación de formas de onda, la recopilación de datos, el filtrado digital y la detección y el análisis de transitorios de dopamina. Para detectar la dopamina extracelular, se aplicó una forma de onda triangular (−0.4 V a 1.3 V frente a Ag/AgCl a 400 V/s) al microelectrodo de fibra de carbono a 10 Hz. Los cambios en la dopamina extracelular se determinaron monitorizando la corriente en una ventana de 100 mV en el potencial de oxidación máximo de la dopamina (aproximadamente 0.65 V). Corrientes de dopamina. in vivo Se convirtieron a concentraciones de dopamina mediante la calibración de los electrodos tras el uso experimental con dos soluciones patrón de dopamina en un sistema de inyección de flujo. La composición del tampón utilizado para la poscalibración fue (en mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 2.4 CaCl2, 1.2 MgCl2, 2.0 Na2SO4, 1.2 NaH2PO4, 15 TRIS HCl, pH=7.4.
Métodos in vivo
Doce ratas se recuperaron de la implantación del catéter durante al menos 3 días completos antes de la privación de comida y agua durante la noche. A la mañana siguiente de la privación, las ratas fueron anestesiadas con uretano (1.5 g/kg ip) y colocadas en un aparato estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C con una almohadilla isotérmica Deltaphase (Braintree Scientific, Braintree, MA). El cuero cabelludo y la fascia subyacente se resecaron y se perforaron agujeros para los electrodos de trabajo, estimulación y referencia. Las coordenadas estereotácticas se dan en mm anteroposterior (AP) y mediolateral (ML) desde el bregma, y dorsoventral (DV) desde la duramadre. Se colocó un electrodo estimulante bipolar (Plastics One Inc., Roanoke, VA) en el área tegmental ventral (VTA): −5.2 AP, +1.0 ML, −7.5 a −9.0 DV. Se colocó un microelectrodo de fibra de carbono en la capa ipsilateral del núcleo accumbens (+1.7 AP, 0.8 ML, −6.4 a −7.4 DV). Se colocó un cable de referencia Ag/AgCl en la corteza contralateral. Se registraron las concentraciones extracelulares de dopamina resultantes de 24 trenes de estimulación de pulsos de 60 Hz (bifásicos, 2 ms cada fase y 130 µA) del ATV. Las ubicaciones de los electrodos estimulantes y de trabajo se optimizaron para encontrar sitios que apoyaran la liberación de dopamina estimulada eléctricamente y los transitorios espontáneos de dopamina. Las plantillas de dopamina para la posterior identificación de transitorios se hicieron a partir de voltamogramas cíclicos obtenidos de la liberación estimulada. Todos los sitios seleccionados para el análisis transitorio apoyaron la liberación estimulada de dopamina con una relación señal-ruido de 30 o más. Se determinó la glucemia en sangre de la cola, como se describió anteriormente, y los datos basales se registraron durante 6 a 10 minutos sin estimulación adicional. Inmediatamente después de la recolección de datos basales finales, se encendió la bomba de infusión. Se infundió glucosa (5% en solución salina) (3 mL/5 min) en la vena porta hepática o yugular. Para el grupo control, se infundió solución salina en la vena porta. Se registraron archivos de un minuto de forma continua durante 20 minutos, después de lo cual se determinó de nuevo la glucemia en sangre de la cola y se verificó el mantenimiento de la liberación estimulada. No se pudo realizar la medición de la glucemia en 2 animales debido al mal funcionamiento del glucómetro. Para determinar si el sitio de liberación de dopamina registrado respondía a la inhibición de la recaptación de dopamina, se administró una inyección intraperitoneal de 15 mg/kg de cocaína una hora después de la infusión. Los datos se registraron durante 25 minutos después de la cocaína y se volvió a verificar la liberación estimulada. En 4 animales, la frecuencia transitoria se había degradado o era inestable en el momento de la administración de la cocaína.
