Soy J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Abr; 300 (4): R876 – R884.
Publicado en línea 2011 Feb 9. doi 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Resumen
Hemos informado previamente que la administración de insulina en el núcleo arqueado del hipotálamo disminuye la motivación para la sacarosa, evaluada mediante una tarea de autoadministración, en ratas. Debido a que el patrón de activación del sistema nervioso central (SNC) en asociación con la autoadministración de sacarosa no se ha evaluado, en el presente estudio, medimos la expresión de c-Fos como un índice de activación neuronal. Se entrenaron ratas para presionar barra para sacarosa, de acuerdo con un programa de proporción fija (FR) o de relación progresiva (PR) y se mapeó la expresión de la inmunorreactividad de c-Fos en el SNC, en comparación con la expresión de c-Fos en los controles manipulados. Observamos una expresión única de c-Fos en el hipotálamo medial (los núcleos arqueado, paraventricular, retrociasmático, dorsomedial y ventromedial) en asociación con el inicio del rendimiento de PR y la expresión de c-Fos en el hipotálamo lateral y el núcleo del lecho. de stria terminalis en asociación con el inicio del rendimiento de FR. La expresión de c-Fos aumentó en el núcleo accumbens de ratas FR y PR. Nuestro estudio enfatiza la importancia de los circuitos de homeostasis de energía hipotalámica y los circuitos límbicos en el desempeño de una tarea de recompensa de alimentos. Dado el papel del hipotálamo medial en la regulación del balance energético, nuestro estudio sugiere que este circuito puede contribuir a recompensar la regulación dentro del contexto más amplio de la homeostasis energética.
El circuito mesolímbico dopaminérgico (DA), que incluye el área tegmental ventral (VTA) y las proyecciones al estriado y los sitios corticales, ha sido identificado como un papel fundamental en los aspectos motivadores o gratificantes de numerosas clases de drogas de abuso (13, 22–24, 26, 48). Investigaciones recientes de nuestro laboratorio y otros sugieren que este circuito también desempeña un papel importante en los aspectos motivadores o gratificantes de los alimentos. La interacción funcional y anatómica con los circuitos que regulan la homeostasis energética es sugerida por los informes de la modulación de la recompensa de los alimentos por el estado nutricional de los animales (10, 14, 16, 43). La modulación de la recompensa, incluida la recompensa alimentaria, por estado nutricional o metabólico, está fuertemente influenciada por las señales neuronales y endocrinas, incluida la insulina (15), leptina (11, 18, 21, 30, 32), grelina (35), hormona concentradora de melanina (MCH) (45), y orexin (5, 7): la presencia de receptores, la eficacia bioquímica y celular y la eficacia in vivo o de comportamiento de estas señales en el sistema nervioso central (SNC) se han demostrado abundantemente en los últimos años.
También se ha demostrado que el circuito límbico extendido desempeña un papel en la alimentación y la recompensa de los alimentos (2, 19, 28). Sin embargo, hay sitios contribuyentes adicionales del SNC. En particular, se sabe desde hace mucho tiempo que el hipotálamo lateral (LH) es un sitio que media las conductas de alimentación y autoestimulación (4, 31). Las neuronas orexinérgicas y la señalización de leptina en la LH se han identificado como importantes para la alimentación y la recompensa de alimentos (5, 29, 30). Recientemente observamos que la insulina administrada en el tercer ventrículo cerebral o en el núcleo arqueado del hipotálamo (ARC) podría disminuir la autoadministración de la sacarosa, pero la administración de insulina en el VTA o el núcleo accumbens no tuvo ningún efecto en este paradigma de recompensa específico (15). Por lo tanto, parece que los múltiples sitios hipotalámicos pueden desempeñar un papel importante en la búsqueda y adquisición motivadas de alimentos, y en concordancia con esto, se podría suponer que las regiones hipotalámicas se activan sustancialmente en asociación con la autoadministración de alimentos. Para comenzar a probar esta hipótesis, hemos mapeado la expresión de c-Fos en el SNC de ratas entrenadas en un paradigma de autoadministración de sacarosa, después del entrenamiento de relaciones fijas (FR), o después del entrenamiento de relaciones progresivas (PR), una tarea más estricta para evaluar la motivación (20).
MATERIALES Y MÉTODOS
Asignaturas.
Los sujetos fueron ratas albinas macho (325-425 g) de Simonsen (Gilroy, CA). Las ratas se mantuvieron con comida ad libitum. Se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con luces encendidas a las 6 a.m. y se entrenaron y probaron entre las 7 a.m. y el mediodía, en la condición posprandial y postabsorción. Todos los procedimientos realizados en las ratas siguieron las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado de los animales y fueron aprobados por el Subcomité de Cuidado y Uso de Animales del Comité de Investigación y Desarrollo del Sistema de Atención Médica VA Puget Sound.
