PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Door cocaïne veroorzaakte veranderingen in genexpressie veroorzaken veranderingen in neuronale morfologie en gedrag die ten grondslag kunnen liggen aan cocaïneverslaving. We identificeerden een essentiële rol voor histon 3 lysine 9 (H3K9) dimethylering en de lysine dimethyltransferase G9a in cocaïne-geïnduceerde structurele en gedragsplasticiteit. Herhaalde cocaïnetoediening verminderde de wereldwijde niveaus van H3K9-dimethylering in de nucleus accumbens. Tzijn vermindering van histon-methylering werd gemedieerd door de onderdrukking van G9a in dit hersengebied, dat werd gereguleerd door de door cocaïne geïnduceerde transcriptiefactor ΔFosB. Met behulp van voorwaardelijke mutagenese en door virussen gemedieerde genoverdracht, ontdekten we dat G9a-downregulatie de plasticiteit van de dendritische wervelkolom van nucleus accumbens-neuronen verhoogde en de voorkeur voor cocaïne verhoogde, waardoor een cruciale rol voor histon-methylatie in de langetermijnwerking van cocaïne werd vastgesteld.
Introductie
Herhaalde blootstelling aan cocaïne wordt gekenmerkt door aanhoudende veranderingen in genexpressie en veranderde neuronale morfologie in de nucleus accumbens (NAc), een belangrijk onderdeel van het beloningscircuit van de hersenen (1-2). Chromatine-remodellering is belangrijk bij afwijkende transcriptionele veranderingen in dit hersengebied die ten grondslag kunnen liggen aan aspecten van cocaïneverslaving (3-9). Cocaïneregulatie van de chromatinestructuur in het NAc is gedeeltelijk het gevolg van directe door cocaïne geïnduceerde modificaties van de chromatine-enzymatische machinerie, leidend tot veranderingen in histonacetylering en fosforylering (4, 7-9); de rol van enzymen die histon-methylering regelen, is echter nog niet onderzocht.
Een recente genoombrede promotoranalyse met behulp van chromatine-immunoprecipitatie gekoppeld aan microarrays (ChIP-Chip) identificeerde veranderde patronen van repressieve histon H3 lysine 9 (H3K9) en 27 (H3K27) methylering bij specifieke genpromotors in het NAc na herhaalde cocaïnebehandeling (6). We hebben daarom talrijke lysine-methyltransferasen (KMT's) en demethylasen (KDM's) geprofileerd waarvan bekend is dat ze H3K9- of H3K27-methylatie regelen (Fig. 1A). Slechts twee enzymen, G9a en GLP, vertoonden aanhoudende transcriptionele regulatie 24 uur na herhaalde cocaïnetoediening, toen de expressie van beide genen aanzienlijk was verlaagd. Omdat G9a en GLP specifiek de dimethylering van H3K9 (H3K9me2) katalyseren, is hun downregulatie door cocaïne consistent met de verlaagde globale niveaus van euchromatisch H3K9me2 die op dit tijdstip zijn waargenomen (Fig. 1B). Daarentegen bleven de wereldwijde niveaus van heterochromatische H3K27-methylering ongewijzigd door herhaalde blootstelling aan cocaïne (Fig. S1 in ondersteunend online materiaal). Vanwege de hoge niveaus van katalytische activiteit beide in vitro en in vivo (10), wilden we de functionele betekenis van G9a-repressie na herhaalde blootstelling aan cocaïne in het NAc verder onderzoeken. Niveaus van G9a-eiwit, zoals niveaus van zijn mRNA, waren significant verlaagd 24 uur na herhaalde toediening van cocaïne (Fig. S2). Hoewel G9a-mRNA-expressie met 35% was verminderd in het NAc, onthulde immunohistochemische analyse een meer bescheiden verlaging van 15% in G9a-eiwitniveaus, consistent met de waargenomen afname van 21% in H3K9me2 na herhaalde toediening van cocaïne (Fig. 1B). G9a-mRNA-expressie werd in dit hersengebied ook met 20% verlaagd na herhaalde zelftoediening van cocaïne (Fig. S3).
Om te identificeren of veranderingen in euchromatisch H3K9me2 correleren met genoomwijde veranderingen in genexpressie in het NAc, hebben we microarray-analyses gebruikt om genexpressieprofielen te onderzoeken die werden geïnduceerd door een provocatiedosis cocaïne bij dieren met of zonder een voorgeschiedenis van eerdere blootstelling aan cocaïne (zie aanvullende informatie). genenlijsten in Tabellen S1-S3). Dieren die herhaaldelijk cocaïne hadden gekregen, vertoonden een dramatisch verhoogde genexpressie 1 uur na een cocaïne-uitdaging in vergelijking met acuut behandelde dieren (Fig. 1C). Deze verhoogde genexpressie trad nog steeds op als reactie op een cocaïne-uitdaging die werd gegeven na 1 week stoppen met herhaalde cocaïne. In overeenstemming met eerdere rapporten vertoonde een klein percentage genen (~ 10%) ongevoelige transcriptionele reacties na herhaalde toediening van cocaïne (Fig. 1C; zien Tabel S1) (5). Om direct de rol van G9a-downregulatie in de verbeterde genexpressie waargenomen na herhaalde cocaïne te onderzoeken, ontvingen muizen intra-NAc-injecties van Herpes simplex-virus (HSV) -vectoren die GFP of G9a tot expressie brachten en werden ze behandeld met zoutoplossing of herhaalde cocaïne om te bepalen of G9a-overexpressie was voldoende om de herhaalde door cocaïne geïnduceerde versterking van genexpressie te blokkeren. Uit een set van 12 willekeurig geselecteerde genen die verhoogde expressieniveaus vertoonden na herhaalde cocaïne, zagen we dat G9a de verhoogde expressie van 50% van deze genen aanzienlijk verminderde (Tabel S4).
