Dieta moderada alta en grasas aumenta la autoadministración de sacarosa en ratas jóvenes (2013)

Dianne P. Figlewicz,^1,2 Jennifer l. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Constance H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ y Jon F. Davis³

Anteriormente hemos informado que una dieta con un contenido de grasa moderadamente alto aumenta la motivación para la sacarosa en ratas adultas. En este estudio, probamos los efectos motivacionales, neuroquímicos y metabólicos de la dieta alta en grasas en ratas macho en transición a través de la pubertad, durante las semanas de edad de 5-8. Observamos que la dieta rica en grasas aumentó la respuesta motivada para la sacarosa, que fue independiente de los cambios metabólicos o de los metabolitos del neurotransmisor de catecolamina en el núcleo accumbens. Sin embargo, los niveles de ARNm de AGRP en el hipotálamo se elevaron significativamente. Demostramos que el aumento de la activación de las neuronas AGRP está asociado con un comportamiento motivado, y que la administración de AGRP exógena (tercer cerebroventricular) resultó en una motivación significativamente mayor para la sacarosa. Estas observaciones sugieren que el aumento de la expresión y la actividad de AGRP en el hipotálamo medial puede ser la base del aumento de la respuesta a la sucrosa causada por la intervención de la dieta alta en grasas. Finalmente, comparamos la motivación para sacarosa en ratas puberales frente a adultas y observamos un aumento en la motivación para sacarosa en ratas puberales, lo cual es consistente con los informes anteriores de que los animales jóvenes y los humanos tienen una mayor preferencia por el sabor dulce en comparación con los adultos. Juntos, nuestros estudios sugieren que la dieta de fondo juega un papel modulador fuerte en la motivación por el sabor dulce en los animales adolescentes.

Materias

Los sujetos eran ratas albinas macho de Simonsen (Gilroy, CA). Las ratas se mantuvieron en chow (Laboratory Roent Diet 5001, LabDiet) o moderada en grasas (31.8%; Research Diets Inc) ad libitum. Las dietas se corresponden con el contenido de carbohidratos en general (58% kcal vs. 51% kcal para bajo en grasa vs. alto en grasa, respectivamente). La comida baja en grasa tiene 6.23 gm% de azúcares libres y la dieta alta en grasas tiene 29 gm% de sacarosa. Se mantuvieron en un ciclo 12: 12 h claro-oscuro con las luces encendidas en 6 AM. A menos que se indique lo contrario, las ratas se trajeron a las 3 semanas de edad, inmediatamente después del destete, y se alojaron para aclimatación hasta las 5 semanas de edad. A esta edad, se inició la dieta y / o entrenamiento conductual y pruebas. Los protocolos específicos se describen en detalle a continuación, y se resumen en Tabla 1. Porque las ratas macho pasan por la pubertad en el 6^th-7^th En la semana de edad, el tiempo de los estudios se diseñó para estudiar ratas a medida que atraviesan esta etapa de desarrollo. Todos los procedimientos realizados en las ratas siguieron las pautas de los NIH para el cuidado de animales, y fueron aprobados por el Subcomité de Cuidado y Uso de Animales del Comité de Investigación y Desarrollo en el Sistema de Cuidado de la Salud VA Puget Sound.

  

Tabla 1

Protocolos Experimentales

Autoadministración de sacarosa

Protocolo general. Los procedimientos se basaron en nuestra metodología publicada (Figlewicz et al., 2008; Figlewicz et al., 2006). Todos los procedimientos de entrenamiento y prueba se llevaron a cabo entre 0700 y 1200 hr. El experimento incluyó fases 2-3: autoformación y entrenamiento de proporción fija (FR); Cirugía y recuperación en cohortes especificadas (ver Tabla 1); y entrenamiento de relaciones progresivas (PR) utilizando el algoritmo de relaciones públicas de Richardson y Roberts (Richardson y Roberts, 1996). El algoritmo de PR requiere 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, como parte de la organización del programa. etc) presiona la palanca para obtener entregas de recompensa exitosas dentro de una sesión, y es una prueba rigurosa de motivación y recompensa (48). Las ratas se entrenaron para autoadministrarse 63% de sacarosa (recompensa de 83 ml) administrada en un recipiente de gotas de líquido. Las cajas operantes, controladas por un sistema Med Associates (Georgia, VT), tenían dos palancas, pero solo una palanca (una palanca activa y retráctil) activaba la bomba de infusión. Las prensas en la otra palanca (una palanca inactiva, estacionaria) también se registraron. La solución de sacarosa se administró en un recipiente de gotas de líquido para consumo oral (Med Associates). El entrenamiento inicial se llevó a cabo durante las sesiones de una hora para los días 110 bajo un programa de refuerzo continuo (FR145: se reforzó cada presión de palanca), con un máximo posible de recompensas de sacarosa 191 entregadas por sesión. Cada sesión comenzó con la inserción de la palanca activa y la iluminación de una luz blanca que permaneció encendida durante toda la sesión. Un tono discreto de 251 (331 Hz, 437 dB sobre el fondo) + luz (luz blanca 575 W sobre la palanca activa) acompañó a cada entrega de recompensa, seguida de un tiempo de espera de 759-sec después de cada entrega de sacarosa. La capacitación en relaciones públicas se llevó a cabo durante un máximo de 999 h / día durante diez días. Las sesiones diarias finalizaron después de que 999 no respondiera a la presión de la palanca activa, momento en el que se apagó la luz de la casa y se retrajo la palanca activa.

Efecto de la AGRP en la autoadministración de sacarosa.