La autoadministración de sacarosa.
Los procedimientos se basaron en nuestra metodología publicada (15) y se llevaron a cabo en ratas alimentadas. El experimento incluyó tres fases: autoconfiguración para iniciar el entrenamiento, entrenamiento en FR y entrenamiento en relaciones progresivas (PR) utilizando el algoritmo de relaciones públicas de Richardson y Roberts (38). El algoritmo de PR requiere 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, como sea. etc) las prensas de palanca para obtener entregas de recompensa en una sesión (38). Las ratas fueron entrenadas para autoadministrarse 5% de sacarosa (recompensa de 0.5 ml) administradas en un recipiente de gotas de líquido. Las cajas operantes, controladas por un sistema Med Associates (Georgia, VT), tenían dos palancas, pero solo una palanca (una palanca activa y retráctil) activaba la bomba de infusión. Las prensas en la otra palanca (una palanca inactiva, estacionaria) también se registraron. Como hemos observado anteriormente, el número de prensas en la palanca inactiva fue muy bajo (menos que las prensas / sesiones 10). La solución de sacarosa se administró en un recipiente de gotas de líquido para consumo oral (Med Associates, St. Albans, VT). El entrenamiento inicial se llevó a cabo durante las sesiones de 1-h bajo un programa de refuerzo continuo (FR1: se reforzó cada presión de palanca). Cada sesión comenzó con la inserción de la palanca activa y la iluminación de una luz de la casa blanca que permaneció encendida durante toda la sesión. Un tono compuesto discreto de 5 (2900 Hz, 20 dB por encima del fondo) y luz clara (luz blanca de 7.5 W sobre la palanca activa) acompañó cada entrega de recompensa, con un tiempo de espera de 20 que comienza con la entrega de sacarosa. El entrenamiento en FR se realizó para los días 10; La respuesta estable se logra en la quinta sesión. Se llevó a cabo el entrenamiento de PR para un máximo de 3 h / día posible para los días de 10. Las sesiones de relaciones públicas terminaron después de que 30 no respondiera a la presión de la palanca activa, momento en el cual la luz de la casa se apagó automáticamente y la palanca activa se retrajo; las ratas fueron sacadas de las cámaras y devueltas a sus jaulas. "Stop time" reportado en Tabla 2 representa el momento en que se apagó el sistema; por lo tanto, la última presión de la palanca activa habría ocurrido 30 min antes de la hora de parada. Datos de comportamiento (Tabla 2) representan los promedios de sesiones 6–10 para entrenamiento en FR, y sesiones 1–9 para la formación de relaciones públicas. Se tomaron ratas con control de la sala de alojamiento y se colocaron en una cámara operante limpia con la luz de la casa encendida durante 60 min, dentro de la sala de procedimientos, para simular el manejo y las experiencias de sala de la sacarosa autoadministrada de ratas. No se les dio nada para comer o beber mientras estaban en las cajas operantes, y no tenían acceso a las palancas.
En el último día, las ratas se colocaron en las cámaras según los días de entrenamiento y se mantuvieron en las cámaras durante 90 min, después de lo cual se retiraron, para anestesia, perfusión y posterior inmunohistoquímica. Asimismo, las ratas de control se llevaron a la sala de procedimientos y se mantuvieron en una cámara operante limpia, según los días de entrenamiento, durante 90 minutos, después de lo cual fueron anestesiadas y perfundidas. Inmediatamente después de esa última sesión de 90 minutos, las ratas fueron profundamente anestesiadas con inhalación de isoflurano y perfundidas con NaCl al 0.9% seguido de una solución fría de paraformaldehído al 4%. El momento para la anestesia y la eutanasia se basó en el curso temporal conocido del pico de expresión de la proteína c-Fos entre 90 y 120 minutos después del evento. Por lo tanto, la expresión de c-Fos reflejaría la activación del SNC al inicio de la tarea conductual, en lugar de ser el resultado de que los animales experimenten la tarea e ingieran sacarosa. Se extrajeron cerebros y se fijaron posteriormente en paraformaldehído durante varios días; luego, se colocaron posteriormente en sacarosa-PBS al 20%, después de lo cual se colocaron en solución de sacarosa-PBS al 30%. Los cerebros se seccionaron en un criostato (criostato Leica CM 3050S) para inmunohistoquímica.
Inmunohistoquímica y cuantificación de c-fos.