Análisis de Datos
Los resultados de los análisis de datos se expresaron como media ± error estándar de la media, donde 'n' representa el número de ratas. Los análisis se realizaron con el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) o NCSS 2000 (NCSS, Kaysville, UT), utilizando ANOVAs unidireccionales o bidireccionales (con pruebas post-hoc de Bonferroni) y pruebas t de Student para una o dos muestras. Se aplicó la corrección de Bonferroni secuencial para comparaciones múltiples mediante el método de Holm [69] cuando se utilizaron varias pruebas t de Student independientes en el mismo conjunto de datos.
Medidas de preferencia de comportamiento
Las pruebas de preferencia de dos botellas se analizaron calculando las proporciones de preferencia como
Donde n(.) denota el número total de lamidas detectadas en un sorbedor específico durante una sesión. Las pruebas de significancia se basaron en pruebas t de una muestra contra 0.5, que es el valor de referencia que indica indiferencia con respecto a cualquier sorbedor.
Medidas de glucemia en sangre
La glucemia basal se definió para cada punto de recolección de sangre en cada animal mediante una única medición realizada inmediatamente antes del inicio del consumo o la administración del estímulo. Los niveles de glucosa en sangre se analizaron como valores absolutos (mg/dl) o como porcentaje de variación con respecto al valor basal. Se calculó la glucemia media tras el consumo o la administración del estímulo y también se identificó el valor máximo de glucemia en este período (glucemia máxima).
Transitorios de dopamina
Los transitorios de dopamina espontáneos se identificaron utilizando un procedimiento publicado que determinó la correspondencia de los supuestos picos de dopamina con un voltamograma de plantilla conocido como dopamina [70] . Un voltamograma cíclico de dopamina que resultó de la liberación de dopamina estimulada eléctricamente sirvió como plantilla. Los voltamogramas cíclicos de línea base se restaron de los de cada punto individual utilizando un algoritmo en el software TH-1. Para cada archivo de datos, este análisis incluyó cuatro pasadas utilizando duraciones de línea base de 0.5 a 1.5 segundos que comenzaron 0.5, 1.0, 1.5 o 2.5 segundos antes del punto de datos probado. Los criterios para determinar los transitorios de dopamina se tomaron de métodos publicados e incluyeron dos puntos consecutivos (resolución de 0.1 segundos) que tuvieron una alta correspondencia con la plantilla (r≥0.86) [14] , [15] , [70] , [71] . Un programa Matlab diseñado a medida tabuló el número de transitorios y sus duraciones (en números de puntos de 0.1 s) y amplitudes combinando los resultados de todas las pasadas. Un transitorio resultó de al menos dos puntos consecutivos identificados como dopamina. Las amplitudes se determinaron como la corriente máxima de dopamina del transitorio menos la línea base cerca del inicio del pico del transitorio y se convirtieron a concentración de dopamina después de la postcalibración in vitro [14] . El número de puntos transitorios consecutivos (0.1 s) se utilizó como duración del transitorio [14].