Como nuestros resultados mostraron un aumento de la expresión del ARNm de AGRP en ratas puberales alimentadas con una dieta rica en grasas, quisimos confirmar que AGRP podría aumentar la autoadministración de sacarosa. Se tomaron ratas alimentadas con chinches de 5-wk de edad a través de entrenamiento FR, luego recibieron cánulas en el tercer ventrículo cerebral (ICV). Después de una semana de recuperación, la confirmación de la colocación con una prueba de respuesta a la bebida con angiotensina II (ver Figlewicz et al., [2006]), y una sesión de reentrenamiento de FR, se iniciaron ratas en el paradigma de autoadministración de RP. Después del día de PR 1, las ratas se asignaron a uno de los dos grupos, de manera que el rendimiento medio del PR Day 1 no difirió entre los dos grupos (vehículo artificial de LCR, aCSF o AGRP, 2 μl de 0.01 nmol). Recibieron inyecciones de aCSF (n = 8) o AGRP (n = 7) en los días de PR 2, 5 y 8. La ingesta diaria total de alimentos se cuantificó durante el tiempo de entrenamiento de RP.

Efecto de la edad en la autoadministración de sacarosa.

Comparamos el comportamiento de autoadministración entre ratas puberales y adultos jóvenes alimentados con chow o con la dieta 31.8% de grasa. Las ratas tuvieron dos semanas de aclimatación al vivero VAPSHCS (3 —5wk o 8 — 10 wk). Luego recibieron la dieta durante todo el período de prueba / entrenamiento (4 wk). Así, como en el experimento inicial, se estudiaron ratas puberales en la semana de edad 5-8. Los adultos jóvenes se estudiaron en la semana de edad 10-13.

Determinación de la composición corporal

La composición corporal se midió utilizando espectroscopia de resonancia magnética cuantitativa (QMR [Nixon et al., 2010]) para determinar el contenido de agua corporal de ratas individuales, a partir de las cuales se calcula la grasa corporal relativa. Los animales se colocaron en soportes cilíndricos sin anestesiar, y luego se insertaron en la máquina QMR para un escaneo de minutos 2, que realiza mediciones por triplicado. Los datos se guardan en una computadora integrada (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) para el cálculo inmediato de agua en todo el cuerpo, grasa y masa magra.

Pruebas de tolerancia a la glucosa por vía intravenosa (IVGTT)

Se llevaron a cabo IVGTT conscientes en ratas con cánulas IV implantadas crónicamente, que se mantuvieron en ayunas durante la noche antes del estudio, utilizando una metodología basada en Frangioudakis, Gyte, Loxham y Poucher (2008). Las cánulas intravenosas bilaterales se implantaron dos semanas antes del estudio, según nuestra metodología establecida (Figlewicz et al., 2009). Las muestras de referencia se tomaron en t-10 min (0.5 ml para la determinación de insulina y glucosa, en todos los puntos de tiempo) y t0 min. Las ratas recibieron una infusión de 1 gm de glucosa / 2ml / kg durante 15-20 segundos seguidos de 0.5 ml de descarga de solución salina. Se tomaron muestras de sangre en 5, 15, 30, 60, 90 y 120 min. Debido al taponamiento de un catéter durante el procedimiento (por lo tanto, la incapacidad para obtener muestras de sangre), las 'n's finales para los datos de referencia / IVGTT presentados son 7-8 para ratas alimentadas con chow y 8 para ratas alimentadas con 31.8 dieta de grasas (Tabla 3). La insulina plasmática se determinó utilizando los kits RIA de insulina de rata Linco (# RI-13K y SRI-13K, Linco) y la glucosa plasmática se determinó en un analizador de glucosa YSI). El área bajo la curva (AUC) para la respuesta desde el inicio se calculó en 5 min y 120 min. El índice HOMA se calculó como ayuno (glucosa [mM] × insulinm [U / L]) / 22.5 y se calculó utilizando muestras de ayuno terminales medidas para insulina y glucosa.

  

Tabla 3

Parámetros metabólicos¹

Parámetros metabólicos en ayunas

Las ratas del experimento 1 se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la eutanasia, unos días después de completar el IVGTT. Las ratas se anestesiaron profundamente con inhalación de isoflurano y se desangraron. Los cerebros se retiraron rápidamente y se congelaron en nitrógeno líquido para medir el ARNm del péptido hipotalámico y las catecolaminas del núcleo accumbens. Se usó plasma o suero terminal para medir la insulina en ayunas, la glucosa, la leptina y los triglicéridos. Para los triglicéridos, se utilizaron el kit Point Scientific Triglyceride GPO # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) y los estándares KIT # 7531-STD (Fisher # XUMX-23-666-422), y se probó 3 μl de suero. La leptina plasmática se midió con Millipore Linco RIA Kit # RL 83K.

Métodos de catecolaminas por HPLC [Davis et al., 2008]

Las ratas se sometieron a eutanasia con anestesia con isoflurano y los cerebros se extrajeron rápidamente, se congelaron y se almacenaron a -80 ° C. Micro-punzones bilaterales del núcleo accumbens (NAcc) se aislaron de cada animal. Aunque se tomó un cuidado sustancial para minimizar la contaminación por regiones cerebrales vecinas, debido a la naturaleza y el tamaño de cada microperforador, nuestro método no nos permitió distinguir las subregiones (es decir, el núcleo NAcc frente al caparazón) dentro del NAcc. Para el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), se añadió una solución antioxidante (perclorato 0.4 N, ácido etilendiaminotetraacético 1.343 mM (EDTA) y metabisulfito sódico 0.526 mM, seguido de homogeneización con un homogeneizador de tejido ultrasónico (Biologics; Gainesville, VA) Una pequeña porción del homogeneizado de tejido se disolvió en 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS) (p / v) para la determinación de proteínas (Pierce BCA Protein Reagent Kit; Rockford, IL). La suspensión restante se centrifugó a 14,000 g para 20 Min. en una centrífuga refrigerada. El sobrenadante se reservó para HPLC.

