FACS identificeert unieke door cocaïne geïnduceerde genregulatie in selectief geactiveerde striatale neuronen van volwassenen (2011) - klein% van striatale neuronen

J Neurosci. Auteur manuscript; beschikbaar in PMC Sep 16, 2011.
Gepubliceerd in definitief bewerkte vorm als:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

De laatste bewerkte versie van dit artikel van de uitgever is gratis beschikbaar op J Neurosci
Zie andere artikelen in PMC dat citeren het gepubliceerde artikel.

Abstract

Talrijke studies met de neurale activiteitsmarker Fos geven aan dat cocaïne slechts een klein deel van dun verdeelde striatale neuronen activeert. Tot nu toe waren er geen efficiënte methoden beschikbaar om neuroadaptaties te beoordelen die specifiek binnen deze geactiveerde neuronen waren geïnduceerd. We gebruikten fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om striatale neuronen te zuiveren die geactiveerd werden tijdens door cocaïne geïnduceerde voortbeweging in naïef en cocaïne-gevoelig cfos-lacZ transgene ratten. Geactiveerde neuronen werden gelabeld met een antilichaam tegen ß-galactosidase, het eiwitproduct van het lacZ-gen. Cocaine induceerde selectief een uniek genexpressieprofiel in de kleine hoeveelheid geactiveerde neuronen die niet werd waargenomen in de niet-geactiveerde meerderheid van neuronen. Deze genen omvatten veranderde niveaus van de directe vroege genen boog, fosB en nr4a3, evenals genen die zijn betrokken bij p38 MAPK-signalering en celtype-specificiteit. We stellen voor dat deze FACS-methode kan worden gebruikt om moleculaire neuroadaptaties te bestuderen in specifieke neuronen die coderen voor de gedragseffecten van misbruikte drugs en andere aangeleerde gedragingen.

sleutelwoorden: cocaïne-sensitisatie, nucleus accumbens, neuronale ensembles, fluorescentie-geactiveerde celsortering

INLEIDING

Een belangrijke hypothese van het huidige neurobiologische onderzoek naar cocaïneverslaving is dat chronische blootstelling aan cocaïne langdurige neuroadaptaties veroorzaakt in het striatum en andere componenten van het mesolimbische dopamine-beloningscircuit, leidend tot compulsief drugsgebruik en langdurige kwetsbaarheid voor terugval (Nestler, 2001; Shaham en Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers et al., 2010; Wolf en Ferrario, 2010). Deze hypothese is echter gebaseerd op talrijke studies die beperkt zijn tot het meten van neuroadaptaties in homogenaten van hersenregio's of neuronen die onafhankelijk van hun activatietoestand tijdens gedrag worden geselecteerd.

Het onderscheid tussen neuroadaptaties in geactiveerde en niet-geactiveerde neuronen is belangrijk omdat ze verschillende rollen kunnen spelen in de fysiologische, gedrags- en psychologische effecten van cocaïne. Talrijke onderzoeken met de marker voor de neurale activiteit Fos geven aan dat cocaïne slechts een klein deel van de dun verspreide neuronen in het striatum activeert. Na contextspecifieke sensibilisatie van de locomotor hebben we aangetoond dat Fos alleen wordt geïnduceerd wanneer ratten in de omgeving met geneesmiddelparen worden geïnjecteerd en niet in een niet-gepaarde omgeving (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Het belangrijkste is dat we hebben aangetoond dat deze selectief geactiveerde neuronen een oorzakelijke rol spelen in de geleerde associatie tussen cocaïne en de omgeving van het gepaarde medicijn die contextspecifieke sensitisatie medieert (Koya et al., 2009). Dus neuroadaptaties in selectief geactiveerde striatale neuronen kunnen unieke en belangrijke rollen spelen bij het leren tijdens context-specifieke sensitisatie en andere door drugs geïnduceerde gedragingen.

Tot nu toe hebben technische beperkingen het moeilijk gemaakt om moleculaire veranderingen vast te stellen binnen de kleine aantallen dun verspreide neuronen die selectief worden geactiveerd tijdens gedrag. Technieken zoals laser capture microdissection (Kwon en Houpt, 2010) en dubbel-label immunohistochemie (Berretta et al., 1992; Gerfen et al., 1995; Peters et al., 1996) zijn in staat moleculaire veranderingen selectief te identificeren binnen geactiveerde neuronen, maar deze technieken hebben een zeer lage doorzet of zijn niet kwantitatief. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan een efficiënt hulpmiddel zijn voor het zuiveren van volwassen neuronale populaties voor moleculaire analyse (Liberles en Buck, 2006; Lobo et al., 2006). FACS is echter niet gebruikt om neuronen te zuiveren op basis van hun activeringsstatus. In de huidige studie hebben we FACS gebruikt voor het zuiveren van de afgewisselde cocaïne-geactiveerde striatale neuronen van transgene cfos-lacZ ratten en vergeleken hun unieke patronen van genexpressie met die in de niet-geactiveerde meerderheid van neuronen.

METHODEN

Dieren

Female cfos-lacZ transgene ratten (Kasof et al., 1995; Koya et al., 2009) en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (Charles River, Raleigh, NC, VS) werden individueel gehuisvest in standaard kunststof kooien in een kamer met temperatuur- en vochtigheidsregeling. Ze werden onderhouden op een 12: 12 h omgekeerd licht: donkere cyclus (licht op bij 20.00 h) en vrije toegang tot voedsel en water. Ze waren gedurende minimaal 7 dagen voorafgaand aan medicamenteuze behandelingen aan deze huisvestingsomstandigheden geacclimatiseerd. Experimentele procedures werden goedgekeurd door de NIDA Animal Care and Use Committee.

Medicijnen

Voor acute cocaïne-experimenten werden ratten geïnjecteerd met cocaïne (30 mg / kg, ip; n = 8) of zoutoplossing (1 ml / kg; n = 6) en geplaatst in een ronde kamer van plexiglas (38 cm diameter). Ratten werden 90 minuten na injecties opgeofferd om hersenweefsel te verkrijgen. Deze behandeling werd driemaal op afzonderlijke dagen herhaald om drie biologische replicaten voor microarray-analyse te verkrijgen. Bovendien werden op dezelfde manier drie onafhankelijke biologische replicaten geproduceerd voor kwantitatieve PCR (qPCR). Voor qPCR-analyses van arc, pdyn, adora2aalleen deze drie onafhankelijke biologische replicaten werden gebruikt. Voor qPCR-analyses van fosB, nr4a3, kcnc1 en map2k6, we gebruikten ook het overgebleven RNA van elk van de microarray-monsters.

