Voldoende Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulatie voor de progressie naar verslaving (2015)

Introductie

Verslaving is een ziekte die evolueert in verschillende stappen (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). De diagnose wordt gesteld wanneer recreatief gebruik dwangmatig wordt en ondanks negatieve gevolgen aanhoudt. Hoewel een leidende verslavingshypothese stelt dat drugsmisbruik de ziekte veroorzaakt omdat ze de concentratie van dopamine (DA) in de hersenen buitensporig verhogen, is het onduidelijk of het activeren van dit systeem voldoende is om de overgang van recreatief gebruik naar verslaving te stimuleren (Di Chiara en Bassareo, 2007, Volkow en Morales, 2015). Het ondersteunende bewijs voor de DA-hypothese voor medicijnversterking heeft zich in de afgelopen decennia verzameld en is gebaseerd op het initiële effect van medicijnen. Verslavende medicijnen verlagen bijvoorbeeld de drempel voor intracraniële zelfstimulatie (ICSS) van de mediale voorhersenenbundel, een vezelkanaal dat onder andere een oplopende DA-projectie van de middenhersenen bevat (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmacologie- en laesiestudies identificeerden vervolgens het mesocorticolimbische DA-systeem als de oorsprong van dit circuit (Wise en Bozarth, 1982). Aan het eind van de jaren tachtig bevestigde een directe meting van de extracellulaire DA-concentratie met microdialyse dat verslavende medicijnen de eigenschap hadden om een ​​DA-stijging in het NAc op te roepen (Di Chiara en Imperato, 1980). Dit leidde tot het voorstel van een mechanistische classificatie van verslavende middelen (Lüscher en Ungless, 1988).

Er is veel minder bekend over hoe deze eerste effecten van drugsgebruik de overgang naar verslaving vergemakkelijken. DA-onafhankelijke mechanismen zijn overwogen omdat verslavende geneesmiddelen andere farmacologische doelen hebben. Cocaïne bijvoorbeeld remt niet alleen de DA-transporter (DAT), maar bindt ook aan SERT (serotoninetransporter) en NET (noradrenaline-transporter) om de heropname van respectievelijk serotonine en norepinefrine te verminderen, waardoor de concentratie van alle belangrijke monoamines (Han en Gu, 2006, Tassin, 2008). Soortgelijke zorgen kunnen van toepassing zijn op andere psychostimulantia. Bovendien wordt beweerd dat opiaten, althans in de beginfase, DA-onafhankelijk zijn (Badiani et al., 2011; Ting-A-Kee en van der Kooy, 2012). De DA-hypothese is ook aangevochten op basis van genetische muismodellen, waar, na interferentie met het DA-systeem, sommige vormen van drugsadaptief gedrag nog steeds duidelijk waren. DAT knock-out-muizen bijvoorbeeld zelf cocaïne toedienen (Rocha et al., 1998), en het afschaffen van DA-synthese hetzij farmacologisch (Pettit et al., 1984) of genetisch (Hnasko et al., 2007) konden zelftoediening van geneesmiddelen niet voorkomen. of geconditioneerde plaatsvoorkeur. Hoewel een betere karakterisering van deze transgene muizen en het genereren van knock-outs van dubbele monoamine transporters enkele van deze problemen hebben opgelost (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), is de toereikendheid van DA om hoofdkenmerken van verslaving te activeren onbekend. Om problemen van niet-specificiteit te omzeilen, hebben we daarom besloten om muizen toe te staan ​​om VTA DA-neuronen zelf te stimuleren met behulp van een optogenetische benadering.

Recente studies hebben aangetoond dat activering van DA-neuronen in de middenhersenen plaatsvoorkeur kan induceren (Tsai et al., 2009) of instrumenteel gedrag kan versterken (Adamantidis et al., 2011; Witten et al., 2011; Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Hoewel deze selectieve activering van DA-routes intracraniële zelfstimulatie (ICSS) -studies bevestigt die meer dan 30 jaar geleden zijn uitgevoerd bij het afbakenen van het beloningssysteem (Fouriezos et al., 1978), schieten ze tekort en demonstreren ze de inductie van adaptief gedrag in een laat stadium dat definieert verslaving, noch identificeerden ze de onderliggende neuronale aanpassingen. Hier hebben we optogenetische manipulatie gebruikt, niet alleen om direct het toereikendheidscriterium voor fasische DA-signalering bij het initiëren van wapening mogelijk te maken, maar ook om te testen op de overgang naar verslaving.