Las muestras se separaron en una columna Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) y se examinaron simultáneamente para determinar el ácido DA, 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanílico (HVA), ambos de los cuales son marcadores de la degradación de la dopamina, 5-HT y 5-HIAA. Los compuestos se detectaron utilizando un detector de matriz coulométrica de canal 12 (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) conectado a un sistema de suministro de solvente 2695 de Waters (Waters; Milford, MA) en las siguientes condiciones: caudal de 1 ml / min; potenciales de detección de 50, 175, 350, 400 y 525 mV, y; Potencial de fregado de 650 mV. La fase móvil consistió en una solución de 10% de metanol en H destilado.₂O que contiene 21 g / l (0.1 M) ácido cítrico, 10.65g / l (0.075 M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8 M) ácido heptanosulfónico y 36 mg / l (0.097 mM) EDTA a un pH de XNUM. Las muestras desconocidas se cuantificaron frente a una curva estándar de punto 4.1 con un mínimo de R² de 0.97. Las muestras de control de calidad se intercalaron con cada ejecución para asegurar la calibración de HPLC.

Péptidos orexigénicos ARNm qPCR

Medimos la expresión de péptidos hipotalámicos que estimulan la alimentación y hemos estado implicados en motivar y recompensar las conductas (Figlewicz y Sipols, 2010): neuropéptido Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin y Schwartz, 1998; Jewett et al., 1995; Kelley, Nannini, Bratt y Hodge, 2001]); péptido relacionado con agouti (AGRP [Aponte, Atasoy y Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos y Bray, 2010; Broberger y otros, 1998; Hagan et al., 2000; Hahn, Breininger, Baskin y Schwartz, 1998; Kaushik et al., 2011; Krashes et al., 2011; Rossi et al., 1998; Tracy et al., 2008]); y orexin (Cason et al., 2010; Choi, Davis, Fitzgerald y Benoit, 2010). Las ratas se sacrificaron con anestesia con isoflurano y los cerebros se extrajeron rápidamente, se congelaron y se almacenaron a -80 ° C hasta su procesamiento. El hipotálamo medial y lateral se microdiseccionó como un bloque utilizando un plano de congelación AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, Il) que mantuvo una temperatura constante de 12 ° C durante todo el proceso de disección. El ARN total de tejido microdisecado se aisló con reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificó usando el Mini Kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se trató para eliminar cualquier posible contaminación de ADN genómico usando ADNasa libre de ARNasa (Promega, Madison, WI) y se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, Reino Unido). La calidad del ARN se confirmó mediante electroforesis estándar en gel de agarosa. A continuación, se retrotranscribió (RT) ADN complementario (ADNc) a partir de 1-2 μg de ARN total mediante una mezcla de hexámeros aleatorios y cebado de oligo DT utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). También se prepararon reacciones no retrotranscritas (sin RT) de cada muestra para controlar la posible contaminación del ADN genómico. Se diluyeron los controles de ADNc y sin RT, y se usaron 5-10 ng de ADNc molde de cada muestra para medir la expresión de ARNm de genes seleccionados mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real MyIQ (Bio-Rad, Hercules Se realizaron mediciones por triplicado para cada muestra en placas de 96 pocillos iCycler estándar, junto con controles sin plantilla (NTC) para detectar una posible contaminación cruzada, en volúmenes de reacción de 20 μl que constan de 10 μl 2 × iQ Sybr Green Supermix (Bio Rad, Hercules, CA), 2 μl de 0.2-0.5 μM de cada cebador, 3 μl de agua DEPC y 5 μl de plantilla. Todas las reacciones de qPCR incluyeron un análisis de la curva de fusión para asegurar la especificidad de la señal. La expresión relativa para cada gen de interés se calculó por extrapolación a una curva estándar ejecutada individualmente en cada placa y derivada de diluciones en serie de una muestra combinada de ADNc de referencia, y se normalizó a la expresión relativa de genes de referencia (fosfoproteína ribosómica ácida 36B4 para expresión génica en tejido hipotalámico y proteína ribosomal mitocondrial L32 para expresión en el núcleo accumbens). Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores (IDT, San Diego, CA) para amplificar prepro-orexina de rata, NPY y AGRP: Prepro-orexina, Adelante: 5'-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ', 5'-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3'; NPY: Adelante, 5- TACTCCGCTCTGCGACACTACATC-3 '; Reverso: 5'-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 '; AGRP, directo: 5'-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 '; Reverso: 5′-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 ′.

cFos Inmunocitoquímica (ICC) y cuantificación

La fluorescencia ICC se utilizó para identificar cuerpos celulares neuronales positivos para Fos y positivos para AGRP en el hipotálamo medial, de acuerdo con nuestra metodología establecida (Figlewicz et al., 2011). El último día (PR día 10), las ratas se colocaron en sus cámaras de autoadministración como de costumbre, durante 90 min. Inmediatamente después de la última sesión de 90 minutos, las ratas se anestesiaron profundamente con inhalación de isoflurano y se perfundieron con NaCl al 0.9% seguido de una solución fría de paraformaldehído al 4%. El momento de la anestesia y la eutanasia se basó en el curso temporal conocido del pico de expresión de la proteína cFos a los 90-120 minutos después del evento. Por tanto, la expresión de cFos reflejaría la activación del SNC al inicio de la tarea conductual, en lugar de ser el resultado de que los animales experimenten la tarea. Los cerebros se extrajeron y se fijaron posteriormente en paraformaldehído durante varios días, luego se colocaron posteriormente en sacarosa al 20%-PBS y luego en una solución de sacarosa-PBS al 30%. Los cerebros se seccionaron en un criostato (criostato Leica CM 3050S) para inmunohistoquímica. Usamos nuestra metodología establecida para cuantificar la proteína cFos inmunorreactiva en secciones del cerebro (Figlewicz et al., 2011). Las secciones coronales de cerebro entero 12 μm montadas en portaobjetos se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, OXOID, Hampshire, Inglaterra). Las secciones se lavaron durante 20 min con 100% etanol / DI agua (50%, v / v) seguido de un lavado con PBS, luego se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS que contenía 5% de cabra normal o suero de burro. Luego, las secciones se lavaron varias veces en PBS y se incubaron durante la noche a 4 ° C en soluciones de anticuerpos primarios compuestas en PBS. Las secciones se lavaron tres veces en PBS y luego se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente en una solución de anticuerpo secundario preparada en PBS durante 1 hora. Posteriormente, las secciones se lavaron de nuevo en PBS y se montaron y se deslizaron en un medio de montaje de fijación dura Vectashield (Vector; Burlingame, CA). Las imágenes digitales de las secciones se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia E-800 Nikon Eclipse conectado a una cámara de captura digital Qimaging Retiga utilizando el software NIS Elements (Nikon).

