Abstract
Psychostimulant-geïnduceerde verandering van dendritische stekels op dopaminoceptieve neuronen in nucleus accumbens (NAcc) is verondersteld als een adaptieve neurale respons die is gekoppeld aan langdurig verslavend gedrag. NAcc is grotendeels samengesteld uit twee afzonderlijke subpopulaties van middelgrote stekelige neuronen die hoge niveaus van dopamine D1- of D2-receptoren tot expressie brengen. In de huidige studie analyseerden we de densiteit van de dendritische wervelkolom na chronische cocaïnebehandeling in verschillende D1- of D2-receptorbevattende middelgrote spiny-neuronen in NAcc. Deze studies maakten gebruik van transgene muizen die EGFP tot expressie brachten onder de controle van ofwel de D1- of D2-receptorpromotor (Drd1-EGFP of Drd2-EGFP). Na 28 dagen van cocaïnebehandeling en 2-dagen van ontwenning, nam de dichtheid van de wervelkolom toe in zowel Drd1-EGFP- als Drd2-EGFP-positieve neuronen. De toename in ruggengraatdichtheid werd echter slechts gehandhaafd in Drd1-EGFP-positieve neuronen 30 dagen na ontwenning van het geneesmiddel. Opmerkelijk was dat een verhoogde ΔFosB-expressie ook werd waargenomen in Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-positieve neuronen na 2-dagen van ontwenning van het geneesmiddel, maar alleen in Drd1-EGFP-positieve neuronen na 30 dagen van ontwenning van het geneesmiddel. Deze resultaten suggereren dat de verhoogde ruggengraatdensiteit waargenomen na chronische cocaïnebehandeling alleen stabiel is in D1-receptor-bevattende neuronen en dat ΔFosB-expressie geassocieerd is met de vorming en / of het behoud van dendritische stekels in D1 evenals D2-receptor bevattende neuronen in NAcc.
De mesolimbische dopaminerge route bestaat uit neuronen in het ventrale tegmentale gebied die de nucleus accumbens (NAcc), olfactorische tuberkel, prefrontale cortex en amygdala (en1), terwijl nigrostriatale dopaminerge neuronen in de substantia nigra (pars compacta) een opgaande projectie naar dorsale striatum verschaffen (2). Psychostimulanten verhogen de synaptische concentraties van dopamine in NAcc: cocaïne, door dopamine-opname uit de synaptische spleet en amfetamine te blokkeren, door dopamine-afgifte van zenuwuiteinden te bevorderen (3-5). Herhaalde, intermitterende toediening van psychostimulantia resulteert in verhoogde gedragsreacties (sensibilisatie) op de acute stimulerende effecten van deze geneesmiddelen (6-8). De meeste bewijslijnen suggereren dat adaptieve veranderingen in het ventrale tegmentale gebied-NAcc dopaminerge systeem centraal staan in veranderingen in de ervaringsafhankelijke plasticiteit die ten grondslag ligt aan door drugs geïnduceerd gedrag.
Naast dopamine is glutamaat nodig voor de ontwikkeling van gedragssensibilisatie als reactie op psychostimulantia (9, 10). Middelgrote stekelige neuronen (MSN's) in het ventrale striatum ontvangen exciterende glutamaterge projecties van de prefrontale cortex die synaps vormen op de hoofden van dendritische stekels. MSN's zijn ook het belangrijkste doelwit voor dopaminerge axonen die synaps vormen op de nek van de wervelkolom (1, 11, 12). Daarom vertegenwoordigen dendritische stekels in MSN's het cellulaire compartiment waar aanvankelijk dopaminerge en glutamaterge transmissie zijn geïntegreerd.
