Ley de Recompensas Naturales y de Drogas sobre Mecanismos de Plasticidad Neural Comunes con ΔFosB como un Mediador Clave (2013)

Los animales

Adultos machos (225 – 250 g al llegar) y hembras (210 – 220 g) ratas Sprague Dawley (Charles River Laboratories) se alojaron en jaulas de plexiglás en parejas del mismo sexo a lo largo de los experimentos, bajo regulación de temperatura y humedad y en un 12 / 12 h Ciclo claro / oscuro con comida y agua disponible gratuitamente. Las parejas femeninas para las sesiones de apareamiento fueron ovariectomizadas y recibieron implantes subcutáneos que contenían 5% de benzoato de estradiol (Sigma-Aldrich) e inyecciones de 500 μg de progesterona (en 0.1 ml de aceite de sésamo; Sigma-Aldrich) 4 h antes de la prueba. Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Western Ontario y la Universidad de Michigan y se ajustaron a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales e Institutos Nacionales de la Salud que involucran animales vertebrados en investigación.

Comportamiento sexual.

Las sesiones de apareamiento ocurrieron durante la fase oscura temprana (entre 2 y 6 h después del inicio del período oscuro) bajo iluminación roja tenue, en jaulas de prueba limpias (60 × 45 × 50 cm). Las ratas macho se aparearon con la eyaculación durante las sesiones diarias de apareamiento de 4 o 5. Se eligieron cinco sesiones porque anteriormente hemos demostrado que este paradigma causa la facilitación a largo plazo del comportamiento sexual (Lanzadores et al., 2010b), sensibilización cruzada a la actividad locomotora de Amph (Lanzadores et al., 2010a), y recompensa (Lanzadores et al., 2010a). La eyaculación se eligió como el punto final de cada sesión de apareamiento porque anteriormente demostramos que es esencial para los efectos de la experiencia sexual en la sensibilización locomotora de Amph (Lanzadores et al., 2010a), lo que no ocurrió cuando se permitió que los animales se aparearan con hembras sin mostrar eyaculación. Los parámetros de comportamiento sexual (es decir, la latencia del primer montaje, la intromisión y la eyaculación y el número de montajes e intromisiones) se registraron como se describió anteriormente (Lanzadores et al., 2010b). Para todos los experimentos, los grupos con experiencia sexual se combinaron para el comportamiento sexual (número total de eyaculaciones y latencia a la eyaculación durante cada sesión de apareamiento). Después de la quinta sesión de apareamiento, los machos permanecieron alojados con parejas del mismo sexo y no se les permitió aparearse durante los períodos de abstinencia sexual de 1, 7 o 28 d. Los animales que permanecieron sexualmente ingenuos fueron manipulados y alojados en las mismas habitaciones que los machos con experiencia sexual. Además, los controles ingenuos se colocaron en jaulas de prueba limpias durante una hora durante 5 días consecutivos, sin acceso a una hembra receptiva.

Expresión de BFosB.

Los animales se anestesiaron profundamente (pentobarbital sódico; 390 mg / kg; ip) y se perfundieron intracardialmente con 50 ml de 0.9% de solución salina, seguido de 500 ml de 4% de paraformaldehído (Sigma-Aldrich) en 0.1 m fosfato (PB) para el tiempo Experimentos de puntos y antagonistas de la RD. Los cerebros se retiraron y se fijaron posteriormente para 1 h a temperatura ambiente en el mismo fijador, luego se almacenaron a 4 ° C en 20% de sacarosa y 0.01% de azida sódica en 0.1 m PB. Para los experimentos con antagonistas de la DR, se extrajeron los cerebros y se redujeron a la mitad a lo largo del eje sagital. Una mitad se almacenó en PB y se usó para DiOlistics, y la otra se procesó para ΔFosB. Las secciones coronales (35 μm) se cortaron con un microtomo de congelación (Microm H400R), se recogieron en cuatro series paralelas en solución crioprotectora (30% de sacarosa y 30% de etilenglicol en 0.1 m PB) y se almacenaron a -20 ° C. Las secciones de flotación libre se lavaron extensivamente con 0.1 m PBS, pH 7.35, entre las incubaciones, y todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. Las secciones fueron expuestas a 1% H₂O₂ (10 min) y solución de incubación (1 h; PBS que contiene 0.1% BSA, Fisher; y 0.4% Triton X-100, Sigma-Aldrich). Las secciones se incubaron luego durante la noche en el anticuerpo policlonal de conejo pan-FosB (1: 5K; sc-48 Biotecnología de Santa Cruz), previamente validado (Perrotti et al., 2004, 2008; Lanzadores et al., 2010b). El anticuerpo pan-FosB se generó contra una región interna compartida por FosB y ΔFosB, y se ha caracterizado previamente para visualizar específicamente las células ΔFosB en los puntos de tiempo utilizados en este estudio (> 1 d después del estímulo) (Perrotti et al., 2004, 2008; Lanzadores et al., 2010b). Luego, las secciones se incubaron en IgG anti-conejo de cabra conjugado con biotina (1 h; 1: 500 en PBS +; Vector Laboratories), avidina-biotina-peroxidasa de rábano picante (1 h; ABC Élite; 1: 1000 en PBS; Vector Laboratories) y 0.02% 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (10 min; Sigma-Aldrich) con 0.02% de sulfato de níquel en 0.1 m PB con peróxido de hidrógeno (0.015%). Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost plus (Fisher) y se cubrieron con xileno de ftalato de dibutilo.