información de soporte
Figura S1
Consumo de agua durante las sesiones de acondicionamiento. El consumo general de agua durante las sesiones de acondicionamiento se comparó utilizando ANOVA de dos vías de medidas repetidas. A. Los animales condicionados con estímulos orales lamieron más durante la administración del vehículo que durante la administración de glucosa (F=8.3, p=0.02), pero no se encontraron efectos para el estímulo condicionante (5% frente a 15% de glucosa, F=0.2, p=0.65) o la interacción entre estos factores (F=0.05, p=0.82). Sin embargo, este efecto de la reducción del lamido durante la disponibilidad de glucosa fue menor, ya que no encontramos diferencias en las comparaciones por pares entre el consumo en sesiones de glucosa frente a las sesiones con vehículo para los animales condicionados con ambos al 5% (4933 ± 117 frente a 5460 ± 141, t=2.3, p>0.05) y 15% de glucosa (5136±259 frente a 5585±502, t=1.8, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc). B. De manera similar a los hallazgos durante el condicionamiento oral, los animales condicionados con estímulos administrados en el JV lamieron más durante la administración del vehículo que de glucosa o sacarina (F=4.5, p=0.04), pero no se encontraron efectos para el estímulo condicionante (5% glucosa vs. 22.5% glucosa vs. 50% glucosa vs. 3.16% sacarina, F=1.5, p=0.23) o la interacción entre estos factores (F=1.4, p=0.27). Nuevamente, no se encontraron diferencias en las comparaciones por pares entre el consumo de glucosa o sacarina frente a las sesiones con vehículo para los animales acondicionados con glucosa al 5% (6614 ± 356 frente a 6466 ± 334, t=0.3, p>0.05), 22.5% de glucosa (5092±650 frente a 6157±245, t=1.7, p>0.05), 50% glucosa (4824±592 vs. 6062±763, t=2.5, p>0.05) y 3.16% de sacarina (4826±802 frente a 5250±512, t=0.6, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc). C. En animales con catéteres en la vena porta hepática (HPV), hubo en general más lamido en aquellos acondicionados con glucosa en relación con el grupo de manitol (F=259, p<0.0001), pero ningún efecto para el vehículo frente a la administración de glucosa o manitol (F=0.7, p=0.41) o la interacción entre estos factores (F=0.1, p=0.73). Además, no encontramos diferencias en las comparaciones por pares entre el consumo en sesiones de glucosa y de vehículo para los animales condicionados con glucosa al 5% (7314 ± 148 frente a 7758 ± 139, t=0.4, p>0.05) y 5% de manitol (3887±183 frente a 4244±574, t=0.8, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc).
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Figura S2
Mediciones de glucemia media y máxima en sangre de la cola (mg/dL) en animales despiertos. A. En animales acondicionados oralmente, no se encontraron diferencias en la glucemia media después del 5% y 15% de glucosa (84 ± 7.4 frente a 94 ± 3 respectivamente, t=1.4, p=0.23, prueba t no pareada). B. La glucemia media tras la administración oral de glucosa al 15%, que fue eficaz para condicionar la reversión del sesgo lateral, también se comparó con la obtenida tras la administración de glucosa en la vena porta. Se observó un efecto global significativo (F=27.6, p<0.0001, ANOVA de una vía) y las comparaciones por pares en relación con la glucosa oral al 15% revelaron diferencias para JV 22.5% (220 ± 19.2, t=3.6, p<0.001) y 50% de glucosa (315±33.6, t=7, p<0.001), pero no en relación con la glucosa al 5% (84±1.8, t=0.3, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc). C. La glucemia media después de la administración de glucosa al 93% por VPH (5.9 ± 5) y JV no fue significativamente diferente (t=1.7, p=0.13, prueba t no pareada). D–F. Se obtuvieron resultados similares al comparar la glucemia máxima con la media. No se encontraron diferencias entre la glucosa al 5% y al 15% (97 ± 2.5 frente a 102 ± 4.3 respectivamente, t=0.87, p=0.42, prueba t no pareada; D). En las comparaciones entre la administración oral de glucosa al 15 % y la administración de glucosa intravenosa, se observó un efecto global significativo (F)=34.4, p<0.0001, ANOVA de una vía) y las comparaciones por pares revelaron diferencias con respecto a JV 22.5% (319±26.3, t=4.9, p<0.001) y 50% de glucosa (424±42.1, t=8, p<0.001), pero no en relación con la glucosa al 5% (110±6.5, t=0.2, p > 0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc; E). Finalmente, la glucemia máxima tras la administración de glucosa al 93% por VPH (5.9 ± 5) y JV no mostró diferencias significativas (t=2, p=0.08, prueba t no pareada, F).