Om stroomopwaartse transcriptiegebeurtenissen te identificeren die de herhaalde cocaïne-geïnduceerde repressie van G9a-expressie mediëren, onderzochten we een mogelijke rol voor ΔFosB, een zeer stabiel splitsingsproduct van het directe vroege gen FosB. ΔFosB hoopt zich op in het NAc na herhaalde blootstelling aan cocaïne, waar het is gekoppeld aan een verhoogde cocaïnebeloning (11). ΔFosB kan fungeren als een transcriptionele activator of repressor, afhankelijk van het betrokken doelwitgen (3, 5, 6, 12). Met behulp van bitransgene NSE-tTA × tetOP-ΔFosB muizen, waarbij ΔFosB-expressie selectief kan worden geïnduceerd in het NAc en dorsale striatum van volwassen dieren (13), onderzochten we de impact van ΔFosB-expressie op cocaïneregulatie van H3K9me2 en KMT's in het NAc. ΔFosB-overexpressie was voldoende om de niveaus van zowel H3K9me2 (Fig. 1D) en G9a-expressie (Fig. 1E), waardoor de effecten van herhaalde cocaïne worden nagebootst. ΔFosB daarentegen verminderde de GLP-expressie in dit hersengebied niet en had geen effect op SUV39H1 en EZH2, de belangrijkste trimethylerende enzymen voor respectievelijk H3K9 en H3K27 (Fig. S4). Om deze gegevens te bevestigen met behulp van een onafhankelijk ΔFosB-overexpressiesysteem, ontvingen wildtype volwassen muizen bilaterale intra-NAc-injecties van Adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren die GFP of ΔFosB tot expressie brachten. Viraal gemedieerde overexpressie van ΔFosB verlaagde niveaus van G9a-expressie in dit hersengebied (Fig. 1E).
Een dergelijke uitgesproken en specifieke regulatie van G9a bracht ons ertoe om te onderzoeken of het veranderen van G9a-expressie specifiek in NAc-neuronen gedragsreacties op cocaïne reguleert. Wildtype-muizen ontvingen intra-NAc-injecties van HSV-vectoren die GFP of G9a tot expressie brachten en werden vervolgens geanalyseerd met behulp van een onbevooroordeeld, door cocaïne geconditioneerd plaatsvoorkeursparadigma, dat een indirecte maatstaf voor medicijnbeloning biedt. Virale overexpressie van G9a in NAc-neuronen werd bevestigd na gedragstesten (Fig. 2A). Overexpressie van G9a verminderde significant de voorkeur voor cocaïne in vergelijking met dieren die GFP tot overexpressie brachten (Fig. 2B), en verhoogde H3K9me2-niveaus in het NAc (Fig. 2C). Overexpressie van een katalytisch dode mutant van G9a (G9aH1093K) (14) had geen invloed op de cocaïnevoorkeur (Fig. 2B) en had geen invloed op de H3K9me2-spiegels in dit hersengebied (Fig. 2C).
Om de rol van G9a in de gedragseffecten van cocaïne verder te bestuderen, en meer specifiek om de herhaalde door cocaïne geïnduceerde onderdrukking van G9a-expressie in het NAc na te bootsen, volwassen G9afl / fl muizen (14) ontvingen intra-NAc-injecties van AAV-vectoren die Cre-recombinase of GFP tot expressie brachten als controle. AAV-Cre knockdown van G9a in het NAc, hetgeen immunohistochemisch werd bevestigd (Fig. S5), verhoogde de effecten van cocaïne aanzienlijk bij conditioneringsexperimenten en verlaagde H3K9me2-niveaus in het NAc (Afb. 2D, E). Een in de handel verkrijgbare farmacologische remmer van G9a en GLP, BIX01294 (15-16), werd gebruikt om vast te stellen of enzymremming op vergelijkbare wijze gedragsreacties op cocaïne beïnvloedt. Farmacologische remming van G9a en GLP verhoogde inderdaad significant de voorkeur voor cocaïne en verminderde H3K9me2 in het NAc (Afb. 2F, G).
Herhaalde toediening van cocaïne verhoogt de dichtheid van dendritische stekels op NAc medium stekelige neuronen (17), een proces geassocieerd met functionele veranderingen bij prikkelende glutamaterge synapsen op deze neuronen (18-19) en gesensibiliseerde gedragsreacties op het medicijn (17, 20). We veronderstelden dus dat downregulatie van G9a-activiteit in het NAc door herhaalde cocaïne het vermogen van cocaïne om de dendritische wervelkolomdichtheid van NAc-neuronen te reguleren, zou kunnen mediëren. Met behulp van chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) met een anti-G9a-antilichaam identificeerden we verschillende vermeende G9a-gendoelen in het NAc, die elk eerder betrokken waren bij door cocaïne geïnduceerde dendritische plasticiteit (Fig. 3A) (20-26). We ontdekten dat herhaalde toediening van cocaïne de G9a-binding aanzienlijk verminderde, evenals de niveaus van H3K9me2, bij deze genpromotors (Fig. 3B). Acute cocaïnetoediening rekruteerde daarentegen snel G9a voor enkele van dezelfde genpromotors, consistent met verhoogde G9a-expressie waargenomen in het NAc 1 uur na een acute dosis cocaïne (Fig. S6). Hoewel G9a-binding aan specifieke genpromotors correleert met veranderingen in de expressie ervan, blijft het onduidelijk of dergelijke gebeurtenissen worden gemedieerd door veranderde globale niveaus van G9a in het NAc en/of door verschillen in G9a-rekrutering na acute vs herhaalde toediening van cocaïne.
