La hipocretina (orexina) facilita la recompensa al atenuar los efectos antibalas de su cotransmisor dinorfina en el área tegmental ventral (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda c. Hasinger,^a Sara onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b y William A. Carlezon, Jr.^a

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La hipocretina (orexina) y la dinorfina son neuromoduladores que desempeñan un papel importante en la regulación del afecto y la motivación. Orexin es crítica para la recompensa y está implicada en la búsqueda de drogas, mientras que la dinorfina media el estado de ánimo negativo y está implicada en estados depresivos. Teniendo en cuenta estos efectos opuestos, los informes de que ambos péptidos se expresan en las mismas neuronas y se coreleased son contraintuitivos. Aquí, demostramos que la orexina y la dinorfina se coexpresan dentro de las mismas vesículas sinápticas y que esta colocalización tiene una profunda influencia en la recompensa, el consumo de drogas y el comportamiento impulsivo. El hecho de que la orexina ocluya los efectos antibalas depresivos de la dinorfina cambia significativamente la forma en que vemos el papel funcional de la orexina en el cerebro.

La hipocretina (orexina) y la dinorfina son neuropéptidos con acciones opuestas sobre el comportamiento motivado. Orexin está implicada en estados de excitación y recompensa, mientras que la dinorfina está implicada en estados depresivos. Mostramos que, a pesar de sus acciones opuestas, estos péptidos están empaquetados en las mismas vesículas sinápticas dentro del hipotálamo. La interrupción de la función orexina mitiga los efectos gratificantes de la estimulación hipotalámica lateral (LH), elimina la impulsividad inducida por la cocaína y reduce la autoadministración de la cocaína. La interrupción concomitante de la función de dinorfina revierte estos cambios de comportamiento. También mostramos que orexin y dynorphin tienen acciones opuestas sobre la excitabilidad de las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral (VTA), un objetivo importante de las neuronas que contienen orexin, y que el antagonismo de orexina intra-VTA causa disminución en la autoadministración de cocaína y autoestimulación de LH que se invierten por el antagonismo de la dinorfina. Nuestros hallazgos identifican un proceso celular único mediante el cual la orexina puede ocluir los efectos que elevan el umbral de la recompensa de la dinorfina liberada y, por lo tanto, actuar de forma permisiva para facilitar la recompensa.

Orexin y Dynorphin son cotransmisores.

Se confirmó la coexpresión de orexina y dinorfina dentro de las mismas neuronas del hipotálamo lateral, periforniano y dorsomedial del ratón mediante microscopía de fluorescencia (18) ( A). La existencia de neuronas que expresan múltiples transmisores se ha descrito en otros circuitos cerebrales y puede representar la base neuronal para los mecanismos de filtrado por los cuales se produce la liberación de neurotransmisores coexpresados ​​a velocidades de disparo diferenciales (19). Usando EM, encontramos, sin embargo, que orexin y dynorphin están colocalized dentro de las mismas vesículas sinápticas. La mayoría de los casos de copackaging se observaron en procesos axonales, varoneses no mielinizados, en los que se encontró inmunomarcaje en o cerca de las vesículas. Dentro de los cuerpos celulares neuronales, el marcado significativo se asoció con el complejo de Golgi, mientras que no se encontró ninguno en los núcleos adyacentes ( B y C). Las dendritas también contenían un marcador asociado a la vesícula para ambos péptidos, lo que sugiere una posible liberación dendrítica de estos transmisores. Un pequeño número de perfiles microestructurales capturaron terminales de axones con etiquetado para ambos péptidos ubicados en vesículas grandes (∼100 nm) ubicadas fuera de la zona de liberación de sinapsis asimétricas ( B y C), brindando apoyo para la conclusión de que orexin y dynorphin funcionan como cotransmisores y que, en condiciones normales, se liberan juntos en lugar de diferenciarse en función de la frecuencia de activación de la celda.

 

Higo. 1.

Orexin y dynorphin son cotransmisores en las neuronas del hipotálamo. (A, extrema izquierda) La fotomicrografía de campo brillante muestra el área del hipotálamo examinada para determinar la inmunorreactividad de orexina (rojo) y dinorfina (verde). (A, extrema derecha) Imagen de dos canales fusionada ...

Los efectos de elevación del umbral de recompensa de Orexin Blockade son invertidos por Dynorphin Blockade.