Dopamine werkt op twee belangrijke receptorsubfamilies, de D1-subfamilie (D1- en D5-subtypen) en de D2-subfamilie (D2-, D3- en D4-subtypen) (13). In dorsale striatum hebben anatomische onderzoeken aangetoond dat striatonigrale MSN's hoge niveaus van D1-receptoren bevatten (samen met substantie P en dynorfine), terwijl striatopallidal MSN's voornamelijk D2-receptoren tot expressie brengen (samen met enkefaline) (14-17). De projecties van NAcc zijn complexer dan in dorsale striatum, waarbij de schaal en kerndelen van de NAcc uitsteken naar verschillende subgebieden van het ventrale pallidum en naar het ventrale tegmentale gebied en substantia nigra (18). Terwijl D2-receptoren en enkefaline in hoge mate tot expressie worden gebracht in projecties van het ventrale pallidum, worden D1-receptoren en stof P gelijkmatig verdeeld in projecties van ventrale pallidum en ventrale tegmentale gebieden (19). Onderzoeken van agonisten en antagonisten selectief voor D1- of D2-receptoren toonden aan dat zowel D1- als D2-receptoren vereist zijn voor psychostimulant-afhankelijke gedragsveranderingen (20-25). De rollen van deze receptoren lijken echter anders te zijn. Stimulatie van D1-receptoren verzwakt bijvoorbeeld het zoeken naar cocaïne veroorzaakt door injecties met cocaïne-priming en aan cocaïne gerelateerde omgevingsfactoren, terwijl stimulatie van D2-receptoren door cocaïne geïnduceerde herstelling mogelijk maakt (26-28).
De gedragsafwijkingen geassocieerd met psychostimulantverslaving zijn extreem langlevend. Daarom is er veel belangstelling geweest voor het identificeren van langdurige medicijngeïnduceerde veranderingen op moleculair en structureel niveau in neuronale circuits gereguleerd door dopamine en glutamaat (29-32). Opmerkelijk is dat langdurige blootstelling aan cocaïne of amfetamine het aantal dendritische vertakkingspunten en stekels van MSN's in NAcc (33-35). Het is aangetoond dat deze structurele veranderingen tot ≈1-3.5 maanden na de laatste blootstelling aan geneesmiddelen aanhouden (30, 35) en er is gesuggereerd te berusten op langdurige veranderingen in synaptische plasticiteit in verband met blootstelling aan psychostimulantia.
Het doel van de huidige studie was om cocaïne-geïnduceerde structurele veranderingen van dendritische stekels te onderzoeken in subpopulaties van accumale MSN's die ofwel D1- of D2-receptoren tot expressie brengen. In deze studies hebben we bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) transgene muizen gebruikt die EGFP tot expressie brengen onder de controle van de D1 (Drd1-EGFP) of D2 (Drd2-EGFP) dopaminereceptorpromotor (36). De resultaten geven aan dat, hoewel verhoogde ruggengraatdichtheid aanvankelijk optreedt in D1-receptor-bevattende MSN's en D2-receptor-bevattende MSN's, de veranderde ruggengraatdichtheid alleen stabiel is in D1-receptor bevattende neuronen. Bovendien vinden we vergelijkbare veranderingen in de expressie van de transcriptiefactor ΔFosB, wat suggereert dat ΔFosB mogelijk betrokken is bij de vorming en / of instandhouding van dendritische stekels in D1 evenals D2-receptor bevattende neuronen in NAcc.
Resultaten
Analyse van MSN's in Drd1-EGFP en Drd2-EGFP BAC transgene muizen.
Het projectiepatroon van MSN's van dorsaal en ventraal striatum in Drd1-EGFP of Drd2-EGFP BAC transgene muizen is gekarakteriseerd door analyse van GFP-expressie (36). De differentiële expressie van GFP in MSN's van dorsale striatum komt in het algemeen overeen met die van endogene D1- of D2-receptoren, respectievelijk (36). We analyseerden verder differentiële expressie van GFP in NAcc in Drd1-EGFP of Drd2-EGFP muizen (Fig 1a en b). Hoewel ≈58% van neuronen in NAcc GFP tot expressie bracht in Drd1-EGFP-muizen (Fig 1a), ≈48% neuronen in NAcc bracht GFP tot expressie in Drd-2-EGFP-muizen (Fig 1b). MSN's vertegenwoordigen 90-95% van alle neuronen in NAcc (12, 37). D1-receptoren worden alleen in MSN's tot expressie gebracht en D2-receptoren worden tot expressie gebracht in MSN's en in cholinerge interneuronen, die 1-3% van striatale neuronen voorstellen (37). Rekening houdend met deze factoren, suggereren de resultaten dat minimaal ≈10-15% van MSN's in NAcc waarschijnlijk zowel D1- als D2-receptoren tot expressie brengen.