Een opvallende observatie van de latere stadia van de ziekte is dat zelfs met de meest verslavende middelen slechts een fractie van de gebruikers verslaafd raakt (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Menselijke verslaafden zullen ondanks de negatieve gevolgen doorgaan met drugsgebruik (zie "Definition of Addiction" van de American Society for Addiction Medicine, DSM5, American Psychiatric Association, 2013), meestal gerelateerd aan sociale en psychologische nederlagen die vaak in de tijd worden vertraagd. Evenzo wordt bij knaagdieren ruwweg een op de vijf dieren die cocaïne zelf toedienen uiteindelijk geclassificeerd als verslaafd (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; maar zie George et al., 2014). Het volhouden van het innemen van medicijnen ondanks de negatieve gevolgen kan ook worden gemodelleerd bij knaagdieren door een eenvoudige aversieve stimulans in het consumptieschema te introduceren. Hoewel de menselijke ziekte complexer is, is het associëren van straf met consumptie een eenvoudig model van een kerncomponent van verslaving.

Hier hebben we een milde voetschok gebruikt om de consequenties te evalueren voor zelftoediening van cocaïne, sucrose en zelfstimulering door optogenetica. We onderzoeken verder of DA-zelfstimulatie van neuronen twee verslavingsgerelateerde gedragingen kan induceren - cue-geassocieerde beloning en dwangmatigheid geassocieerd met consumptie ondanks negatieve consequenties - en karakteriseren de neurale plasticiteit die geassocieerd is met dit gedrag.

Resultaten

Om de activiteit van DA-neuronen te controleren, injecteerden we een Cre-induceerbaar adeno-geassocieerd virus (AAV) met een dubbel-gevulde omgekeerd open leeskader (DIO) dat ChR2 gefuseerd met versterkt geel fluorescerend eiwit (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) in de VTA van DAT-Cre-muizen. Bovendien werd een optische vezel geplaatst om de VTA (ChR2, Zie Experimentele procedures). Specificiteit van de ChR2 expressie werd bevestigd door de co-lokalisatie van eYFP met Tyrosine Hydroxylase (TH), een enzym dat nodig is voor DA-synthese (Figuur 1EEN). 

Ten eerste, om het laserstimulatieprotocol vast te stellen, werden muizen in een operante doos geplaatst waar ze op een actieve hendel konden drukken, die een aantal laserstimulaties activeerde die elke keer varieerde (1, 2, 8, 32, 60 of 120 bursts). twee sessies. Om een ​​fasisch schietpatroon na te bootsen (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009), typisch geïnduceerd door natuurlijke beloning (Schultz, 1998), gebruikten we burst-stimulatie. Een burst bestond uit vijf laserpulsen van 4 ms, bij 20 Hz, en werd twee keer per seconde herhaald. We ontdekten dat muizen hun gedrag bij het indrukken van de hendel aanpasten als een functie van bursts per laserstimulatie, waardoor het totale aantal ontvangen bursts werd gecontroleerd (Figuur 1B). Dit gedrag deed denken aan zelftoediening van verslavende middelen, waarbij de dosis per infusie werd gevarieerd (Piazza et al., 2000). Voor de daaropvolgende experimenten kozen we ervoor om 30 bursts per hendelpers toe te dienen, wat een half maximaal aantal bursts opleverde (Figuur 1B). Om de vertraging in DA-toename na te bootsen die doorgaans wordt waargenomen wanneer geneesmiddelen intraveneus worden toegediend (Aragona et al., 2008), hebben we de laserstimulatie met 5 seconden vertraagd en een knipperend cue-licht toegevoegd gedurende 10 seconden (Figuur 1C).