Voor herhaalde cocaïne-experimenten werden vrouwelijke ratten gesensibiliseerd met vier injecties cocaïne (15 mg / kg ip), eens per twee dagen toegediend. Op injectiedagen werd elke rat geplaatst in een 43 x XUMX cm vierkante plexiglas locomotoreactiekamer (Med Associates, St. Albans, VT, VS) om gedurende 43 minuten te wennen. Ratten werden geïnjecteerd met cocaïne en bewegingsactiviteit werd geregistreerd als afgelegde afstand gedurende 30 minuten. Na de vierde herhaalde cocaïne-injectie bleven ratten gedurende 60-7 dagen in hun thuishaven. Op de testdag werden ratten gewend voor 8 min in de locomotoreactiekamers en vervolgens geïnjecteerd met cocaïne (30 mg / kg ip) of zoutoplossing. Ratten werden onthoofd en de hersenen werden negentig minuten na injecties geëxtraheerd. De volledige sensibiliseringsbehandeling werd drie keer herhaald gedurende verschillende weken om drie biologische replicaten van elke groep voor qPCR-analyse te verkrijgen.

Cel dissociatie

Striataal weefsel werd gedissocieerd om een ​​eencellige suspensie te verkrijgen. Ratten werden onthoofd en hun striata werd binnen twee minuten geëxtraheerd. Elk striatum werd fijngehakt met scheermesjes op een ijskoude glasplaat en geplaatst in 1 ml van Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata werden enzymatisch gedigereerd in 1 ml Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) met end-over-end mixen voor 30 min bij 4 ° C. Weefsel werd gedurende 2 minuten bij 425 x g gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 300 pl ijskoude Hibernate A. Alle volgende centrifugatiestappen werden uitgevoerd bij 4 ° C.

Gedigereerd striatumweefsel werd mechanisch gedissocieerd door trituratie. Vier striata werden gecombineerd in één Eppendorf-buis en tien keer getritureerd met een Pasteur-pipet met grote diameter (~ 1.3mm). Buizen werden kort op ijs geplaatst om grote stukken weefsel te laten bezinken; 600 μl troebele suspensie met gedissocieerde cellen werd overgebracht naar een 15 ml Falcon-buis op ijs. 600μL verse Hibernate A werd toegevoegd aan de originele Eppendorf-buis en vervolgens werden trituratiestappen herhaald zoals hierboven met pipets met gemiddelde en kleine diameter (~ 0.8mm en ~ 0.4mm). Elke troebele suspensie die gedissocieerde cellen bevatte werd samengevoegd met de vorige suspensie.

Resterende celclusters in de gepoolde celsuspensie werden verwijderd door filtratie door voorbevochtigde 100 μm en 40 μm-celzeefjes (merk Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Klein cellulair puin in de suspensie werd gereduceerd door het filtraat te centrifugeren voor 3 min bij 430 x g via een drie-staps dichtheidsgradiënt van Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). De troebele toplaag (bij benadering 2 ml) die puin bevatte, werd weggegooid. Cellen in de overblijvende lagen werden geresuspendeerd in de overblijvende Percoll-oplossing en gedurende 5 minuten bij 550xg gecentrifugeerd. De pellet werd geresuspendeerd in 1 ml van Hibernate A.

Immunolabeling en FACS

Gedissocieerde cellen werden gefixeerd en gepermeabiliseerd door het toevoegen van een gelijk volume ethanol voor een eindconcentratie van 50% ethanol en op ijs gehouden gedurende 15 minuten met zo nu en dan mengen. Cellen werden gedurende 2 minuten bij 425xg gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in RNase-vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Cellen werden geïncubeerd met een gebiotinyleerd primair antilichaam tegen NeuN (1: 1000 verdunning, Cat # MAB377B, Chemicon) en een primair antilichaam tegen (3-galactosidase ((ß-gal; 1: 10000 verdunning, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole , Verenigd Koninkrijk) .Cellen werden eind-over-eind geroteerd in primair antilichaam gedurende 30 minuten bij 4 ° C en drie min gecentrifugeerd bij 425xg. Cellen werden gewassen met 800 pl PBS en opnieuw gesuspendeerd in 700 pl van PBS. Cellen werden geïncubeerd met fluorescent gelabeld streptavidine (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 1000-verdunning, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) en secundair antilichaam (Alexa Fluor 488-gelabeld anti-geit IgG, 1: 1000-verdunning, Cat # A- 11055, Invitrogen) en eind-over-eind geroteerd voor 15 min. Cellen werden gewassen met 800 pl PBS, drie minuten gecentrifugeerd bij 425 x g en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS.

Immunolabel cellen werden gescand en gesorteerd op de Johns Hopkins Bayview Campus flowcytometrie kernfaciliteit. Een FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) werd gebruikt voor celsortering. Controlemonsters werden eerst geanalyseerd om optimale criteria voor het sorteren van testmonsters te bepalen. Specifiek werden gefixeerde cellen zonder antilichaambehandeling gebruikt om de lichtverstrooiingspoort in te stellen. Vaste cellen behandeld met fluorescerend secundair antilichaam, maar geen primair antilichaam, werden vervolgens gebruikt om drempels in te stellen voor endogene weefselfluorescentie en niet-specifieke binding door streptavidine of secundair antilichaam. Vervolgens werden controlemonsters met enkelvoudige labels met primair en secundair antilichaam voor elk eiwit (NeuN of (3-gal) gebruikt om te compenseren voor fluorescerende overlap in naburige kanalen. Ten slotte werden testmonsters gemerkt met beide fluorescente markers geanalyseerd en gesorteerd. Gesorteerde cellen werden verzameld in laag-bindende buizen (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) met 100 pl PBS in elke buis.