Analyse van dendritische stekels in Drd1-EGFP en Drd2-EGFP muizen.
GFP-expressie in de Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-muizen was nuttig om neuronale cellichamen te kleuren. Het GFP-signaal in dendrieten en dendritische spines was echter te zwak om hun analyse mogelijk te maken na immuunkleuring met anti-GFP-antilichamen. Door deeltjes gemedieerde ballistische afgifte van fluorescente kleurstoffen is recentelijk gebruikt om neuronale populaties op een snelle en efficiënte manier te labelen (38). Volledige neuronen kunnen met deze techniek worden gelabeld en de methode lijkt vergelijkbaar te zijn met Golgi-Cox-kleuring. Om de dendritische morfologie van neuronen in NAcc te analyseren, werden gefixeerde geaccumuleerde plakjes gemerkt met de lipofiele fluorescentiekleurstof 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) met behulp van een genenpistool. Een voorbeeld van een met DiI gekleurd MSN wordt getoond in Fig 1c. Onder de gebruikte omstandigheden observeerden we over het algemeen gelabelde neuronen zonder overlappende dendrieten van andere gelabelde neuronen. Bij een hogere vergroting kon een gedetailleerde dendritische morfologie, inclusief dendritische stekels, worden waargenomen (Fig 1d).
Vervolgens gebruikten we een combinatie van DiI-labeling en immunohistochemie voor GFP in ofwel Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-transgene muizen, wat mogelijk werd gemaakt door een lage concentratie detergens te gebruiken voor weefselpermeabiliteit (zie Methoden). Door zorgvuldige vergelijking van de DiI-kleuring en GFP-expressie in de cellichamen van MSN's, konden we DiI- en GFP-positieve of DiI-positieve en GFP-negatieve neuronen identificeren in Drd1-EGFP (Fig 2a) of Drd2-EGFP (Fig 2b) muizen. Voor de volgende studies analyseerden we de dendritische morfologie in alleen DiI- en GFP-positieve neuronen van Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muizen.
Chronische cocaïnebehandeling resulteert in een verhoogde werveldichtheid in Accumbal MSN's die Drd1-EGFP of Drd2-EGFP tot expressie brengen.
Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-muizen werden herhaaldelijk geïnjecteerd met cocaïne (30 mg / kg) of zoutoplossing gedurende vier opeenvolgende weken (zie Methoden). Twee dagen (2WD) of 30-dagen (30WD) na de laatste medicamenteuze behandeling, werden de hersenen verwerkt voor DiI-labeling en immunohistochemie zoals hierboven beschreven. Een eerdere studie meldde dat chronische behandeling met amfetamine de werveldichtheid op distale maar niet proximale dendrieten van MSN's in NAcc deed toenemen (35). Daarom hebben we onze analyse beperkt tot distale dendrieten (dwz die met takken van de tweede of derde orde), inclusief eindgebieden. Bij analyse bij 2WD bleek de dichtheid van de wervelkolom te stijgen in Drd1-EGFP-positieve MSN's (128% van de zoutgroep) (Fig 3a en c) en in mindere mate in Drd2-EGFP-positieve neuronen (115% van de zoutgroep) (Fig 3 b en d). Na 30WD werd een verhoogde ruggengraatdensiteit gehandhaafd in Drd1-EGFP-positieve neuronen (118% van zoutoplossingcontrole) (Fig 3 a en c) maar niet in Drd2-EGFP-positieve neuronen (Fig 3 b en d).