Utilizamos nuestra metodología establecida para cuantificar la proteína c-Fos inmunorreactiva en secciones del cerebro (12). Se realizó una evaluación cualitativa inicial de todo el cerebro para determinar la expresión de c-fos. Las secciones coronales de cerebro completo 12-μm montadas en portaobjetos se lavaron 3 veces en PBS (Oxoid, Hampshire, Reino Unido). Las secciones se bloquearon para 1 h a temperatura ambiente en PBS que contenía 5% de suero normal de cabra o burro. Luego, las secciones se lavaron varias veces en PBS y se incubaron durante la noche a 4 ° C en soluciones de anticuerpos primarios compuestas en PBS. Las secciones se lavaron tres veces en PBS y luego se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente en una solución de anticuerpo secundario preparada en PBS para 1 h. Posteriormente, las secciones se lavaron de nuevo en PBS y se montaron y la cubierta se deslizó en medio de montaje Vectashield hard set mount (medio de montaje Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las imágenes digitales de las secciones se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia E-800 Eclipse de Nikon conectado a una cámara Optiphot y utilizando el software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Posteriormente, nos centramos en un número limitado de áreas que mostraban una diferencia aparente entre las condiciones, para la cuantificación y para el fenotipado neuronal. Específicamente, nos enfocamos en el núcleo y la cubierta del núcleo accumbens (NAc); núcleo de lecho anterior y posterior de la estría terminal (aBNST, pBNST); regiones hipotalámicas mediales [núcleo ventromedial (VMH), hipotálamo dorsomedial (DMH), núcleo paraventricular (PVN), área retrociasmática (RCh) y ARC]; hipotálamo lateral (LH), incluidas las regiones dorsal y ventral y el área periforniana (peF); VTA; tallo cerebral [olivo inferior, núcleo hipogloso (nXII) del tracto solitario, núcleo reticular lateral y núcleos de adrenalina / noradrenalina C1 / A1]. Las secciones de 12-μm emparejadas en atlas se evaluaron para determinar la expresión y cuantificación de c-Fos en secciones y regiones emparejadas, según el atlas de Paxinos y Watson (34). Por favor mira Tabla 1 Para coordenadas estereotáxicas específicas. El enfoque principal de los ensayos fue comparar cada tarea de comportamiento con su control respectivo (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Para optimizar las posibles diferencias en función del comportamiento frente a las condiciones de control, se seleccionaron los analizadores de rendimiento de los grupos PR y FR. Por lo tanto, se analizaron las ratas 4 / 12 PR y 3 / 12 FR: estas ratas tenían un número de presión de palanca activa (el punto final del comportamiento primario) que era mayor que una desviación estándar por encima de la media para su grupo de comportamiento respectivo. También se analizó un subcohorte de las ratas de control (ratas 5 PRC y 3 FRC, presentes en la sala de procedimientos al mismo tiempo que las ratas FR o PR). Se tomó un grupo adicional de tres ratas mediante el procedimiento FR ("FRext") para imitar la duración adicional del procedimiento PR (es decir, para un total de días 20, ya que las ratas PR se toman a través de FR y luego PR) para evaluar si Las diferencias entre FR y PR se debieron a la tarea de comportamiento o la duración del procedimiento. Los cerebros de FRext no se analizaron y seleccionaron sistemáticamente, pero se analizaron regiones de interés específicas con los otros cuatro grupos, para permitir la cuantificación comparativa, como se indica específicamente en los resultados.
Para la cuantificación (en el aumento de 40 ×), se seleccionaron regiones emparejadas atlas. Se utilizó el software ImagePro Plus (Media Cybernetics) para capturar una imagen del área deseada. Se definió un área para el recuento y se estableció un umbral para los recuentos de células positivos. El área y el fondo (umbral) idénticos se utilizaron para las secciones de los grupos experimentales respectivos, y el conteo de las células positivas (cuantificación) por software se llevó a cabo en la misma sesión para todos los grupos experimentales, para evitar cambios entre las sesiones en la configuración de fondo. Para el análisis estadístico, los recuentos se tomaron de una rata individual solo si las secciones correspondientes o completas a través de cada área (como se define en Tabla 1) estaban disponibles; los datos para un área específica no se tomaron de una rata si hubiera una representación bilateral incompleta para esa área.
Análisis cualitativo de inmunofluorescencia de doble marcaje.