Op basis van G9a's regulatie van talrijke aan plasticiteit gerelateerde genen in het NAc, hebben we direct onderzocht of handhaving van G9a-expressie in dit hersengebied na herhaalde cocaïnebehandeling voldoende was om door cocaïne geïnduceerde vorming van dendritische wervelkolom te blokkeren. Gebruikmakend van een cocaïnebehandelingsprotocol waarvan eerder is aangetoond dat het de inductie van dendritische wervelkolom in het NAc bevordert (20), onderzochten we de dichtheid van de wervelkolom bij dieren die waren geïnjecteerd met HSV-GFP of HSV-G9a. In overeenstemming met eerdere bevindingen, zagen we een significante toename van dendritische wervelkolomdichtheid in het NAc na behandeling met cocaïne, een effect dat volledig werd geblokkeerd door overexpressie van G9a (Fig. 3C). Overexpressie van G9a alleen was niet voldoende om de dendritische wervelkolomdichtheid van NAc te verminderen in afwezigheid van cocaïne. Als aanvulling op deze gegevens heeft G9afl / fl muizen ontvingen intra-NAc-injecties van HSV-Cre en de dichtheid van de wervelkolom werd gekwantificeerd en vergeleken met dieren die HSV-GFP kregen in afwezigheid van cocaïne. Neerhalen van G9a-expressie verhoogde significant de ruggengraatdichtheid op NAc medium stekelige neuronen (Fig. 3C).
Gezien het bewijs dat G9a-downregulatie in het NAc na herhaalde cocaïne wordt gemedieerd door ΔFosB, hebben we vervolgens onderzocht of deze transcriptiefactor eveneens betrokken is bij de regulatie van NAc dendritische stekels. Hoewel ΔFosB niet eerder causaal in verband is gebracht met dergelijke dendritische plasticiteit, zijn verschillende van zijn doelen, waaronder Cdk5- en NFKB-subeenheden, zo betrokken (20-23), en de aanhoudende expressie van ΔFosB in NAc-neuronen correleert met een verhoogde dendritische wervelkolomdichtheid na herhaalde cocaïnebehandeling (27). Ten eerste ontdekten we dat inductie van ΔFosB in bitransgene muizen in afwezigheid van cocaïne, wat de G9a- en H3K9me2-expressie verlaagde (Afb. 1D, E), verminderde G9a-binding aan talrijke aan plasticiteit gerelateerde genen, waarvan er vele ook zijn aangetoond dat ze directe doelen zijn van ΔFosB zelf (Fig. 3D) (3, 6). We toonden vervolgens aan dat virale overexpressie van ΔFosB in het NAc de dichtheid van de dendritische wervelkolom onder basale omstandigheden aanzienlijk verhoogde, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen na herhaalde toediening van cocaïne (Fig. 3E). Omgekeerd blokkeerde overexpressie in het NAc van ΔJunD, een dominant negatief mutant eiwit dat ΔFosB-transcriptieactiviteit tegenwerkt, het vermogen van herhaalde cocaïne om dendritische wervelkolomvorming in het NAc te verhogen. (Fig. 3C).
Onze observatie dat ΔFosB de G9a-expressie in het NAc reguleert, en dat ΔFosB en G9a enkele van dezelfde doelwitgenen reguleren, bracht ons ertoe andere interacties tussen ΔFosB en G9a te onderzoeken. Na acute cocaïne, toen de G9a-spiegels waren verhoogd, binding van G9a aan de FosB gen was verhoogd, terwijl na herhaalde cocaïne, wanneer G9a-expressie werd onderdrukt, G9a-binding aan de FosB gen was verlaagd (Fig. 3A). Een dergelijke verminderde G9a-binding na herhaaldelijk gebruik van cocaïne werd niet waargenomen c-fos, waar G9a-binding wordt verhoogd door herhaalde cocaïne (Fig. S7). Dit komt overeen met het feit dat, in tegenstelling tot FosB, c-fos wordt onderdrukt, niet geïnduceerd, door chronische blootstelling aan psychostimulantia (5). ΔFosB-overexpressie in bitransgene muizen was voldoende om G9a-binding aan de FosB gen (Fig. 3D). Bovendien was de overexpressie van G9a voldoende om verhoogde ΔFosB-expressie te verminderen na herhaalde toediening van cocaïne (Tabel S4). Deze gegevens suggereren een autoregulerende lus waarbij G9a aanvankelijk de inductie van ΔFosB door acute cocaïnetoediening beperkt. Naarmate ΔFosB zich echter ophoopt bij herhaalde blootstelling aan geneesmiddelen, onderdrukt het G9a en versterkt daardoor zijn eigen verdere inductie.
Concluderend hebben we aangetoond dat histon-lysine-methylering in het NAc kritisch betrokken is bij het reguleren van neuronale genexpressie als reactie op cocaïne. Onderdrukking van G9a en H3K9me2 na herhaalde cocaïnetoediening bevordert de voorkeur voor cocaïne, gedeeltelijk door de transcriptionele activering van talrijke genen waarvan bekend is dat ze afwijkende vormen van dendritische plasticiteit reguleren. Een beter begrip krijgen van de genen die via dergelijke mechanismen worden gereguleerd, zal onze kennis van de complexe biologische basis van drugsverslaving verbeteren en zou kunnen helpen bij de ontwikkeling van effectievere behandelingen van verslavende aandoeningen.