Gedurende 12 opeenvolgende dagen mochten muizen maximaal 80 keer zichzelf stimuleren in 2 uur. Muizen verhoogden snel de snelheid van laserstimulatie en bereikten 80 laserstimulaties (LS) vóór het einde van het eerste uur van een sessie (Cijfers 1D en 1E). Het onderscheid tussen de actieve en inactieve hendel werd snel verkregen en het aantal actieve hendelpersen nam dienovereenkomstig toe met stijgende schema's met vaste verhoudingen (FR1, 2, 3) (Cijfers 1F en 1G). Bij controle-experimenten met DAT-Cre-muizen of muizen die ChR2 tot expressie brachten in y-aminoboterzuur (GABA) -neuronen (GAD-Cre + -muizen, om de remmende neuronen van de VTA te targeten), waren de zelfstimuleringssnelheden laag en daalden ze voortdurend sessies. Dit gold ook voor twee Cre + -dieren waarbij post-hoc-validatie aantoonde dat de VTA niet was geïnfecteerd met ChR2-eYFP (niet getoond). Bovendien werd geen discriminatie tussen de actieve en inactieve hendel gedetecteerd (Figuren S1A en S1B).

We hebben waargenomen dat DAT-Cre + muizen vaker op de actieve hendel drukten dan nodig was voor de laserstimulatie. In feite waren dergelijke "futiele" actieve hendelpersen goed voor meer dan 30% van alle actieve hendelpersen (Figuur S2A) en gebeurden - naarmate de sessies vorderden - meestal tussen het begin van cue en laserstimulatie (Figuren S2B en S2C). Dit enkelvoudig gedrag ontwikkeld tijdens acquisitie en kan impulsieve reacties weerspiegelen.

Samengenomen, versterkt burst-activiteit in VTA DA-neuronen de reactie van de hendel sterk.

Occlusie van VTA DA Neuron zelfstimulatie door cocaïne

Om te testen of de zelfstimulatie van VTA DA-neuronen afhangt van dezelfde hersencircuits die het doelwit zijn van verslavende medicijnen om gedrag te versterken, injecteerden we cocaïne intraperitoneaal (ip) onmiddellijk voorafgaand aan zelfstimulatiesessies (gratis toegang tot laser gedurende 45 minuten, Figuur 2EEN). Bij de basislijn drukten goed getrainde dieren ongeveer 400 keer om 85 LS te verkrijgen in 45 minuten volgens het FR3-schema. Na cocaïne-injectie nam de prestatie significant af op een dosisafhankelijke manier tot ongeveer 30 LS voor 100 hendeldrukken met de hoogste dosis (Figuur 2B). Deze occlusie was het meest uitgesproken tijdens de eerste 30 minuten van de sessie en weerspiegelt de farmacokinetiek van het medicijn (Figuur 2C). Dit experiment geeft aan dat versterking door optogenetische zelfstimulatie en versterking door cocaïne onderliggende neurale circuits delen.

Om optogenetische zelfstimulatie verder te vergelijken met verslavende medicijnen, vroegen we vervolgens of muizen na enkele weken van terugtrekking terug zouden vallen op zelfstimulatie van VTA DA-neuronen. Omdat cue-geassocieerd zoeken naar geneesmiddelen een gevestigd model van terugval is (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), plaatsten we muizen 30 dagen na de laatste zelfhulpkamer terug in de operatiekamer. stimulatiesessie, waarbij het actief indrukken van de hendel nu het cue-lampje activeerde zonder laserstimulatie (Figuur 3EEN). Robuust cue-geassocieerd zoekgedrag, aangetoond door een hoge mate van actieve hendelpersen, was alleen duidelijk bij muizen met expressie van eYFP-ChR2 in VTA DA-neuronen (DAT-Cre + maar niet DAT-Cre− muizen, Figuur 3B).

Eerdere studies hebben het causale verband aangetoond tussen cue-geassocieerde terugval en synaptische plasticiteit opgewekt door cocaïne in een subtype van NAc-neuronen die de DA D1R tot expressie brengen (Pascoli, Terrier et al., 2014). Om deze synaptische plasticiteit te evalueren, hebben we daarom DAT-Cre-muizen gegenereerd die zijn gekruist met Drd1a-tdTomato muizen om het subtyp van middelgrote doornige neuronen (MSN's) in het NAc te identificeren. In plaats van de zoektest werden plakjes NAc bereid waar D1R-MSN's rood waren, in tegenstelling tot groene vezels van VTA DA-neuronen die waren geïnfecteerd met flox-ChR2-eYFP (Figuur 3C). Whole-cell patch-clamp-opnames ex vivo onthulden een gelijkrichtende stroomspanningsrelatie voor door AMPAR opgewekte postsynaptische stromen (AMPAR-EPSC's) en een verhoogde AMPAR / NMDAR-verhouding (Cijfers 3D en 3E), in de D1R-MSN's maar niet in de D2R-MSN's. Soortgelijke bevindingen die eerder werden verkregen na terugtrekking uit zelftoediening door cocaïne, bleken de gecombineerde insertie van GluA2-ontbrekende en GluA2-bevattende AMPAR's aan te duiden, bij afzonderlijke invoer op D1R-MSN's (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Zelfstimulatie ondanks straf