Los números de células ΔFosB-IR se contaron en la cubierta y el núcleo de NAc dentro de las áreas de análisis estándar (400 × 600 μm) como se describió anteriormente (Lanzadores et al., 2010b). Se contabilizaron dos secciones por subregión NAc, promediadas por animal. En el experimento de punto temporal, los números de células ΔFosB-IR se expresaron como un cambio de veces del grupo de control ingenuo en el momento apropiado y se compararon entre grupos experimentados e ingenuos para cada subregión en cada punto de tiempo individual utilizando datos no pareados. t pruebas con un nivel de significación de p <0.05. En los experimentos con antagonistas de ΔJunD-AAV y DR, se utilizó un ANOVA bidireccional o unidireccional, respectivamente, y el método de Holm-Sidak. Además, las células ΔFosB-IR se contaron en el cuerpo estriado dorsal (área de análisis: 200 x 600 μm), inmediatamente dorsal al NAc y adyacente al ventrículo lateral, en todos los animales en el experimento del antagonista DR. ANOVA unidireccional y t Se usaron pruebas para comparar entre grupos.

DiOlistics.

Para el experimento de vector viral pointJunD en el momento y en el tiempo, las ratas se perfundieron intracardialmente con 50 ml de solución salina (0.9%), seguido de 500 ml de 2% de paraformaldehído en 0.1 m PB. Los cerebros se seccionaron (100 μm coronal) utilizando un vibratome (Microm) y las secciones se almacenaron en 0.1 m PB con 0.01% de azida sódica a 4 ° C. El recubrimiento de partículas de tungsteno (1.3 μm de diámetro, Bio-Rad) con el colorante lipofílico carbocianina DiI (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′3′-tetramethylindocarbocyanine perclorato; Invitrogen) se realizó como se describió anteriormente (Forlano y Woolley, 2010). Las partículas de tungsteno recubiertas con DiI se entregaron en el tejido a 160-180 psi utilizando el sistema Helios Gene Gun (Bio-Rad) a través de un filtro con un tamaño de poro de 3.0 μm (BD Biosciences) y se dejó difundir a través de membranas neuronales en 0.1 m PB para 24 h mientras está protegido contra la luz a 4 ° C. A continuación, las rodajas se fijaron posteriormente en 4% paraformaldehído en PB para 3 a temperatura ambiente, se lavaron en PB y se montaron en cámaras selladas con marco (Bio-Rad) con gelvatol que contiene el agente anti-desvanecimiento 1,4-diazabiciclo (2,2) octano ( 50 mg / ml, Sigma-Aldrich) (Lennette, 1978).

Las neuronas marcadas con DiI se tomaron imágenes usando Zeiss LSM 510 m microscopio confocal (Carl Zeiss) y láser de helio / neón 543 nm. Para cada animal, se utilizaron neuronas 2-5 en cada subregión NAc, o en la cáscara (según la ubicación en relación con los puntos de referencia, incluidos el ventrículo lateral y la comisura anterior) en los experimentos de ΔJunD-AAV y DR antagonista, para ubicar una región de Interés en una dendrita de segundo orden para la cuantificación de la columna vertebral. Para cada neurona, se analizaron las dendritas 2-4 para cuantificar una longitud dendrítica total de 40-100 μm. Los segmentos dendríticos se capturaron utilizando el objetivo de inmersión en agua 40 × a intervalos de μm 0.25 a lo largo del z-axis, y una imagen 3D fue reconstruida (Zeiss) y se sometió a deconvolución (Autoquant X, Media Cybernetics) utilizando la configuración PSF adaptativa (ciega) y teórica según lo recomendado por el software. La densidad de la columna vertebral se cuantificó utilizando el módulo Filamento del paquete de software Imaris (versión 7.0, Bitplane). Los números de espinas dendríticas se expresaron por 10 μm, promediados para cada neurona y luego para cada animal. Las diferencias estadísticas se determinaron utilizando ANOVA de dos vías en el experimento de series temporales entre animales sexualmente ingenuos y experimentados en cada momento (factores: experiencia sexual y subregión NAc) y en el experimento ΔJunD (factores: experiencia sexual y vector viral), y uno Vía ANOVA en el experimento antagonista DR. Las comparaciones de grupo se realizaron con el método de Holm-Sidak con un nivel de significación de p <0.05.

