Papel de la ghrelina en la recompensa de alimentos: impacto de la ghrelina en la autoadministración de sacarosa y la expresión del gen del receptor de dopamina mesolímbica y acetilcolina (2012)

PMCID: PMC3298643

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Resumen

La decisión de comer está fuertemente influenciada por factores no homeostáticos como la palatabilidad de los alimentos. De hecho, el valor gratificante y motivador de los alimentos puede anular las señales homeostáticas, lo que lleva a un mayor consumo y, por lo tanto, a la obesidad. La grelina, una hormona orexigénica derivada del intestino, tiene un papel destacado en la alimentación homeostática. Recientemente, sin embargo, ha surgido como un potente modulador de la vía de recompensa dopaminérgica mesolímbica, lo que sugiere un papel de la grelina en la recompensa alimentaria. Aquí, buscamos determinar si la grelina y sus receptores son importantes para reforzar la motivación para la recompensa natural del azúcar al examinar el papel de la estimulación y el bloqueo del receptor de grelina (GHS-R1A) para el condicionamiento operante de la proporción progresiva de sacarosa, un procedimiento utilizado para medir el impulso motivacional para obtener una recompensa. La grelina administrada central y periféricamente aumentó significativamente la respuesta operante y, por lo tanto, la motivación de incentivo para la sacarosa. Utilizando el antagonista de GHS-R1A JMV2959, demostramos que el bloqueo de la señalización de GHS-R1A disminuyó significativamente la respuesta operante a la sacarosa. Además, investigamos los efectos de la grelina en los nodos de recompensa mesolímbicos clave, el área tegmental ventral (VTA) y el núcleo accumbens (NAcc), mediante la evaluación de los efectos del tratamiento con grelina central crónica en la expresión de genes que codifican los principales receptores de neurotransmisores de recompensa, a saber, dopamina y acetilcolina. El tratamiento con grelina se asoció con un aumento de la expresión del gen del receptor de dopamina D5 y del receptor de acetilcolina nAChRβ2 en el VTA y una disminución de la expresión de D1, D3, D5 y nAChRα3 en el NAcc. Nuestros datos indican que la grelina juega un papel importante en la motivación y el refuerzo de la sacarosa y tiene un impacto en la expresión de genes que codifican dopamina y acetilcolina en el circuito de recompensa mesolímbico. Estos hallazgos sugieren que los antagonistas de la grelina tienen potencial terapéutico para el tratamiento de la obesidad y para suprimir el consumo excesivo de alimentos dulces.

Palabras clave: Acetilcolina, dopamina, motivación de los alimentos, grelina, GHS-R1A, acondicionamiento operante

INTRODUCCIÓN

Está bien establecido que la hormona circulante grelina desempeña un papel importante en la regulación del equilibrio energético (Kojima et al. 1999; Nogueiras, Tschöp y Zigman 2008). Liberado principalmente por el estómago (Dornonville de la Cour et al. 2001), la grelina provoca potentes efectos orexigénicos tanto en roedores como en el hombre (Reyezuelo et al. 2000, 2001) a través de la estimulación de su receptor del sistema nervioso central (SNC) (Saloméet al. 2009a), el receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento (GHS-R1A) (Howard et al. 1996). De hecho, la grelina se dirige a los circuitos hipotalámicos y cerebrales involucrados en la alimentación y la homeostasis energética (Dickson, Leng y Robinson 1993; Bailey et al. 2000; Hewson y Dickson 2000; Faulconbridge et al. 2003, 2008). Sin embargo, el comportamiento de alimentación no solo está motivado por la necesidad de la reposición de nutrientes (es decir, la necesidad de restaurar la homeostasis); Los alimentos sabrosos con alto contenido de grasa y / o azúcar pueden motivar el consumo a pesar de un estado de saciedad (Zheng et al. 2009). El consumo excesivo de refuerzos naturales sabrosos como el azúcar es un factor importante que impulsa la actual epidemia de obesidad. Queda por determinar si el sistema de señalización de ghrelina central es importante para el consumo de azúcar no homeostático, proporcionando así un objetivo terapéutico potencialmente importante para suprimir la ingesta de alimentos dulces, calóricos y gratificantes.

Inspirado por hallazgos recientes, la ghrelina interactúa con las áreas mesolímbicas involucradas en la alimentación no homeostática / de recompensa (Jerlhag et al. 2007), tratamos de evaluar el papel de la ghrelina y su receptor en la motivación de los alimentos y el comportamiento dirigido hacia el objetivo para la recompensa de sacarosa. Estas áreas mesolímbicas han sido durante mucho tiempo el foco de la investigación de la adicción a las drogas, ya que son un objetivo importante para la mayoría de las drogas de abuso (Engel 1977; Koob 1992). La vía mesolímbica objetivo para la grelina incluye la proyección de dopamina desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens (NAcc) (Jerlhag et al. 2006, 2007), un camino que confiere recompensas tanto de drogas químicas adictivas como de recompensas naturales, incluidos los alimentos (Koob 1992). Curiosamente, GHS-R1A se expresa en neuronas dopaminérgicas (Abizaid et al. 2006), lo que implica posibles efectos directos de la grelina sobre el sistema de dopamina VTA. Estos datos inmunohistoquímicos se complementan con la acumulación de evidencia conductual y electrofisiológica del efecto de la grelina en el VTA. Por ejemplo, la administración intra-VTA de grelina aumenta la actividad de las neuronas de dopamina VTA (Abizaid et al. 2006) y aumenta la liberación de dopamina en el NAcc (Jerlhag et al. 2007). La grelina también aumenta la actividad del enlace colinérgico-dopaminérgico, una importante vía de recompensa. De hecho, al menos parte de los efectos de la grelina sobre la dopamina parecen estar mediados por el sistema colinérgico (Jerlhag et al. 2007).