RNA-extractie

Na het sorteren werden monsters die ofwel (3gal-positieve of (3gal-negatieve cellen van cocaïne-geïnjecteerde ratten of alle NeuN-positieve cellen van met zoutoplossing geïnjecteerde ratten bevatten, gecentrifugeerd voor 8 min bij 2650 xg bij 18 ° C. NeuN-negatieve cellen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten werden bij 8 x gecentrifugeerd voor 6000 ming bij 18 ° C. Voor microarray-experimenten werd RNA geëxtraheerd met Trizol-reagens (Cat # 15596-026, Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Kwaliteit en kwantiteit van RNA werden beoordeeld met behulp van de Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Voor qPCR-experimenten werd RNA geëxtraheerd met RNEasy Micro-kit (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) volgens de instructies van de fabrikant met DNase-behandeling. De hoeveelheid en zuiverheid van RNA werd bepaald met behulp van een Nanodrop-spectrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Microarray-experimenten

Microarrays werden gebruikt voor het analyseren van RNA van NeuN-positieve en NeuN-negatieve cellen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten en pgal-positieve en (3gal-negatieve neuronen van cocaïne-geïnjecteerde ratten. Zoals hierboven beschreven in de medicijnbehandelingssectie bevatten microarrays drie biologische replicaten voor elk van de vier monstertypen. Vijf μl totaal RNA van elk monster werd gelabeld met behulp van de Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) in een tweestaps proces van cDNA-synthese gevolgd door in vitro RNA-transcriptie met biotine-16-UTP. 0.75 μg biotine-gelabeld cRNA werd gehybridiseerd gedurende 16 uur met Illumina Sentrix Rat Ref12 V1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Gebiotinyleerd cRNA gehybridiseerd met de chip werd gedetecteerd met Cy3-gelabeld streptavidine en gekwantificeerd met Illumina's BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems-scanner. Alle labels en analyses werden gedaan op de Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core.

Real-time kwantitatieve PCR

Realtime kwantitatieve PCR werd gebruikt om FACS- en microarrayresultaten te valideren. RNA werd omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van de RETROscript-kit (Cat # AM1710, Ambion) met een oligo (dT) -primer. Elke 25 μl PCR-reactie omvatte 12.5 μl Taqman Gene Expression Master Mix (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl elk van 20 μM voorwaartse en achterwaartse primers, 0.25 μl van 100 μM FAM-gelabelde probe, 5 μl water en 5 μl 1 ng / μl cDNA. Primer en probe-combinaties [Tabel 1] werden ontworpen met behulp van het Roche Universal Probe Library Assay Design Center om intron-overspannend te zijn. PCR-reacties werden gevolgd met behulp van de Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Het programma begon met 20-plaat leest bij 50 ° C voor fotobleken, gevolgd door 5 min bij 95 ° C, en vervolgens 40-cycli van 20 seconden bij 94 ° C, 1 min bij 60 ° C en een plaat lezen.

Tabel 1 

Primers en probes gebruikt voor qPCR

Standaardcurveacties werden voor het eerst uitgevoerd voor elk gen om de amplificatie-efficiëntie te bepalen [Tabel 1]. Expressieniveaus voor elk geamplificeerd gen werden berekend met behulp van efficiëntie ^ ACq waarACq = Cq(experimenteel gen) - Cq(referentiegen) voor elk biologisch replicaat. Gorasp2 werd gekozen als een referentie-gen omdat het niet anders werd uitgedrukt tussen neuronen en glia in microarray-analyses. Het werd verder gevalideerd als een referentie-gen als gevolg van gelijke qPCR-amplificatie over alle monsters bij het laden van dezelfde hoeveelheid sjabloon. Technische test drievoud Cq waarden werden gemiddeld voor het berekenen van ΔCq voor elk gen in een steekproef. Voor elk mRNA gemeten in qPCR, werden genexpressiewaarden gemiddeld over biologische replicaten. Om vervolgens de waarden voor de vouwverandering weer te geven, hebben we dit gemiddelde gedeeld door de gemiddelde genexpressiewaarden van NeuN-positieve cellen uit zoutoplossing-geïnjecteerde ratten. Deze waarden worden aangegeven als gemiddelden en standaardfouten in de grafieken en tabellen.

immunohistochemie

Hersenweefsel werd verkregen van wild-type vrouwelijke Spraque-Dawley-ratten na dezelfde hierboven beschreven acute en herhaalde cocaïnebehandelingen voor de microarray- en qPCR-experimenten. 90 minuten na injecties op de testdag werden ratten echter diep geanesthetiseerd met isofluraan en geperfundeerd met 100 ml PBS gevolgd door 400 ml 4% paraformaldehyde (PFA). Hersenen werden post-gefixeerd in PFA gedurende 2 uren en overgebracht naar 30% sucrose-oplossing bij 4 ° C voor 2-3 dagen. Hersenen werden bevroren op droogijs in poedervorm en bewaard bij -80 ° C tot snijden. Coronale secties werden 40 μm dik gesneden tussen Bregma 2.5 en -0.5 (Paxinos en Watson, 1998).

Secties waren immunolabeld voor Fos en Arc. In het kort werden secties driemaal gewassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en gepermeabiliseerd voor 30 min in TBS met 0.2% Triton X-100. Secties werden opnieuw gewassen in TBS en geïncubeerd in primaire antilichamen verdund in PBS met 0.3% Triton X-100 gedurende 24 uren op een schudinrichting bij 4 ° C. We gebruikten een polyklonaal konijn tegen c-Fos antilichaam (1: 500 verdunning, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en een muis monoklonaal Arc-antilichaam (1: 100-verdunning, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Secties werden driemaal gewassen in TBS en geïncubeerd in secundaire antilichamen verdund in PBS gedurende 1.5 uren op een schudinrichting bij kamertemperatuur. We gebruikten Alexa Fluor 488-gelabeld ezel-antilichaam tegen konijnen (1: 200-verdunning, Cat # A21206, Invitrogen) en Alexa Fluor 568-gelabeld geitenantilichaam tegen muizen (1: 200-verdunning, Cat # A11004, Invitrogen). Secties werden gewassen in TBS, gemonteerd op met chroom-alum gecoate glaasjes en afgedekt met VectaShield hard-set montagemedia.

Fluorescerende beelden van Fos en Arc immunoreactiviteit in caudate-putamen en NAc (ongeveer 2.0 mm vóór Bregma) werden vastgelegd met behulp van een CCD-camera (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) bevestigd aan een Zeiss Axioskop 2-microscoop. Afbeeldingen voor het tellen van gemerkte cellen werden genomen bij 200x-vergroting; afbeeldingen voor het bepalen van Fos en Arc colocalisatie werden genomen bij 400x vergroting. Gelabelde cellen van vier hemisferen per rat werden automatisch geteld met behulp van IPLab-software voor Macintosh, versie 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Tellingen van alle vier hemisferen werden gemiddeld om een ​​enkele waarde voor elke rat te verkrijgen.