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Figura S3
Mediciones de glucemia media en sangre de la cola (% valor inicial) en animales despiertos. Los datos de glucemia se muestran arriba (Fig. S2), también se analizó después de la normalización al valor inicial (% valor inicial; ver también Figuras 2B, 2C y y3B3B para valores pico) A. En animales acondicionados oralmente, no se encontraron diferencias en la glucemia media después del 5% y 15% de glucosa (100 ± 4.2 frente a 121 ± 7.3, t=2.3, p=0.07, prueba t no pareada). B. La glucemia media tras la administración oral de glucosa al 15%, que fue eficaz para condicionar la reversión del sesgo lateral, también se comparó con la obtenida tras la administración de glucosa en la vena porta. Se observó un efecto global significativo (F=20.8, p<0.0001, ANOVA de una vía) y las comparaciones por pares en relación con la glucosa oral al 15% revelaron diferencias para JV 22.5% (296 ± 29.4, t=3.6, p<0.01) y 50% de glucosa (402±46.2, t=6.3, p<0.001), pero no en relación con la glucosa al 5% (130±6.4, t=0.2, p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc). C. La glucemia media después de la administración de glucosa al 121% por VPH (6.6 ± 5) y JV no fue significativamente diferente (t=1, p=0.33, prueba t no pareada).
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Figura S4
Duración y amplitud transitoria de la dopamina en el núcleo accumbens de ratas anestesiadas, después de la administración de glucosa o vehículo en la vena hepático-porta o yugular. Se utilizó voltamperometría cíclica de barrido rápido para identificar eventos de liberación espontánea de dopamina (transitorios) en el núcleo accumbens de ratas anestesiadas. Se realizaron mediciones durante un período basal, así como durante y después de la infusión de glucosa al 5 % en la vena yugular (VJ).=4) o VPH (n=4), o vehículo en este último (n=4) Se demostró que la infusión de glucosa en el VPH, pero no en el YV, causa un aumento en la frecuencia transitoria de dopamina, en comparación con el efecto de la infusión del vehículo en el VPH (ver ). A. Aquí mostramos la duración transitoria (ms) antes de la infusión (línea base) y en intervalos de 5 minutos después del inicio de la infusión, para el vehículo de VPH (línea base, 464 ± 204; 5 minutos, 371 ± 117; 10 minutos, 316 ± 29; 15 minutos, 350 ± 74; 20 minutos, 402 ± 82; cuadrados azules), glucosa de VPH (línea base, 548 ± 79; 5 minutos, 437 ± 48; 10 minutos, 416 ± 34; 15 minutos, 434 ± 61; 20 minutos, 474 ± 61; cuadrados rojos) y glucosa de JV (línea base, 534 ± 120; 5 minutos, 507 ± 142; 10 minutos, 464 ± 41; 15 minutos, 396 ± 108; 20 minutos, 493 ± 97; cuadrados negros). El ANOVA de dos vías reveló la ausencia de efectos significativos del tratamiento (F=1.6, p=0.21), tiempo (F=0.9, p=0.49) y la interacción entre estos factores (F=0.08, p=1). B. Para la amplitud transitoria (nM), los valores para el vehículo HPV (línea base, 35.9 ± 7.4; 5 minutos, 32.8 ± 7.1; 10 minutos, 29.7 ± 7; 15 minutos, 26.5 ± 5.3; 20 minutos, 24.4 ± 3.3), glucosa HPV (línea base, 29.3 ± 7.7; 5 minutos, 26.6 ± 4.4; 10 minutos, 30.2 ± 4.8; 15 minutos, 26.5 ± 3.7; 20 minutos, 23.1 ± 3.4) y glucosa JV (línea base, 26.3 ± 1.2; 5 minutos, 21.7 ± 1.8; 10 minutos, 24.9 ± 1.8; 15 minutos, 25.9 ± 1.2; 20 minutos, 25.8 ± 3.4) también se compararon mediante ANOVA de dos vías y no se encontraron efectos para el tratamiento (F=1.4, p=0.25), tiempo (F=0.7, p=0.58) y la interacción entre estos factores (F=0.4, p=0.91).