Si bien se estableció que la ghrelina tiene un potente efecto orexigénico cuando los alimentos están fácilmente disponibles, aún no se sabe si los efectos orexigénicos de la grelina pueden incluir cambios en la motivación y aspectos de refuerzo de los refuerzos naturales, como los alimentos dulces sabrosos (es decir, aumentar el deseo y el esfuerzo / trabajo que uno está dispuesto a poner en la obtención de una golosina dulce). La motivación y la eficacia de la recompensa de las drogas de adicción pueden evaluarse en el modelo de autoadministración y condicionamiento operante. El condicionamiento operante es un procedimiento principal para el análisis del comportamiento motivado que evalúa el comportamiento adquirido y voluntario dirigido a obtener una recompensa. Al medir la cantidad de trabajo que un sujeto está dispuesto a gastar para obtener la recompensa, ofrece una medida objetiva del valor de la recompensa (Hodos 1961). Las regiones mesolímbicas son cruciales para los aspectos motivacionales del comportamiento, incluida la alimentación, y está claro que la grelina afecta la actividad neuronal en las regiones mesolímbicas relevantes. Lo que aún no se ha demostrado es el efecto directo de la grelina en la motivación de los alimentos con alto contenido de azúcar. El objetivo principal de nuestro estudio es investigar si el sistema de señalización de ghrelina central desempeña un papel en las propiedades de refuerzo hedónico / motivacional o positivo de la recompensa de alimentos con alto contenido de azúcar y si se trata de la supresión de este sistema, utilizando un nuevo antagonista selectivo de GHS-R1A JMV2959 (Saloméet al. 2009a), puede suprimir la motivación para obtener dulces. Los antagonistas de GHS-R1A se están evaluando terapéuticamente en pacientes diabéticos tipo 2, ya que la supresión de la señalización de ghrelina tiene efectos beneficiosos sobre la homeostasis de la glucosa (Dom et al. 2006), efectos que también se beneficiarían de una ingesta reducida de alimentos dulces. Varias líneas de evidencia sugieren que la neurotransmisión dopaminérgica y colinérgica juega un papel importante en la conducta de recompensa motivada. Por lo tanto, para caracterizar mejor los efectos de la ghrelina en los circuitos centrales de recompensa, evaluamos el impacto del tratamiento con grelina en los cambios en la expresión génica del receptor de dopamina y acetilcolina en los nodos de recompensa clave, el VTA y el NAcc, después del tratamiento con grelina.

FORMAS DE PAGO

Animales

Ratas macho adultas Sprague-Dawley (200 – 250 g, Charles River, Alemania) se alojaron en un ciclo de luz / oscuridad de 12-hora con comida regular y agua disponibles ad libitum, salvo que se indique lo contrario. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo con un permiso ético y de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Gotemburgo.

La cirugía

Para experimentos de comportamiento dirigidos al SNC, una cánula guía del tercer ventricular (calibre 26; Plastics One, Roanoke, VA, EE. UU.; Coordenadas: en la línea media, 2 mm posterior al bregma y 5.5 mm ventral a la duramadre, con inyector dirigido a 7.5 mm ventral a la duramadre) se implantó bajo anestesia con isoflurano. Las cánulas se unieron al cráneo con acrílico dental y tornillos de joyero y se cerraron con un obturador, como se describió anteriormente (Skibicka, Alhadeff & Grill 2009). La colocación de la cánula en el tercer ventrículo se verificó una semana después de la cirugía mediante la medición de la respuesta glucémica mediada por sympathoadrenal a la inyección central de 5-tio-D-glucosa [210 µg en 2 µl de vehículo (solución salina)] (Ritter, Slusser y Stone 1981). En este protocolo de verificación de colocación, se requirió una elevación posterior a la inyección de al menos 100% del nivel de glucosa en plasma de referencia para la inclusión del sujeto. Para el experimento de expresión génica, se anestesiaron las ratas (60 – 75 mg / kg Ketalar y 0.5 mg / kg Domitor ip; Pfizer, Suecia; Orion Co, Finlandia) y una cánula intracerebroventricular (ICV) crónica (Alzet Brain Infusion Kit II, DURECT Corp, Cupertino, CA, EE. UU.) Se insertó en el ventrículo lateral utilizando las siguientes coordenadas: 0.6 mm posterior de bregma, 1.4 mm lateral de la línea media, 2.3 ventral del cráneo. La cánula se conectó a través de un catéter de polietileno a una minibomba osmótica (Bomba Alzet Mini-Osmótica Modelo 2002, Durect, Cupertino, caudal, 0.5 µl / hora durante los días 14) implantada por vía subcutánea en la parte posterior de los animales.

Modelo de condicionamiento operante.

aparato

Se realizaron experimentos de acondicionamiento operante en ocho cámaras de acondicionamiento operante diseñadas para ratas (30.5 × 24.1 × 21.0 cm; Medical-Associates, Georgia, VT, EE. UU.), Que se colocaron en un gabinete con atenuación acústica y con poca luz. Cada cámara tenía un piso de rejilla metálica, dos palancas retráctiles con bombillas de luz blanca sobre ellas y un dispensador de pellets de alimentos que puede entregar pellets de sacarosa 45 mg (GlaxoSmithKline, Test Diet, Richmond, IN, EE. UU.) A la bandeja de alimentos. La recolección y el procesamiento de los datos fueron controlados por el software MED-PC (Medical-Associates, Georgia, VT, EE. UU.).