Data-analyse

Gegevens over motorische sensibilisatie werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA met herhaalde metingen voor het hoofdeffect van tijd gedurende 4 injectiedagen. De statistische significantie werd vastgesteld op p <0.05. Microarray-gegevens werden geanalyseerd met DIANE 6.0, een op spreadsheet gebaseerd microarray-analyseprogramma op basis van SAS JMP 7.0, zoals eerder beschreven (Garg et al., 2009). Fluorescentie-intensiteitsgegevens van microarrays werden onderworpen aan filtering door detectie p-waarden en Z normalisatie. De kwaliteit van het monster werd geanalyseerd met behulp van scatterplots, analyse van hoofdcomponenten en genmonsters Zhiërarchische clustering op basis van scores om mogelijke uitschieters uit te sluiten. ANOVA-tests werden vervolgens gebruikt om genen met grotere varianties binnen elke vergelijkingsgroep te elimineren. Genen werden geïdentificeerd als differentieel uitgedrukt als p <0.01, absoluut Z-ratio ≥ 1.5 en valse ontdekkingsratio (fdr) <0.07. Voor qPCR-gegevens werd eenweg-ANOVA gebruikt om gegevens voor elk gen te vergelijken. De statistische significantie werd vastgesteld op p <0.05. Voor Fos- en Arc-immunohistochemie werd een t-test gebruikt die ongelijke variantie veronderstelde om de statistische significantie te berekenen, vastgesteld op p <0.05.

RESULTATEN

cfos-lacZ transgene ratten

De cfos-lacZ transgen in deze ratten wordt gereguleerd door een c-fos promotor vergelijkbaar met die in het endogene c-fos gen en wordt dus op vergelijkbare wijze geactiveerd in neuronen door hoge niveaus van exciterende synaptische input (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). Het eiwitproduct van de cfos-lacZ transgen, β-galactosidase (βgal), wordt mede tot expressie gebracht met c-Fos in sterk geactiveerde neuronen (Koya et al., 2009) en gebruikt om geactiveerde striatale neuronen te labelen in de volgende FACS-zuiveringsprocedure.

FACS-zuivering van geactiveerde striatale neuronen na enkele acute cocaïne-injecties

Hele striata werden verkregen van cfos-lacZ ratten 90 minuten na acute injecties van 30 mg / kg cocaïne of zoutoplossing buiten hun thuissysteem. Gedissocieerde striatale cellen van op vergelijkbare wijze behandelde ratten werden samengevoegd voorafgaand aan FACS-zuivering voor elk van de biologische replicaten in daaropvolgende microarray en kwantitatieve PCR (qPCR) -analyses. Gedissociëerde striatale cellen werden aanvankelijk geanalyseerd volgens hun voorwaartse en zijwaartse lichtverstrooiingskarakteristieken [Figuur 1a]. De meerderheid van NeuN-gelabelde neuronen werd gevonden binnen een reeks van gebeurtenissen langs het onderste deel van de plot. Dus alle volgende analyses waren forward-gated om alleen events binnen deze strip te omvatten.

Figuur 1 

Fluorescentie-geactiveerde celsortering van βgal-gelabelde neuronen van ratten behandeld met een enkele injectie van cocaïne

Cellen binnen deze gate werden gescheiden volgens hun mate van immunolabeling met de neuronale marker NeuN en de neurale activeringsmarkeerder pgal. In weefsel verkregen van cocaïne-geïnjecteerde ratten had ongeveer 15% NeuN-gelabelde neuronen hoge niveaus van pgal [Figuur 1b], wat correspondeerde met ongeveer 100,000 βgal-gelabelde neuronen per rat. Alle β-gelabelde cellen brachten samen NeuN tot expressie, wat aangeeft dat alleen neuronen βgal tot expressie brachten. Daarentegen brachten zeer weinig NeuN-gelabelde neuronen, verkregen uit zoutoplossing-geïnjecteerde ratten, de activeringsmarkers ßgal of Fos tot expressie, die ßgal en Fos immunoreactiviteit ondersteunt als markers van neurale activering bij cocaïne-geïnjecteerde ratten. Het lage aantal βgal tot expressie brengende neuronen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten leverde niet genoeg cellen op voor daaropvolgende moleculaire analyses. Daarom gebruikten we alleen NeuN-labeling om neuronale cellen te scheiden van niet-neuronale cellen in alle volgende experimenten met striataal weefsel verkregen uit zoutoplossing-geïnjecteerde ratten. Over het algemeen was ongeveer 30% van alle striatale cellichamen NeuN-positief, wat overeenkomt met ongeveer 600,000 striatale neuronen per rat. Wanneer FACS-gezuiverde cellen werden onderzocht met fluorescentiemicroscopie, waren alle cellen rond en verstoken van processen [Figuur 2]. Microscopische observatie bevestigde dat FACS-gesorteerde cellen op de juiste manier waren gelabeld voor NeuN- en βgal-immunoreactiviteit. Monsters van FACS-gezuiverde cellen bleken> 90% zuiver te zijn bij beoordeling met een tweede ronde van flowcytometrie (gegevens niet getoond).

Figuur 2 

Microscoopfoto's van FACS-gezuiverde cellen en puin

We bepaalden de selectiviteit van onze FACS-zuiveringsprocedure met microarray om genexpressiepatronen van de FACS-gezuiverde cellen te analyseren. We vergeleken genexpressie in βgal-positieve en βgal-negatieve neuronen van cocaïne-geïnjecteerde ratten alsook NeuN-positieve en NeuN-negatieve cellen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten. Hoofdcomponent en clusteranalyse gaven aan dat de primaire differentiërende factor was of de cellen neuronen of glia waren [Figuur 3a]. De tweede onderscheidende factor was βgal-expressie die werd gebruikt om geactiveerde van niet-geactiveerde neuronen te scheiden. Genen werden geïdentificeerd als differentieel uitgedrukt als p <0.01, absoluut Z-ratio ≥ 1.5 en valse ontdekkingsratio (fdr) <0.07. We ontdekten dat 125 genen waren verhoogd en 467 genen waren verminderd in βgal-positieve neuronen in vergelijking met βgal-negatieve neuronen die werden verkregen uit hetzelfde striatale weefsel van met cocaïne geïnjecteerde ratten [Figuur 3b]. Wanneer dezelfde βgal-positieve neuronen van met cocaïne geïnjecteerde ratten werden vergeleken met controlemonsters van alle NeuN-gelabelde neuronen van met zoutoplossing geïnjecteerde ratten, waren er 133 genen verhoogd en waren 890 genen afgenomen in de βgal-positieve neuronen. Met name de twee controlegroepen - βgal-negatieve neuronen van met cocaïne geïnjecteerde ratten en alle NeuN-gelabelde neuronen van met zoutoplossing geïnjecteerde ratten - produceerden zeer vergelijkbare genexpressiepatronen; genexpressie was niet significant verschillend tussen deze controlegroepen [Figuur 3b].