Se tomaron secciones de cerebro de las ratas en las que se cuantificó c-Fos, para inmunohistoquímica de doble marcaje. Debido a que no deseamos alterar el comportamiento de los animales, no fueron tratados previamente con colchicina para optimizar la visualización de los neurotransmisores peptídicos. Por tanto, la visualización de los fenotipos neuronales activados en asociación con la tarea de autoadministración fue limitada. Sin embargo, para comenzar la evaluación de los fenotipos de neuronas activadas en varias ubicaciones del SNC, se tomaron imágenes digitales (adquiridas como se describe en la sección anterior) con un aumento de 20 ×, 40 × o 60 × (como se indica en las leyendas de las figuras) . El procedimiento de tinción doble para glutamato descarboxilasa (GAD), tirosina hidroxilasa (TH), CRF, neuropéptido Y (NPY), péptido relacionado con Agouti (AgRP) y triptófano hidroxilasa fue comparable al ensayo de inmunorreactividad de c-Fos en su propia, excepto que se utilizó una mezcla de c-Fos-Ab y uno de los otros anticuerpos primarios para la incubación durante la noche a 4ºC; asimismo, ambos anticuerpos secundarios se encontraban en la misma solución y se incubaron durante 1 h en oscuridad a temperatura ambiente. Se utilizó un lavado con etanol al 20% durante 50 minutos antes de la etapa de bloqueo para el ensayo de orexina. Se llevaron a cabo ensayos de optimización inicial para determinar una dilución apropiada de los anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-c-Fos de conejo (1: 500) (sc-52) y anti-c-Fos de ratón (1: 800) (ambos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-GAD de ratón (1: 1,000), anti-tirosina hidroxilasa de ratón (1: 500) y anti-triptófano hidroxilasa de oveja (todos de Chemicon, Temecula, CA); anti-CRF de conejo (1: 500) (obsequio del Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); anti-NPY de conejo (1: 1,000), anti-AGRP de conejo (1: 1,000) y anti-orexina A de cabra (1: 5,000) todos de Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-conejo o anti-ratón de cabra conjugados con Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), IgG anti-oveja anti-conejo o anti-conejo o burro de cabra Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) ; todos los anticuerpos secundarios se diluyeron a 1: 500. La inmunotinción dual de c-Fos / MCH se ensayó en serie; primero, para MCH (anticuerpo primario 1: 2,500, Millipore) con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra Alexa-488 (1: 500). Los portaobjetos se volvieron a bloquear con suero de cabra normal al 5% y se tiñeron para anti-c-Fos (1: 500) y anti-conejo de cabra cy3 como anticuerpo secundario. Se utilizó un lavado con etanol al 20% durante 50 minutos antes de la etapa de bloqueo para el ensayo de MCH.
Análisis estadístico.
Los datos de grupo se presentan como medias ± SE en el texto, tablas y figuras. La significación se define como P ≤ 0.05. Las comparaciones estadísticas se hacen entre grupos experimentales (FR vs. PR) o entre grupos experimentales y controles correspondientes (PR vs. PRC; FR vs. FRC) utilizando Student's no apareados. t-prueba. Los coeficientes de correlación de Pearson entre las presiones de palanca activa y la expresión de c-Fos en diferentes regiones del cerebro, así como la correlación de la expresión de c-Fos entre varias regiones del cerebro en condiciones experimentales idénticas, se calcularon utilizando el programa de análisis estadístico StatPlus: mac LE para la versión de Mac OS 2009 por AnalystSoft. Probamos las correlaciones lineales (Pearson R estadística) entre la expresión de c-Fos en diferentes regiones del SNC. También examinamos las correlaciones entre la expresión de c-Fos en diferentes regiones CNS activadas y el comportamiento. Los datos de FR y PR de ratas, para los cuales se realizó la cuantificación de c-Fos, se utilizaron para estas correlaciones.
RESULTADOS
Cuantificación de c-fos.