Het gebruik van middelen ondanks de negatieve gevolgen is een ander cruciaal kenmerk van verslaving (zie DSM5-definitie, American Psychiatric Association, 2013). Er zijn rattenmodellen opgesteld (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013) waarbij een elektrische schok geïntroduceerd in het zelftoedieningsschema van cocaïne cocaïne onderdrukt. consumptie bij sommige dieren. Na 12 dagen initiële blootstelling (acquisitie) mochten muizen drie extra sessies op FR3 hebben, maar met een verminderde sessie-cut-off (60 minuten of maximaal 40 beloningen). Deze drie sessies dienden als basislijn voor de volgende vier sessies, waarbij elke derde laserstimulatie gepaard ging met een voetschok (500 ms; 0.2 mA) voorspeld door een nieuwe cue (Figuur 4EEN). De intensiteit en duur van de voetschok werden aangepast om het indrukken van de hendel voor sucrose-beloning volledig te onderdrukken (zie ook onderstaande gegevens). Het strafschema leidde tot twee tegenovergestelde gedragsreacties (Figuur 4B). Sommige muizen stopten snel met reageren toen de straf werd geïntroduceerd ("gevoelig" genoemd), terwijl anderen bleven reageren om het maximale aantal laserstimulaties te verkrijgen en kunnen worden beschouwd als "resistent" tegen straf. De twee groepen dieren kwamen volledig tevoorschijn aan het einde van de vier strafsessies (Figuur 4C). "Resistente muizen" behielden het aantal laserstimulaties (minder dan 20% reductie) terwijl "gevoelige muizen" de zelfstimulering met meer dan 80% verminderden. Met deze criteria kon slechts één dier (grijze stippen) niet worden toegewezen. Deze waarneming toont aan dat geforceerde burst-activiteit opgewekt door zelfstimulatie van VTA DA-neuronen voldoende is om doorzetten van consumptie te induceren ondanks negatieve consequenties in een fractie van muizen. Als controle werd in een onafhankelijke groep muizen die resistentie of gevoeligheid voor de straf geassocieerd met zelfstimulering had vastgesteld, nociceptie geëvalueerd met behulp van de staartflitsassay. Er werd geen verschil gedetecteerd in de latency om de staart terug te trekken die was ondergedompeld in warm water tussen gevoelig en resistent (Figuur S3).

Vervolgens vroegen we, post hoc, of een bepaald kenmerk tijdens de acquisitiefase van zelfstimulatie de weerstand tegen straf kon voorspellen. Gevoelige en resistente muizen maakten een identiek aantal actieve en inactieve hendeltjepersen tijdens basislijnsessies, en alle muizen bereikten het maximum van 80 LS (Figuren S4A en S4B), in een vergelijkbare hoeveelheid tijd (Figuren S4A en S4C). Hoewel de fractie van de futiele actieve hefboompers in de twee subpopulaties opnieuw niet verschillend was (Cijfers 4D en S4D), het aantal nutteloze hefboompersen vóór het begin van de laserstimulatie werd significant hoger bij resistente muizen aan het einde van de acquisitiesessies (Cijfers 4E en S4E). Aangezien dit gedrag zich ontwikkelde tijdens acquisitie, kan het, samen met aangeboren impulsiviteit (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), bijdragen aan het vaststellen van de weerstand tegen straf. Bovendien werd op dag 11 een progressieve verhoudingsproef uitgevoerd om de motivatie voor de optogenetische stimulatie te kwantificeren (Richardson en Roberts, 1996). Resistente muizen vertoonden een breekpunt dat statistisch niet verschilde van gevoelige muizen (Figuur S4F).