Sobre la base de estudios de PCR que demostraron un aumento de los niveles de ARNm de AGRP, nos centramos en las regiones hipotalámicas mediales, en particular el núcleo ventromedial y el núcleo arqueado (ARC)). Las secciones 12 μm de Atlas emparejadas se evaluaron para determinar la expresión y cuantificación de cFos en secciones y regiones coincidentes, en función del atlas de Paxinos y Watson [2005]. Para la cuantificación (a un aumento de 40 ×), se seleccionaron regiones emparejadas atlas. El software NIS Elements (Nikon) se utilizó para capturar una imagen del área deseada. Se estableció un área para el recuento y se estableció un umbral para los recuentos de células positivos. El área y el fondo (umbral) idénticos se utilizaron para las secciones de los grupos experimentales respectivos, y el conteo de las células positivas (cuantificación) por software se llevó a cabo en la misma sesión para todos los grupos experimentales, para evitar cambios entre las sesiones en la configuración de fondo. Para el análisis estadístico, los recuentos se tomaron de una rata individual solo si las secciones correspondientes o completas de cada área estaban disponibles; los datos para un área específica no se tomaron de una rata si había una representación bilateral incompleta para esa área.

Además de la cuantificación de cFos, se llevó a cabo una inmunohistoquímica cuantitativa de doble marca para cFos y AGRP. Debido a que no deseamos perturbar el desempeño conductual de los animales, no fueron tratados previamente con colchicina para optimizar la visualización de AGRP. Por lo tanto, la visualización de neuronas positivas para AGRP podría subestimarse. El procedimiento de tinción dual para AGRP fue comparable al ensayo de inmunorreactividad de cFos por sí solo, excepto que las secciones se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente en PBS-suero de burro al 5%. Luego, se usó una mezcla de anticuerpos primarios fos-Ab y AGRP para la incubación durante la noche a 4ºC; asimismo, ambos anticuerpos secundarios se encontraban en la misma solución y se incubaron durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Se llevaron a cabo ensayos de optimización inicial para determinar una dilución apropiada de los anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-cFos de conejo (1: 500) (sc-52) y anti-AGRP de cabra (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-conejo de burro conjugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), e IgG anti-cabra de burro Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR); todos los anticuerpos secundarios se diluyeron a 1: 500.

Análisis estadístico

Los datos del grupo se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM) en el texto, las tablas y las figuras. La significancia se define como p ≤ 0.05. Las comparaciones estadísticas se realizan entre grupos experimentales, como se presenta en "Resultados", utilizando la prueba 't' de Student no emparejada (por ejemplo, comparación de dieta, edad o tratamiento). La "normalización" de los datos se define a medida que se utilizan.

Efecto de la dieta moderada alta en grasas en la motivación peri-puberal para sacarosa

Las ratas que consumieron 31.8% de grasa en la dieta durante las semanas 5-8, mientras que en las sesiones de autoadministración, tuvieron una motivación significativamente alta para la sacarosa, en comparación con las ratas alimentadas con chow. Como se muestra en Figura 1a, no hubo diferencias en el rendimiento durante el entrenamiento inicial de FR (promedios de la palanca activa de FRDays 1-10, 38 ± 5 vs. 39 ± 2 para chow vs. 31.8% de dieta grasa, respectivamente). Sin embargo, cuando las ratas se cambiaron a la tarea de RP más estricta, hubo un aumento significativo del número de presiones de palanca activas y del número de recompensas de sacarosa tomadas, pero no en la duración total de la sesión (Figura 1b). No hubo ningún efecto del tratamiento de dieta crónica en el número de prensas de palanca inactivas. Cuando las ratas fueron alimentadas con la dieta alta en grasas durante las semanas 5-8 pero posteriormente regresaron a una dieta Chow tomada a través del entrenamiento de FR y PR durante las semanas 9-12, hubo una tendencia, pero no hubo una diferencia significativa en las prensas de palanca activas. Por lo tanto, no parece haber un efecto de arrastre conductual de una dieta moderadamente alta en grasas consumida durante el período peri-puberal. Los datos de los parámetros de PR para estas cohortes se resumen en Tabla 2. Para comenzar a dilucidar el (los) mecanismo (s) de contribución al aumento inducido por la dieta en la motivación de la sacarosa, realizamos una serie de mediciones metabólicas y del SNC.

  

Figura 1 y XNUMX

La respuesta motivada por RP para las recompensas de sacarosa aumenta en ratas peripúberas alimentadas con una dieta de 31.8% de grasa (n = 8). 1a. A lo largo de las sesiones de FR, no hubo efecto de la dieta, pero el efecto de la dieta se manifiesta cuando las ratas se cambian al paradigma PR. 1b. Los datos son ...

  

Tabla 2

Efecto de la Dieta Peri-Pubertal Alta en Grasas en el Rendimiento de Ratios Progresivos para la Sacarosa

Efecto de la dieta moderada alta en grasas en los parámetros metabólicos

Inmediatamente después de la conclusión de las pruebas de comportamiento, se determinó la composición de la grasa corporal en ratas que tuvieron la intervención de la dieta y el paradigma de comportamiento durante las semanas 5-8. Luego, las ratas recibieron cánulas intravenosas crónicas para pruebas de tolerancia a la glucosa (conscientes) IV (IVGTT). Posteriormente, se obtuvieron plasma y suero en ayunas terminales para medidas metabólicas adicionales. Como se muestra en Tabla 3, no hubo diferencias en la composición corporal, el peso corporal, la insulina en ayunas o las mediciones de glucosa, la sensibilidad a la insulina (cálculo de HOMA) o las respuestas al IVGTT, entre las ratas alimentadas con chow y las dietas con alto contenido de grasa. Las mediciones terminales de leptina y triglicéridos en ayunas no difirieron entre los dos grupos. Por lo tanto, aunque el tratamiento de la dieta tuvo un efecto significativo en la motivación de la sacarosa, refleja una respuesta de comportamiento en ratas alimentadas con alto contenido de grasa que son pre-obesas.