Preferencia de lugar condicionado.

El diseño experimental de CPP era idéntico al descrito anteriormente (Lanzadores et al., 2010a), utilizando un aparato imparcial de tres compartimentos (Med Associates) y un diseño imparcial, con un ensayo de acondicionamiento de emparejamiento único de d-Amph sulfate (Amph; Sigma-Aldrich; 0.5 mg / ml / kg sc calculado sobre la base de la base libre) en la cámara emparejada y solución salina en la cámara no emparejada durante días alternos, y se realizó durante la primera mitad de la fase de luz. Los animales de control recibieron solución salina en ambas cámaras.

Las puntuaciones de CPP se calcularon para cada animal como el tiempo transcurrido (en segundos) en la cámara pareada durante la prueba posterior menos la prueba previa. Se utilizaron ANOVA de una vía y el método de Holm-Sidak para comparar grupos en los experimentos de punto temporal. Impar t prueba con significado establecido en p Se usó <0.05 para comparar Naive-Sal y Naive Amph dentro de cada punto de tiempo en el experimento de punto de tiempo, y dentro de cada tratamiento con vector viral en el experimento JunD. En el experimento de tiempo, se utilizaron ANOVA unidireccionales y el método de Holm-Sidak para comparar los grupos con experiencia sexual (Exp-Sal, 7 d Exp Amph y 28 d Exp Amph), y t Se usó la prueba para comparar los grupos ingenuos de 2. ANOVA de dos vías y el método de Holm-Sidak se utilizaron para comparar todos los grupos en el experimento antagonista DR. Dos desaparecidos t La prueba se usó para comparar los grupos Naive-Sal y Naive Amph con cada condición de tratamiento de vector viral (GFP o ΔJunD), ya que los datos eran demasiado variables en los grupos ΔJunD para permitir el análisis ANOVA. Todos los niveles de significación se establecieron en p <0.05.

Experimentos de vectores virales.

Se anestesiaron ratas macho con ketamina (87 mg / ml / kg; ip) y xilazina (13 mg / ml / kg ip), se colocaron en un aparato estereotáxico (Kopf Instruments) y se recibieron microinyecciones bilaterales de vectores virales recombinantes asociados que codifican Solo GFP (proteína verde fluorescente) o ΔJunD (pareja de unión dominante-negativa de ΔFosB) y GFP, en la NAc (coordenadas: AP + 1.5, ML ± 1.2 de bregma; DV −7.6 de cráneo), en un volumen de 1.5 μl / hemisferio sobre 7 min con una jeringa Hamilton (Harvard Apparatus). ΔJunD disminuye la transcripción mediada por BFosB mediante la heterodimerización competitiva con ΔFosB y, por lo tanto, evita la unión de ΔFosB a la región AP-1 dentro de las regiones promotoras de los genes diana (Winstanley et al., 2007; Lanzadores et al., 2010b). Aunque ΔJunD se une con alta afinidad a ΔFosB, es posible que algunos de los efectos observados de ΔJunD puedan estar mediados por antagonizar otras proteínas AP-1. Sin embargo, parece que ΔFosB es la proteína AP-1 predominante expresada en las condiciones probadas (Lanzadores et al., 2010b). Entre 3 y 4 semanas más tarde, los animales recibieron experiencia sexual durante las sesiones de apareamiento consecutivas de 4 o se mantuvieron ingenuos para crear grupos de 4: GFP sexualmente ingenuo, GFP sexualmente experimentado, ΔJunD sexualmente ingenuo y ΔJunD sexualmente experimentado. La experiencia sexual estuvo compuesta por 4 sesión de apareamiento diaria consecutiva. Los animales fueron probados para CPP y diOlistics. La verificación de los sitios de inyección se realizó como se describió anteriormente (Lanzadores et al., 2010b). Las secciones de NAc (coronal; 100 μm) se procesaron por inmunidad para GFP (1: 20,000; anticuerpo anti-GFP de conejo; Invitrogen). La propagación del virus se limitó principalmente a la porción de concha de la NAc, con propagación adicional al núcleo.