Formación

El procedimiento utilizado para el condicionamiento operante fue adaptado dela flor et al. 2007) Y (Tracy et al. 2008). Todas las ratas fueron sometidas a un paradigma de restricción de alimentos suaves durante el cual su peso corporal inicial se redujo gradualmente a 90% durante un período de una semana. Para las ratas canuladas por ICV, el entrenamiento comenzó una semana después de la cirugía. Antes de la colocación en las cajas operantes, las ratas se expusieron a los gránulos de sacarosa en el entorno de la jaula de origen en al menos dos ocasiones. A continuación, las ratas aprendieron a presionar con la palanca para obtener pellets de sacarosa con un programa FR1 de proporción fija con dos sesiones por día. En FR1, una sola pulsación en la palanca activa dio lugar a la entrega de un pellet de sacarosa. Todas las sesiones de FR duraron minutos 30 o hasta que las ratas obtuvieron bolitas 100, lo que ocurriera primero. La mayoría de las ratas lograron el criterio de 100 pellets por sesión después de las sesiones de 10 a 15. Las prensas en la palanca inactiva se registraron pero no tuvieron ninguna consecuencia programada. Las sesiones programadas de FR1 fueron seguidas por FR3 y FR5 (es decir, tres y cinco prensas por pellet, respectivamente). Nuevamente, se requirió un mínimo de respuestas 100 por sesión en la palanca activa para avanzar al siguiente horario; la mayoría de las ratas solo necesitaban uno o dos programas de FR3 y FR5 para alcanzar este nivel. El programa FR5 fue seguido por el programa de relación progresiva (PR) durante el cual el costo de una recompensa se incrementa progresivamente para cada recompensa siguiente para determinar la cantidad de trabajo que la rata está dispuesta a obtener para obtener la recompensa. El requerimiento de respuesta aumentó de acuerdo con la siguiente ecuación: relación de respuesta = [5e (0.2 × número de infusión)] - 5 a través de la siguiente serie: 1, 2, 4, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95, 118, 145, 178 , 219, 268, 328, 60, 15, 75, 120, XNUMX, XNUMX. La sesión de relaciones públicas finalizó cuando la rata no logró ganar una recompensa en minutos XNUMX. El punto de quiebre se definió como la proporción finalizada antes de finalizar la sesión. La respuesta se consideró estable cuando el número de gránulos de alimentos obtenidos por sesión no difirió más del XNUMX% durante tres sesiones consecutivas. En la mayoría de los casos, la respuesta se estabilizó dentro de cinco a siete sesiones. PR prueba se llevó a cabo una sesión / día. Las sesiones duraron, en promedio, minutos XNUMX, aunque todas las ratas permanecieron en las cajas operantes hasta los minutos XNUMX para permitir que todas las sesiones terminaran. Posteriormente, las ratas se transfirieron a jaulas de origen para una medición de la ingesta de comida para una hora de alimentación libre. Al final del entrenamiento y antes de la prueba, las ratas fueron devueltas a un ad libitum Horario de alimentación.

Diseño experimental

Todas las ratas recibieron inyecciones intraperitoneales (IP) o en un grupo separado de ratas, tercer ventrículo (tercer ICV) al inicio del ciclo de luz (para pruebas de ghrelina) y al final del ciclo de luz para experimentos con antagonistas de ghrelina 20 minutos antes del inicio de pruebas operantes. Todas las condiciones se separaron por un mínimo de 48 horas y se ejecutaron de manera contrabalanceada (cada rata recibió todas las condiciones en días de prueba separados).

Experimento 1: impacto de la administración de ghrelina central o periférica en la respuesta operante de RP para sacarosa en ratas

Para todas las ratas, se examinaron las respuestas de presión de palanca después de dos condiciones: tratamiento con IP con solución salina o ghrelina de rata acilada (Tocris, Bristol, Reino Unido; 0.33 mg / kg de peso corporal a 1 ml / kg). Se ha demostrado previamente que la dosis de grelina IP seleccionada induce una respuesta de alimentación en ratas (Reyezuelo et al. 2000) y también para inducir la liberación de dopamina accumbal y la actividad locomotora en ratones (Jerlhag 2008). Posteriormente a la prueba operante, las ratas tuvieron acceso libre al chow y la ingesta del chow se midió después de un período de una hora. A continuación, en un grupo separado de ratas, examinamos las respuestas después de la administración dirigida del fármaco para el SNC después de las siguientes tres condiciones: condición de control con solución salina del tercer ventrículo, 0.5 µg o 1.0 µg de grelina de rata acilada (Tocris) en un volumen de 1 µl. Las dosis seleccionadas de grelina se ha demostrado anteriormente que provocan respuestas de alimentación (Nakazato et al. 2001). Tanto en el estudio de ICV como en el de IP, se realizaron experimentos de prensado de palanca en estado de saciedad (es decir, cuando la ingesta de alimentos se vería impulsada por las propiedades gratificantes de los alimentos en lugar de las unidades homeostáticas). Además, en ambos estudios, después de la prueba operante, se permitió el acceso libre de las ratas al chow, y se midió la ingesta del chow después de un período de una hora.

Experimento 2: impacto del tratamiento periférico o central con un antagonista del receptor de ghrelina (GHS-R1A) (JMV2959) en la motivación para una recompensa de sacarosa en ratas

Las respuestas operativas de PR se examinaron después de tres condiciones de la siguiente manera: condición de control con solución salina IP, 1 mg / kg o 3 mg / kg de JMV2959 (AEZS-123, AeternaZentaris GmBH, Frankfurt, Alemania). Las dosis de JMV2959 se seleccionaron en base a Jerlhag et al. (2009) y Egecioglu et al. (2010) y datos preliminares, que anteriormente se demostró que disminuyen el comportamiento de preferencia de lugar condicionado pero no tienen un efecto independiente sobre la actividad locomotora. Posteriormente a las pruebas operantes, las ratas se les permitió el acceso libre a la comida. Para evaluar los efectos de la acción antagonista central aguda directa, en un grupo separado de ratas, se examinó el comportamiento operante después de las siguientes tres condiciones: condición de control con inyección de solución salina del tercer ventrículo, 5 µg o 10 µg de JMV2959 en un volumen de 1 µl. Las dosis de ICV seleccionadas de JMV2959 se basaron en Saloméet al. (2009a) en la que se bloqueó la acción orexigénica de 1 µg de ICV administrada con ghrelina. Después de la prueba operante, las ratas se les permitió el acceso libre a la comida y la ingesta de comida se midió después de un período de una hora y también en 24 horas después de la inyección inicial. Los estudios con el antagonista de GHS-R1A, en contraste con los realizados con ghrelina (ver más arriba), se realizaron en ratas después de una restricción de alimentos de 16-hora antes de las inyecciones para asegurar altos niveles de ghrelina circulante endógena (Cummings et al. 2001).