Figuur 3 

Microarray-analyse van cellen gesorteerd uit rattenstriata na een enkele injectie van cocaïne of zoutoplossing

Specifieke genen gevonden in de verschillende steekproefgroepen bevestigden scheiding van geactiveerde en niet-geactiveerde neuronen, evenals neuronale van niet-neuronale cellen met behulp van FACS [Tabel 2]. βalg-positieve neuronen van cocaïne-geïnjecteerde ratten brachten hogere niveaus van vele neurale activatie-merkergenen tot expressie ten opzichte van βgal-negatieve neuronen van dezelfde cocaïne-geïnjecteerde ratten of alle NeuN-gelabelde neuronen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten [Figuur 3c]. Deze activiteitsmerkgenen zijn inbegrepen c-fos, JunB, boog, EGR familie (1, 2, 4) en nr4a3 (Guzowski et al., 2005). Interessant is dat deze β-positieve neuronen ook significant hogere niveaus van het D1-dopaminereceptorceltypespecifieke merker-prodynorfinegen tot expressie brachten en significant lagere niveaus van het D2-dopaminereceptorgen.

Tabel 2 

Samenvatting van microarray- en qPCR-gegevens van het acute cocaïne-experiment.

Microarray-genexpressiegegevens werden gevalideerd met behulp van qPCR. De activiteitsmerkgenen FosB, boog en nr4a3 werden uitgedrukt in hogere niveaus in βg-positieve neuronen van cocaïne-geïnjecteerde ratten in verhouding tot zowel βgal-negatieve neuronen van dezelfde cocaïne-geïnjecteerde ratten en alle neuronen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten [Figuur 4a; gegevens en statistische informatie in Tabel 2]. βgal-positieve neuronen brachten ook hogere niveaus van het prodynorfine-gen tot expressie [Figuur 4b]. Hoewel β-positieve neuronen blijkbaar lagere expressieniveaus hadden voor verschillende genen, waaronder de A2A-adenosinereceptor, de Kv3.1-kaliumkanaal en map2k6 / MEKK6-genen, waren alleen Kv3.1- en map2k6 / MEKK6-expressieniveaus statistisch verschillend met qPCR [Figuur 4c]. Over het algemeen waren genexpressie-veranderingen die werden beoordeeld met qPCR vrijwel identiek aan genexpressie-veranderingen die werden beoordeeld door microarray-experimenten.

Figuur 4 

Kwantitatieve PCR toont een ander genexpressieprofiel voor βgal-positieve neuronen na acute cocaïne-injecties, vergeleken met βg-negatieve neuronen van dezelfde ratten, of met alle neuronen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten

Om te bepalen of mRNA-veranderingen in geactiveerde neuronen op het eiwitniveau werden gereflecteerd, gebruikten we immunohistochemische analyse van coronale hersensecties van met cocaïne en zoutoplossing geïnjecteerde wildtype vrouwelijke ratten [Figuur 5]. Deze secties ondergingen geen dissociatie of FACS en daarom werd immunohistochemische analyse niet beïnvloed door de celdissociatie die werd gevonden in de FACS-procedure. In het ventrale striatum van cocaïne-geïnjecteerde ratten [Figuur 5a], werden de neurale activiteitsmarkers Fos en Arc mede tot expressie gebracht in dezelfde cellen: 85 ± 4% van alle Fos-positieve cellen waren Arc-positief, terwijl 82 ± 3% van alle Arc-positieve cellen Fos-positief waren. Cocaïne-injecties produceerden een 2.7-voudige toename in Fos-gelabelde neuronen en een 2.7-voudige toename in Arc-gelabelde neuronen. In het dorsale striatum van cocaïne-geïnjecteerde ratten [Figuur 5b], 80 ± 2% van alle Fos-positieve cellen waren Arc-positief, terwijl 86 ± 3% van alle Arc-positieve cellen Fos-positief was. Cocaïne-injecties produceerden een 4.4-voudige toename in Fos-gelabelde neuronen en een 3.8-voudige toename in Arc-gelabelde neuronen.

Figuur 5 

Fos en Arc worden mede tot uitdrukking gebracht in (a) ventraal striatum en (b) dorsaal striatum na een enkele injectie van cocaïne

FACS-zuivering van geactiveerde striatale neuronen van voor cocaïne gesensibiliseerde ratten

In het tweede FACS-experiment werden alle ratten gesensibiliseerd met herhaalde cocaïnespuiten. Herhaalde toediening van cocaïne in de locomotievenkast verbeterde door cocaïne geïnduceerde voortbeweging: voortbeweging op dag 7 was 180 ± 18% van dag 1 voortbeweging (belangrijkste effect van tijd op 4 herhaalde injecties, F3, 363 = 24.9, p <0.001), wat duidde op significante psychomotorische sensibilisatie. Zeven dagen later op de testdag werd cocaïne of zoutoplossing aan ratten toegediend in dezelfde locomotorische box. Negentig minuten later werd striataal weefsel, inclusief NAc, geëxtraheerd en werden cellen met FACS gezuiverd met behulp van de hierboven beschreven procedure.

Cellen binnen dezelfde lichtverstrooide strook van gebeurtenissen als in het vorige experiment werden gescheiden op basis van hun mate van immunolabeling met de neuronale marker NeuN en de neurale activeringsmarkeerder pgal. In weefsel verkregen van cocaïne-geïnjecteerde ratten had ongeveer 10% NeuN-gelabelde neuronen hoge niveaus van pgal [Figuur 6], wat correspondeerde met ongeveer 60,000 βgal-gelabelde neuronen per rat. Alle β-gelabelde cellen brachten samen NeuN tot expressie, wat aangeeft dat alleen neuronen βgal tot expressie brachten. Opnieuw produceerde weefsel verkregen van ratten geïnjecteerd met zoutoplossing op de testdag zeer weinig (3gal- of Fos tot expressie brengende neuronen, en dus niet genoeg cellen voor daaropvolgende moleculaire analyses. Daarom gebruikten we alleen NeuN-labeling om neuronale cellen te scheiden van niet-neuronale cellen verkregen uit zoutoplossing-geïnjecteerde ratten. Ongeveer 30% van alle cellichamen in zoutoplossing-geïnjecteerde ratten was NeuN-positief, wat in dit experiment overeenkwam met ongeveer 400,000 striatale neuronen per rat.