Antagonistas de D1R / D2R.

Las ratas macho se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (0.1 ml / kg) de ketamina (87 mg / ml) y xilazina (13 mg / ml), y se colocaron en un aparato estereotáxico (Kopf Instruments). Las cánulas de guía de calibre 21 bilaterales (Plastics One) se bajaron hacia el NAc en AP + 1.7, ML ± 1.2 de bregma; −6.4 DV desde el cráneo y asegurado con acrílico dental, se adhiere a tres tornillos fijados en el cráneo. Los animales se manipularon diariamente por habituación a los procedimientos de infusión durante un período de recuperación de 2 semana. Quince minutos antes del inicio de cada una de las sesiones de apareamiento diarias de 4 mediante la introducción de la hembra receptiva, las ratas macho recibieron microinyecciones bilaterales de antagonista de D1R R (+) clorhidrato de SCH-23390 (Sigma-Aldrich), antagonista del receptor de D2R (D2R) ( -) clorhidrato de eticloprida (Sigma-Aldrich) se disolvió en solución salina estéril (0.9%; cada uno a 10 μg en 1 μl por hemisferio; disuelto en 0.9% saline), o solución salina (1.0 μl por hemisferio), a una tasa de flujo de 1.0 μl / min en un intervalo 1 min seguido de 1 min con la cánula de inyección en su lugar para la difusión del fármaco. El volumen de esta inyección infundirá tanto el núcleo como la cubierta, ya que las infusiones de 0.5 μl están restringidas a las subdivisiones de la cubierta o del núcleo (Laviolette et al., 2008). Las dosis se basaron en estudios previos que demostraron que estas dosis o dosis más bajas afectaron el comportamiento de la droga o la recompensa natural (Laviolette et al., 2008; Roberts et al., 2012). Los machos de control permanecieron sexualmente ingenuos, pero recibieron solución salina intra-NAc antes de colocarlos en la jaula de prueba vacía, durante las sesiones diarias de manejo de 4. Una semana después de la sesión final de apareamiento o manejo, los machos fueron evaluados para CPP de Amph, y análisis de columna y andFosB. El uso de cuatro sesiones, en lugar de cinco sesiones como en los otros experimentos, se eligió para eliminar el daño excesivo a la NAc causado por las infusiones repetidas y, por lo tanto, permitir el análisis de la columna vertebral y ΔFosB. De hecho, el daño no fue evidente, y los análisis de la columna vertebral y ΔFosB en NAc de animales infundidos con solución salina mostraron datos similares a los grupos no infundidos en los experimentos previos. Método de ANOVA de dos vías y de Holm-Sidak con significado establecido en p Se utilizó <0.05 para determinar la facilitación de la conducta sexual inducida por la experiencia sexual.

La experiencia sexual causó un aumento inmediato y persistente en el número de células ΔFosB-IR. Doble el cambio del número de células ΔFosB-IR en la cáscara NAc (A) y núcleo (B) en animales sexualmente experimentados (negros) en comparación con controles sexualmente ingenuos (blancos) (n = 4 cada grupo). Los datos son media grupal ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles ingenuos. Representante de imágenes de Naive 1 d (C), Exp 1 d (D), Exp 7 d (E), y Exp 28 d (F). ac, comisura anterior. Barra de escala, 100 μm.

La experiencia sexual causó un aumento en el número de espinas dendríticas en la NAc y sensibilizó la recompensa de Amph. A, B, El número de espinas dendríticas en la concha NAc y el núcleo de 7 d (A) o 28 d (DB de animales sexualmente ingenuos [blancos] y experimentados [negros]; n = 4 o 5). Los datos son media grupal ± SEM. ^#p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles ingenuos. C, Segmentos dendríticos representativos de los grupos Naive 7 d y Exp 7 d utilizados para cuantificar la densidad de la columna vertebral. Barra de escala, 3 μm. D, La cantidad de tiempo que pasó en la cámara emparejada (Anf o solución salina) durante la prueba posterior menos la prueba previa (puntuación CPP) para animales sexualmente ingenuos (blancos) o experimentados (negros) analizados con 7 d o 28 d después del apareamiento final o sesión de manejo: Naive-Sal (7 d después del manejo; n = 8), Naive Amph (7 d después de la manipulación; n = 9), Exp-Sal (grupos combinados de animales probaron 7 d o 28 d después del apareamiento; n = 7), 7 d Exp Amph (7 d después del apareamiento; n = 9), y 28 d Exp Amph (28 d después del apareamiento; n = 11). Los grupos de Sal recibieron a Sal emparejado con ambas cámaras. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles de solución salina con experiencia sexual.