De morfologie van dendritische stekels is variabel in termen van hun lengte en de breedte van de wervelkolom. Daarom classificeerden we dendritische uitsteeksels in vier spine klassen (stompe, paddestoel, dunne en filopodie) bij 2WD van cocaïne (gegevens niet getoond). De dichtheid van paddenstoelentype (119.7 ± 4.0%, P <0.01) en dunne stekels (120.0 ± 3.4%, P <0.01) werd verhoogd door cocaïnebehandeling in Drd1-EGFP-positieve MSN's, terwijl de dichtheid van gedrongen (182.4 ± 21.6%, P <0.05) en paddenstoelstekels (122.5 ± 5.0%, P <0.01) was verhoogd in Drd2-EGFP-positieve MSN's. Er was geen significante toename van stompe stekels in Drd1-EGFP-positieve neuronen of van dunne stekels in Drd2-EGFP-positieve neuronen.
Chronische cocaïne induceert ΔFosB-expressie in Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-positieve MSN's in NAcc.
ΔFosB is een lid van de Fos-familie van transcriptiefactoren. Terwijl acute toediening van cocaïne een snelle en voorbijgaande inductie van verschillende Fos-isovormen induceert in NAcc, verhoogt herhaalde blootstelling aan cocaïne het niveau van ΔFosB. Bovendien blijft de toename van de ΔFosB-expressie aanhouden in NAcc gedurende weken tot maanden na het staken van de blootstelling aan het geneesmiddel en er is gesuggereerd dat het betrokken is bij langdurige regulatie van genexpressie, zelfs nadat het stoppen met het gebruik van geneesmiddelen stopt (29, 39, 40).
Om de inductie van ΔFosB in NAcc van Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muizen na cocaïnebehandeling te onderzoeken, analyseerden we de FosB- en GFP-expressie door middel van dubbele labeling (Fig 4 en Tabel 1) Het anti-FosB-antilichaam herkent alle vormen van FosB, maar we nemen aan dat het verhoogde immunokleuren ΔFosB vertegenwoordigt (zie Methoden voor verdere discussie). In met zoutoplossing behandelde muizen bracht 16% van Drd1-EGFP-positieve neuronen en 15% van Drd2-EGFP-positieve neuronen FosB-immunoreactiviteit tot expressie met een relatief zwakke intensiteit (Fig 4 a en b en Tabel 1). Herhaalde behandeling met cocaïne gevolgd door 2WD resulteerde in een significante toename van het aantal Drd1-EGFP-positieve neuronen dat ΔFosB samen tot expressie bracht (55% van GFP-positieve neuronen) (Fig 4c en Tabel 1). Een kleinere, maar nog steeds significante toename van ΔFosB-expressie werd gevonden in Drd2-EGFP-positieve neuronen (25% van GFP-positieve neuronen) (Fig 4d en Tabel 1). Zoals met de veranderingen in ruggengraatdichtheid, werd de verhoogde expressie van ΔFosB gehandhaafd in Drd1-EGFP-positieve neuronen (46% GFP-positieve neuronen) maar niet in Drd2-EGFP-positieve neuronen (15% van GFP-positieve neuronen) na 30WD (Fig 4 e en f en Tabel 1). Merk op dat de verhoogde ΔFosB-expressie die wordt waargenomen in Fig 4f is aanwezig in Drd2-EGFP-negatieve neuronen.
Discussie
Langdurige aanpassingen in dopaminerge neurotransmissie worden verondersteld ten grondslag te liggen aan verslavend gedrag dat geassocieerd is met psychostimulerende geneesmiddelen. Met name psychostimulant-geïnduceerde verhogingen van dendritische wervelkolomdichtheid van MSN's in NAcc zijn verondersteld te zijn gekoppeld aan reorganisatie van synaptische connectiviteit (30). De NAcc is grotendeels samengesteld uit twee verschillende subpopulaties van MSN's die hoge niveaus van D1- of D2-dopaminereceptoren tot expressie brengen. In de huidige studie hebben we de dichtheid van de wervelkolom geanalyseerd in verschillende D1 of D2 receptor-bevattende MSN's in NAcc na chronische behandeling met cocaïne. De verkregen resultaten tonen aan dat, hoewel verhoogde ruggengraatdichtheid aanvankelijk optreedt in D1-receptor-bevattende MSN's en D2-receptor-bevattende MSN's, veranderde wervelkolomdichtheid alleen stabiel is in D1-receptor-bevattende neuronen. Bovendien vinden we een vergelijkbaar patroon van veranderingen in de expressie van de transcriptiefactor ΔFosB in D1 en D2 receptor-bevattende MSN's.