Como hemos observado anteriormente, el número de presiones de palanca activas fue significativamente mayor para el rendimiento de PR frente a FR (Tabla 2), y el número de recompensas de sacarosa fue mayor durante el desempeño de FR. La duración de la sesión para las ratas PR fue aproximadamente 90 min (tiempo de parada - 30). Tabla 3 enumera los recuentos de células inmunoreactivas de c-Fos en todas las regiones del SNC donde se realizó la cuantificación. El patrón de expresión de c-Fos para las ratas FR y PR se resume en . Hubo activación significativa del hipotálamo medial (MHa , un compuesto de ARC, PVN, RCh, DMH y VMH) de ratas enganchadas en la palanca PR para sacarosa, pero sin activación general en ratas enganchadas en la palanca FR para sacarosa, en comparación con los controles respectivos. Dentro del hipotálamo medial de ratas PR, esta activación ocurrió en el PVN, ARC y VMH ( ). Presionar la palanca FR, pero no presionar la palanca PR, se asoció con una activación significativa dentro de la LH (basada predominantemente en la activación dentro del área periforniana). Tanto las presiones de palanca activas como la expresión hipotalámica de c-Fos fueron comparables entre los grupos FRext y FR (MHa , 946 ± 26 y 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 y 186 ± 10; LHa , 468 ± 79 y 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 y 173 ± 15, respectivamente), lo que sugiere que la diferencia en el patrón de expresión entre los grupos de FR y PR no se relaciona con la duración de la capacitación / experiencia sino con la naturaleza de la tarea instrumental. Para el grupo de FR, hubo un aumento significativo en la expresión de c-Fos en el BNST, observado tanto en aBNST como en pBNST. Tanto el prensado de palanca FR como PR se asociaron con un aumento de las neuronas inmunopositivas C-Fos en la capa NAc; Los recuentos de c-Fos aumentaron significativamente en el núcleo NAc de ratas comprometidas en el presionado de la palanca FR, con una tendencia no significativa hacia una mayor expresión de c-Fos en ratas involucradas en el presionado de la palanca PR. c-Fos no aumentó en el VTA con la tarea PR, aunque se observó una tendencia no significativa hacia un aumento con la tarea FR. Finalmente, c-Fos aumentó significativamente en el núcleo hipogloso (nervio craneal XII) en el tronco cerebral de ratas entrenadas para RP, pero no para FR.
La expresión de c-Fos se observó en otras regiones del SNC, incluidas la amígdala y la corteza cerebral ( ). Sin embargo, la expresión se observó tanto en las condiciones de control como en asociación con las tareas de PR y FR, lo que sugiere que los aspectos no específicos del procedimiento (manejo, movimiento en la sala de procedimientos) podrían haber resultado en esta activación. No se realizó cuantificación en estas regiones. Del mismo modo, se observó activación en regiones del tronco cerebral distintas de nXII, pero se produjo en asociación con condiciones de control y relacionadas con la tarea, lo que también sugiere un papel en la activación no específica o la activación del comportamiento.
Probamos las correlaciones entre la expresión de c-Fos en diferentes regiones del SNC. Combinando datos de grupos de presión de palanca, encontramos una correlación negativa entre la expresión de c-Fos en la LH y la VMH; por lo tanto, la activación del VMH se asoció con una disminución de la activación general del LH (Pearson R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Además, observamos una correlación positiva significativa entre la expresión de c-Fos en la región perifornical de la LH y el VTA (Pearson R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), consistente con la conectividad monosináptica conocida entre estas dos regiones (vea la discusión en Refs. 2 y 13). Encontramos una correlación negativa significativa entre la expresión de c-Fos en el VTA frente al NAc-shell, ya sea que se hayan probado por separado para el rendimiento de FR (Pearson R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) o para el desempeño de relaciones públicas (Pearson R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), consistente con las entradas recíprocas conocidas entre las regiones estriatales a la sustancia negra y VTA (2, 13). También probamos las correlaciones entre la expresión de c-Fos en diferentes regiones del SNC y el comportamiento. Combinando los datos de los grupos de presión de palanca, observamos una correlación positiva significativa entre c-Fos en el ARC y las presiones de palanca activas (Pearson R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identificación de neuronas activadas con ingesta de sacarosa y motivación para la sacarosa.
En el tronco cerebral, las neuronas positivas para c-Fos no mostraron una inmunotinción positiva para la TH, la enzima limitante de la velocidad para la epinefrina y la norepinefrina (y la dopamina); por lo tanto, estas neuronas catecolaminérgicas no parecían estar activadas por las tareas de FR o PR. Sin embargo, algunas neuronas positivas para c-Fos mostraron una inmunotinción positiva para la triptófano hidroxilasa, lo que indica que se activó una población de neuronas de serotonina. Como se muestra en , en el ARC, los cuerpos celulares positivos para c-Fos estaban rodeados por fibras teñidas con AGRP, y se observó un patrón similar para la inmunotinción de fibra NPY / c-Fos (no se muestra). En el PVN, las neuronas positivas para c-Fos parecían rodear a las neuronas positivas para CRF, pero no se observó colocalización (datos no mostrados). muestra inmunotinción para orexina y MCH en la LH. Las neuronas de Orexin se encontraron tanto en el dLH como en el peLH. Aunque observamos neuronas MCH positivas en la peLH, no hubo esencialmente colocalización con c-Fos en esa región de la LH. Sin embargo, observamos la colocalización de c-Fos en neuronas positivas para orexina dentro de la peLH ( , parte superior), y muy limitada la colocalización de c-Fos con MCH en el vLH ( , fondo). Se debe volver a enfatizar que tanto la localización como la colocalización con c-Fos se pueden subestimar para los neurotransmisores peptídicos como la CRH, porque las ratas no se pretrataron con colchicina. Finalmente, dentro del núcleo accumbens núcleo y concha ( ), se observó una combinación de c-Fos con GAD, la enzima sintética para el neurotransmisor GABA, tanto para ratas FR como para PR. Hubo tinción robusta para TH dentro del VTA; sin embargo, las neuronas positivas para c-Fos se observaron raramente y no parecieron colocarse exclusivamente con TH.