La atenuación de la actividad de ΔFosB en la NAc bloqueó la recompensa AMPH sensibilizada y el aumento en el número de espinas NAc en animales con experiencia sexual. AImágenes representativas de la expresión de GFP en tres animales que recibieron una inyección de enoJunD viral-adenoasociado recombinante dirigida al núcleo accumbens, que ilustra los sitios de inyección pequeños (izquierda), intermedios (medios) y grandes (derecha). ac, comisura anterior; LV, ventrículo lateral. Barra de escala, 250 μm. B, Ilustración esquemática de los lugares más destacados y patrones de propagación del virus. En todos los animales, se detectó GFP en la cáscara, pero la propagación al núcleo fue variable. C, La cantidad de tiempo que pasó en la cámara emparejada con Amph durante la prueba posterior menos la prueba previa (puntuación CPP) para animales sexualmente ingenuos (blancos) y experimentados (negros) que recibieron una inyección del vector de control de GFP (Naive, n = 9; Exp. n = 10) o ΔJunD vector (Naive, n = 9; Exp. n = 9). DImágenes representativas de segmentos dendríticos de GFP con experiencia sexual y ΔJunD utilizados para cuantificar la densidad de la columna vertebral. Barra de escala, 3 μm. E, El número de espinas dendríticas en la NAc de animales sexualmente ingenuos (blancos) y experimentados (negros) que recibieron una inyección de vector de control de GFP o vector ΔJunD. Los datos son media grupal ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles ingenuos. ^#p <0.05, diferencia significativa con respecto a los controles experimentados con GFP.

Parámetros del comportamiento sexual durante la adquisición de la experiencia sexual en grupos que recibieron infusiones NAc de vectores virales que expresan GFP o unJunD^a

Los antagonistas del receptor de dopamina infundidos en el NAc no afectaron el comportamiento sexual. Coronal NAc secciones (A, + 2.2; B, + 1.7; C, + 1.2 de bregma) que indica los sitios de inyección intra-NAc para todos los animales. Las cánulas eran bilaterales pero están representadas unilateralmente para facilitar la presentación de todos los animales (Naive-Sal, blanco, n = 7; Exp-Saline; gris oscuro, n = 9; Exp D1R Ant, gris claro, n = 9; Exp D2R Ant, negro, n = 8). ac, comisura anterior; LV, ventrículo lateral; CPu, caudado-putamen. Latencia de montaje (D), latencia de intromisión (E), y la latencia de la eyaculación (F) para todos los grupos con experiencia sexual (Saline, blanco; D1R Ant, gris; D2R Ant, negro). Los datos representan la media ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa entre el día 1 y el día 4 dentro del tratamiento.

El bloqueo de D1R en la NAc atenúa el aumento en el número de células ΔFosB-IR en la NAc de animales con experiencia sexual. Doble el cambio del número de células ΔFosB-IR en la cáscara NAc (A) y núcleo (B) en animales sexualmente experimentados (negros) en comparación con controles sexualmente ingenuos (blancos) (Naive-Sal, n = 6; Exp-salina, n = 7; Exp D1R Ant, n = 9; Exp D2R Ant, n = 8). Los datos son media grupal ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles ingenuos. ^#p <0.05, diferencia significativa en comparación con los animales experimentados con solución salina y D2R Ant. Representante de imágenes de Naive Sal (C), Exp Sal ​​(D), Exp D1R Ant (E), y Exp D2R Ant (F). ac, comisura anterior. Barra de escala, 100 μm.

El bloqueo de los receptores D1 en la NAc elimina la recompensa de Amph sensibilizada y el aumento de las espinas dendríticas en animales con experiencia sexual. A, La cantidad de tiempo que pasó en la cámara emparejada con Amph durante la prueba posterior menos la prueba previa (puntuación de CPP, segundos) para la ingenuidad sexual (blanco, n = 6) y animales experimentados (negros) que recibieron solución salina (n = 7), antagonista de D1R (n = 9), o antagonista de D2R (n = 8). Los datos son media grupal ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles de solución salina sin tratamiento previo. ^#p <0.05, diferencia significativa con respecto a los animales experimentados con D1R Ant. B, El número de espinas dendríticas (por 10 μm) para sexualmente ingenuo (blanco, n = 7) y animales experimentados (negros) que recibieron solución salina (n = 8), antagonista de D1R (n = 8), o antagonista de D2R (n = 8). Los datos son media grupal ± SEM. *p <0.05, diferencia significativa en comparación con los controles de solución salina sin tratamiento previo. ^#p <0.05, diferencia significativa con respecto a los controles de solución salina experimentados.