Experimento 3: cambios inducidos por la grelina en la expresión de genes relacionados con la dopamina y la acetilcolina en el VTA y el NAcc

Aquí, determinamos los efectos de la infusión crónica de grelina ICV durante dos semanas sobre la expresión de genes seleccionados involucrados en la transmisión dopaminérgica y colinérgica en dos nodos clave de la vía de recompensa mesolímbica, el VTA y NAcc. Los genes relacionados con la dopamina seleccionados eran genes que codifican los receptores de dopamina (D1A, D2, D3, D5), catecol-O-metiltransferasa, tirosina hidroxilasa (solo en VTA) y monoamino oxidasa A. Los genes relacionados con la acetilcolina fueron: subunidades del receptor nicotínico (α3 α6, β2, β3). Los genes que elegimos evaluar han estado implicados previamente en los efectos de la grelina y / o en el comportamiento de recompensa / motivación (Kelley et al. 2002; Figlewicz et al. 2006; Jerlhag et al. 2006, 2007; Sibilia et al. 2006; Dalley et al. 2007; Kuzmin et al. 2009; Lee et al. 2009; Nimitvilai y Brodie 2010; Perello et al. 2010). Se utilizó un protocolo de infusión de grelina / solución salina crónica con preferencia a la inyección aguda para aumentar las posibilidades de ver un efecto en la expresión génica; además, si la ghrelina es un importante regulador del sistema de recompensa a largo plazo, promoviendo la sobrealimentación y la obesidad, es probable que sus efectos crónicos para alterar los mecanismos clave de recompensa sean de considerable importancia.

Administración de fármacos y disección de tejidos.

El catéter y la bomba osmótica se llenaron con ghrelina humana acetilada (donada de Rose Pharma, Copenhague, Dinamarca) (8.3 µg / rata / día) o solución salina (0.9% NaCl); esta dosis y la duración del tratamiento han demostrado previamente que afectan la expresión de genes en el hipotálamo (Saloméet al. 2009b). Catorce días después de la implantación de las minibombas, las ratas se sacrificaron por decapitación. Los cerebros se retiraron rápidamente y el VTA y el NAcc se diseccionaron utilizando una matriz cerebral (los bordes de cada región se determinaron en función de Paxinos y Watson 1986), congelado en nitrógeno líquido y almacenado a –80 ° C para su posterior determinación de la expresión del ARNm.

Aislamiento de ARN y expresión de ARNm

Se homogeneizaron muestras de cerebro individuales en Qiazol (Qiagen, Hilden, Alemania) utilizando un TissueLyzer (Qiagen). El ARN total se extrajo utilizando RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) o RNeasy Micro Kit (Qiagen), ambos con tratamiento adicional con ADNasa (Qiagen). La calidad y cantidad de ARN se evaluaron mediante mediciones espectrofotométricas (Nanodrop 1000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). Para la síntesis de ADNc, el ARN total se transcribió de forma inversa utilizando hexámeros aleatorios (Applied Biosystems, Sundbyberg, Suecia) y transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen Life Technologies, Paisley, Reino Unido) de acuerdo con la descripción del fabricante. Se añadió inhibidor recombinante de ribonucleasa RNaseout (Invitrogen) para prevenir la degradación mediada por RNasa. Todas las reacciones de ADNc se realizaron por triplicado. La PCR de transcripción inversa en tiempo real se realizó utilizando ensayos TaqMan Custom Array. Fueron diseñados con sonda TaqMan y conjuntos de cebadores para genes diana elegidos de un catálogo en línea (Applied Biosystems). Cada puerto de las plataformas TaqMan Array se cargó con cDNA correspondiente a 100 ng de RNA total combinado con agua libre de nucleasas y 50 µl de TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) hasta un volumen final de 100 µl. Las matrices TaqMan se analizaron utilizando el sistema 7900HT con una actualización de matriz TaqMan (Applied Biosystems). Las condiciones de los ciclos térmicos fueron: 50 ° C durante dos minutos, 94.5 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 97 ° C durante 30 segundos y 59.7 ° C durante un minuto.

Los valores de expresión génica se calcularon en base a laCt método (Livak y Schmittgen 2001), donde el grupo tratado con solución salina fue designado el calibrador. En pocas palabras, ΔCt representa el ciclo umbral (Ct) del gen diana menos el del gen de referencia y ΔΔCt representa el ΔCt del grupo tratado con grelina menos el del calibrador. Las cantidades relativas se determinaron utilizando la ecuación cantidad relativa = 2−ΔΔCt. Para la muestra del calibrador, la ecuación es cantidad relativa = 2-0, que es 1; por lo tanto, cada otra muestra se expresa en relación con esto. Se utilizó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa como gen de referencia.

Estadística

Todos los parámetros de comportamiento se analizaron mediante análisis de varianza seguido de post hoc Prueba de Tukey o t-pruebas según corresponda. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statistica (Tulsa, OK, EE. UU.). Para analizar el efecto del tratamiento crónico con grelina central sobre la expresión génica, t-se usó la prueba, con P-valores calculados utilizando la ΔCt-valores. Las diferencias fueron consideradas significativas a P <0.05. Los datos se expresan como media ± SEM.

RESULTADOS

Experimento 1: impacto de la administración de ghrelina central o periférica en la respuesta operante de RP para sacarosa en ratas