Deze studies maakten gebruik van BAC-transgene muizen die GFP tot expressie brengen in specifieke subpopulaties van MSN's onder de controle van ofwel de D1- of D2-receptorpromotor. Bovendien ontwikkelden we een methode voor dubbele labeling die immunohistochemie voor GFP combineerde met ballistische labeling van neuronen met DiI. Eerdere studies hebben de Golgi-Cox-methode gebruikt om het effect van psychostimulantia op de dichtheid van de wervelkolom te analyseren (34), en de DiI-methode die hier werd gebruikt, gaf resultaten die kwantitatief vergelijkbaar waren. We hebben de methode voor dubbele labeling ontwikkeld omdat Golgi-kleuring niet compatibel is met immunohistochemie. Immunokleuren vereist meestal weefselpermeabiliteit met detergentia, een proces dat doorgaans leidt tot solubilisatie van lipofiele kleurstoffen uit het membraan (38). In onze huidige onderzoeken vereiste GFP-immuunkleuring echter geen hoge concentratie van detergens voor weefselpermeabilisatie en kon dus worden gebruikt in combinatie met lipofiele kleurstofmarkering. Onze dubbele labelingmethode zou in het algemeen nuttig moeten zijn voor studies van structurele veranderingen in dendritische stekels, bijvoorbeeld wanneer gebruikt voor analyse van BAC-transgene muizenlijnen waar GFP tot expressie wordt gebracht in specifieke populaties van neuronen in cortex (36).
Hoewel het nog steeds enigszins controversieel is, wordt aangenomen dat de D1- en D2-receptoren grotendeels anatomisch gescheiden zijn van de directe (striatonigrale) en indirecte (striatopallidal) striatale projectie-neuronen, respectievelijk (17, 41). De eerste karakterisering van de lokalisatie van GFP in de Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-muizen was consistent met deze conclusie (36). Bovendien komt onze analyse van het aantal GFP-positieve neuronen in NAcc van Drd1-EGFP en Drd2-EGFP muizen overeen met de conclusie dat ≈50% van MSN's alleen D1-receptoren tot expressie brengt, die ≈35-40% alleen D2-receptoren tot expressie brengen, en dat ≈10-15% zowel D1- als D2-receptoren samen tot expressie brengt. Deze coëfficiëntwaarde is vergelijkbaar met die van studies van dorsale striatum die patch-clamp-analyse van afzonderlijke striatale neuronen combineerden met RT-PCR-technieken om mRNA's te isoleren en te amplificeren (≈17% co-expressie van enkefaline en stof P) (42). Opgemerkt moet worden dat onze huidige studies niet de kwestie van de expressie van D3-, D4- en D5-receptoren aanpakken, noch de kwestie van lage niveaus van expressie van D1-receptoren bij MSN's die hoge niveaus van D2-receptoren tot expressie brengen, of vice versa.
Verschillende eerdere studies hebben de neuronale lokalisatie van door psychostimulant geïnduceerde Fos-expressie en de rol van D1- en D2-receptoren onderzocht (43-45). Die studies ondersteunden de conclusie dat Fos en ΔFosB-inductie wordt gemedieerd door activering van D1-receptoren. De cellulaire lokalisatie van de FOS-expressie wordt echter beïnvloed door de omgevingscontext waarin psychostimulerende geneesmiddelen worden toegediend (46, 47). Bijvoorbeeld, amfetamine of cocaïne gegeven in de thuiskooi induceert bij voorkeur vroege vroege genen (waaronder Fos) bij voorkeur in substantie P-positieve cellen die D1-receptoren tot co-expressie brengen. In tegenstelling hiermee kunnen deze geneesmiddelen Fos-expressie induceren in zowel D1- als D2-receptor-bevattende MSN's wanneer toegediend in een nieuwe omgeving. Het protocol dat in onze huidige onderzoeken werd gebruikt, omvatte niet het koppelen van geneesmiddelinjectie met blootstelling aan een nieuwe omgeving. We kunnen echter een soort contextafhankelijke stress die verantwoordelijk is voor ΔFosB-expressie in D2-receptor-bevattende MSN's niet uitsluiten.