Materialen en methoden
Dieren en behandelingen
Tenzij anders vermeld, werden de muizen vier tot vijf per kooi gehuisvest in een kolonie met een licht/donkercyclus van 12 uur (licht aan van 7 uur tot 00 uur) bij een constante temperatuur (7°C) met ad libitum toegang tot water en voedsel. Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door IACUC in zowel het UT Southwestern Medical Center als de Mount Sinai School of Medicine.
Voor cocaïne-experimenten [immunohistochemie, western blotting, kwantitatieve PCR (qPCR), microarray-analyse en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)] werden mannelijke C8BL/10J-muizen van 57 tot 6 weken oud gebruikt. Dieren kregen dagelijkse injecties van ofwel 'zoutoplossing' (7 behandelingen zoutoplossing, ip), 'acute' cocaïne (6 behandelingen zoutoplossing + één behandeling 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip) of 'herhaalde' cocaïne (7 behandelingen 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip). Muizen werden 1 uur of 24 uur na de laatste behandeling opgeofferd. Voor microarray-onderzoeken werden dieren dagelijks behandeld met 'zoutoplossing' (15 behandelingen zoutoplossing, ip), 'acute' cocaïne (14 behandelingen zoutoplossing + 1 behandeling 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip), 'herhaald + acuut' cocaïne ( 7 behandelingen zoutoplossing + 8 behandelingen 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip) of 'herhaalde onthouding + acute' cocaïne (7 behandelingen 20 mg/kg cocaïne-HCl + 7 behandelingen zoutoplossing + 1 provocatiebehandeling 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip) en werden 1 uur na de laatste behandeling opgeofferd. Bij gedragsexperimenten werden muizen afzonderlijk gehuisvest na de operatie en werden ze behandeld met 10 mg/kg cocaïne-HCl, ip zoals hieronder beschreven. Voor dendritische wervelkolomanalyse en microarray-validatie na HSV-GFP- en HSV-G9a-GFP-infectie werden muizen behandeld met 'zoutoplossing' (5 behandelingen zoutoplossing, ip) of 'herhaalde cocaïne' (5 behandelingen 20 mg/kg cocaïne-HCl, ip ) in de loop van 3 dagen, aangezien eerder is aangetoond dat dit injectieprotocol de dichtheid van de wervelkolom op nucleus accumbens (NAc) neuronen verhoogt binnen het tijdsbestek van Herpes simplex virus (HSV) transgenexpressie (Aanvullende referentie S1). Muizen die werden gebruikt voor analyse van de dendritische wervelkolom werden 4 uur na de laatste behandeling opgeofferd.
Om lokale deletie te induceren van het G9a-transcript beperkt tot NAc-neuronen, gebruikten we mutante muizen die homozygoot waren voor een floxed G9a-allel, die elders in detail zijn beschreven (S2). Cre-geïnduceerde recombinatie produceert exon 22 tot 25 out-of-frame splicing, wat leidt tot onzin-gemedieerd verval van het gemuteerde transcript. We gebruikten G9a floxed-muizen die volledig waren teruggekruist met C57BL/6J-muizen. Muizen werden sterotaxisch geïnjecteerd in het NAc met Adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren (serotype 2) die GFP of Cre-GFP tot expressie brengen tussen de leeftijd van 7 en 10 weken. Immunohistochemische analyse werd gebruikt om de efficiëntie van Cre-gemedieerde recombinatie te verifiëren (zie Aanvullende afbeelding S5). We gebruikten AAV-geïnjecteerde dieren 21 dagen na de operatie omdat recombinatie in G9a floxed muizen stabiel en maximaal was op dit tijdstip, consistent met gepubliceerde rapporten (S3-S4). G9a- en ΔJunD-overexpressie-experimenten werden op vergelijkbare wijze uitgevoerd met behulp van HSV-virusvectoren die ofwel GFP, wildtype G9a-GFP, katalytisch dood G9aH1093K-GFP of ΔJunD-GFP tot expressie brachten (zie S2 voor details over de ontwikkeling van G9a-constructies). Muizen met HSV-overexpressie werden 3 dagen na de operatie gebruikt, aangezien de overexpressie op dit tijdstip maximaal was, zoals waargenomen via immunohistochemie. Vanwege de voorbijgaande aard van HSV-expressie en de aanzienlijk stabielere aard van AAV-expressie, werden HSV-vectoren gebruikt in experimenten die snelle transgenexpressie op korte termijn vereisten, terwijl AAV-vectoren werden gebruikt in experimenten die langdurige perioden van transgenexpressie vereisten. Van beide vectoren is in uitgebreide eerdere studies aangetoond dat ze alleen neuronale cellichamen binnen het geïnjecteerde hersengebied infecteren, zonder enige infectie van afferente of efferente neuronen.
Voor gedragsexperimenten met behulp van de farmacologische G9a / GLP-remmer, BIX01294 (25 ng / μl), werden muizen stereotaxisch geïmplanteerd met twee subcutane minipompen, evenals bilaterale geleidecanules, in de NAc. Minipompen werden 12 uur voorafgaand aan implantatie geactiveerd, waardoor de continue afgifte (0.25 μl / uur) van ofwel drager (5-hydroxypropyl-β-cyclodextrine) of geneesmiddel gedurende 14 dagen werd geïnitieerd, gedurende welke tijd gedragsevaluaties werden uitgevoerd.