Figuur 6 

Fluorescentie-geactiveerde celsortering van βgal-gelabelde neuronen van gesensibiliseerde ratten uitgedaagd met cocaïne 7 dagen na herhaalde behandeling met cocaïne

We gebruikten qPCR om genexpressie te vergelijken in βgal-positieve en βgal-negatieve neuronen van met cocaïne geïnjecteerde ratten, evenals alle NeuN-positieve neuronen van met zoutoplossing geïnjecteerde ratten na cocaïne-sensibilisatie. βgal-positieve neuronen van met cocaïne geïnjecteerde ratten brachten hogere niveaus van drie markergenen voor neurale activiteit tot expressie - FosB, boog en nr4a3- ten opzichte van βgal-negatieve neuronen van dezelfde met cocaïne geïnjecteerde ratten en voor alle neuronen van met zoutoplossing geïnjecteerde ratten [Figuur 7a; gegevens en statistische informatie in Tabel 3]. βgal-positieve neuronen brachten ook een hoger niveau van het prodynorfine-gen tot expressie dat vergelijkbaar is met dat in het enkele cocaïne-injectie-experiment [Figuur 7b]. Daarentegen hadden βgal-positieve neuronen lagere expressieniveaus voor verschillende genen [Figuur 7c], inclusief Drd2 codering van de D2 dopamine-receptor, en Map2k6 coderend voor de kinase die p38 MAPK activeert, vergelijkbaar met het enkele acute cocaïne-injectie-experiment. Uiteindelijk hadden βg-positieve neuronen een verhoogde expressie van dusp1, ook bekend als mkp1 [Figuur 7c], die codeert voor het fosfatase dat p38 MAPK inactiveert (Sgambato et al., 1998).

Figuur 7 

Kwantitatieve PCR toont een ander genexpressieprofiel in βgal-positieve neuronen van gesensibiliseerde cocaïne-uitgedaagde ratten, in vergelijking met βgal-negatieve neuronen van dezelfde ratten, of alle neuronen van zout-uitgedaagde ratten
Tabel 3 

Samenvatting van qPCR-gegevens van het herhaalde cocaïne-experiment.

Om te bepalen of mRNA-veranderingen in geactiveerde neuronen op het eiwitniveau worden gereflecteerd, gebruikten we immunohistochemische analyse van coronale hersencoupes van wildtype cocaïne-gesensitiseerde vrouwelijke ratten na cocaïne- of zoutoplossinginjecties op de testdag. In het ventrale striatum van cocaïne-geïnjecteerde ratten werden de markers voor neurale activiteit, Fos en Arc, gezamenlijk in dezelfde cellen tot expressie gebracht: 90 ± 2% van alle Fos-positieve cellen waren Arc-positief en 83 ± 2% van alle Arc-positieve cellen cellen waren Fos-positief. Cocaïnestestinjecties produceerden een 2.3-voudige toename in Fos-gelabelde neuronen en een 2.2-voudige toename in Arc-gelabelde neuronen. In het dorsale striatum van cocaïne-geïnjecteerde ratten was 93 ± 2% van alle Fos-positieve cellen Arc-positief en 90 ± 3% van alle Arc-positieve cellen was Fos-positief. Cocaïnestestinjecties produceerden een 4.4-voudige toename in Fos-gelabelde neuronen en een 4.5-voudige toename in Arc-gelabelde neuronen. Aldus brachten heel weinig niet-Fos-gelabelde cellen Arc tot expressie en zeer weinig niet-Arc-gelabelde cellen brachten Fos tot expressie die onze bevindingen van gesorteerde cellen ondersteunt.

DISCUSSIE

We hebben een procedure ontwikkeld voor het zuiveren en beoordelen van moleculaire veranderingen binnen neuronen die alleen worden gedefinieerd door hun eerdere activeringstoestand tijdens door cocaïne geïnduceerde locomotorische activiteit. Gegevens uit de microarray-, qPCR- en immunohistochemische experimenten bevestigden onafhankelijk dat onze FACS-procedure unieke moleculaire veranderingen identificeerde binnen geactiveerde neuronen, zoals gedefinieerd door c-fos promotorinductie van pgal-expressie. De belangrijkste biologische bevinding met behulp van deze procedure was dat directe vroege genen (IEG's) alleen in geactiveerde neuronen worden geïnduceerd, terwijl IEG-expressie onveranderd of zelfs verlaagd is in de niet-geactiveerde meerderheid van neuronen. Omdat veel van deze IEG-markers voor neurale activiteit ook transcriptiefactoren zijn, is het waarschijnlijk dat binnen deze geactiveerde neuronen zeer verschillende patronen van genexpressie worden geïnduceerd die kunnen bijdragen aan de fysiologische en gedragseffecten van cocaïne (zie bijvoorbeeld (Curran en Franza, 1988; Nestler et al., 1993; McClung et al., 2004; Loebrich en Nedivi, 2009).

Differentiële IEG-inductie tussen geactiveerde en niet-geactiveerde neuronen ondersteunt de hypothese dat slechts een minderheid van de neuronen sterk wordt geactiveerd tijdens cocaïne-geïnduceerde voortbeweging, terwijl de meeste neuronen in veel mindere mate of helemaal niet worden geactiveerd. Elektrofysiologische experimenten in wildtype ratten geven aan dat Fos-eiwitexpressie correleert met hoge niveaus van exciterende synaptische input (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). We weten dat Fos en βgal-expressie op dezelfde manier worden gereguleerd in dezelfde neuronen in cfos-lacZ ratten (Koya et al., 2009). We concluderen dus dat verhoogde βgal- en IEG-expressie in slechts een klein aantal striatale neuronen erop wijst dat slechts een minderheid van striatale neuronen hoge niveaus van exciterende synaptische input ontvangt als reactie op cocaïnebeheersing.