Een opmerkelijk kenmerk van de onderhavige resultaten was het parallelle patroon van verhoogde werveldichtheid en AFosB-expressie. Toegenomen wervelkolomdichtheid en ΔFosB-expressie deden zich aanvankelijk voor bij MSN's die Drd1-EGFP en Drd2-EGFP tot expressie brengen. Deze veranderingen waren echter alleen stabiel in D1-receptor bevattende neuronen. Een mogelijke verklaring voor de waarneming dat een verhoogde ruggengraatdichtheid en ΔFosB-expressie tijdelijk werd gevonden in D2-receptor bevattende neuronen, is dat dit plaatsvond in de kleine fractie van MSN's die zowel D1- als D2-dopaminereceptoren tot co-expressie brengen. De tijdelijke aard van deze toenames kan dus worden geassocieerd met antagonistische effecten van D2-receptoractivering op D1-afhankelijke signaalroutes (48). Het is van belang dat de veranderingen in ruggengraatdichtheid en ΔFosB-expressie reversibel waren, wat het vermogen van D2-receptor-afhankelijke signaalroutes om de stabiliteit van ΔFosB te beïnvloeden, kan weerspiegelen.
De waarneming dat er parallelle veranderingen zijn in de expressie van ΔFosB en de wervelkolomdichtheid is consistent met het idee dat ΔFosB betrokken is bij de initiële vorming en het daaropvolgende behoud van dendritische stekels in D1-receptor bevattende neuronen in NAcc. De expressie van ΔFosB wordt geregeld door de D1 / DARPP-32 / PP1-afhankelijke signaleringsroute in MSN's (49). Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat ΔFosB een belangrijke rol speelt in de belonende en locomotor-activerende werking van psychostimulantia (39), waarschijnlijk door de expressie van meerdere genen die neurotransmitterreceptoren, signalerende eiwitten en eiwitten die betrokken zijn bij regulatie van neuronale morfologie (50). De specifieke moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij chronische cocaïne-geïnduceerde wervelkolomvorming zijn momenteel echter niet bekend. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat roscovitine door intraaccumbalale infusie van de Cdk5-remmer door cocaïne veroorzaakte toename van de dichtheid van de wervelkolom verzwakte (51). Bovendien is Cdk5 een stroomafwaarts doelwitgen voor ΔFosB en is het betrokken bij compensatoire adaptieve veranderingen die verband houden met chronische cocaïnebehandeling (52). Daarom is een wijziging in Cdk5-afhankelijke fosforylatie een plausibel mechanisme dat ten grondslag ligt aan de door cocaïne geïnduceerde vorming van wervelkolom en / of de stabiliteit van de wervelkolom. PAK (53), β-catenine (54), PSD-95 (55) en spinophilin (56) zijn substraten voor Cdk5 en zijn allemaal betrokken bij regulatie van de morfogenese van de wervelkolom (57-60). Verdere karakterisering van deze en andere Cdk5-substraten in stekels zal hopelijk licht werpen op de mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van wervelkolomvorming door psychostimulantia.
Methoden
Dieren.
Muizen met een EGFP-transgen onder de controle van de D1- of D2-dopaminereceptoren werden gegenereerd door het Gensat BAC-transgene project (36). De transgene muizen die in deze studie werden gebruikt, waren 4-5 weken oud en hadden een achtergrond in een Swiss-Webster. Muizen werden in een 12: 12-h licht / donker cyclus gehouden en gehuisvest in groepen van 2-5 met voedsel en water ad libitum beschikbaar. Alle dierprotocollen waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren en werden goedgekeurd door de Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee.