Aquí, empleamos un paradigma utilizado en la investigación de la adicción para evaluar el papel de la grelina en la motivación de los alimentos dulces naturales y las propiedades de refuerzo del azúcar. Específicamente, para determinar el papel de la administración de ghrelina periférica en la eficacia de la recompensa de sacarosa, se examinó la autoadministración de sacarosa en un programa de respuesta progresiva en las ratas 20 minutos después de la inyección IP de vehículo o grelina. Todas las medidas de comportamiento operante aumentaron significativamente en las ratas después de la inyección aguda de grelina periférica: presión activa de palanca (P <0.05 para todos los puntos de tiempo), número de gránulos de azúcar obtenidos (P <0.005 para todos los puntos de tiempo) y 120 minutos de punto de interrupción (P <0.005, 32.53 ± 3.4 y 41 ± 4.3 para vehículo y grelina, respectivamente; Fig. 1a, b). La literatura apoya principalmente un sitio de acción central para el efecto orexigénico de la grelina. Sin embargo, GHS-R1A también se expresa fuera del SNC en sitios relevantes para el control de la ingesta de alimentos, por ejemplo, en el nervio vago; por lo tanto, no se puede descartar que parte de los efectos observados de la grelina IP estén mediados por esos receptores periféricos. Sin embargo, la inyección central de un volumen y una dosis bajos de grelina sólo estimula el sistema nervioso central GHS-R1A. Por lo tanto, para determinar un efecto directo de la grelina en el SNC sobre la eficacia de la recompensa de sacarosa, realizamos un estudio paralelo en el que se administró vehículo o grelina mediante inyección en el tercer ventrículo, también 20 minutos antes del paradigma operante. De acuerdo con la hipótesis del sitio central del efecto, la inyección aguda de grelina ICV en ratas (dosis de 0.5 µg y 1.0 µg) aumentó significativamente todas las medidas de comportamiento operante antes mencionadas (Fig. 2a, b). El curso temporal de las respuestas de la palanca activa en el estudio ICV con ghrelin reveló que, si bien el efecto surgió lentamente durante los puntos de tiempo de 10 y 30, alcanzó importancia a los minutos de 60 [palanca activa: minutos de 10 F(2, 24) = 0.94, P = 0.41, 30 minutos F(2, 24) = 3.13, P = 0.06, 60 minutos F(2, 24) = 5.86, P <0.01, 90 minutos F(2, 24) = 6.42, P <0.01, 120 minutos F(2, 24) = 6.03, P <0.01; recompensas ganadas: 10 minutos F(2, 24) = 0.26, P = 0.78, 30 minutos F(2, 24) = 2.76, P = 0.08, 60 minutos F(2, 24) = 8.31, P <0.005, 90 minutos F(2, 24) = 10.16, P <0.001, 120 minutos F(2, 24) = 11.93, P <0.001; y punto de ruptura: F(2, 24) = 7.22, P <0.005 (17.31 ± 1.53, 33.15 ± 5.52, 36 ± 6.95 para el vehículo, 0.5 µg y 1.0 µg de grelina, respectivamente)], un curso de tiempo consistente con otros informes de latencia de alimentación inducida por grelina cuando se administra por esta vía (Faulconbridge et al. 2003). En ambos experimentos, la actividad en la palanca inactiva fue menor y no difirió significativamente entre los diferentes grupos de tratamiento (IP 4.1 ± 1.1, 4.1 ± 1.1 para vehículo y ghrelina, respectivamente; ICV 3.9 ± 1.1, 2.1 ± 0.7, 3.5 ± 1.6 para vehículo, 0.5 µg y 1.0 µg ghrelina, respectivamente), lo que sugiere que el tratamiento no produce cambios inespecíficos en la actividad no orientados a los objetivos. Inmediatamente después de la prueba operante, las ratas fueron devueltas a sus jaulas y se les permitió el libre acceso al chow; las ratas inyectadas con grelina, ya sea administradas periféricamente (P <0.05) o centralmente [F(2, 24) = 12.64, P <0.001], casi duplicó su ingesta de comida durante la primera hora en comparación con los grupos tratados con vehículo (Higos 1c y 2c). En línea con los datos anteriores (Faulconbridge et al. 2003) que indica que la mayor parte del efecto hiperfágico de la inyección de ghrelina central aguda tiene lugar dentro de las tres horas posteriores a la inyección, no se observó ningún efecto en la ingesta de alimento en nuestro estudio entre las tres y las 24 horas después de la administración por ICV de cualquier dosis de ghrelina [17.4 ± 1.12, 18.42 ± 1.34, 19.12 ± 1.43 vehículo, 0.5 µg y 1.0 µg ghrelina, respectivamente, F(2, 24) = 2.27, P = 0.13].

Figura 1 y XNUMX 

La inyección de grelina periférica aumenta la motivación para obtener alimentos sabrosos en un modelo de condicionamiento operante de relación PR. El número de respuestas en la palanca activa (a) y el número de recompensas de sacarosa de 45 mg (b) se incrementan significativamente en ...
Figura 2 y XNUMX 

El suministro de grelina en el SNC (tercer ICV) aumenta el valor gratificante de la sacarosa en un modelo de condicionamiento operante de relación PR. El número de respuestas en la palanca activa (a) y el número de recompensas 45 mg de sacarosa obtenidas (b) aumentan significativamente en un tercer lugar. ...

Experimento 2: impacto del tratamiento periférico o central con un antagonista del receptor de ghrelina (GHS-R1A) (JMV2959) sobre la motivación de incentivo para la recompensa de sacarosa en ratas

A continuación, exploramos los efectos del bloqueo farmacológico de GHS-R1A sobre la eficacia de la recompensa de sacarosa. Por lo tanto, la autoadministración de sacarosa en un programa de respuesta progresiva se examinó en ratas con restricción de alimento durante la noche para asegurar altos niveles de ghrelina 20 endógena minutos después de la inyección IP de vehículo o 1 mg / kg o 3 mg / kg de JMV2959, un GHS -R1A antagonista. Todas las medidas de comportamiento operante disminuyeron significativamente en las ratas después de la inyección periférica de JMV2959 [palanca activa: cinco minutos F(2, 24) = 11.53 P <0.0005, 120 minutos F(2, 24) = 11.27, P <0.001; recompensas ganadas: cinco minutos F(2, 24) = 23.39 P <0.0005, 120 minutos F(2, 24) = 9.26, P <0.001 y punto de quiebre en 120: F(2, 24) = 5.98, P <0.01 (45.31 ± 6.45, 42.08 ± 5.80, 30.0 ± 5.89 para vehículo, 1 mg / kg y 3 mg / kg de JMV2959, respectivamente)]. Post hoc El análisis reveló que el efecto principal se debió a la dosis de 3 mg / kg (Fig. 3a, b). Para determinar el papel del receptor de ghrelina central en la eficacia de la recompensa de sacarosa, se realizó un estudio similar en el que se administró un vehículo o JMV2959 (5 µg o 10 µg) al tercer ventrículo 20 minutos antes de las mediciones operantes. Todas las medidas antes mencionadas de comportamiento operante disminuyeron significativamente en las ratas después de la infusión aguda del tercer ventrículo de ambas dosis de JMV2959 (Fig. 4a, b). El efecto observado fue inmediato como post hoc el análisis reveló diferencias significativas entre los grupos de tratamiento solo después de 10 minutos de actividad en la cámara operante que se mantuvieron durante todo el período de prueba [palanca activa: 10 minutos F(2, 24) = 10.16, P <0.0005, 30 minutos F(2, 24) = 11.48, P <0.0005, 60 minutos F(2, 24) = 9.11, P <0.001, 90 minutos F(2, 24) = 8.30, P <0.001, 120 minutos F(2, 24) = 4.95, P <0.05; recompensas ganadas: 10 minutos F(2, 24) = 21.23, P <0.0001, 30 minutos F(2, 24) = 25.08, P <0.0001, 60 minutos F(2, 24) = 19.24, P <0.0001, 90 minutos F(2, 24) = 20.04, P <0.0001, 120 minutos F(2, 24) = 5.44, P <0.01; y punto de ruptura: F(2, 24) = 3.78, P <0.05 (51.4 ± 8.58, 38.13 ± 5.07, 33.67 ± 5.21 para vehículo, 5 µg y 10 µg de JMV2959, respectivamente)].