Weerstand tegen Straf voor Cocaïne maar niet voor Sucrose

Om te testen of het consumptieparadigma, ondanks de schadelijke gevolgen en het indrukken van een impuls, ook de dwangmatige inname van een verslavend medicijn zou kunnen voorspellen, onderging een nieuw cohort muizen 12 dagen van zelftoediening door cocaïne. Experimentele parameters voor verwerving van zelftoediening door cocaïne werden ingesteld op maximaal 80 infusies van cocaïne binnen 4 uur tijdens acquisitie en tot 40 infusies binnen 2 uur tijdens de drie baseline-sessies voorafgaand aan de vier strafsessies (Cijfers 5A en S5EEN). Opnieuw kwamen er twee groepen tevoorschijn na het koppelen van cocaïnebeloningen met elektrische schokken. 5 uit 22-muizen werd inderdaad geclassificeerd als resistent (minder dan 20% afname ten opzichte van baseline), terwijl 17 zich kwalificeerde als gevoelig (meer dan 80% afname) en één dier daartussen viel (13-infusies op dag 19) (Figuur 5B). We hebben toen gezocht naar gedragsvoorspellers van weerstand tegen straf. Tussen de twee groepen waren het aantal infusies, de snelheid van infusie en het aantal actieve of inactieve hendelpersen niet verschillend (Figuren S5B-S5D), en de breekpunten waren vergelijkbaar (Figuur S5E). Wat verschilde was de evolutie van de verdeling in de tijd van de nutteloze persen op de actieve hefboom. In de eerste vier sessies namen futiele hendelpersen regelmatig af tijdens de time-outperioden in zowel resistente als gevoelige muizen, terwijl aan het einde van de acquisitie alleen gevoelige muizen dit gedrag vasthielden (Cijfers 5C en 5D en S5F). Daarentegen hadden resistente muizen de neiging hun totale aantal nutteloze hefboompersen te vergroten (Cijfers 5C en S5D), vooral in het laatste kwartaal van de time-outperiode (Figuur 5D). Hoewel kwalitatief vergelijkbaar met de eerder gemaakte observatie met de optogenetische stimulatie van DA-neuronen (zie hierboven), werd de clustering van de nutteloze persen tijdens de vroege time-outperiode niet gezien met cocaïne, hoogstwaarschijnlijk vanwege de langzamere kinetiek waarmee het medicijn verhoogde DA-niveaus. Desalniettemin kunnen soortgelijke conclusies worden getrokken op basis van deze unieke evolutie van de futiele distributie van de hefboompers in de korte periode voorafgaand aan "de interne detectie van de DA-stijging". Onze observaties suggereren dus dat de verdeling van de futiele actieve hefboompersen drugsgebruik voorspelt ondanks negatieve gevolgen.

Ten slotte herhaalden we het experiment met ad libitum-gevoede muizen die een sucrose-beloning konden gebruiken. Nadat de straf was geïntroduceerd, stopten alle muizen met het zelf toedienen van de sucrose (Figuur 5E), wat aantoont dat dit schema de inname van een niet-essentiële natuurlijke beloning onderdrukte, maar de detectie van een dwangmatige inname van een verslavend medicijn of sterke DA-neuronstimulatie mogelijk maakte.

Samengenomen tonen deze resultaten aan dat VTA DA zelfstimulering voldoende is om dwangmatigheid te induceren, zoals blijkt uit de weerstand tegen bestraffing in een subset van muizen (68%). Evenzo, na cocaïne SA, raakten sommige muizen resistent tegen straf (23%), wat nooit het geval was na sucrose SA (Figuur 5F).

Om het hersengebied te bepalen dat de beslissing om ondanks negatieve gevolgen door te gaan met zelftoediening te bepalen, hebben we eerst de generieke 'neuronale activiteit' gevolgd door het aantal neuronen te tellen waarin de strafsessie de expressie van het onmiddellijke vroege gen cFos in 15 veroorzaakte. verschillende regio's. Muizen werden 90 minuten na het einde van de laatste strafsessie intracardiaal geperfuseerd met PFA. De controlegroepen omvatten naïeve dieren, evenals muizen die waren ingespannen tegen gevoelige of resistente muizen om het mogelijk verstorende effect van het aantal ontvangen schokken onder controle te houden.