Para explorar la importancia funcional de este patrón único de expresión del transmisor, examinamos si las interrupciones en la señalización de orexina y dinorfina pueden afectar comportamientos complejos que reflejan una motivación normal y aberrante. En ratones C57BL / 6 entrenados para realizar autoestimulación intracraneal (ICSS) reforzado con estimulación lateral hipotalámica (LH) (20), bloqueo de OX₁Rs por N- (2-metil-6-benzoxazolil) -N ”″ -1,5-naftiridin-4-ilurea (SB334867) durante la fase de luz causó aumentos dependientes de la dosis en los umbrales de recompensa ( A; ANOVA de medidas unidireccionales para dosis: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Los aumentos en los umbrales de ICSS reflejan reducciones inducidas por el tratamiento en el impacto gratificante de la estimulación, un signo de tipo depresivo que indica una disminución de la sensibilidad a la recompensa (20). Este efecto no se debió a la sedación ni a otras deficiencias conductuales no específicas, ya que las tasas de respuesta del ICSS no se vieron afectadas ( B; ANOVA de medidas unidireccionales para dosis: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Higo. 2.

Los efectos de elevación del umbral de recompensa del bloqueo de orexina se invierten mediante el bloqueo de dinorfina. (A) Bloqueo de la señalización de orexina en OX.₁R por SB334867 (0 – 30 mg / kg, ip) eleva los umbrales de recompensa en la prueba ICSS, lo que indica una disminución en la recompensa. Este efecto ...

Las elevaciones en los umbrales de recompensa causadas por SB334867 se evitaron mediante el tratamiento previo con nor-binaltorphimine (norBNI) [ANOVA de medidas repetidas de dos vías para Fármaco (factor entre sujetos) × Interacción entre la dosis SB (factor dentro de los sujetos): F_3,24 = 3.98, P <0.01], que produce un bloqueo duradero de las acciones de la dinorfina en los KOR (10). Estos datos sugieren que la pérdida de la señalización de la orexina revela efectos antirrobo latentes de la dinorfina liberada. La administración de norBNI solo no disminuyó los umbrales de recompensa. Aunque este efecto puede estar relacionado con la farmacodinámica única de norBNI y otros antagonistas prototípicos de KOR (10), también puede indicar que existe redundancia en los procesos que modulan la actividad de los circuitos de recompensa cerebral o que los aumentos fásicos en el tono de orexina solo (sin oposición de la dinorfina coreleased) son insuficientes para transmitir una señal de recompensa desde el sitio de estimulación en el hipotálamo lateral. Estos hallazgos pueden parecer al principio inconsistentes con el trabajo de otros que examinaron SB334867 en el umbral ICSS durante la fase oscura (21). Sin embargo, existe evidencia considerable de que la disminución de la función de la orexina puede tener consecuencias que dependen de si los animales son examinados durante su fase clara u oscura. Por ejemplo, los alimentos y el agua conservan sus efectos gratificantes en los ratones orexin KO cuando se realizan pruebas durante la fase oscura pero no durante la fase ligera (22), el momento en el que realizamos todas nuestras pruebas de comportamiento.

Para localizar los efectos de la administración sistémica de SB334867 y norBNI en ICSS, se implantó una cohorte separada de ratones con electrodos de estimulación de LH y cánulas de guía VTA. La microinfusión de SB334867 en VTA causó aumentos marcados en los umbrales de recompensa, lo que indica una sensibilidad reducida en la recompensa. Aunque intra-VTA ni BNI solo no tuvo efecto en los umbrales de la ICSS, bloqueó los efectos de elevación del umbral de la infusión de SB334867 posterior ( C; unidireccional medidas repetidas ANOVA para la droga: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Aunque las infusiones de fármacos intracraneales tendieron a producir reducciones modestas en las tasas máximas de respuesta en comparación con las inyecciones de fármacos sistémicas, estos efectos no alcanzaron significación estadística ( D; unidireccional medidas repetidas ANOVA para la droga: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsividad regulada por Orexin y Dynorphin Transmission.