Figura 3 y XNUMX 

Entrega periférica de un antagonista del receptor de ghrelina, JMV2959. disminuye la motivación para obtener alimentos sabrosos en un modelo de condicionamiento operante de relación PR. El número de respuestas en la palanca activa (a) y el número de recompensas de sacarosa de 45 mg obtenidas ...
Figura 4 y XNUMX 

El bloqueo central de GHS-R1A con JMV2959 disminuye la motivación para obtener recompensa de alimentos en un modelo de condicionamiento operante de relación PR. El número de respuestas en la palanca activa (a) y el número de recompensas de sacarosa 45 mg (b) obtenidas disminuyen significativamente ...

Como se esperaba (Hodos 1961; Jewett et al. 1995), en todos los grupos de tratamiento, incluidas las rutas de administración IP e ICV, el efecto de la privación de alimentos en la respuesta operante para la sacarosa fue evidente (Higos 3a y 4a) y contrasta con lo observado en el estado saciado (Higos 1a y 2a). La actividad en la palanca inactiva fue menor (IP 9.6 ± 3.0, 6.8 ± 2.2, 5.6 ± 1.9 para el vehículo y 1 mg / kg o 3 mg / kg JMV2959, 6.4 XXUM XX XXUMX, XXUMX µg y 1.3 µg de JMV4.6, respectivamente) y si se administró de forma periférica o central, JMV1.3 no tuvo ningún efecto significativo sobre esa actividad (esta actividad no difirió significativamente entre los diferentes grupos de tratamiento). Para el estudio de ICV, inmediatamente después de las pruebas operantes, las ratas fueron devueltas a sus jaulas y se les permitió el acceso gratuito al chow; Curiosamente, no se observó ningún efecto en la ingesta de chow ni a la hora (Fig. 4c) o el punto de hora de 24 (datos no mostrados). Esto podría indicar que, si bien la señalización de ghrelina es necesaria para la motivación de los alimentos inducida por la privación, no es esencial para la alimentación libre inducida por la privación de alimentos durante las horas 16 probablemente debido a otros mecanismos redundantes activados durante un período de privación. Todas las medidas de alimentación gratuita se realizaron 140 minutos después de la inyección del medicamento, por lo que no podemos excluir que la falta de efecto se deba en parte al lavado del medicamento.

Experimento 3: cambios inducidos por la grelina en la expresión de genes relacionados con la dopamina y la acetilcolina en el VTA y el NAcc

En el presente estudio, también exploramos si los genes relacionados con la dopamina y la acetilcolina están alterados por la ghrelina en los nodos mesolímbicos clave, el VTA y el NAcc, al examinar los efectos del tratamiento crónico con grelina central en la expresión de receptores de dopamina seleccionados y enzimas involucradas en la producción y el metabolismo de la dopamina, en un paradigma ya establecido para producir cambios asociados a la grelina en la expresión génica en el hipotálamo (Saloméet al. 2009b). En el VTA, el receptor de dopamina D5 y el receptor nicotínico de acetilcolina (nAChRβ2) tuvieron un aumento de la expresión de ARNm en las ratas tratadas con grelina en comparación con el grupo tratado con solución salina (Fig. 5a). En el NAcc, hubo una disminución en la expresión del ARNm de los genes que codifican los receptores de dopamina D1A, D3 y D5 y también el receptor nicotínico de acetilcolina nAChRα3 en las ratas tratadas con grelina en comparación con el grupo tratado con solución salina (Fig. 5b).

Figura 5 y XNUMX 

Expresión génica asociada a dopamina y acetilcolina en VTA (a) y NAcc (b) después de tratamiento con ghrelina o vehículo ICV crónico. Los datos representan la media del cambio de pliegue en relación con el tratamiento con solución salina. D1, receptor de dopamina D1; D2 dopamina D2 receptor; D3, dopamina ...

DISCUSIÓN

Aquí, revelamos un papel para el sistema de señalización de la grelina central en la modulación de la motivación de incentivo y las propiedades de refuerzo de la recompensa de sacarosa e indicamos un impacto del tratamiento crónico de la grelina central en la expresión génica de los receptores dopaminérgicos y colinérgicos en los nodos clave de la recompensa mesolímbica. Los resultados demuestran que el suministro central y periférico de grelina aumenta significativamente la cantidad de trabajo que un animal está dispuesto a hacer para obtener la recompensa de sacarosa. Además, el bloqueo sistémico o central del receptor de ghrelina suprimió el operante que respondía a la sacarosa. Por lo tanto, podemos inferir que la señalización de grelina endógena es importante para la motivación de incentivo para una recompensa de sacarosa. Nuestros hallazgos están en línea con la hipótesis de que un papel importante del sistema de señalización de ghrelin central es aumentar el valor de incentivo de las recompensas, incluidos los alimentos. Dado que la restricción de alimentos aumenta el valor gratificante de la sacarosa (Hodos 1961; Jewett et al. 1995) y que los niveles de grelina se elevan durante la restricción de alimentos a corto plazo (Gualillo et al. 2002), es posible que durante un estado de restricción / privación de alimentos, la grelina sea uno de los factores que contribuyen a aumentar el valor gratificante de los alimentos. De hecho, la exposición a la grelina periférica aumentó el comportamiento operante a niveles similares a los observados en ratas privadas de alimentos y, a la inversa, el bloqueo de la señalización de ghrelina disminuyó el comportamiento operante a niveles notados en las ratas no privadas.