Terwijl in de meeste van de gekozen regio's het aantal cFos-positieve neuronen het grootst was in plakjes van resistente muizen vergeleken met naïeve muizenplakken, kwamen er twee soorten reacties naar voren, waarvan de prelimbische cortex (PL) en de laterale OFC voorbeelden zijn. In de PL vonden we een vergelijkbare toename van cFos-positieve cellen in resistente muizen en hun jukcontroles, terwijl in de OFC deze toename alleen zichtbaar was in de resistente en niet in de overeenkomstige jukmuizen (Cijfers 6A en 6B). Om dit verschil te kwantificeren, werden alle gegevens eerst genormaliseerd naar expressieniveaus in naïeve dieren. Vervolgens werd de verhouding berekend tussen de resistente overgevoelige gedeeld door de gespannen tot resistente over ingespannen naar gevoelige (Ratio_cfos = (R / S) / (YR / YS), Figuur 6B). Deze procedure identificeerde de cingulaire cortex, de OFC en VTA als de regio's die worden geactiveerd in resistente maar niet in gevoelige muizen en waar er weinig verschil was tussen beide groepen van gejukte controles (in feite vergelijkbare lage cFos-positieve neuronen in juk) . Het vinden van de VTA is niet verrassend, aangezien het het gebied is van door laser gestimuleerde neuronen. Dit is in lijn met een eerder rapport dat aantoont dat ChR2-stimulatie cFos-activering triggert (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Een lage verhouding_cfos werd gevonden in regio's waar de activering vergelijkbaar was in gevoelig en resistent (zoals CeA en PAG). De ratio_cfos was ook laag toen de activering parallel liep met een groot verschil in de jukbesturing (zoals de PL, Figuur 6C voor samengevatte verhouding_cfos gegevens). Een vergelijkbare cFos-expressie in resistente en jukbestendige muizen werd daarom waarschijnlijk veroorzaakt door het aantal voetschokken en had weinig te maken met de weerstand tegen bestraffing. Alles bij elkaar genomen, de hoge ratio_cfos in de OFC suggereert dat neurale activiteit in deze regio wordt geassocieerd met weerstand tegen straf en kan dus de overgang naar verslaving bevorderen.

Om het substraat van de verhoogde neuronale activiteit in de OFC bij de muizen die straf weerstaan ​​te identificeren, hebben we 24 uur na de laatste strafsessie plakjes van de PL en L-OFC voorbereid om te testen op intrinsieke prikkelbaarheid. De twee regio's werden gekozen vanwege hun zeer verschillende patroon van c-Fos-expressie in de vorige experimenten. De neuronale prikkelbaarheid werd gekwantificeerd door het aantal actiepotentialen (AP's) te tellen dat werd opgewekt door de injectie van toenemende hoeveelheden stroom (van 0 tot 600 pA) in opnames van hele cellen. Deze opnames onthulden een aanhoudende hypo-prikkelbaarheid in piramidale neuronen van de PL van resistente muizen (en hun jukcontrole) in vergelijking met gevoelige of naïeve muizen (Figuur 7EEN). De rustmembraanpotentiaal (RMP) van opgenomen neuronen was niet verschillend tussen de experimentele groepen (Figuur 7B). Deze resultaten suggereren sterk dat de prikkelbaarheid van neuronen in de PL direct correleert met het aantal ontvangen schokken en misschien niet met de beslissing om straf te weerstaan. Dit weerspiegelt hoogstwaarschijnlijk een negatieve feedbackaanpassing veroorzaakt door neuronale excitatie veroorzaakt door de voetschokken een dag eerder. Daarentegen waren neuronen van L-OFC meer exciteerbaar alleen in resistente muizen. De exciteerbaarheid van neuronen van jukmuizen was niet anders dan de prikkelbaarheid van neuronen van naïeve muizen, waardoor een effect van de voetschok zelf uitgesloten werd (Cijfers 7C en 7D). Deze verhoogde activiteit van OFC-neuronen ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de cFos-uitdrukking en kan het verzet tegen straf bestendigen.