La impulsividad se caracteriza por deficiencias en la supresión de los comportamientos de búsqueda de recompensa, con altos niveles de impulsividad como una característica común de muchas enfermedades psiquiátricas (23). Las drogas de abuso, incluida la cocaína, también pueden desencadenar un aumento de la impulsividad, que se cree que impulsa el desarrollo de la adicción (24). Teniendo en cuenta el papel clave de la orexina y la dinorfina para controlar la sensibilidad al efecto gratificante de la estimulación de la LH en la prueba ICSS, planteamos la hipótesis de que las interacciones entre estos dos neuropéptidos pueden influir en la impulsividad inicial y en los déficits inducidos por la cocaína en este comportamiento. La impulsividad se puede cuantificar en roedores midiendo respuestas prematuras en la tarea de tiempo de reacción en serie de elección 5 (5-CSRTT) (25), un modelo animal análogo a la prueba de rendimiento continuo utilizada para estudiar la atención en humanos. La respuesta prematura en esta prueba tiende a ser baja en condiciones normales y se ve agravada por los fármacos que elevan la transmisión de DA (26). Utilizamos el 5-CSRTT para examinar la contribución del sistema orexin-dynorphin al comportamiento impulsivo espontáneo e inducido por la cocaína. Cuando se administra solo, SB334867 reduce aún más el ya bajo número de respuestas prematuras espontáneas ( A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Estas reducciones ocurrieron en ausencia de efectos sobre la precisión de la respuesta (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latencia de recuperación de pellets (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), o el número de pruebas de estímulo completadas (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), lo que indica que no se debieron a una vigilancia degradada o capacidades del motor. La administración de norBNI, sin embargo, revirtió los efectos de SB334867 en la respuesta prematura ( B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), lo que sugiere que la transmisión de dinorfina sin oposición es crítica para mediar estos efectos antiimpulsivos. Dado solo o en combinación con SB334867, ni BNI no produjo efectos en las medidas de precisión de respuesta (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latencia (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), o el número de ensayos de estímulo completados (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). El pretratamiento con SB334867 también previno el doble aumento de la respuesta prematura inducida por la cocaína ( C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Estos datos proporcionan evidencia de que la neurotransmisión de orexina puede regular el comportamiento impulsivo tanto en condiciones basales como estimuladas por cocaína de una manera sensible a la dinorfina.

 

Higo. 3.

Comportamiento de impulsividad regulado por equilibrio de orexina y dinorfina. (A) SB334867 atenúa las respuestas prematuras en el modelo de rata 5-CSRTT de impulsividad motora. Las medidas de precisión, la latencia para recuperar el sedimento de alimentos y el número de ensayos omitidos fueron ...

Dynorphin media la autoadministración de cocaína reducida en OX₁R-ratones nulos.

La vulnerabilidad a la adicción se incrementa notablemente en los individuos impulsivos, y se presume que los aumentos en la impulsividad inducidos por la cocaína contribuyen a la aparición de la adicción (23, 27). Además, la transmisión de orexina y la transmisión de dinorfina se han implicado de manera independiente en la regulación de los efectos gratificantes de la cocaína y otras drogas de abuso (28–32). Nuestra hipótesis es que las interacciones entre la transmisión de orexina y dinorfina pueden controlar directamente el consumo de drogas. Para explorar esta posibilidad, examinamos la autoadministración de cocaína iv en ratones modificados genéticamente que carecen de OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Los ratones de este genotipo exhiben una autoadministración de cocaína significativamente más baja en un amplio rango de dosis (0.1-1 mg / kg por infusión) pero demuestran una respuesta inalterada por las recompensas de alimentos bajo los mismos programas de refuerzo (33), sugiriendo que las reducciones en el consumo de cocaína no son secundarias a los déficits en el comportamiento del comportamiento. Por otra parte, OX₁R^{- / -} los ratones muestran tasas normales de autoadministración de cocaína durante las aproximadamente tres sesiones iniciales de acceso a la cocaína, pero luego muestran rápidamente una disminución en el consumo de cocaína (33). Confirmamos este fenotipo a una dosis de 0.3 mg / kg por infusión, lo que indica que la señalización se realiza mediante OX.₁Rs juega un papel crítico en el establecimiento y mantenimiento del comportamiento de autoadministración de cocaína [ ; ANOVA de medidas bidireccionales, Genotipo (factor entre sujetos) × Tratamiento farmacológico (dentro del factor sujetos): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Así como el pretratamiento con norBNI restauró el ICSS normal y el comportamiento impulsivo en ratones que recibieron SB334867, también restauró parcialmente la autoadministración de cocaína en OX₁R^{- / -} ratones, proporcionando un ejemplo único en el que un déficit de comportamiento producido por la ablación genética en la función de un sistema de neurotransmisores es rescatado por el bloqueo de otro. Estos hallazgos sugieren que, en OX₁R^{- / -} Los ratones, las acciones sin oposición de la dinorfina atenúan las propiedades gratificantes de la cocaína y, por lo tanto, disminuyen la autoadministración de la droga. Curiosamente, en OX₁R^{+ / +} (control) ratones, ni BNI redujeron inesperadamente la autoadministración de cocaína. Una posible explicación de este efecto es que la dinorfina liberada por las neuronas que no son poroxina, como las llamadas neuronas espinosas del medio estriatonigral "directo", tiene los efectos opuestos en la ingesta de cocaína y puede en realidad facilitar los efectos gratificantes de la cocaína. La existencia de dos poblaciones de KOR con roles opuestos en la recompensa de cocaína también explicaría por qué norBNI solo revirtió parcialmente los déficits en el comportamiento de consumo de cocaína detectado en el OX₁Ratones R KO. Alternativamente, el antagonismo de KOR reduce los efectos aversivos o estresantes de la abstinencia de cocaína (34), que contribuyen a los patrones de consumo de drogas (17). En cualquier caso, estos datos sugieren que los efectos depresivos de la dinorfina prevalecen en ausencia de señalización de orexina intacta, produciendo reducciones en los efectos gratificantes de la cocaína, mientras que los efectos de la orexina facilitan los efectos gratificantes de la cocaína, extendiendo su duración en ausencia de Señalización de dinorfinas.