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Figura S5
Frecuencia, duración y amplitud transitoria de la dopamina, en el núcleo accumbens de ratas anestesiadas, después de la administración sistémica de cocaína. Para determinar si el sitio de liberación de dopamina seleccionado respondía a la inhibición de la recaptación de dopamina, una vez medidos los efectos de la administración de glucosa sobre los transitorios dopaminérgicos del núcleo accumbens, se administraron 15 mg/kg de cocaína por inyección intraperitoneal. En cuatro animales, la frecuencia de los transitorios se había reducido o era inestable. Los datos de las ocho ratas restantes se presentan juntos, independientemente del grupo de tratamiento. Se utilizó un ANOVA unidireccional de medidas repetidas para investigar los posibles cambios en la frecuencia, duración y amplitud de los transitorios en intervalos de 4 minutos tras la inyección intraperitoneal, en comparación con el período basal inmediatamente anterior a la inyección de cocaína. A. La cocaína tuvo un efecto general de aumento de la frecuencia transitoria (F=3.8, p=0.007) con un efecto significativo en comparación con el valor basal (2.2 ± 0.7 transitorios/min) a los 20 minutos (7 ± 2.1, t=3.3, p<0.05), pero no los puntos de tiempo restantes (5 minutos, 2.2±0.7, t=0.004; 10 minutos, 4.5 ± 1.3, t=1.5; 15 minutos, 5.9 ± 1.8, t=2.5; 25 minutos, 5.9 ± 1.6, t=2.5; p>0.05 para todos; pruebas t de Bonferroni post-hoc). B. Durante la duración transitoria, la cocaína también tuvo un efecto general significativo (F=4, p=0.006), con efectos significativos adicionales en comparación con el valor inicial (423 ± 32 ms) a los 10 minutos (711 ± 122, t=3.4, p<0.01), 15 minutos (736±126, t=3.7, p<0.01), 20 minutos (700±65, t=3.3, p<0.05) y 25 minutos, 705±76, t=3.4, p<0.01), pero no a los 5 minutos (600±84, t=2.1; p>0.05; pruebas t de Bonferroni post-hoc). C. Los efectos de la cocaína sobre la amplitud transitoria no fueron significativos, tanto en general (F=1.3, p=0.31) y cuando cada punto de tiempo se comparó con el valor inicial (21.2 ± 2.4 nM; 5 minutos, 23.7 ± 1.9, t=1.1; 10 minutos, 25.5 ± 3.8, t=1.9; 15 minutos, 26.5 ± 3.2, t=2.3; 20 minutos, 23.9 ± 1.8, t=1.2; 25 minutos, 23.6 ± 2, t=1.1; p>0.05 para todos; pruebas t de Bonferroni post-hoc).
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Tabla S1
Mediciones de glucemia en sangre de la cola (mg/dL) en animales despiertos. Se permitió a las ratas beber agua mientras se administraba simultáneamente una de las soluciones de glucosa utilizadas para el acondicionamiento (5 % o 15 % por vía oral, 5 %, 22.5 % o 50 % en la JV o 5 % en la HPV). La glucemia se midió a partir de la sangre de la cola al inicio (línea base) y al final (0′) de la sesión conductual de 10 minutos de duración, y cada 10 minutos a partir de entonces (10′–40′). La glucemia (mg/dl) se comparó mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas, revelando efectos globales significativos para el estímulo (JV vs. HPV vs. glucosa oral al 5 % vs. glucosa oral al 15 % vs. glucosa al 22.5 % en la JV vs. glucosa al 50 % en la JV; F=25.4, p<0.0001), tiempo (línea base vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′; F=42.24, p<0.0001) y la interacción entre estos factores (F=12.5, p < 0.0001). Se realizaron comparaciones adicionales en cada punto temporal entre la glucemia después de JV glucosa al 5%, considerada como un estímulo de control que no condicionó la inversión del sesgo lateral, y la glucemia medida después de cada uno de los estímulos de glucosa restantes (véanse los detalles en esta tabla). Dada la interacción significativa, los datos también se analizaron por separado para cada estímulo, mostrando un efecto significativo para el tiempo en todos los casos (JV glucosa al 5%, F=14.48, p<0.0001; JV 22.5% glucosa, F=19.98, p<0.0001; JV 50% glucosa, F=28.04, p<0.0001; glucosa oral al 15%, F=3.212, p=0.036; VPH 5% glucosa, F=26.7, p<0.0001) con excepción de la glucosa oral al 5% (F=2.68, p=0.087; ANOVA de medidas repetidas de una vía). Finalmente, se comparó la glucemia en cada punto temporal con la medición basal respectiva (véanse los detalles en esta tabla). Las comparaciones significativas se resaltan en negrita (basilea – basal).