Efecto de la dieta moderada alta en grasas sobre la neuroquímica homeostática y de recompensa del SNC

Además de las mediciones metabólicas terminales, los cerebros de la cohorte que tuvieron tanto intervención con dieta como entrenamiento conductual durante las semanas 5-8 se midieron para los perfiles de aminas del núcleo accumbens (n ​​= 4 por grupo de dieta) o los niveles de ARNm de péptidos orexigénicos hipotalámicos. Como se muestra en Tabla 4, no hubo un efecto significativo de la dieta alta en grasas sobre los metabolitos de dopamina, norepinefrina o serotonina en el núcleo accumbens, un sitio central de recompensa y actividad motivacional (Ikemoto y Panksepp, 1996; Kelley y Berridge, 2002) en el que cada uno de estos sistemas de neurotransmisores juega un papel regulador clave. Dentro de los extractos hipotalámicos, se midieron los niveles de ARNm de los péptidos orexigénicos, NPY, AGRP y orexina. En esta cohorte se observó una tendencia fuerte pero no significativa de aumento de AGRP en las ratas alimentadas con grasa (n = 8 para cualquier dieta); por lo tanto, repetimos el paradigma de entrenamiento de dieta / comportamiento en una cohorte adicional y medimos el ARNm de NPY, AGRP y orexina en el hipotálamo. En las cohortes combinadas, observamos un aumento significativo (p <0.05) en el ARNm de AGRP en ratas alimentadas con la dieta alta en grasas frente a los controles de comida (Figura 2 y XNUMX), pero no hay cambios significativos en la expresión de NPY u orexina. Para evaluar las posibles conexiones entre la expresión de AGRP y el comportamiento de autoadministración, medimos las neuronas inmunopositivas cFos y AGRP en el hipotálamo mediobasal. Los grupos de ratas fueron alimentados con la dieta Chow o 31.8% grasa; algunos se tomaron a través del protocolo de autoadministración (semanas 5-8) y otros se manejaron como controles de comportamiento. Figura 3a muestra un ejemplo de co-localización de cFos y AGRP en una neurona de núcleo arqueado. Como se resume en Tabla 5La activación de las neuronas AGRP (coexpresión de cFos-ICC y AGRP-ICC dentro de las mismas células) se asoció con la actividad de autoadministración. Esto se demuestra en Figura 3b, donde el número de neuronas activadas (cFos-positivas) se muestra como el recuento de células neuronales, o como porcentaje del total de neuronas AGRP-positivas: hay una activación significativa de las neuronas AGRP en las ratas auto-administradas con sacarosa, frente a los controles de manejo , en los grupos de dieta combinada. Una comparación de tratamiento dentro de la dieta para el número de neuronas AGRP activadas en el grupo de autoadministración versus controles de manejo mostró una tendencia que no alcanzó significación estadística (chow, p = .078; 31.8% dieta de grasas, p = .073) . Es importante destacar que, no solo estos datos vinculan la activación neuronal de AGRP con el comportamiento de autoadministración, sino también por la sincronización de la medición de cFos (90 minutos después de que las ratas fueron colocadas en sus cámaras de autoadministración), la expresión de cFos refleja la actividad de las neuronas AGRP en anticipación de, o en el inicio de, la actividad de auto-administración. Hubo una tendencia no significativa para el aumento de neuronas positivas para AGRP totales en el grupo de autoadministración (frente a controles de manejo, p = 0.16). En esas ratas, donde el prensado de palanca se emparejó entre los grupos de dieta, el número de neuronas AGRP positivas también se emparejó. No hubo ningún efecto del tratamiento con dieta solo sobre el número de neuronas positivas para AGRP en las ratas de control conductual.

  

Figura 2 y XNUMX

Efecto de una dieta con 31.8% de grasas sobre la expresión de ARNm del péptido hipotalámico medial. Los datos están normalizados para ratas alimentadas con alto contenido de grasa (n = 17) frente a los de los controles de comida (n = 16). El ARNm de AGRP está significativamente elevado (p <0.05).

  

Figura 3 y XNUMX

Activación de las neuronas AGRP al inicio de la autoadministración de sacarosa. 3a. Co-localización de cFos y AGRP en neurona de núcleo arqueado, aumento de 60x. 3b. Número de neuronas inmunopositivas activadas (cFos-inmunopositivas) en el hipotálamo mediobasal ...

  

Tabla 4

Metabolitos de aminas de Nucleus Accumbens

  