 

Higo. 4.

Reducción de la autoadministración de cocaína en OX.₁Los ratones R KO son restaurados por el bloqueo KOR. Deterioro de la señalización de orexina en OX₁R por eliminación genética de este receptor reduce la autoadministración iv de cocaína (0.3 mg / kg por infusión). Este déficit es parcialmente ...

Orexin y Dynorphin pueden ejercer efectos opuestos equilibrados sobre la excitabilidad de las neuronas VTA DA.

Las estructuras cerebrales que reciben información de orexina hipotalámica y neuronas dinorfinas están potencialmente expuestas a ambos péptidos y, por lo tanto, están sujetas a sus efectos opuestos sobre la excitabilidad neuronal (35, 36). El grado en que los efectos de un péptido prevalecen sobre los del otro probablemente depende de numerosos factores, incluida la abundancia relativa de cada péptido, la longevidad en el espacio extracelular y la expresión del receptor en diferentes poblaciones de neuronas diana, así como las interacciones entre Los receptores y sus mecanismos de señalización intracelular en las células postsinápticas. La impulsividad y la recompensa de la cocaína están reguladas, al menos en parte, por las neuronas DA en el VTA (26), un objetivo prominente de las células hipotalámicas que contienen orexina (37). Además, la infusión de orexina en el VTA mejora la búsqueda de drogas (6). Para evaluar las contribuciones relativas de cada péptido en la actividad de las neuronas VTA, hicimos registros electrofisiológicos de células DA en cortes de cerebro de ratón C57BL / 6 expuestos a orexina y dinorfina aplicadas individualmente o juntas. Como se anticipó, cuando se aplicó por separado, la orexina fue uniformemente excitadora, mientras que la dinorfina produjo solo efectos inhibitorios ( A y B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). En la población de neuronas DA registradas, la mayoría respondió a las concentraciones de saturación de ambos péptidos, aunque una pequeña minoría respondió selectivamente solo a la orexina o la dinorfina ( B). Sorprendentemente, cuando ambos péptidos se aplicaron a las neuronas de respuesta dual (n = 10), no hubo efecto neto en la velocidad de disparo ( A), lo que sugiere que los efectos opuestos de cada péptido en concentraciones de saturación se cancelan efectivamente entre sí tras la liberación de núcleo. Cuatro de las 10 neuronas mostraron inhibición preferencial por dinorfina a pesar de la presencia de orexina, mientras que una célula fue excitada preferentemente (cambio> 1.5 veces) por orexina a pesar de la presencia de dinorfina ( A y C). En general, aunque más células respondieron a la orexina que a la dinorfina, aquellas células que respondieron a ambos péptidos no tuvieron un cambio neto en la tasa de activación cuando se aplicaron orexina y dinorfina, lo que sugiere que las influencias opuestas de cada péptido se equilibraron dentro del conjunto de VTA DA neuronas estudiadas.