Voor experimenten met ΔFosB-overexpressie [western blotting, qPCR en ChIP], mannelijke bitransgene NSE-tTA × tetOP-ΔFosB muizen werden gebruikt (10 weken oud), waarbij bij afwezigheid van het tetracyclinederivaat doxycycline (8 weken zonder doxycycline), dieren robuuste striatale beperkte constitutieve expressie van ΔFosB vertoonden (S5). ΔFosB-overexpressie bij deze muizen werd bevestigd via qPCR. Om bevindingen te bevestigen met behulp van NSE-tTA × tetOP-ΔFosB muizen, wildtype 8 weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen werden sterotaxisch geïnjecteerd intra-NAc met AAV-vectoren die GFP of ΔFosB-GFP tot expressie brachten. AAV-vectoren werden in dit geval gebruikt om maximale ΔFosB-expressie te garanderen op 8 weken na de operatie, waardoor een directe vergelijking mogelijk was tussen viraal geïnfecteerde en bitransgene ΔFosB tot overexpressie brengende muizen. Virale overexpressie werd bevestigd met behulp van qPCR 8 weken na de operatie (15-gauge NAc-ponsen werden ontleed onder de injectieplaats). AAV-GFP en AAV-ΔFosB-GFP tot overexpressie brengende muizen die niet werden gebruikt voor qPCR werden behandeld met zoutoplossing (14 behandelingen zoutoplossing, ip) of herhaalde cocaïne (14 behandelingen 30 mg/kg cocaïne-HCl, ip) vanaf 6 weken post- chirurgie. 4 dagen na de laatste behandeling werden de hersenen gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gesneden op een vibratoom en gebruikt voor dendritische wervelkolomanalyse.
Western blot-analyse
14-gauge NAc-ponsen werden genomen van coronale secties van 1 mm verkregen met behulp van een roestvrijstalen muizenhersenenmatrix en werden gesoniceerd in 1 M HEPES-lysisbuffer (1% SDS) die protease- en fosfataseremmers bevatte. 10-Monsters van 30 μg totaal eiwit werden geëlektroforeerd op 18% SDS-gels. Eiwitten werden overgebracht naar PVDF-membranen en geïncubeerd met ofwel anti-H3K9me2 (monoklonaal muis, 1:500), anti-β-tubuline (monoklonaal muis, 1:60,000), anti-totaal histon H3 (polyklonaal konijn, 1:5,000), anti-GFP (gebruikt voor verificatie van gelijke virale expressie in geponst weefsel) (konijn polyklonaal, 1:1000), anti-H3K27me3 (konijn polyklonaal, 1:500) of anti-actine antilichamen (muis monoklonaal, 1:60,000) 's nachts bij 4°C (alle membranen waren geblokkeerd in 5% melk of 5% runderserumalbumine). Membranen werden vervolgens geïncubeerd met met peroxidase gemerkte secundaire antilichamen (1:15,000-1:60,000 afhankelijk van het gebruikte primaire antilichaam) en banden werden gevisualiseerd met behulp van SuperSignal West Dura-substraat. Banden werden gekwantificeerd met NIH Image J Software en H3K9me2-banden werden genormaliseerd naar actine of β-tubuline en naar totaal histon H3 om te controleren op gelijke belasting. Herhaalde cocaïne had geen effect op de actinespiegels (Fig. S8) of totaal histon 3 (Fig. S1) in het NAc. Bovendien hadden HSV-G9a-GFP- en HSV-G9aH1093K-GFP-infectie geen effect op de totale niveaus van β-tubuline in het NAc (Fig. S8).
immunohistochemie
Muizen werden verdoofd met een dodelijke dosis chloraalhydraat en geperfundeerd met 4% paraformaldehyde voordat ze werden geanalyseerd door enkele of dubbele immunohistochemie zoals eerder beschreven (S6). In het kort werden post-gefixeerde hersenen een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd in 30% sucrose voordat ze werden gesneden bij 35 μm (hersenen die werden gebruikt voor analyse van de dendritische wervelkolom werden gesneden op een vibratoom bij secties van 100 μm in afwezigheid van 30% sucrose). Vrij zwevende NAc-secties werden gewassen met 1X PBS, geblokkeerd (3% normaal ezelserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) en later geïncubeerd met anti-GFP (polyklonaal kip, 1:8000) en/of anti-G9a (polyklonaal konijn , 1:500) antilichamen in blokkerende oplossing. Secties die werden geanalyseerd op dendritische stekels werden geïncubeerd met een konijnen polyklonaal anti-GFP-antilichaam in een verhouding van 1:200. Na incubatie gedurende de nacht werden NAc-secties 3 keer gedurende 10 minuten gespoeld met 1X PBS, gevolgd door incubatie met Cy2 en/of Cy3 fluorescerend gekoppelde secundaire antilichamen in 1X PBS-blokkeeroplossing gedurende 2 uur. Secties die voor morfologiestudies werden gebruikt, werden een nacht bij kamertemperatuur in secundair antilichaam geïncubeerd. Nucleaire co-kleuring werd bereikt door secties in 1X PBS met DAPI (1:50,000) gedurende 10 minuten te incuberen. Secties werden opnieuw gewassen, gevolgd door dehydratatie met ethanol en montage met DPX. Alle secties werden afgebeeld met behulp van confocale microscopie.