Tabla 5

Activación de la neurona de Agrp: Dieta y tratamiento conductual

Efecto de la administración de AGRP sobre la motivación de la sacarosa

Nuestra interpretación de este hallazgo es que la expresión de AGRP en ratas puberales es un mecanismo clave que subyace a la autoadministración de sacarosa mejorada de ratas alimentadas con dieta rica en grasas. Para confirmar la eficacia de la AGRP para aumentar la motivación para la sacarosa, la AGRP se administró a través del tercer ventrículo a ratas peri-puberales alimentadas con chow durante la parte PR del paradigma de comportamiento. Este régimen de dosis de AGRP estuvo por debajo del umbral para la estimulación de la ingesta de Chow a lo largo de las dos semanas del paradigma PR, pero resultó en un aumento significativo de la autoadministración de sacarosa, como se muestra en Figura 4 y XNUMX. (Tenga en cuenta que cada recompensa de sacarosa tiene un contenido calórico de 0.1 kcal, por lo tanto, la actividad de autoadministración de sacarosa aporta calorías despreciables a la ingesta diaria total). Tabla 6 muestra datos de parámetros de autoadministración a través del paradigma de PR de 9-día, con AGRP o aCSF inyectado ICV en los Días 2, 5 y 8. En ratas tratadas con AGRP, el número de prensas de palanca activas aumentó significativamente en general en los días PR 2-10 (p = 0.03) y en los días sin inyección (p = 0.048) con una tendencia hacia un aumento en el (promedio) Días de inyección. Además, el tiempo de parada (que refleja el tiempo total dedicado a la tarea de autoadministración) se incrementó significativamente en los días sin inyección (p = 0.02) con tendencias hacia un aumento general y en los días de inyección. El número de recompensas de sacarosa se incrementó en general durante los días PR 2-10 (p = 0.03). No hubo efecto del tratamiento con AGRP en el prensado de palanca inactivo, en comparación con los controles tratados con aCSF, o entre los días de inyección y de no inyección. Los resultados apoyan una interpretación de un efecto sostenido de AGRP para aumentar la autoadministración de la sacarosa: las ratas presionaron más la palanca de recompensa, recibieron más recompensas de la sacarosa y pasaron más tiempo trabajando en la tarea.

  

Figura 4 y XNUMX

El tercer AGRP ventricular (ICV) (0.01 nmol) estimula la autoadministración de sacarosa en el paradigma PR, pero no tiene efecto en la ingesta diaria de alimentos durante el período de estudio (PR Days 2 - 10, con inyecciones en los días 2, 5 y 8) . Los datos AGRP (n = 9) se expresan ...

  

Tabla 6

Efecto de ICV AGRP en comparación con aCSF en el rendimiento de las relaciones progresivas para sacarosa

Efecto de la etapa de la vida en la preferencia y motivación por la sacarosa.

En el experimento final, evaluamos si la motivación para sacarosa difiere entre ratas puberas y adultas. Inicialmente, a las ratas 5 y 10-wk se les realizó una prueba de preferencia de sacarosa con opciones de soluciones que iban desde 0 a 20% de sacarosa, antes de comenzar las pruebas y el entrenamiento de autoadministración. Como se muestra en Figura 5ay de acuerdo con los hallazgos reportados en la literatura, las ratas prepúberes parecieron preferir una solución más dulce que las ratas adultas jóvenes: la mayoría de las ratas prepúberes tenían una ingesta máxima de 20% de solución de sacarosa, mientras que las ratas adultas mostraron una ingesta máxima de 15% sacarosa. Posteriormente, ambos grupos de edad se dividieron entre comida de rata y dieta alta en grasas durante el entrenamiento y las pruebas de autoadministración. Hubo un aumento pequeño pero estadísticamente significativo en el número de presiones de palanca activas por las ratas peri-puberales frente a las adultas (45 ± 3 vs. 37 ± 2, p = 0.05) promediadas en las sesiones de FR, sin diferencia en el número de Premios de sacarosa o número de prensas en la palanca inactiva. Como se muestra en Figura 5b, hubo un efecto global altamente significativo de la edad en todas las sesiones de PR, con un aumento significativo del prensado de la palanca activa para ratas pubertales (n = 15) frente a adultos jóvenes (n = 14) (ANOVA de vías 2, PRDay × edad; efecto de la edad, p = 0.017, ningún efecto independiente de PRDay, ninguna interacción significativa). Hubo una tendencia a un mayor efecto de la edad en la condición alimentada con dieta alta en grasas, pero esto no alcanzó significación estadística (p = .13). Tabla 7 enumera los parámetros de comportamiento de PR: además del aumento de las prensas de palanca activa, las ratas peri-puberales recibieron significativamente más recompensas de sacarosa y mostraron una tendencia hacia el aumento del tiempo de parada. Además, las ratas peri-puberales tuvieron un aumento pequeño pero significativo de las presiones sobre la palanca inactiva (es decir, no gratificante), aunque para ratas peri-puberales y adultas, el número de presiones de palanca inactivas fue aproximadamente 10% del número de palanca activa. Estos resultados sugieren que las ratas peri-puberales prefieren y buscarán con mayor avidez los alimentos de sabor dulce, y el efecto puede amplificarse con un fondo de dieta alta en grasas.

  

Figura 5 y XNUMX

Las ratas juveniles tienen mayor motivación para las recompensas de sacarosa en comparación con las ratas adultas. 5a. Pruebas de preferencia de sacarosa para ratas juveniles (peri-puberales, n = 15) y adultos jóvenes (n = 14). Las ratas tenían 30 min para beber del intervalo de concentraciones (0-20% de sacarosa). ...

  

Tabla 7

Efecto de la edad en el rendimiento de los ratios progresivos^a para sacarosa

Esta investigación fue apoyada por NIH subvención DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann es científica investigadora principal del Programa de Investigación del Laboratorio Biomédico, Departamento de Asuntos de Veteranos, Sistema de Atención Sanitaria Puget Sound, Seattle, Washington. Stephen Benoit fue apoyado por NIH DK066223 y Ethicon Endosurgery Inc. Los autores agradecen al Dr. Tami Wolden-Hanson por el apoyo con las mediciones de la composición corporal; Dr. William Banks y Lucy Dillman por su apoyo con las mediciones de triglicéridos; y Amalie Alver, y Samantha Thomas-Nadler por su ayuda con los estudios de comportamiento.