(DOC)
Tabla S2
Mediciones de glucemia sanguínea (mg/dL) en animales anestesiados. Las ratas fueron anestesiadas y luego inyectadas con vehículo o una de las diferentes soluciones de glucosa utilizadas para el acondicionamiento a través del duodeno (agua, n=5; 5% glucosa, n=4; 15% glucosa, n=6), JV (solución salina, n=5; 5% glucosa, n=6; 22.5% glucosa, n=4; 50% glucosa, n=4) o VPH (solución salina, n=4; 5% glucosa, n=7) catéteres. Se midió la glucemia de la cola y de la sangre del VPH al inicio (basal) y al final (0') de la perfusión de estímulo, y posteriormente cada 10 minutos (10'-50'). Inicialmente, se analizaron por separado los datos de las inyecciones de vehículo y glucosa, y de la glucemia de la cola y de la sangre del VPH. A. En las mediciones de glucemia en sangre de la cola después de las inyecciones del vehículo, se encontró un efecto general significativo para el tiempo (línea de base vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′ vs. 50′; F=2.6, p=0.02) pero no para el lugar de inyección (YV vs. duodenal vs. HPV; F=0.3, p=0.78) o la interacción entre estos factores (F=1.1, p=0.4; ANOVA de dos vías para medidas repetidas). Se realizaron comparaciones adicionales en cada punto temporal entre la glucemia tras la administración de solución salina JV y la observada tras la administración de agua duodenal o solución salina HPV (véanse los detalles en esta tabla). B. Con las mediciones de glucemia en sangre del VPH después de las inyecciones del vehículo, no se encontraron efectos generales significativos para el tiempo (F=1, p=0.41), lugar de inyección (F=1.3, p=0.31) ni la interacción entre estos factores (F=1.9, p=0.05; ANOVA de dos vías para medidas repetidas). Nuevamente, se compararon en cada punto temporal la glucemia tras la administración de solución salina JV con la observada tras otras vías de administración del vehículo (véanse los detalles en esta tabla). C. En relación con las mediciones de glucemia en sangre de la cola después de las inyecciones de glucosa, se encontró un efecto general significativo para el tiempo (F=129.3, p<0.0001), estímulo (JV vs. HPV vs. glucosa oral al 5% vs. glucosa oral al 15% vs. glucosa JV al 22.5% vs. glucosa JV al 50%; F=45.5, p<0.0001) y la interacción entre estos factores (F=30.7, p < 0.0001; ANOVA de dos vías para medidas repetidas. Se realizaron comparaciones adicionales en cada punto temporal entre la glucemia tras la administración de glucosa al 5% en JV, considerada como un estímulo de control que no condicionó la inversión del sesgo lateral, y la observada tras los demás estímulos de glucosa (véanse los detalles en esta tabla). D. En términos de mediciones de glucemia en sangre por VPH después de inyecciones de glucosa, se encontró un efecto general significativo para el tiempo (F=132, p<0.0001), estímulo (F=15.5, p<0.0001) y la interacción entre estos factores (F=27.5, p < 0.0001; ANOVA de dos vías para medidas repetidas. Se realizaron comparaciones adicionales en cada punto temporal entre las mediciones de glucemia tras la administración de glucosa al 5% en JV y las observadas tras los demás estímulos de glucosa (véanse los detalles en esta tabla). Las comparaciones significativas se resaltan en negrita (basal: basal; dd: duodenal; sal: salina; agua: agua).