 

Higo. 5.

Orexin y dynorphin ejercen efectos equilibrados pero opuestos en las neuronas VTA DA. (Una izquíerda) La orexina y la dinorfina aplicadas no producen un cambio neto en la velocidad de activación de las neuronas VTA DA (n = 10). Aplicada individualmente, la dinorfina fue inhibitoria y la orexina fue excitadora. ...

Para dilucidar más las posibles interacciones orexina-dinorfina dentro de las neuronas VTA DA que eran sensibles tanto a la orexina como a la dinorfina, intentamos, alternativamente, aumentar los efectos inhibitorios de la dinorfina aplicada en el baño mediante el tratamiento con SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) o para mejorar los efectos excitadores de la orexina aplicada en baño mediante el tratamiento con norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). En ambos experimentos, OX₁El bloqueo R y KOR no produjo estos efectos, lo que sugiere que SB334867 y norBNI no están ejerciendo efectos a través de acciones no específicas. Más importante aún, estos datos sugieren que el tono de cada péptido in vitro es insuficiente para ser influenciado por la aplicación de antagonistas de moléculas pequeñas como SB334867 y norBNI. Este hallazgo es consistente con trabajos previos que indican que la exocitosis de vesículas grandes que contienen péptidos típicamente ocurre solo a altas frecuencias de disparo sostenido que normalmente no están presentes en las preparaciones de corte (38).

Para verificar que norBNI no influyó en el comportamiento a través de acciones "fuera del objetivo" directamente en OX₁Rs, a continuación examinamos los efectos de este antagonista en OX₁R señalización. Específicamente, utilizamos un ensayo de lector de placa de imágenes fluorométricas (FLIPR) para determinar la capacidad de la orexina A, SB334867 o norBNI aplicada en el baño para inducir transitorios de calcio intracelulares en células CHO cultivadas que expresan OX humano₁Rs. Aunque la orexina A produjo los aumentos esperados en el calcio intracelular (EC₅₀ = 0.01 μM) y SB334867 atenuó de forma dependiente de la dosis este efecto (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI no produjo ningún efecto sobre los aumentos evocados en el calcio intracelular de la línea de base o de la orexina A. Esto sugiere que los efectos de norBNI en la fisiología neuronal de VTA DA son únicamente a través de los mecanismos de señalización KOR propuestos y el fármaco no tiene efecto directo en OX₁R (39) (Fig. S3 A–C).

Interacciones Orexin-Dynorphin en VTA Regula Cocaine Self-Administration.

Nuestros estudios de electrofisiología demuestran que las interacciones dinámicas entre orexin y dynorphin regulan la actividad VTA DA, y que las neuronas VTA probablemente sirven como un sustrato clave para los efectos del sistema orexin-dynorphin en conductas motivadas. Para probar esta hipótesis directamente, examinamos los efectos de la infusión intra-VTA de SB334867 en la autoadministración iv de cocaína en ratas. En comparación con la infusión de vehículo intra-VTA, SB334867 intra-VTA causó una reducción marcada de la ingesta de cocaína que fue bloqueada por norBNI ( ; ANOVA unidireccional: F_3,24 = 11.56, P <0.01), lo que sugiere que las acciones de la dinorfina sin oposición dentro de esta área del cerebro atenúan la recompensa de la cocaína. Estos resultados parecen estar en desacuerdo con los que han demostrado la ausencia de SB334867 intra-VTA sobre la autoadministración de cocaína en programas de refuerzo de proporción fija de bajo esfuerzo 1 (FR1) (40). Sin embargo, varios informes han demostrado que a medida que aumentan las demandas de tareas, SB334867 es más eficaz para reducir el consumo de drogas (2, 33). Debido a que las ratas en este experimento estaban realizando un programa FR5 de mayor esfuerzo, los resultados actuales son consistentes con esta literatura. Estos datos proporcionan evidencia directa de que la naturaleza opuesta de la orexina y la dinorfina en la fisiología neuronal VTA DA puede ejercer efectos significativos en los comportamientos basados ​​en la recompensa.

 

Higo. 6.