• Andersen SL, Teicher MH. Estrés, periodos sensibles y eventos madurativos en la depresión adolescente. Tendencias en neurociencia. 2008; 31: 183 – 191. ElPubMed]
• Aponte Y, Atasoy D, Sternson SM. Las neuronas AGRP son suficientes para orquestar el comportamiento de alimentación rápidamente y sin entrenamiento. Neurociencia de la naturaleza. 2011; 14: 351 – 355. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Barnes MJ, Argyropoulos G, Bray GA. La preferencia por una dieta alta en grasas, pero no la hiperfagia después de la activación de los receptores opioides mu, está bloqueada en ratones knockout para AgRP. Investigación del cerebro. 2010; 1317: 100 – 107. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Bolaños CA, Barrot M, Berton O, Wallace-Black D, Nestler EJ. El tratamiento con metilfenidato durante la pre y la periadolescencia altera las respuestas de comportamiento a los estímulos emocionales en la edad adulta. Psiquiatría Biológica. 2003; 54: 1317 – 1329. ElPubMed]
• Bolaños CA, Glatt SJ, Jackson D. Subsensibilidad a los medicamentos dopaminérgicos en ratas periadolescentes: un análisis de comportamiento y neuroquímico. Investigación del cerebro Investigación del cerebro del desarrollo. 1998; 111: 25 – 33. ElPubMed]
• Brandon CL, Marinelli M, Baker LK, White FJ. Mayor reactividad y vulnerabilidad a la cocaína después del tratamiento con metilfenidato en ratas adolescentes. Neuropsicofarmacología. 2001; 25: 651 – 61. ElPubMed]
• Brandon CL, Marinelli M, White FJ. La exposición de los adolescentes al metilfenidato altera la actividad de las neuronas de dopamina del cerebro medio de rata. Psiquiatría Biológica. 2003; 54: 1338 – 1344. ElPubMed]
• Broberger C, Johansen J, Johansson C, Schalling M, Hokfelt T. Circuitos cerebrales de la proteína relacionada con el gen del neuropéptido Y / agutí (AGRP) en ratones normales, anoréxicos y tratados con glutamato monosódico. Actas de la Academia Nacional de Ciencias. 1998; 95: 15043 – 15048. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Cason AM, Smith RJ, Tahsili-Fahadan P, Moorman DE, Sartor GC, Aston-Jones G. Papel de la orexina / hipocretina en la búsqueda de recompensas y la adicción: implicaciones para la obesidad. Fisiología y comportamiento. 2010; 100: 419–428. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Choi DL, Davis JF, Fitzgerald ME, Benoit SC. El papel de la orexina-A en la motivación de los alimentos, la conducta de alimentación basada en la recompensa y la activación neuronal inducida por los alimentos en ratas. Neurociencia 2010; 167: 11 – 20. ElPubMed]
• Cizza G, Brown RJ, Rother KI. Creciente incidencia y desafíos de la diabetes infantil. Una mini reseña. Revista de investigación endocrinológica. 2012 epub May 8, 2012. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Coldwell SE, Oswald TK, Reed DR. Un marcador de crecimiento difiere entre los adolescentes con una preferencia alta o baja en azúcar. Fisiología y comportamiento. 2009; 96: 574–580. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Benoit SC. Insulina, leptina y recompensa. Tendencias en endocrinología y metabolismo. 2010; 21: 68 – 74. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Fitzgerald MF, Clegg DJ, Lipton JW, Figlewicz DP, Benoit SC. La leptina regula el equilibrio energético y la motivación a través de la acción en distintos circuitos neuronales. Psiquiatría Biológica. 2011a; 69: 668 – 674. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Krause EG, Fitzgerald MF, Lipton JW, Sakai RR, Benoit SC. Las melanocortinas centrales modulan la actividad mesocorticolímbica y el comportamiento de búsqueda de alimento en la rata. Fisiología y comportamiento. 2011b; 102: 491–495. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Davis JF, Tracy AL, Schurdak JD, Tschop MH, Clegg DJ, Benoit SC, Lipton JW. La exposición a niveles elevados de grasa en la dieta atenúa la recompensa psicoestimulante y la rotación de dopamina mesolímbica en la rata. Neurociencia del comportamiento. 2008; 122: 1257 – 1263. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Desor JA, Beauchamp GK. Cambios longitudinales en las preferencias dulces de los humanos. Fisiología y comportamiento. 1987; 39: 639–641. [PubMed]
• Desor JA, Greene LS, Maller O. Preferencias para dulces y salados en humanos de 9 a adultos de 15 años. Ciencia. 1975; 190: 686 – 687. ElPubMed]
• Drewnowski A. Densidad de energía, palatabilidad y saciedad: implicaciones para el control de peso. Revisiones de nutrición. 1998; 56: 347 – 353. ElPubMed]
• Figlewicz DP, Bennett JL, Aliakbari S, Zavosh A, Sipols AJ. La insulina actúa en diferentes sitios del SNC para disminuir la alimentación con sacarosa aguda y la autoadministración de sacarosa en ratas. Revista Americana de Fisiología. 2008; 295: R388 – R394. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Bennett JL, Naleid AM, Davis C, Grimm JW. La insulina intraventricular y la leptina disminuyen la autoadministración de sacarosa en ratas. Fisiología y comportamiento. 2006; 89: 611–616. [PubMed]
• Figlewicz DP, Bennett-Jay JL, Kittleson S, Sipols AJ, autoadministración de sacarosa Zavosh A. y activación del SNC en ratas. Soy J Physiol. 2011; 300: R876 – R884. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Ioannou G, Bennett Jay J, Kittleson S, Savard C, Roth CL. Efecto de la ingesta moderada de edulcorantes sobre la salud metabólica de la rata. Fisiología y comportamiento. 2009; 98: 618–624. [Artículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Figlewicz DP, Sipols AJ. Señales reguladoras de energía y recompensa de alimentos. Farmacología, bioquímica y comportamiento. 2010; 97: 15 – 24. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Frangioudakis G, Gyte AC, Loxham SJ, Poucher SM. La prueba de tolerancia a la glucosa por vía intravenosa en ratas Wistar canuladas: un método robusto para la evaluación in vivo de la secreción de insulina estimulada por glucosa. Revista de Métodos Farmacológicos y Toxicológicos. 2008; 57: 106 – 113. ElPubMed]