(DOC)
Tabla S3
Glucemia sanguínea media y máxima (mg/dL) en animales anestesiados. Mediciones de glucemia en sangre de la cola y del VPH en ratas anestesiadas (ver Tabla S2) también se analizaron según los valores medios y máximos tras la administración de glucosa o vehículo (es decir, 0′–50′). Dado que, como se describió anteriormente, no se encontraron diferencias generales en la glucemia según las diferentes vías de administración del vehículo, los datos del vehículo se incluyeron como una sola categoría. Los estímulos de glucosa que previamente no demostraron ser eficaces para condicionar la inversión del sesgo lateral se destacan en negrita. A. La glucemia media se comparó mediante ANOVA de dos vías de medidas repetidas, revelando efectos generales significativos para el estímulo (JV vs. HPV vs. glucosa duodenal al 5% vs. glucosa duodenal al 15% vs. glucosa JV al 22.5% vs. glucosa JV al 50% vs. vehículo; F=47.56, p<0.0001), territorio sanguíneo (cola vs. VPH; F=13.44, p=0.0007) y la interacción entre estos factores (F=25.2, p < 0.0001). También se encontraron diferencias significativas entre la glucemia de la cola y la del VPH para varios estímulos individuales (véanse los detalles en esta tabla). Dada la interacción significativa entre los factores, se analizaron por separado la glucemia de la cola y la del VPH y, en ambos casos, se encontraron diferencias significativas generales (respectivamente: F=66.26, p<0.0001; F=31.84, p < 0.0001; ANOVA de una vía). Se realizaron comparaciones pareadas adicionales por separado para la cola y la sangre HPV entre las mediciones de glucemia después de JV con glucosa al 5%, considerado un estímulo de control que no condicionó la inversión del sesgo lateral, y las observadas después de los demás estímulos de glucosa. Para las mediciones de sangre de la cola, se encontraron diferencias para JV con glucosa al 22.5% y al 50% y vehículo, mientras que para las mediciones de sangre HPV se encontraron diferencias para la glucosa duodenal al 15% y JV con glucosa al 22.5% y al 50% (véanse los detalles en esta tabla). B. Se comparó la glucemia máxima utilizando las mismas metodologías. Se encontraron efectos generales significativos para el estímulo (F=160.1, p<0.0001), territorio sanguíneo (F=32.22, p<0.0001) y la interacción entre estos factores (F=10.46, p < 0.0001; ANOVA de dos vías de medidas repetidas), así como diferencias significativas entre la glucemia de la cola y la del VPH para varios estímulos (véase la tabla). De nuevo, se encontraron diferencias significativas generales tanto para la glucemia de la cola como para la del VPH (respectivamente: F=154.8, p<0.0001; F=93.98, p<0.0001; ANOVA de una vía). Para las mediciones de sangre de la cola, la glucosa duodenal al 5%, la glucosa JV al 22.5% y al 50% y el vehículo difirieron significativamente de la glucosa JV al 5%, mientras que para las mediciones de sangre HPV, se encontraron diferencias para el vehículo, la glucosa HPV al 5%, la glucosa duodenal al 15% y la glucosa JV al 22.5% y al 50%. En este último caso, la glucosa duodenal al 5%, el único otro estímulo de glucosa que no condicionó la inversión del sesgo lateral en animales despiertos, fue el único estímulo probado que no difirió significativamente de la glucosa JV al 5% (véanse los detalles en esta tabla). Las comparaciones significativas se destacan en negrita. (dd. – duodenal).