Om te testen op causaliteit tussen verhoogde OFC-neuronprikkelbaarheid en weerstand tegen straf, hebben we de remmende DREADD (designerreceptoren die exclusief worden geactiveerd door designer-medicijnen: CamKIIα-hM4D) uitgedrukt in piramidale neuronen van de OFC van DAT-Cre + -muizen (Figuur 8EEN). In acute plakjes van de OFC induceerde badtoepassing van CNO (clozapine-N-oxide) een langzame uitgaande stroom, hoogstwaarschijnlijk gemedieerd door GIRK-kanalen, die werd omgekeerd door barium (Ba²⁺), een niet-specifieke blokker van kaliumkanalen (Figuur 8B). De CNO heeft ook de invoer / uitvoercurve naar rechts verschoven (Figuur 8C). De DAT-Cre + -muizen besmet met AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry in de OFC (Figuur 8D) verworven DA-neuron-zelfstimulatie-paradigma gevolgd door twee opeenvolgende blokken met het strafschema, de eerste in aanwezigheid van CNO en de tweede zonder CNO. De twee blokken werden onderbroken door 6 dagen zonder straf (Figuur 8E). Aan het einde van het eerste strafblok, in de aanwezigheid van CNO, waren alleen 5 van 16-muizen resistent (Figuur 8F, linkerpaneel). In tegenstelling, zonder OFC-remming, tijdens de tweede strafperiode, 14 uit 16 werden geclassificeerd als "resistent" (Cijfers 8F, rechterpaneel en 8G). Met andere woorden, de fractie resistente muizen was significant lager in de aanwezigheid van CNO in vergelijking met het eerste cohort van 34-muizen dat eerder onder dezelfde omstandigheden werd getest (vergelijking tussen de groepen, Figuur 8H) en werd vergelijkbaar met het eerste cohort zonder CNO (vergelijking binnen de groep). Ten slotte heeft CNO voor de negen muizen die van gevoelig naar resistent veranderden de staartflitslatentie bij onderdompeling in warm water niet gewijzigd (Figuur 8IK).

Alles bij elkaar laat dit experiment zien dat de activiteit van piramidale neuronen van het OFC de beslissing om door te gaan met zelfstimulering drijft, ondanks negatieve gevolgen die een belangrijk kenmerk van de overgang naar verslaving bij knaagdieren vertegenwoordigt.

Discussie 

Een recent voorgesteld verslavingsmodel onderscheidt drie stappen in de progressie van de ziekte: sporadisch recreatief drugsgebruik, gevolgd door intensiever, aanhoudend, escalerend drugsgebruik en uiteindelijk dwangmatig gebruik geassocieerd met controleverlies (Piazza en Deroche-Gamonet, 2013; maar zie George et al., 2014). Onze studie toont aan dat stimulatie van VTA DA-neuronen voldoende is om deze progressie met een relatief snel tijdsverloop te stimuleren.

Door een natuurlijk voorkomend burst-firing-patroon na te bootsen, wordt een efficiënte afgifte van DA opgeroepen in doelgebieden van de VTA, zoals het NAc (Bass et al., 2010). DA-niveaus in het NAc bepalen daarom waarschijnlijk de zelfstimulatie, net zoals knaagdieren zelf de volgende infusie van cocaïne of heroïne toedienen zodra de DA-concentratie onder de drempel daalt (Wise et al., 1995). Dit wordt ook ondersteund door onze waarneming dat cocaïne, geïnjecteerd ip, zelfstimulatie kan blokkeren. Zelfstimulatie van DA-neuronen lijkt dus sterk op zelftoediening door geneesmiddelen, hoewel de kinetiek ervan zeker sneller is dan welke farmacologische stof ook, inclusief cocaïne, zoals gesuggereerd door de verschillende reactiesnelheid die in de huidige studie wordt waargenomen.

Hoewel we ons selectief richtten op DA-neuronen van de VTA, heeft hun optogenetische zelfstimulatie mogelijk geactiveerde groepen cellen met verschillende fysiologische functies. Onlangs is bijvoorbeeld gesuggereerd dat sommige DA-neuronen coderen voor aversieve stimuli (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Deze cellen projecteren naar mPFC, terwijl VTA DA-neuronen die projecteren naar laterale NAc-schaal positieve versterking mediëren (Lammel et al., 2012). Het zou interessant zijn om zelfstimulatie en progressie te beoordelen met selectieve targeting (Gunaydin et al., 2014). Omdat onze manipulatie alle VTA DA-neuronen activeerde, net zoals cocaïne inwerkt op alle DAT-expresserende neuronen, is het denkbaar dat sommige DA-neuronen het leren van bekrachtiging stimuleren, terwijl andere DA-neuronen aversieleren stimuleren. Het netto-effect zou nog steeds een versterking van het gedrag zijn; de "aversie-neuronen" zouden echter kunnen bijdragen aan de inductie van een tegenstanderproces (Koob, 2013, Wise en Koob, 2014).