DISCUSIÓN
En el presente estudio, utilizamos la expresión del gen temprano inmediato, c-Fos, para evaluar el patrón de activación aguda del SNC asociada con el inicio de la actividad de presionar la palanca de autoadministración de sacarosa, ya sea como una tarea relativamente no exigente (FR) o tarea progresivamente más desafiante, pensada para reflejar la búsqueda motivada de una recompensa, como la sacarosa, y para involucrar fuertemente a los circuitos límbicos (22, 24, 49) (PR). Los patrones hipotalámicos de activación difirieron entre las dos tareas, predominando la activación de LH / límbica en la tarea de FR y la activación límbica medial y predominando en la tarea de PR (ver ). Hay varias razones posibles para esto. Primero, estos paradigmas podrían "mapearse" como experiencias cualitativamente diferentes en el SNC. Las ratas entrenadas en el rendimiento de FR estarían esperando una actividad fácil y de alta recompensa. La anticipación de un alimento gratificante debería influir fuertemente en el patrón de c-Fos observado en las ratas FR. La aparente diferencia cualitativa en el patrón de activación sugiere que es menos probable una segunda posibilidad, que los animales de relaciones públicas simplemente tengan más experiencia con la tarea, y esto fue respaldado por nuestra medición de c-Fos en el hipotálamo de ratas que recibieron sesiones de 20 FR , que mostró actividad similar al grupo FR, no al grupo PR. Ambas posibilidades podrían probarse aumentando sistemáticamente la dificultad de la capacitación en FR y evaluando los cambios en la activación del SNC, en cuyo caso, se podría predecir un cambio cualitativo en el patrón de activación. Sin embargo, mientras que el número de experiencias de entrenamiento puede no tener en cuenta el patrón de activación del SNC, el número promedio de recompensas de sacarosa en una sesión podría: la tarea de RP podría aprenderse simplemente como una experiencia "menos gratificante", y esto podría estar vinculado funcionalmente con el Falta de activación de LH. Por lo tanto, el patrón de activación del SNC al inicio de la sesión podría reflejar un estado interoceptivo, como el del paradigma de lugar condicionado: la fuerza de activación dentro de los circuitos límbicos está vinculada al aprendizaje y la motivación. Observamos la variabilidad de la expresión de c-Fos en el hipotálamo medial de los animales FRC. Particularmente dentro del PVN, esta variabilidad podría estar enmascarando la activación en las ratas FR, por lo que se observó una tendencia hacia el aumento de c-Fos frente a ratas FRC (Tabla 3). Sin embargo, la activación hipotalámica medial general no difirió entre los animales FR y FRC.
Se debe tener en cuenta que aunque nuestro objetivo fue identificar los sitios del SNC que contribuyen al inicio del comportamiento, la resolución temporal es, en cierta medida, una consideración. Como se analiza a continuación, ahora se aprecia que diferentes subcomponentes de conductas instrumentales u operativas están mediadas por la activación de diferentes poblaciones de neuronas (13, 23, 33, 49). No podemos descartar por completo que la activación debido a una presión de barra muy inmediata o la pérdida de recompensas podría haber contribuido de alguna manera a los patrones de activación que observamos. Nuestros hallazgos proporcionan la base para una mayor investigación sobre las funciones de los sitios específicos del SNC en diferentes aspectos o componentes de la tarea de autoadministración, y para dichos estudios, la medición de otros genes tempranos inmediatos con diferentes cursos de tiempo "on" y "off" (36) Será muy útil.
Las correlaciones que encontramos en la expresión de c-Fos entre diferentes regiones del cerebro son compatibles con la conectividad funcional conocida de las regiones límbicas hipotálamicas y primarias para esta tarea de recompensa particular, como entre la LH y la VMH, y entre la región periforniana de la LH y la VTA. (ver discusión en Refs. 2 y 13). También examinamos las correlaciones entre la expresión de c-Fos en diferentes regiones activadas y el comportamiento. La correlación entre c-Fos en el ARC y las presiones de palanca activas se ajusta al papel bien definido de la actividad del ARC en la ingesta de alimentos (1); con nuestra observación previa de que la inyección de insulina específicamente en el ARC redujo la autoadministración de la sacarosa (15); con informes previos sobre el papel crítico del CRA y sus neuronas endorfinérgicas en la adquisición y el rendimiento de la autoadministración de cocaína (40–42); y con las proyecciones identificadas del ARC a la NAc (17). Por lo tanto, es probable que el ARC desempeñe un papel clave en el comportamiento motivado para buscar y obtener muchos tipos de estímulos gratificantes, incluidos, entre otros, los alimentos. Finalmente, observamos una activación significativa de PVN y VMH con el inicio de la búsqueda de sacarosa PR. Esto es consistente con los roles bien caracterizados de estos núcleos hipotalámicos mediales en la regulación de la ingesta de alimentos, la conectividad sináptica directa con el ARC y las conexiones identificadas con el circuito límbico (1, 27, 37).