Behandeling met geneesmiddelen.
Van chronische cocaïnebehandeling (30 mg / kg, dagelijks) werd gerapporteerd dat het een robuuste toename in de ruggengraatdichtheid van MSN's in zowel de kern als de schaal van NAcc van de rat produceerde, maar een lagere dosis (15 mg / kg) verhoogde de wervelkolomdichtheid alleen in de schelp (61). We hebben daarom de hogere dosis cocaïne gebruikt om structurele modificatie in beide NACC-onderdelen te induceren. Muizen ontvingen elke dag voor 30 opeenvolgende dagen één injectie (ip) van 5 mg / kg cocaïne-HCl (of zoutoplossing), gevolgd door 2-injectievrije dagen, en deze procedure werd herhaald gedurende 4 opeenvolgende weken. Injecties werden uitgevoerd in de huiskooi. 2WD of 30WD, muishersenen werden verwerkt voor DiI-labeling en / of immunohistochemie.
Ballistische labeling met de fluorescerende kleurstof DiI.
Muizen werden geanesthetiseerd met 80 mg / kg natriumpentobarbital en transcardiaal geperfuseerd met 5 ml PBS, gevolgd door snelle perfusie met 40 ml 4% paraformaldehyde in PBS (20 ml / min). Hersenen werden snel uit de schedel verwijderd en post-gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor 10 min. Hersenenplakjes (100 μm) werden gelabeld door ballistische afgifte van fluorescente kleurstof DiI (Molecular Probes) zoals beschreven in ref. 38. Een gecombineerde DiI-labeling-immunohistochemische methode werd ontwikkeld met een lage concentratie aan detergent. DiI-gelabelde secties werden gepermeabiliseerd met 0.01% Triton X-100 in PBS voor 15 min en vervolgens geïncubeerd in 0.01% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum in PBS voor 1 h om niet-specifieke labeling te minimaliseren. Weefselcoupes werden vervolgens geïncubeerd met 1% normaal geitenserum / 0.01% Triton X-100 en anti-GFP antilichaam (Abcam, Cambridge, MA) voor 2 h bij kamertemperatuur, gewassen en geïncubeerd in een 1: 1,000 verdunning van FITC- geconjugeerd secundair antilichaam (Molecular Probes). Secties werden op microscoopglaasjes geplaatst en bedekt met bevestigingsmateriaal. De ballistische labelingmethode maakte een gedetailleerde analyse van de dendritische wervelkolomstructuur mogelijk en de verkregen resultaten waren kwalitatief en kwantitatief vergelijkbaar met eerdere studies met behulp van de Golgi-Cox-impregnatiemethode in rattenhersenen (34). In tegenstelling tot eerdere studies hebben we echter zelden tweekoppige stekels in met DiI gekleurde neuronen waargenomen. Dit verschil kan worden veroorzaakt door de gevoeligheid van kleuringsmethoden of variabiliteit van muizen (dit onderzoek) versus rattenweefsel (34).
Immunohistochemie.