RNA-isolatie en qPCR
Bilaterale 14-gauge NAc-ponsen werden gehomogeniseerd in Trizol en verwerkt volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd gezuiverd met RNAesy Micro-kolommen en spectroscopie bevestigde dat de RNA 260/280 en 260/230 rantsoenen >1.8 waren. RNA werd vervolgens omgekeerd getranscribeerd met behulp van een Bio-Rad iScript Kit. cDNA werd gekwantificeerd door qPCR met behulp van SYBR Green. Elke reactie werd in duplo of triplo uitgevoerd en geanalyseerd volgens de ΔΔCt-methode zoals eerder beschreven met behulp van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als normalisatiecontrole (S7). Zien aanvullende tabel S5 voor mRNA-primersequenties.
DNA-microarray-analyse
Vier groepen (3 onafhankelijke biologische replica's per groep) werden gebruikt voor de microarray-studie, in totaal 12 microarrays. 1 uur na de laatste cocaïne-injectie werden de dieren snel onthoofd en werden de hersenen verwijderd en op ijs geplaatst. Dissecties van NAc werden genomen met behulp van een 15-gauge naaldpons en werden snel ingevroren op droogijs totdat RNA was geëxtraheerd. Bilaterale stoten werden samengevoegd van vier dieren per replicaat, in totaal 12 muizen per groep. RNA-isolatie, microarray-verwerking en gegevensanalyse werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (S8). In het kort, RNA werd geïsoleerd en gezuiverd zoals hierboven beschreven en werd gecontroleerd op kwaliteit met behulp van Agilent's Bioanalyzer. Omgekeerde transcriptie, amplificatie, labeling en hybridisatie met Illumina MouseWG-6 v2.0-arrays werden uitgevoerd met behulp van standaardprocedures door de microarray-kern van UT Southwestern. Ruwe gegevens werden op de achtergrond afgetrokken en kwantiel genormaliseerd met behulp van Beadstudio-software. Genormaliseerde gegevens werden geanalyseerd met behulp van GeneSpring-software en genelisten werden gegenereerd met behulp van significantiecriteria van een 1.3-voudige veranderingsgrens gekoppeld aan een niet-strikte p-waarde-grenswaarde van p <0.05.
We hebben om verschillende redenen een hoge mate van vertrouwen in deze gegevens. Ten eerste werden alle dieren tegelijkertijd en onder dezelfde omstandigheden gehanteerd, behandeld en gedood. Ook werden alle RNA- en array-verwerking tegelijkertijd uitgevoerd. Ten tweede hebben we drievoudige arrays uitgevoerd en meerdere dieren per array-monster gepoold, waardoor verschillen als gevolg van individuele variabiliteit en toenemende statistische kracht werden geminimaliseerd (S9). Ten derde worden de criteria voor gegevensanalyse die voor ons onderzoek zijn gebruikt, aanbevolen door het MicroArray Quality Control-project, aangezien deze criteria zijn gevalideerd om een hoge mate van intersite-reproduceerbaarheid en inter- en intraplatform-reproduceerbaarheid te bieden (S10-S11).
Constructie van virale vectoren
Vanwege beperkingen in de grootte van de virale vectorinsertie, werden coderende sequenties voor wildtype G9a (G9a) of katalytisch dood G9a (G9aH1093K) gesubkloneerd in het bicistronische p1005+ HSV-plasmide dat GFP tot expressie brengt onder de controle van de humane directe vroege cytomegaloviruspromoter (CMV) (de G9a invoeggrootte was ~ 3.96 kb, wat groter is dan de maximale invoeggrootte voor AAV-2-vectoren). De IE4/5-promoter stuurt G9a-expressie aan. Fragmenten werden gesubkloneerd in het bicistronische p1005+ HSV-plasmide via ligaties met stompe uiteinden met met Klenow behandeld PmeI en met EcoRI gedigereerd G9a (uit pcDNA3.1) en met CIP behandeld p1005+ na digestie met EcoRI. Voor de productie van HSV-AJunD-GFP werd de coderende sequentie van AJunD geflankeerd door EcoRI-restrictieplaatsen gegenereerd door PCR met behulp van primeroligonucleotiden die de EcoRI-plaats bevatten. Het PCR-product werd vervolgens geligeerd in de EcoRI-plaats van de p1005+-vector. Lokale expressie van Cre-recombinase in NAc-neuronen werd bereikt door viraal gemedieerde genafgifte met behulp van een AAV-vector zoals beschreven (S12). GFP of een N-terminale fusie van GFP met Cre werd gesubkloneerd in een recombinante AAV-2-vector die een CMV-promoter bevatte met een splitsingsdonoracceptorsequentie en polyadenylatiesignaal. Alle vectorinserties werden bevestigd door middel van dideoxy-sequencing. Virale vectoren werden geproduceerd met behulp van een drievoudige transfectie, helpervrije methode, zoals eerder beschreven (S13). Gezuiverd virus werd bewaard bij -80°C. Virale kwaliteit werd beoordeeld door infectieuze titer geëvalueerd in HEK293-cellen. AAV-ΔFosB-GFP-virussen werden op dezelfde manier bereid. Voor HSV-Cre werd Cre-expressie aangestuurd door een IRES-promoter, in tegenstelling tot de IE4/5-promoter, om Cre-expressie te minimaliseren en neuronale toxiciteit te voorkomen (zie S14 voor virale constructie). In alle gevallen werd virale overexpressie gevalideerd, beide in vitro en in vivo, via qPCR, en virussen werden immunohistochemisch bevestigd om NAc-beperkte expressie te vertonen na een operatie.