Encontramos una correlación negativa significativa entre la expresión de c-Fos en el VTA frente a la shell NAc, ya sea que se haya probado el rendimiento de FR o PR. Fue algo sorprendente que no se observara una activación de VTA más fuerte en asociación con la autoadministración de sacarosa PR o FR (frente a los controles respectivos). Quizás este hallazgo refleje el tiempo de nuestra medición, centrándose en los sitios CNS potenciales activos al inicio de la tarea, para los cuales estos animales estaban bien entrenados. Esto sería consistente con las observaciones y tesis de Schultz (44), que la activación neuronal de dopamina sirve como marcador de estímulos o recompensas inesperados, y esta activación disminuye en asociación con el entrenamiento. Sin embargo, se ha demostrado que la liberación de dopamina estriatal durante la toma de sacarosa en animales entrenados se presenta como un evento muy preciso y temporalmente discreto (39). Por lo tanto, es posible que las tendencias que observamos sean muy significativas con un grupo de estudio más grande (es decir, más poder estadístico). Observamos la activación de NAc en asociación con el inicio de la toma de sacarosa FR y PR. Tanto la activación como la inhibición de las neuronas NAc se informaron en asociación con el rendimiento de la recompensa instrumental, y el patrón de activación / actividad depende del entrenamiento y el entorno, y está asociado con diferentes componentes del comportamiento (por ejemplo, orientación, enfoque, ingesta) (6, 33, 50). Como se discutió anteriormente, la medición de c-Fos no capturaría tal actividad específica. Carlezon ha propuesto que la "recompensa" está asociada predominantemente con una disminución en la actividad de las neuronas NAc, es decir, neuronas espinosas medias (3). Esto no es coherente con nuestras observaciones: NAc c-Fos sustancialmente mejorado en comparación con los controles de manejo y las neuronas positivas para c-Fos colocalizadas con GAD, compatibles con la activación de neuronas espinosas medias (GABAergic); ". Tanto la activación como la inhibición de NAc pueden ocurrir durante las tareas instrumentales, con especificidad tanto anatómica como temporal. Desde la perspectiva de este estudio, se puede concluir que la NAc está involucrada en el inicio de la toma instrumental de sacarosa, con el núcleo de la NAc contribuyendo a la activación motora y la cubierta de la NAc contribuyendo a los aspectos motores y motivacionales de la tarea.
También observamos la activación de ambas regiones principales de la BNST (anterior y posterior) en ratas FR. El BNST es una porción del circuito límbico que modula las respuestas neuroendocrinas a experiencias de estímulo repetidas (8, 9), y en un sentido más amplio, se asocia con el aprendizaje sobre estímulos recurrentes. Si bien su función se ha dilucidado de manera más amplia en relación con las experiencias repetitivas de estrés, nuestro hallazgo sugiere una función más amplia para el BNST: el BNST puede modular las respuestas del SNC a estímulos positivos recurrentes, así como a estímulos negativos o estresantes. Dado que observamos esta activación al inicio del rendimiento de FR, pero no de PR, el reclutamiento de BNST puede estar vinculado al aumento de las recompensas de sacarosa de la capacitación de FR. Nuestra observación de que no hay activación directa de las neuronas CRF sugiere que la respuesta instrumental para la sacarosa no es un factor estresante importante; sin embargo, la expresión de c-Fos en otras neuronas PVN es consistente con la modulación de los circuitos de estrés (46). De hecho, Ulrich-Lai y sus colegas informaron que, utilizando un paradigma de alimentación / alimentación diferente, la ingesta de sacarosa modula la función de PVN (47). Finalmente, observamos la activación del núcleo del nervio hipogloso en asociación con PR pero no con el desempeño de FR. El significado de esto solo puede ser especulado sobre esto; Una posibilidad es que la relevancia del sabor de la sacarosa puede aumentar en ratas que ingieren menos recompensas de sacarosa.