Ahora parece claro que un aumento problemático en la ingesta de alimentos probablemente refleja una desregulación de los mecanismos centrales de la recompensa de alimentos, que involucra aspectos tanto hedónicos como motivacionales. Como la alimentación libre y la alimentación motivada por la recompensa parecen ser dos fenómenos separables con sustratos neuroanatómicos de control diferencial (Salamone et al. 1991), es importante examinar ambos cuando se evalúa el papel de los agentes implicados en la conducta alimentaria. Los potentes efectos orexigénicos de la grelina se han estudiado en gran medida en modelos de acceso a la alimentación libre en los que sería difícil distinguir entre su papel en la repleción de nutrientes y la alimentación motivada por recompensas. En el presente estudio, encontramos que los ligandos GHS-R1A interfieren con la motivación de la recompensa de sacarosa, utilizando un modelo experimental que se ha utilizado en otros contextos para mostrar el deseo y la motivación por las drogas adictivas de abuso. Un aumento en el comportamiento motivado es común tanto a la adicción a las drogas químicas como a la restricción calórica y probablemente implica la superposición de mecanismos neurobiológicos. En el presente estudio, también detectamos un aumento inducido por grelina en la alimentación libre de comida normal en los mismos animales que gastaron significativamente más trabajo para la comida en la cámara operante. Por lo tanto, nuestros datos, junto con informes anteriores de los efectos de la grelina en modelos de alimentación libre (Reyezuelo et al. 2000), indican que la grelina tiene la capacidad de modular tanto la alimentación gratuita como la motivación de alimentación.

Dado que el receptor de ghrelina GHS-R1A está presente en áreas hipotalámicas, del cerebro posterior y mesolímbicas clave involucradas en el balance energético y la recompensa (Zigman et al. 2006) y que la inyección ventricular central de los ligandos GHS-R1A probablemente obtenga un acceso generalizado a estas áreas del SNC, podría haber varios sustratos neuroanatómicos relevantes para el efecto de la motivación de recompensa de sacarosa de la grelina que se muestra aquí. Parece probable que la grelina actúe directamente en áreas mesolímbicas clave, ya que la grelina activa las neuronas de dopamina VTA (Abizaid et al. 2006) y la administración directa de grelina al VTA aumenta la liberación de dopamina accumbal (Jerlhag et al. 2007). De acuerdo con esto, hemos informado previamente los efectos de la ghrelina intra-VTA para aumentar el consumo de alimentos gratificantes / sabrosos en los paradigmas de alimentación de elección libre y también las lesiones de la VTA dirigen el comportamiento exploratorio inducido por ghrelin de los alimentos palatables (Egecioglu et al. 2010). El NAcc también puede ser un objetivo directo para la grelina en la modulación de los aspectos motivacionales de la ingesta de alimentos; cuando se inyecta directamente en esta área, la ghrelina induce una respuesta de alimentación (Naleid et al. 2005), aunque la presencia de GHS-R1A en esta área en roedores no fue descrita por otros investigadores (Zigman et al. 2006) y por lo tanto, requiere una mayor aclaración.

Consistentemente, con su papel esencial en los comportamientos motivados, varios genes dentro del sistema de dopamina fueron alterados por el tratamiento con ghrelina central. Estos datos plantean la posibilidad de que la regulación de la expresión del receptor de dopamina sea un mecanismo a largo plazo a través del cual la ghrelina impacta la función y la señalización relacionadas con la recompensa. La evaluación de los receptores de dopamina no solo es importante en el sitio de liberación, como el NAcc, sino también en el VTA, debido a la liberación de dopamina dendrítica (Cragg y Greenfield 1997), es probable que actúe localmente para influir en las conductas motivadas de recompensa. Aquí, encontramos un aumento de la expresión de D5 en el VTA después del tratamiento con grelina. Los receptores D5 de dopamina están presentes en los cuerpos celulares de las neuronas VTA dopaminérgicas (Ciliax et al. 2000) y su actividad es necesaria para restablecer la actividad de la neurona dopamina VTA después de un período de desensibilización (Nimitvilai y Brodie 2010). En el NAcc, notamos una expresión disminuida de D1. De hecho, recientemente se ha demostrado una expresión reducida de este receptor en el NAcc de ratas propensas a la obesidad pero no resistentes a la obesidad en una dieta alta en grasas, lo que indica su papel potencial en NAcc en la obesidad y el consumo excesivo (Alsio et al. 2010). Además, la expresión de los genes que codifican D3 se redujo con la grelina, un hallazgo de particular interés dada la menor disponibilidad de los receptores D2 / D3 en usuarios de drogas tanto en ratas como en humanos se correlaciona con una mayor impulsividad (Dalley et al. 2007; Lee et al. 2009). Curiosamente, no vimos ningún cambio significativo en las enzimas involucradas en la síntesis o producción de dopamina.

El importante papel del sistema de acetilcolina para recompensas de medicamentos y alimentos está bien documentado; aquí, mostramos que el tratamiento con ghrelina se asoció con cambios en la expresión de genes que codifican varias subunidades de receptores nicotínicos de acetilcolina, lo que proporciona otra vía por la cual la grelina puede potencialmente alterar la función de recompensa. La grelina puede regular las neuronas dopaminérgicas VTA indirectamente a través de su acción sobre las neuronas colinérgicas en el área tegmental laterodorsal (LDTg), un área rica en GHS-R1A, que es importante para la recompensa de alcohol que implica una proyección colinérgica al sistema de dopamina VTA. De hecho, anteriormente, demostramos que la inyección bilateral de grelina en el LDTg en ratones estimula la liberación de dopamina de una manera dependiente de la colinérgica (Jerlhag et al. 2007, 2008) y aumenta el consumo de alcohol en un paradigma de consumo de elección libre (alcohol / agua) (Jerlhag et al. 2009). De hecho, estudios recientes han implicado el enlace de recompensa colinérgico-dopaminérico en la recompensa de alimentos (Dickson et al. 2010). Otra posibilidad interesante es que la ghrelina puede mejorar la señalización colinérgica en el VTA a través de la regulación positiva de los receptores colinérgicos. De hecho, nuestros datos de expresión génica actuales parecen apoyar ese mecanismo ya que los niveles de ARNm de VTA nAChRβ2 aumentaron en las ratas tratadas con ghrelina.