Stereotaxische chirurgie
Onder anesthesie met ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) werden muizen in een stereotactisch instrument voor kleine dieren geplaatst en werd het schedeloppervlak blootgelegd. Drieëndertig gauge injectienaalden werden gebruikt om bilateraal 0.5 μl virus in het NAc te infunderen in een hoek van 10° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV − 4.4) met een snelheid van 0.1 μl/min. Dieren die HSV-injecties kregen, mochten 2 dagen na de operatie herstellen, terwijl muizen die werden gebruikt voor gedragstesten die AAV-vectoren ontvingen, 20 dagen mochten herstellen voordat ze werden onderworpen aan plaatsconditionering. Deze tijden komen overeen met de perioden van maximale viraal gemedieerde transgenexpressie voor de twee vectoren. Voor BIX01294-infusies werden elk van de twee minipompen subcutaan op de rug van de muis geplaatst. Plaatsingen van canules werden bereikt door twee kleine schedelgaten boven de NAc te boren en door de canule van bregma af te leveren (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Muizen mochten 4 tot 5 dagen herstellen van een operatie voordat ze begonnen met de plaatsconditioneringsprocedure voor cocaïne, zoals hieronder beschreven.
Geconditioneerde plaatsvoorkeur
De procedure voor plaatsconditionering werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met de volgende wijzigingen (S7). In het kort, 3 dagen na intra-NAc-infusies van HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP of HSV-GFP, werden muizen in de conditioneringskamers geplaatst, die uit drie verschillende omgevingen bestaan. Muizen die een significante voorkeur vertoonden voor een van de twee conditioneringskamers werden uitgesloten van het onderzoek (<10% van alle dieren). Conditioneringsgroepen werden vervolgens uitgebalanceerd om zich aan te passen aan eventuele kamerafwijkingen die mogelijk nog bestaan. Op de daaropvolgende dagen werden de dieren geïnjecteerd met zoutoplossing en 's middags gedurende 30 minuten opgesloten in één kamer en vervolgens geïnjecteerd met cocaïne (10 mg/kg, ip) en gedurende 30 minuten opgesloten in de andere kamer gedurende 2 dagen (twee dagen per dag). zoutoplossing en twee combinaties van cocaïne). Op de dag van de test werden muizen zonder behandeling gedurende 20 minuten terug in het apparaat geplaatst en getest om te evalueren aan welke kant ze de voorkeur gaven. Locomotorische reacties op cocaïne werden beoordeeld via bundelonderbrekingen in de cocaïne-gepaarde kamers om de effectiviteit van de medicamenteuze behandeling te waarborgen. Voor AAV- en BIX01294 CPP-experimenten werd een enigszins aangepast protocol gebruikt. Dieren werden opnieuw geïnjecteerd met zoutoplossing of cocaïne (10 mg/kg, ip) en opgesloten in specifieke kamers gedurende sessies van 30 minuten, maar werden in plaats daarvan slechts eenmaal per dag gedurende 4 dagen geconditioneerd, gevolgd door de test op dag 5 (dieren werden geconditioneerd 's avonds en conditioneringsbehandelingen werden afgewisseld). Voor alle groepen werd de uitgangsbeweging als reactie op zoutoplossing beoordeeld om ervoor te zorgen dat de voortbeweging niet werd beïnvloed door behandeling met virussen of remmers.
Intraveneuze cocaïne zelftoediening
Er werden mannelijke adolescente Long-Evans-ratten verkregen, die aan het begin van het experiment 230-250 g wogen. Ze werden gehuisvest in een omgeving met gecontroleerde vochtigheid en temperatuur op een omgekeerde licht/donkercyclus van 12 uur (licht uit om 9 uur) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Ratten mochten acclimatiseren in hun nieuwe omgeving en werden gedurende 1 week voor aanvang van het experiment dagelijks aangeraakt. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institute of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door Mount Sinai's Animal Care and Use Committee. De apparatuur voor zelftoediening was uitgerust met infraroodstralen om het bewegingsgedrag te meten. Zelftoediening werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (S15-S16) met katheters geïmplanteerd in de rechter halsader onder isofluraan (2.4-2.7%) anesthesie. Katheters werden gespoeld met 0.1 ml van een zoutoplossing die 10 U heparine en ampicilline (50 mg/kg) bevatte. Na een week herstel na een operatie begon de training voor zelftoediening tijdens de donkere fase van de licht/donkercyclus. Dieren kregen 3 uur per dag toegang tot cocaïne (0.75 mg/kg/infuus) volgens een vast ratio-1 (FR1) versterkingsschema, waarbij 1 actieve druk op de hendel resulteerde in een enkele infusie van het geneesmiddel. Ratten stabiliseerden hun cocaïne-inname na 6 dagen (<15% variatie in responspercentage gedurende 3 opeenvolgende dagen, waarbij ten minste 75% reageerde op de versterkte hendel). 24 uur na de laatste zelftoedieningssessie werden de ratten snel onthoofd, werden de hersenen snel verwijderd en verwerkt voor RNA-isolatie en qPCR.