Las interacciones de Orexin y dinorfina en la VTA median la toma de fármacos. La autoadministración de cocaína se reduce con SB334867 intra-VTA (3 μg por lado), mientras que este efecto se revierte con el tratamiento previo con norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Los animales

Los ratones adultos C57BL / 6J macho (semana 8; Jackson Laboratory) utilizados en experimentos EM se alojaron en grupo (de tres a cinco por jaula); los utilizados para ICSS se alojaron individualmente después de la cirugía. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos adultos (350 g) (Charles River Laboratories) en los experimentos de autoadministración de 5-CSRTT y cocaína y se alojaron en grupos de cuatro. Los ratones machos adultos C57BL / 6J (días postnatales 19-21) utilizados para los experimentos de electrofisiología se alojaron en grupo (de tres a cinco por jaula). El OX1^{- / -} ratones y su OX1^{+ / +} Los compañeros de camada (semanas de edad 6) utilizados para los estudios de autoadministración se obtuvieron del Laboratorio Jackson y se cruzaron de nuevo más de siete generaciones con ratones C57BL / 6. Estos ratones fueron alojados en grupo (dos por jaula). Todos los animales se alojaron en condiciones de temperatura controlada en un ciclo de luz / oscuridad 12-h, y se realizaron pruebas de comportamiento de 4-5 h en el ciclo de luz; los alimentos y el agua estaban disponibles ad libitum a menos que se indique lo contrario. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud. Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (50) y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Hospital McLean, la Universidad de British Columbia y Scripps Florida.

Inmunohistoquímica y Microscopía.

La inmunomarcación de oro con fluorescencia y plata para orexina A o prodinorfina se llevó a cabo en secciones de cerebro de ratón alternativas de acuerdo con los procedimientos informados previamente (51), y procesados ​​siguiendo los protocolos estándar de EM. Las regiones no superpuestas del tejido inmunolizado se seleccionaron al azar y se fotografiaron para la cuantificación de partículas utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health) (Materiales y Métodos SI, Inmunohistoquímica y Microscopía).

Electrofisiología.

Las pipetas de parche (3 – 5 MΩ) se llenaron con gluconato de potasio 143 mM, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (con un pH de 7.2) y 270 – 280 – 20 – 2 – 10.0 – 70 – 250 – 60 – 130 – 10 – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX – XNUMX– Los datos se adquirieron a XNUMX kHz y se filtraron a XNUMX kHz utilizando el software pClamp XNUMX (Molecular Devices). Después de adquirir una configuración de celda completa, las celdas se sujetaron por voltaje a −XNUMX mV y se aplicaron una serie de pasos de voltaje (XNUMX ms, de −XNUMX a −XNUMX mV en pasos de XNUMX-mV) para detectar hiperpolarización (I_h) corrientes. I_h se determinó como el cambio en la corriente entre ∼30 ms y 248 ms luego de que se aplicó el paso de voltaje. La actividad intrínseca de las neuronas VTA DA se midió en el modo de pinza de corriente. Los experimentos comenzaron cuando se logró una tasa de cocción de línea de base estable; Los sustratos se aplicaron a continuación para 5 min y posteriormente se lavaron con líquido cefalorraquídeo artificial. El último 3 min de cada segmento 5-min se usó para el análisis de datos. La dinorfina A (1 – 17; 200 nM) y la orexina A (100 nM) se obtuvieron a partir de American Peptide y se disolvieron en agua destilada. Se descubrió previamente que estas concentraciones ejercen efectos de saturación sobre la actividad de las células VTA (5, 52). El tiorphan (1 μM) y la bestatina (10 μM) se obtuvieron de Sigma-Aldrich, se disolvieron en agua destilada y se aplicaron junto con la dinorfina A (Materiales y Métodos SI, Electrofisiología).

Ensayo FLIPR.

OX₁La actividad R se evaluó midiendo los niveles de calcio intracelular mediante el ensayo FLIPR como se describió anteriormente (53) (Materiales y métodos SI, ensayo de lector de placas con imágenes fluorométricas).

ICSS.