Discrete activering van striatale neuronen is consistent met de upstate-downstate-hypothese die tegengestelde effecten van dopamine op striatale neuronale activiteit beschrijft. Cocaïne-geïnduceerde dopamine wordt verondersteld om de verschillen te vergroten tussen hoge activiteit en lage activiteit neuronen door de aanhoudende elektrofysiologische activiteit van neuronen die al in een hoge activiteitstoestand zijn te verbeteren, terwijl de doorgaande activiteit van de meerderheid van neuronen met lagere activiteit wordt verzwakt (Wilson en Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez et al., 1997; Nicola et al., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola et al., 2004). De resulterende toename van de signaalruisverhouding verbetert niet alleen de selectiviteit tijdens acute signalering, maar kan, zoals in onze studie wordt gesuggereerd, ook bijdragen aan de inductie van unieke moleculaire neuroadaptaties in alleen de hoge activiteitsneuronen. Ondertussen leek genexpressie in βgal-negatieve neuronen, die de meerderheid van striatale neuronen van cocaïne-geïnjecteerde ratten vormen, niet te verschillen van genexpressie in striatale neuronen van zoutoplossing-geïnjecteerde ratten; dit ondersteunt de hypothese dat de meeste striatale neuronen in de downstate blijven tijdens blootstelling aan cocaïne.

Componenten van de p38 MAP-kinase-signaleringsroute werden ook differentieel veranderd tussen geactiveerde en niet-geactiveerde neuronen. Genexpressie van Map2k6 / MEKK6, een kinase dat p38 activeert, was verminderd, terwijl genexpressie van Mkp1 / Dusp1, een fosfatase dat p38 inactiveert (Sgambato et al., 1998), was verhoogd in geactiveerde neuronen, maar niet in niet-geactiveerde neuronen. Aldus algemene p38 MAPK-signalering, waarvan wordt aangetoond dat deze een rol speelt bij synaptische plasticiteit (Bolshakov et al., 2000; Izumi et al., 2008), kan worden verzwakt in geactiveerde neuronen ten opzichte van de niet-geactiveerde meerderheid van neuronen.

FACS kan ook helpen bij het identificeren van de neuronale typen die worden geactiveerd na acute of herhaalde blootstelling aan cocaïne. We vonden hogere expressie van het neuronale merker-genprodynorfine van D1 in geactiveerde neuronen en lagere expressie van de D2-neuronale markergenen D2-dopaminereceptor en A2A-adenosinereceptor in geactiveerde neuronen. Dit suggereert dat Fos voornamelijk in D1 striatale neuronen werd geïnduceerd. Hoewel dit overeenkomt met veel immunohistochemische studies die Fos-inductie voornamelijk in D1-neuronen rapporteren na injecties met psychostimulant in de thuis kooi (Berretta et al., 1992; Cenci et al., 1992), is in tegenspraak met de gelijke activering van D1- en D2-neuronen die na een psychostimulant-injectie in een relatief nieuwe omgeving buiten de huiskooi van de rat (Jaber et al., 1995; Badiani et al., 1999; Hope et al., 2006).

Omdat we dezelfde βgal-marker gebruikten om geactiveerde neuronen te identificeren tijdens FACS zoals we gebruikten voor onze eerder beschreven Daun02-inactivatieprocedure (Koya et al., 2009), is het aannemelijk dat we unieke moleculaire veranderingen in neuronale ensembles waarnemen die nodig zijn voor de geleerde component van context-specifieke sensitisatie van door cocaïne geïnduceerde motoriek. We hebben eerder geconstateerd dat inactivatie van slechts een klein aantal schaars verdeelde neuronen binnen een vermeend ensemble voldoende is om context-specifieke cocaïne psychomotorische sensitisatie te verstoren (Koya et al., 2009). Deze bevinding werd gerepliceerd met dezelfde vrouw cfos-lacZ ratten en sensibilisatieregime gebruikt in de huidige studie [http://irp.drugabuse.gov]. Deze neuronen zijn niet inherent gevoeliger voor alle stimuli, omdat het veranderen van de omgeving of context waarin het medicijn werd toegediend, een andere reeks striatale neuronen activeerde na cocaïne-injecties (Mattson et al., 2008; Koya et al., 2009). Selectie van een specifiek striataal neuronaal ensemble lijkt primair afhankelijk van het patroon van activiteit van corticale en subcorticale glutamaterge afferenten (Pennartz et al., 1994; O'Donnell, 2003), en deze inputs worden zelf bepaald door specifieke omgevings- en interoceptieve stimuli die aanwezig zijn tijdens het gedrag. Uit dit eerdere werk en onze huidige gegevens veronderstellen we dat herhaalde koppeling van cocaïne met omgevingsstimuli tijdens ons sensibiliseringsregime unieke moleculaire veranderingen produceert binnen herhaaldelijk geactiveerde neuronale ensembles die kunnen bijdragen aan de geleerde associaties die ten grondslag liggen aan context-specifieke sensitisatie.

Over het geheel genomen hebben we een nieuwe toepassing van FACS aangetoond voor het isoleren van volwassen neuronen die selectief worden geactiveerd tijdens acute cocaïne-geïnduceerde locomotorische activiteit en herhaalde door cocaïne geïnduceerde locomotorisibilisatie. We stellen voor dat deze aanpak ook kan worden gebruikt om unieke moleculaire neuroadaptaties te identificeren in neuronale ensembles die coderen voor de gedragseffecten van misbruikte drugs en andere aangeleerde gedragingen. De causale rollen van deze unieke moleculaire neuroadaptaties in neurale plasticiteit en gedrag moeten uiteindelijk worden onderzocht door het manipuleren van genexpressie in alleen geactiveerde neuronen; deze techniek moet echter nog worden ontwikkeld.

Dankwoord

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van het National Institute on Drug Abuse. D. Guez-Barber werd gesteund door NIH MSTP TG 5T32GM07205, Award Number F30DA024931 van het National Institute on Drug Abuse en de Charles BG Murphy Chair in Psychiatry aan de Yale University. We danken Joe Chrest voor zijn uitstekende technische assistentie met FACS, en Chris Cheadle, Tonya Watkins en Alan Berger voor hun werk aan de microarray. We danken Yavin Shaham voor nuttige opmerkingen over het manuscript.

voetnoten

 

Er zijn geen belangenconflicten voor auteurs van dit manuscript.