• Hagan MM, PA corriendo, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack AM, Van Der Ploeg LHT, Woods SC, Seeley RJ. Los efectos orexigénicos a largo plazo de AgRP- (83-132) implican mecanismos distintos al bloqueo del receptor de melanocortina. Revista Americana de Fisiología. 2000; 279: R47 – R52. ElPubMed]
• Hahn TM, Breininger JF, Baskin DG, Schwartz MW. Coexpresión de Agrp y NPY en neuronas hipotalámicas activadas en ayunas. Neurociencia de la naturaleza. 1998; 1: 271 – 272. ElPubMed]
• La relación progresiva de Hodos W. como medida de la fuerza de recompensa. Ciencia. 1961; 134: 943 – 944. ElPubMed]
• Ikemoto S, Panksepp J. Disociaciones entre respuestas apetitivas y consumatorias por manipulaciones farmacológicas de regiones cerebrales relevantes para la recompensa. Neurociencia del comportamiento. 1996; 110: 331 – 345. ElPubMed]
• Jewett DC, Cleary J, Levine AS, Schaal DW, Thompson T. Efectos del neuropéptido Y, insulina, 2-desoxiglucosa y privación de alimentos en el comportamiento motivado por los alimentos. Psicofarmacología. 1995; 120: 267 – 271. ElPubMed]
• Kaushik S, Rodriguez-Navarro JA, Arias E, Kiffin R, Sahu S, Schwartz GJ, Cuervo AM, Singh R. La autofagia en las neuronas hipotalámicas AgRP regula la ingesta de alimentos y el balance energético. Metabolismo celular. 2011; 14: 173 – 183. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Kelley AE, Berridge KC. La neurociencia de las recompensas naturales: relevancia para las drogas adictivas. Diario de la neurociencia. 2002; 22: 3306 – 3311. ElPubMed]
• Kelley SP, Nannini MA, Bratt AM, Hodge CW. El neuropéptido-Y en el núcleo paraventricular aumenta la autoadministración de etanol. Péptidos 2001; 22: 515 – 522. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Kohli R, Boyd T, Lago K, Dietrich K, Nicholas L, Balistreri WF, Ebach D, Shashidkar H, Xanthakos SA. Progresión rápida de NASH en la infancia. Revista de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica. 2010; 50: 453 – 456. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Krashes MJ, Koda S, Ye CP, Rogan SC, Adams AC, Cusher DS, Maratos-Flier E, Roth BL, Lowell BB. La activación reversible rápida de las neuronas AgRP impulsa el comportamiento de alimentación en ratones. Revista de investigación clínica. 2011; 121: 1424 – 1428. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Mennella JA, Pepino MY, Reed DR. Determinantes genéticos y ambientales de la percepción amarga y las preferencias dulces. Pediatría. 2005; 115: 216 – 222. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Myers KP, Sclafani A. Desarrollo de las preferencias de sabor aprendidas. Psicobiología del desarrollo. 2006; 48: 380 – 388. ElPubMed]
• Programa de investigación aplicada del Instituto Nacional del Cáncer. Fuentes de calorías de azúcares agregados entre la población de EE. UU., 2005-06. Actualizado 21 diciembre 2010. [Acceso a 21 de septiembre 2011]; 2010 Disponible desde: http://riskfactor.cancer.gov/diet/foodsources/added_sugars/
• Nixon JP, Zhang M, Wang CF, Kuskowski MA, Novak CM, Levine JA, Billington CJ, Kotz CM. Evaluación de un sistema de imágenes de resonancia magnética cuantitativa para el análisis de la composición corporal total en roedores. Obesidad. 2010; 18: 1652 – 1659. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Ogden CL, Carroll MD. División de Encuestas de Examen de Salud y Nutrición. Prevalencia de obesidad en niños y adolescentes: Estados Unidos, tendencias 1963-1965 a través de 2007-2008. [Accedido a 21 de septiembre 2011]; Health E-Stat. 2010 2010 Disponible desde: http://www.cdc.gov/nchs/fastats/overwt.htm.
• Paxinos G, Watson C. Atlas del cerebro de rata en coordenadas estereotáxicas. 5th. San Diego CA: Elsevier Academic Press; 2005.
• Richardson NR, Roberts DC. Esquemas de relación progresiva en estudios de autoadministración de fármacos en ratas: un método para evaluar el refuerzo de la eficacia. Diario de los métodos de neurociencia. 1996; 66: 1 – 11. ElPubMed]
• Roitman MF, Stuber GD, Phillips PE, Wightman RM, Carelli RM. La dopamina funciona como un modulador subsecundario de la búsqueda de alimentos. Diario de la neurociencia. 2004; 24: 1265 – 1271. ElPubMed]
• Rossi M, Kim M, Morgan D, C pequeña, Edwards C, Sunter D, Abusnana S, Goldstone A, Russell S, Stanley S, Smith D, Yagaloff K, Ghatei M, Bloom S. Un fragmento C-terminal de Agouti- La proteína relacionada aumenta la alimentación y antagoniza el efecto de la hormona estimulante de los melanocitos alfa in vivo. Endocrinología. 1998; 139: 4428 – 4431. ElPubMed]
• Stanhope KL. Papel de los azúcares que contienen fructosa en las epidemias de obesidad y síndrome metabólico. Revisiones anuales de medicina. 2012; 63: 329 – 343. ElPubMed]
• Sturman DA, Mandell DR, Moghaddam B. Los adolescentes muestran diferencias de comportamiento con respecto a los adultos durante el aprendizaje y la extinción insturmetales. Neurociencia del comportamiento. 2010; 124: 16 – 25. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• Tracy AL, Clegg DJ, Johnson JD, Davidson TL, Woods SC. El antagonista de la melanocortina AgRP (83-132) aumenta la respuesta del apetito para un reforzador de grasa, pero no de carbohidratos. Farmacología Bioquímica y Comportamiento. 2008; 89: 263 – 271. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
• LR Vartanian, Schwartz MB, Brownell KD. Efectos del consumo de refrescos en la nutrición y la salud: una revisión sistemática y un meta-análisis. Revista Americana de Salud Pública. 2007; 97: 667 – 75. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]