(DOC)
Tabla S4
Glucemia sanguínea media y máxima (% basal) en animales anestesiados. También se compararon la media y el pico de glucemia en sangre y la glucemia por VPH utilizando valores normalizados con respecto a las medidas iniciales (% del valor inicial; ver Tablas S2 y S3). Nuevamente, los estímulos de glucosa que anteriormente no habían demostrado ser efectivos para condicionar la inversión del sesgo lateral se destacan con texto en negrita. A. Para la glucemia relativa media encontramos efectos generales significativos para el estímulo (F=61.8, p<0.0001), territorio sanguíneo (F=10.98, p=0.002) y la interacción entre estos factores (F=21.45, p < 0.0001; ANOVA de dos vías para medidas repetidas), y se encontraron diferencias significativas entre la glucemia de la cola y la del VPH para varios estímulos específicos (véanse los detalles en esta tabla). Dada la interacción significativa entre los factores, la glucemia de la cola y la del VPH también se analizaron por separado y se encontraron efectos significativos generales para la sangre de la cola (F=78.37, p<0.0001) y mediciones de sangre de VPH (F=39.95, p < 0.0001; ANOVA de medidas repetidas de una vía). Como se hizo previamente, se realizaron comparaciones pareadas adicionales entre las mediciones de glucemia tras la administración de glucosa en la vena cava inferior (VJ) al 5%, considerada como un estímulo de control que no condicionó la inversión del sesgo lateral, y las observadas tras los demás estímulos de glucosa. En la sangre de la cola, la glucosa en la VJ al 22.5% y al 50% fue significativamente diferente, mientras que en la sangre del VPH, se encontraron diferencias para la glucosa en la VPH al 5%, la glucosa duodenal al 5% y al 15%, y la VJ al 22.5% y al 50% (véase la tabla). B. Para la glucemia relativa máxima, se encontraron efectos principales significativos para el estímulo (F=112.2, p<0.001), territorio sanguíneo (F=29.6, p<0.001) y la interacción entre estos factores (F=11.4, p < 0.001; ANOVA de dos vías de medidas repetidas), así como para varios estímulos específicos entre la cola y la glucemia del VPH (véanse los detalles en esta tabla). Dada la interacción significativa entre los factores, se analizaron por separado la cola y la glucemia del VPH y, en ambos casos, se encontraron diferencias significativas (respectivamente: F=85.92, p<0.001 y F=92.8, p < 0.001; ANOVA de medidas repetidas de una vía). Además, para las mediciones de sangre de la cola, solo la glucosa del 22.5 % y el 50 % del VJ y el vehículo difirieron significativamente de la glucosa del 5 % del VJ, mientras que para las mediciones de sangre del VPH se encontraron diferencias para todos los estímulos, excepto la glucosa duodenal al 5 %, el único otro estímulo de glucosa que no resultó en inversión del sesgo lateral (véanse los detalles en esta tabla). Las comparaciones significativas se resaltan en negrita (dd. – duodenal).
(DOC)
Tabla S5
Frecuencia transitoria de dopamina en el núcleo accumbens de ratas anestesiadas, después de la administración de glucosa o vehículo en la vena hepático-porta o yugular. Se utilizó voltamperometría cíclica de barrido rápido para identificar eventos de liberación espontánea de dopamina o transitorios en el núcleo accumbens de ratas anestesiadas. Se realizaron mediciones durante un período basal, así como durante y después de la infusión de glucosa al 5 % en la vena yugular (VJ).=4) o VPH (n=4), o vehículo en este último (n=4) Se demostró que la infusión de glucosa en el VPH, pero no en el YV, causaba un aumento en la frecuencia transitoria de dopamina, en comparación con el efecto de la infusión del vehículo en el VPH y también los valores basales respectivos (véase también ). Las comparaciones significativas se destacan en negrita. (sal. – salina).
(DOC)
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Teresa Maia, Jim Meloy y Gary Lehew por el soporte técnico, y a Susan Halkiotis por la revisión del manuscrito.
Notas a pie de página
Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.
Financiación: Este trabajo fue financiado por la subvención número R01DC001065 otorgada a Sidney Simon por el Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (NIDCD). Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar ni la preparación del manuscrito. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial del NIDCD ni de los Institutos Nacionales de la Salud.
Referencias