La función de las neuronas colinérgicas NAcc y la acetilcolina en la NAcc, por otro lado, ha sido más controvertida, ya que algunos informes indican un papel de la acetilcolina en el aumento del comportamiento orientado a la recompensa (Pratt y Kelley 2005; Pratt y Blackstone 2009) pero otros indican que Ach en NAcc puede actuar para inhibir la alimentación y desempeñar un papel en el mecanismo de saciedad (Casco et al. 2003; Hoebel et al. 2007). De hecho, nuestros resultados parecen ser consistentes con este último, ya que el tratamiento con grelina se asoció con una disminución de la expresión de una de las subunidades del receptor nicotínico, el nAChRα3. Es importante señalar que los estudios de expresión génica, si bien son muy valiosos para indicar posibles objetivos posteriores de la grelina, solo sugieren el tipo de relación (regulación positiva o negativa) necesaria para la expresión de la respuesta orexigénica / orientada a la recompensa, pero no la definen. ya que sería difícil disociar directamente de los cambios compensatorios. Por lo tanto, nuestros estudios de expresión génica indican una conexión y proporcionan una plataforma para futuros estudios genéticos y farmacológicos que determinan el papel de esos genes en los efectos de la grelina en la alimentación libre y motivada por recompensas.

Si bien es probable que las áreas hipotalámicas y del tronco cerebral contribuyan a la alimentación homeostática, no podemos excluir un papel indirecto de los sistemas aferentes hipotalámicos y / o cerebrales en la motivación de recompensa de alimentos inducida por la grelina. De hecho, las neuronas orexinérgicas se proyectan desde el hipotálamo lateral hacia el circuito de recompensa mesolímbica, incluido el VTA y el NAcc (Toshinai et al. 2003; Harris et al. 2005; Perello et al. 2010). Las neuronas del neuropéptido Y (NPY) / AgRP del núcleo arqueado, otro objetivo para los ligandos GHS-R1A (Dickson y Luckman 1997; Keen-Rhinehart y Bartness 2007a,b), también puede jugar un papel importante. Se ha demostrado que NPY aumenta la eficacia de la recompensa tanto del chow como de la sacarosa (Brown, Fletcher y Coscina 1998), mientras que AgRP parece aumentar la eficacia de la recompensa de los alimentos altos en grasa solamente (Tracy et al. 2008). La grelina parece tener un papel tanto en la recompensa de sacarosa (estudio actual) como en la recompensa alta en grasa (Perello et al. 2010); sin embargo, la importancia relativa de las neuronas NPY / AgRP para estos efectos de la grelina aún no se ha aclarado. En resumen, la grelina tiene propiedades motivacionales de los alimentos que se extienden a través de los componentes nutricionales y probablemente afecta varias áreas del cerebro para sincronizar una respuesta conductual coordinada para promover la alimentación.

Aunque el transporte de grelina al cerebro es limitado (Bancos et al. 2002), la grelina periférica parece acceder a áreas como el hipocampo (Diano et al. 2006) y VTA (Jerlhag 2008). Aunque sigue habiendo cierto debate sobre la relevancia del nervio vago como una ruta indirecta para los efectos centrales de la grelina (Dornonville de la Cour et al. 2005; Fecha et al. 2002; Arnold et al. 2006), una acción directa dentro del SNC parece probable, ya que los efectos de la grelina periférica en la ingesta de alimentos pueden ser suprimidos por la administración intra-VTA de antagonistas de grelina (Abizaid et al. 2006). La grelina se produce dentro del cerebro (Cowley et al. 2003), aunque queda por determinar cómo se regula esto y si la grelina derivada del cerebro proporciona una importante señal generada centralmente para la ingesta de alimentos y la motivación para comer. Tomado junto con el hecho de que el receptor de ghrelina GHS-R1A es constitutivamente activo (es decir, tiene actividad en ausencia de ligando de ghrelina) (Holst et al. 2003), surge la pregunta de si la grelina circulante proporciona una señal fisiológicamente relevante del intestino-cerebro para incentivar la motivación para la recompensa de los alimentos. Los resultados del presente estudio, que muestran efectos similares en el trabajo de recompensa de la sacarosa, se pueden obtener a través de la administración central y periférica de ligandos GHS-R1A, podrían indicar que tanto la grelina liberada centralmente como la liberada periféricamente pueden afectar la motivación de los alimentos.

En conclusión, nuestros nuevos datos proporcionan nueva evidencia de que la señalización de la grelina es importante para la motivación para obtener la recompensa de la sacarosa y el impacto en la expresión génica dopaminérgica y colinérgica en la vía de recompensa mesolímbica. Nuestros hallazgos inspiran preguntas importantes sobre el papel de la grelina endógena en la determinación del valor incentivador de recompensas naturales como el azúcar, en el comportamiento apetitivo normal y en la fisiopatología de los trastornos alimentarios y la obesidad. Aunque queda trabajo significativo para relacionar causalmente los cambios moleculares en el sistema de dopamina y acetilcolina con el impacto de la grelina en la recompensa, nuestros datos indican potencialmente un mecanismo novedoso por el cual la grelina impacta en el comportamiento de recompensa. Comprender el papel de la grelina en los procesos de recompensa es importante para comprender la neurobiología superpuesta de los trastornos alimentarios y la adicción a las drogas químicas y proporciona una vía potencial para comprender la etiología de estas enfermedades y para el desarrollo de nuevas terapias. Finalmente, la posibilidad de suprimir la ingesta excesiva problemática de alimentos dulces sabrosos utilizando antagonistas de GHS-R1A puede tener relevancia clínica y terapéutica para los efectos beneficiosos emergentes de dichos compuestos para el control de la glucosa en sangre (Dom et al. 2006) en pacientes diabéticos tipo 2 (Esler et al. 2007).

AGRADECIMIENTOS

Investigación apoyada por el Consejo Sueco de Investigación de Medicina (VR 2006-5663; 2009-S266), Marco de la Unión Europea 7th (FP7-HENLTH-2009-241592; FP7-KBBE-2009-3-245009) el Instituto Sueco y la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica del Centro de Investigación Cardiovascular y Metabólica Sahlgrenska (A7601-305). También nos gustaría agradecer al Dr. Daniel Perrissoud (AeternaZentaris, GmBH, Alemania) por proporcionar al antagonista de GHS-R188A JMV1 y a Anders Friberg por su ayuda con la presentación.

Contribución de los autores

KPS inició, diseñó, realizó y analizó todos los estudios de comportamiento. CH realizó y analizó todos los estudios de expresión génica. EE contribuyó a la iniciación del estudio. SLD fue el autor principal y brindó supervisión y apoyo financiero para todos los estudios. El manuscrito fue creado por KPS y SLD, todos los autores contribuyeron al texto final.

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