Los ratones fueron implantados con electrodos de estimulación monopolar o cánulas (PlasticsOne) bajo ketamina / xilazina (80 y 10 mg / kg, respectivamente, ip; Sigma) dirigidos estereotácticamente a la LH (18) y / o VTA contralateral [de bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; mediolateral (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm desde la duramadre]. Después de un período de recuperación de 7-d, los ratones fueron entrenados para responder a la estimulación cerebral como se describió anteriormente (18). La frecuencia más baja que admitió la respuesta (umbral) se calculó utilizando el análisis de la línea de mejor ajuste de mínimos cuadrados. Cuando los ratones cumplieron con los criterios de estabilidad para los umbrales de ICSS (± 10% sobre 5 días consecutivos), se midieron los efectos de los tratamientos farmacológicos. SB334867 (Scripps Florida) o DMSO se administró en días alternos con una jeringa Hamilton (0.1 mL / kg ip), y los umbrales se cuantificaron inmediatamente en sesiones de prueba de 15-min. El norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) se administró en solución salina (10 mL / kg) 48 h antes del inicio de las pruebas de ICSS.

El 5-CSRTT.

Las ratas fueron restringidas por alimentos (hasta 85% de peso de alimentación libre) y entrenadas en cámaras operantes controladas por computadora alojadas dentro de gabinetes ventilados, con atenuación de sonido (Med Associates), y los procedimientos de 5-CSRTT se llevaron a cabo como se describe (25). SB334867 (en DMSO, 0.1 mL / kg) y / o cocaína (en solución salina, 1 mL / kg; Sigma) se administró mediante inyección ip 10 min antes de la prueba, como en otros experimentos, y norBNI se administró al menos 48 h antes de la prueba. comienzo de la pruebaMateriales y Métodos SI, 5–Opción de tiempo de reacción en serie de elección).

IV Autogestión de la cocaína.

Las ratas y los ratones se anestesiaron con una mezcla de vapor de oxígeno isoflurano (1-3% vol / vol) y se prepararon quirúrgicamente con catéteres Silastic (VWR Scientific) en la vena yugular según los procedimientos establecidos (54). Inmediatamente después de la implantación del catéter en las ratas, se implantaron cánulas guía bilaterales de acero inoxidable (calibre 23, 17 mm de longitud) en el VTA (de bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm de dura ). La prueba con SB334867 o norBNI durante sesiones diarias de 60 minutos se realizó después de que se logró una ingesta estable de cocaína (<20% de variación en la respuesta durante 3 días consecutivos; Materiales y Métodos SI, IV Auto-Administración de Cocaína).

Estadísticas.

Los datos se expresan como media ± SEM. Para los experimentos de ICSS, se usó ANOVA de medidas repetidas de dos vías para comparar las medias entre las condiciones tratadas con SB334867 y las tratadas con norBNI + SB334867. ANOVA de medidas unidireccionales de una vía con pruebas post hoc de Newman-Keuls se usó para comparar medias dentro de SB334867 y norBNI + SB334867. Las pruebas ANOVA y Newman-Keuls de medidas unidireccionales también se utilizaron para comparar medias en todos los experimentos 5CSRTT. Se usó ANOVA de medidas repetidas de dos vías para comparar las medias entre los grupos de tratamiento en experimentos de autoadministración de cocaína con OX₁Ratones R KO. Se utilizaron las pruebas ANOVA y Newman-Keuls de medidas unidireccionales para comparar las respuestas medias a orexina y dinorfina por las neuronas VTA DA. Las pruebas ANOVA y Newman-Keuls de una sola vía también se utilizaron para comparar los promedios del consumo de cocaína en ratas tratadas con SB334867 y norBNI. Las diferencias se consideraron significativas si P <0.05.

Agradecemos al Dr. Garrett Fitzmaurice por sus útiles comentarios sobre el manuscrito ya Miranda S. Gallo y Melissa Chen por su asistencia en la recolección de datos. Este trabajo fue apoyado por National Institutes of Health Grants F32-DA026250 y K99-DA031767 (a JWM), F32-DA024932 y K99-DA031222 (a JAH), R01-DA023915 (a. PJK), y RXNXX ) y por una beca de descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (a SLB).

Declaración de conflicto de intereses: WAC posee una patente (Patente de EE. UU. 6,528,518; Asignado: McLean Hospital) relacionada con el uso de antagonistas opioides kappa para el tratamiento de trastornos depresivos. Todos los demás autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Este artículo es un envío directo PNAS.

Ver Comentario en la página. 5765.

Este artículo contiene información de apoyo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.