La búsqueda de sacarosa y la toma de sacarosa se deben considerar como una experiencia multimodal, dinámica en el tiempo, ya que la ingestión daría como resultado señales periféricas relacionadas con el contenido calórico de la sacarosa, así como la habituación y la aliestesia dentro de la sesión (25). Si bien nuestra investigación se ha centrado en la influencia de las señales endocrinas periféricas, es decir, la insulina y la leptina, para modular la recompensa de los alimentos, sus efectos pueden, a su vez, ser mediados directamente por transmisores y neuropéptidos que desempeñan un papel en el corto o largo plazo. Alimentación o recompensa de comida (ver discusión en la ref. 14). El estudio actual proporciona una idea de esto; observamos cierta activación de las neuronas que expresan MCH u orexina, dos neuropéptidos que son orexigénicos. De hecho, estos hallazgos pueden subestimar el papel de la MCH o la orexina en la recompensa de los alimentos, ya que la inmunocitoquímica en ratas no tratadas con colchicina sin duda limitó la visualización de estos dos neuropéptidos. La identificación de las neuronas de orexina activadas en la LH es consistente en general con los numerosos estudios que implican a las neuronas de orexina en la alimentación, la recompensa de alimentos y la recompensa de estímulos más generalizada (por ejemplo, 5, 7, 29). Observamos activación de neuronas de peFLH orexina. Aston-Jones y sus colegas (5) han diseccionado los roles de diferentes poblaciones de neuronas LH orexin en el comportamiento de recompensa y han implicado a las neuronas peFLH orexina en la activación, en oposición a la recompensa per se. Nuestro hallazgo, por lo tanto, sugiere un papel para la orexina LH en la excitación, y tal vez la orientación hacia la palanca activa o señales para la toma de sacarosa.
Digno de consideración futura es la singularidad o generalización de la sacarosa como estímulo gratificante. Queda por determinar si el patrón de activación temprana del SNC que informamos aquí es específico para los alimentos como estímulo, o generaliza a otros estímulos gratificantes. Como se mencionó anteriormente, particularmente en la tarea de FR, se esperaría que la ingestión de una serie de recompensas de sacarosa tenga consecuencias metabólicas, con modulación de la liberación de hormonas (por ejemplo, colecistoquinina, grelina, insulina) y cambios en la activación neural periférica y del SNC. No se esperaría que estos cambios desempeñen un papel directo en los patrones iniciales de activación del SNC que medimos, pero pueden jugar un papel en el aprendizaje sobre la recompensa de sacarosa durante el entrenamiento. Nuevamente, los neuropéptidos como la orexina pueden estar implicados críticamente.
Nuestro estudio representa, a nuestro entender, la primera demostración de la activación de núcleos hipotalámicos mediales específicos al inicio de la autoadministración de sacarosa, que incluye tanto el PVN, implicado en la homeostasis como la respuesta al estrés, y el ARC, que es crítico para la homeostasis energética. Detección de nutrientes, y regulación de la ingesta de alimentos. De manera importante, observamos la activación del hipotálamo medial y la NAc, en asociación con el inicio de PR, lo que sugiere que tanto los sitios homeostáticos como los límbicos desempeñan un papel en el inicio de la autoadministración de la sacarosa. Se pueden reclutar sitios adicionales de circuitos límbicos en un momento posterior de la tarea.
Perspectivas y significado
Mientras que, históricamente, los estudios de conductas motivacionales y de recompensa implicarían más fuertemente los circuitos límbicos del SNC, se ha acumulado una gran cantidad de evidencia que enfatiza la interacción funcional crítica entre los circuitos de homeostasis límbica y energética. El estudio actual ahora sugiere la probable importancia de núcleos hipotalámicos mediales específicos en el trabajo motivado para sacarosa. Extrapolando de este estudio, futuros estudios pueden evaluar si el papel del hipotálamo medial es un requisito y si su activación está implicada en la búsqueda motivada de otras recompensas, como las drogas de abuso. Además, los hallazgos de este estudio proporcionan la razón para estudiar las alteraciones de los comportamientos motivados en circunstancias concomitantes con la fisiología hipotalámica medial alterada, como en la obesidad.
SUBVENCIONES
Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud Grant DK40963. La Dra. Dianne Figlewicz Lattemann es científica investigadora principal del Programa de Investigación del Laboratorio Biomédico del Departamento de Asuntos de Veteranos del Sistema de Salud de Puget Sound, Seattle, Washington. El Dr. Sipols cuenta con el apoyo del Consejo de Ciencias de Letonia 04.1116.
DIVULGACIONES
Ningún conflicto de intereses, financieros o de otro tipo, son declarados por los autores.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a los Dres. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius y JE Blevins por consejos y discusiones útiles.
Referencias
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