Dieren werden geanesthetiseerd en geperfuseerd zoals hierboven beschreven. Hersenen werden verwijderd en overnacht bewaard in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C. Hersenen werden overgebracht naar 30% sucrose in PBS-oplossing voor cryoprotectie. Coronale secties (12 μm) werden gesneden op een bevriezend microtoom (Leica) en vervolgens verwerkt voor immunohistochemie. Hersensecties werden vervolgens gepermeabiliseerd in 0.3% Triton X-100 in PBS voor 15 min en tweemaal gespoeld in PBS. De coupes werden voorgeïncubeerd in 10% normaal geitenserum in PBS voor 1 h bij 37 ° C, blootgesteld aan primaire antilichamen (verdund in 1% normaal geitenserum in PBS) gedurende de nacht bij 4 ° C, en vervolgens gespoeld in PBS en geïncubeerd met secundair antilichamen voor 1 h bij 37 ° C. De volgende antilichamen werden gebruikt: anti-pan-FosB van konijn (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), muis anti-NeuN (Chemicon), anti-GFP van konijnen, FITC-geconjugeerd anti-konijn IgG en rhodamine- geconjugeerd anti-muis IgG (Molecular Probes). Voor drievoudige labeling (ΔFosB, NeuN en GFP) werden hersensecties eerst immunologisch gekleurd met anti-pan FosB-antilichaam en anti-NeuN-antilichaam en vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen (rhodamine-geconjugeerd anti-konijn IgG en cyaan-geconjugeerd anti-muis-IgG ). Dubbelgekleurde hersencoupes werden verder verwerkt voor GFP immunokleuring met behulp van Zenon labelingtechnologie (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Het anti-pan-FosB-antilichaam werd verhoogd tot het N-uiteinde van FosB en herkent ΔFosB en FosB van volledige lengte (62). Op basis van eerdere onderzoeken waaruit bleek dat ΔFosB, maar niet FosB of andere aan Fos gerelateerde antigenen na chronische behandeling met cocaïne stabiel tot expressie worden gebracht, nemen we aan dat de langdurige toename in immunoreactiviteit een stabiele expressie van ΔFosB vertegenwoordigt. De identiteit van het immunoreactieve FosB-signaal waargenomen bij met zoutoplossing behandelde muizen is echter onbekend. Statistische analyse in Tabel 1 gebruikte de Student's t test.
Dendritische wervelkolomanalyse.
Individuele MSN's in de NAcc werden gekozen voor wervelkolomanalyse op basis van verschillende criteria. (i) Er was minimale of geen overlap met andere gelabelde cellen om ervoor te zorgen dat processen van verschillende cellen niet verward zouden zijn. (ii) Er moesten ten minste drie primaire dendrieten zichtbaar zijn voor cellen die voor analyse werden gebruikt. (iii) Distale dendrieten (terminale dendrieten of dichtbij de terminale dendriet) werden onderzocht. Dendrieten van beide MSN's in de kern en schaal van de NAcc werden geanalyseerd. Hoewel we dungestekelde MSN's (stekelige type II) hebben waargenomen, hebben we alleen dichtgestekelde MSN's (stekelige type I) geanalyseerd. Om de dichtheid van de wervelkolom te berekenen, werd een lengte van dendriet (> 20 μm lang) getraceerd met behulp van een confocale microscoop (Zeiss LSM 510) met een olie-immersielens (× 40). Alle afbeeldingen van dendrieten zijn op verschillend genomen z niveaus (0.5-1 μm diepte-intervallen) om de morfologie van dendritische stekels te onderzoeken. Alle metingen zijn uitgevoerd met metamorfe beeldanalysesoftware (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistische analyse gebruikte de Kolmogorov-Smirnov-test.
Uitsteeksels van dendrieten werden ingedeeld in vier typen op basis van hun lengte zoals beschreven in ref. 63 en 64. Klasse 1-uitsteeksels, ook wel stompe uitsteeksels genoemd, waren <0.5 μm lang, hadden geen grote ruggengraat en leken geen nek te hebben; klasse 2, of paddestoelvormige stekels, waren tussen 0.5 en 1.25 μm lang en werden gekenmerkt door een korte nek en een grote wervelkop; klasse 3, of dunne stekels, varieerden tussen 1.25 en 3.0 μm en hadden langwerpige wervelkolomhalzen met kleine koppen; klasse 4, of filopodiale extensies, waren lange draadvormige uitsteeksels die een waarneembare ruggengraat misten.
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door de United States Public Health Service Grant DA10044 (aan PG en ACN) en door The Simons Foundation, de Peter J. Sharp Foundation, de Picower Foundation en de FM Kirby Foundation.
Afkortingen
- NACC
- nucleus accumbens
- MSN
- middelgrote stekelige neuron
- BAC
- bacterieel kunstmatig chromosoom
- Drd1
- dopamine receptor D1 promotor-gestuurd
- Drd2
- dopamine receptor D2 promotor-gestuurd
- Dii
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat
- 2WD
- 2 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling
- 30WD
- 30 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling.
Referenties
;