Chromatin immunoprecipitatie (ChIP)
Verse NAc-ponsen werden met formaldehyde verknoopt en voorbereid voor ChIP zoals eerder beschreven (S17-S18) met kleine aanpassingen. In het kort werden 4 14-gauge NAc-ponsen per dier (5 dieren samengevoegd per monster) verzameld, verknoopt met 1% formaldehyde en geblust met 2 M glycine voordat het werd ingevroren bij -80°C. 1 dag voorafgaand aan sonificatie van het monster werden schapen-anti-konijn / muis (afhankelijk van precipitatie-antilichaam) IgG-magnetische kralen bereid door geschikte magnetische kralen te incuberen met ofwel anti-G9a (konijn polyklonale ChIP-kwaliteit) of anti-H3K9me2 (muis monoklonale ChIP-kwaliteit) antilichamen overnacht bij 4°C onder constante rotatie in blokoplossing. Weefsel-sonicatie en chromatine-afschuiving werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (S17). Na sonicatie werden gelijke concentraties chromatine overgebracht naar nieuwe buizen en ~5% van de eindproducten werd bewaard om te dienen als 'input'-controles. Na grondig wassen en opnieuw suspenderen van de geconjugeerde bolletjes/antilichaammengsels, werden gelijke volumes antilichaam/bolletjesmengsels (-7.5 µg antilichaam/monster) aan elk chromatinemonster toegevoegd en ongeveer 16 uur onder constante rotatie bij 4°C geïncubeerd. Monsters werden verder gewassen en een nacht omgekeerd verknoopt bij 65°C voorafgaand aan DNA-zuivering met behulp van een PCR-zuiveringskit. Na DNA-zuivering werden monsters onderworpen aan qPCR en werden ze genormaliseerd naar hun geschikte 'input'-controles zoals eerder beschreven (S17). Normale muis-IgG-immunoprecipitaties met behulp van een muis polyklonaal anti-IgG-antilichaam werden ook uitgevoerd om te controleren op geschikte verrijking van signaalamplificatie. Adeninefosforibosyltransferase (APRT) werd gebruikt als een negatieve controle voor cocaïne- en ΔFosB-overexpressie-experimenten. Zien Aanvullende tabel S5 voor promoter-primersequenties.
Analyse van de dendritische wervelkolom
Om de rol van G9a in de regulatie van neuronale morfologie in vivo te bestuderen, hebben we eerder beschreven methoden gebruikt met de volgende wijzigingen (S1). Drie dagen na injectie van HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (alle virussen werden gebruikt in wildtype C57Bl/6J-muizen) of HSV-Cre-GFP (gebruikt in G9afl / fl muizen), wanneer de virale expressie maximaal was, werden de muizen geperfuseerd, de hersenen werden cryobeschermd en later op een vibratoom in secties van 100 μm gesneden. Secties werden vervolgens immunologisch gekleurd met behulp van een antilichaam tegen GFP zoals hierboven beschreven (zie Immunohistochemie). Om de effecten van G9a-overexpressie en knock-out op het aantal ruggengraat te beoordelen, evenals het effect van ΔJunD-overexpressie, hebben we het aantal stekels gemeten op ongeveer 1-2 neurieten per neuron, gelijk aan ten minste 299 μm secundaire dendrieten van GFP tot expressie brengend NAc-medium stekelige neuronen (MSN's). Gezien het feit dat MSN's morfologisch verschillen van andere neuronale populaties in het NAc, evenals eerdere rapporten die aangeven dat HSV voornamelijk DARPP-32 infecteert die neuronen tot expressie brengen in dit hersengebied (S19), zijn we ervan overtuigd dat MSN's uitsluitend in deze onderzoeken zijn beoordeeld. Voor elk dier onderzochten we ~6-8 neuronen in 3-4 dieren per groep (7 groepen), waarna voor elk dier een gemiddelde waarde werd verkregen voor statistische analyse. Experimenten die waren ontworpen om de effecten van ΔFosB-overexpressie op NAc-ruggengraatdichtheid te onderzoeken, werden op dezelfde manier uitgevoerd als hierboven beschreven, met de uitzondering dat AAV-vectoren werden gebruikt om GFP of ΔFosB-GFP gedurende langere tijd (8 weken) tot expressie te brengen. Alle HSV-beelden werden vastgelegd met behulp van een confocale microscoop met een 100X olie-immersie-objectief (AAV-beelden werden vastgelegd met een 63X olie-immersie-objectief). Afbeeldingen werden verkregen met de pinhole ingesteld op 1 willekeurige eenheid en een framegrootte van 1024 × 1024. De dendritische lengte werd gemeten met behulp van NIH Image J-software en het aantal ruggengraat werd blind geteld door de primaire onderzoeker, aangezien de objectglaasjes werden gecodeerd voorafgaand aan het experimentele scannen. Het gemiddelde aantal stekels per 10 μm dendriet werd berekend.
statistische analyse
Een- en tweerichtings-ANOVA's werden uitgevoerd om de significantie voor geconditioneerde plaatsvoorkeur en dendritische wervelkolomanalyse met meer dan twee groepen te bepalen. Student's t-testen werden gebruikt voor andere vergelijkingen, waaronder qPCR, western blotting, dendritische wervelkolomanalyse waarbij HSV-GFP werd vergeleken met HSV-Cre in G9afl / fl muizen, microarray-analyses (zie hierboven) en chromatine-immunoprecipitatie-experimenten. Geplande t-testen van studenten werden gebruikt na tweeweg ANOVA-analyse van dendritische wervelkolomdichtheid na ΔFosB-overexpressie met bevestiging van significante hoofdeffecten van medicamenteuze behandeling en virus. Alle waarden in de figuurlegenda's vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (*p ≤ 0.05; **p < 0.001). Gedetailleerde statistische analyses voor Fig. 1-3 in de hoofdtekst worden gegeven in: Gedetailleerde figuurlegenda's inclusief statistieken.
voetnoten
Ik verklaar dat geen van de materialen in het manuscript getiteld Essentiële rol van de Histone Methyltransferase G9a in door cocaïne geïnduceerde plasticiteit zijn eerder gepubliceerd of worden elders overwogen, ook op internet.
Al het werk waarbij dieren werden gebruikt, werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en IACUC-richtlijnen van zowel het University of Texas Southwestern Medical Center als de Mount Sinai School of Medicine.
Referenties en notities
;