Referenties

  1. Badiani A, Oates MM, dag HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Milieumodulatie van door amfetamine geïnduceerde c-fos-expressie in D1 versus D2 striatale neuronen. Gedrag Brain Res. 1999, 103: 203-209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Dopamine en glutamaat agonisten stimuleren neuron-specifieke expressie van Fos-achtige eiwitten in het striatum. J Neurophysiol. 1992, 68: 767-777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dubbele MAP-kinasekaden bemiddelen tegengestelde vormen van langetermijnplasticiteit bij CA3-CA1-synapsen. Nat Neurosci. 2000, 3: 1107-1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA-receptor synaptische plasticiteit geïnduceerd door psychostimulantia: het verleden, het heden en de therapeutische toekomst. Neuron. 2010, 67: 11-24. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Striatal c-fos Inductie door cocaïne of apomorfine doet zich bij voorkeur voor in uitgangs neuronen die naar de substantie Nigra in de rat projecteren. Eur J Neurosci. 1992, 4: 376-380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos en Jun: de AP-1-verbinding. Cel. 1988, 55: 395-397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88-expressie door CNS-residente cellen is cruciaal voor het opwekken van beschermende immuniteit in hersenabcessen. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1- en D2-dopaminereceptorfunctie in het striatum: co-activatie van D1- en D2-dopaminereceptoren op afzonderlijke populaties van neuronen resulteert in gepotentieerde onmiddellijke vroege genrespons in D1-bevattende neuronen. J Neurosci. 1995, 15: 8167-8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Het in kaart brengen van gedragsrelevante neurale circuits met onmiddellijke vroege expressie. Curr Opin Neurobiol. 2005, 15: 599-606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1-receptoractivering verbetert evoked ontlading in neostriatale medium stekelige neuronen door het moduleren van een L-type Ca2 + geleiding. J Neurosci. 1997, 17: 3334-3342. [PubMed]
  11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Cocaïne-geïnduceerde locomotorische activiteit en Fos-expressie in nucleus accumbens zijn gevoelig voor 6 maanden na herhaalde toediening van cocaïne buiten de kooi. Eur J Neurosci. 2006, 24: 867-875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Langetermijnpotentiatie-inhibitie door laag-niveau N-methyl-D-aspartaat receptor-activering omvat calcineurine, stikstofmonoxide en p38-mitogeen-geactiveerde eiwitkinase. Zeepaardje. 2008, 18: 258-265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Acute en chronische amfetaminebehandelingen reguleren op verschillende manieren neuropeptide-boodschapper-RNA-niveaus en Fos-immunoreactiviteit in striatale neuronen van de rat. NEUROSCIENCE. 1995, 65: 1041-1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. De glutamaat homeostase-hypothese van verslaving. Nat Rev Neurosci. 2009, 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontaan en opgeroepen glutamaatsignalering beïnvloedt de Fos-lacZ-expressie en pyramidale celdood in hippocampale plakculturen van transgene ratten. Brain Res Mol Brain Res. 1995, 34: 197-208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Targeted disruption of door cocaïne geactiveerde nucleus accumbens neuronen voorkomt context-specifieke sensibilisatie. Nat Neurosci. 2009, 12: 1069-U1152. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. Een gecombineerde methode van laser capture microdissectie en X-Gal histologie om genexpressie in c-Fos-specifieke neuronen te analyseren. J Neurosci-methoden. 2010, 186: 155-164. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Inductie van c-fos-mRNA door ontstoken vangsten: complexe relatie met neuronburstverbranding. J Neurosci. 1993, 13: 744-751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Een tweede klasse van chemosensorische receptoren in het reukepitheel. Natuur. 2006, 442: 645-650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Gray M, Geschwind DH, Yang XW. FACS-array-profilering van striatale projectie-neuron-subtypen in hersenen van juveniele en volwassen muizen. Nat Neurosci. 2006, 9: 443-452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. De functie van activiteitsgereguleerde genen in het zenuwstelsel. Physiol Rev. 2009; 89: 1079-1103. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Context-specifieke sensitisatie van cocaïne-geïnduceerde locomotorische activiteit en bijbehorende neuronale ensembles in rattenkern accumbens. Eur J Neurosci. 2008, 27: 202-212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: een moleculaire switch voor langdurige aanpassing in de hersenen. Brain Res Mol Brain Res. 2004, 132: 146-154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Drugsverslaving - een model voor de moleculaire basis van neurale plasticiteit. Neuron. 1993; 11: 995-1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Moleculaire basis van langetermijnplasticiteit ten grondslag aan verslaving. Nat Rev Neurosci. 2001, 2: 119-128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminergische modulatie van neuronale exciteerbaarheid in het striatum en nucleus accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000, 23: 185-215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Contrastverbetering: een fysiologisch effect van striatale dopamine? Cell Tissue Res. 2004, 318: 93-106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Dopamine gating van neurale ensembles van de voorhersenen. Eur J Neurosci. 2003, 17: 429-435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. De hersenen van de rat in stereotaxische coördinaten. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. De kern accumbens als een complex van functioneel verschillende neuronale ensembles: een integratie van gedrags-, elektrofysiologische en anatomische gegevens. Prog Neurobiol. 1994, 42: 719-761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-FOS-expressie in de ratten-intergenerende leaflet: fotische regulatie, co-lokalisatie met Fos-B en cellulaire identificatie. Brain Res. 1996, 728: 231-241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Effect van elektrische stimulatie van de hersenschors op de expressie van het Fos-eiwit in de basale ganglia. Neurosci. 1997, 81: 93-112. [PubMed]
  33. Sgambato V, Pages C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracellulair signaalgereguleerd kinase (ERK) controleert onmiddellijke vroege geninductie op corticostriatale stimulatie. J Neurosci. 1998, 18: 8814-8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. De rol van neuroadaptaties bij terugval naar het zoeken naar medicijnen. Nat Neurosci. 2005, 8: 1437-1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Inductie van c-fos mRNA-expressie door na-ontlading in de hippocampus van naïeve en ontstoken ratten. J Neurochem. 1990, 55: 1050-1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. De oorsprong van spontane membraanpotentiaalschommelingen in twee toestanden van neostriatale stekelige neuronen. J Neurosci. 1996, 16: 2397-2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. AMPA-receptorplasticiteit in de nucleus accumbens na herhaalde blootstelling aan cocaïne. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC gratis artikel] [PubMed]