Na gedwongen onthouding veroorzaakte herblootstelling aan de context het zoeken naar zelfstimulatie, een gevestigd knaagdiermodel van terugval van drugs. Opmerkelijk is dat de onderliggende neurale plasticiteit niet te onderscheiden is van degene die wordt waargenomen na terugtrekking uit zelftoediening door cocaïne (Pascoli, Terrier et al., 2014). Dit draagt ​​bij aan een onderzoek dat eerder identieke synaptische plasticiteit in VTA DA-neuronen rapporteerde, opgewekt door een enkele sessie van optische stimulatie of een eerste injectie van een verslavend medicijn (Brown et al., 2010). Een patroon van synaptische aanpassingen komt naar voren dat c adaptief gedrag dat alle verslavende medicijnen gemeen hebben.

Een opvallend kenmerk van onze studie is de tweedeling in de reactie op een aversieve stimulus die sterk genoeg is om de consumptie van niet-essentiële natuurlijke beloning bij alle dieren te verstoren. In onze setting vertoonden resistente muizen geen significant hogere motivatie voor de zelfbezorging van de beloning, wat in contrast staat met een onderzoek met cocaïne bij ratten (Pelloux et al., 2007). De gedragsvoorspeller voor weerstand tegen straf bij muizen was echter een nutteloze hefboomwerking gedurende de 5 seconden voorafgaand aan het begin van de DA-neuronstimulatie. Het onvermogen om te wachten tot de beloning wordt afgeleverd, kan daarom worden gezien als een marker van impulsiviteit (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton en Vezina, 2014). We waren geïntrigeerd door de waarneming dat impulsief nemen pas ontstond na verschillende sessies van zelfstimulatie. Dit verhoogt de mogelijkheid dat weerstand tegen straf (en bij uitbreiding kwetsbaarheid voor verslaving) misschien niet volledig aangeboren is, maar zich ontwikkelt tijdens de eerste fasen van verslaving. Als dit het geval is, wordt de tweedeling die door ons en anderen wordt waargenomen (Deroche-Gamonet et al., 2004) mogelijk niet alleen bepaald door genetische factoren. Dit zou ook verklaren dat een vergelijkbare fractie van individuen verslaafd raakt aan genetisch relatief homogene muizenstammen en genetisch zeker meer diverse menselijke populaties.

Als weerstand tegen bestraffing de individuele kwetsbaarheid voor verslaving onthult, naar schatting 20% ​​bij mensen, zelfs met cocaïne (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), dan is het veel hogere percentage dat hier wordt gevonden. zou de kracht van de directe en selectieve DA-neuronstimulatie kunnen weerspiegelen. Met andere woorden, selectieve DA-neuronstimulatie kan veel verslavend zijn dan welk medicijn dan ook. Dit kan worden verklaard door de niet-selectieve werking van farmacologische stoffen. In het geval van cocaïne kunnen andere monoaminen dan DA bijvoorbeeld de inductie van verslaving vertragen. Serotonine kan inderdaad DA-afhankelijk adaptief gedrag tegengaan, zoals reageren op geconditioneerde beloning, zelfstimulatie en geconditioneerde plaatsvoorkeur (Wang et al., 1995; Fletcher en Korth, 1999; Fletcher et al., 2002) door de associatie te vergemakkelijken van signalen voor aversieve stimuli (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Als alternatief kan het verschil liggen in het verschil in kinetiek tussen optogenetische zelfstimulatie en farmacologische inductie van extracellulaire DA-toename. Een dergelijke variatie in verslavende potentie kan ook bestaan ​​tussen verschillende soorten misbruik (George et al., 2014).

Hoewel we formeel verschillen in DA-afgifte en / of relatieve signalering niet formeel kunnen uitsluiten om een ​​bijdrage te leveren aan het vaststellen van strafresistentie, is dit scenario onwaarschijnlijk omdat de histologische validatie van de infectie van dieren die in het onderzoek waren opgenomen, toonde eYFP-ChR2 expressie in de gehele VTA. Bovendien leidde het optogenetische stimulatieprotocol dat ontworpen was om de DA-afgifte te verzadigen tot zelfstimulering die culmineerde in unimodaal verdeelde waarden voor het breekpunt, wat de stimulerende motivatie weerspiegelt.

Een ander verrassend resultaat is dat het aantal elektrische voetschokken correleerde met de prikkelbaarheid van de neuronen in de PL. Verminderde prikkelbaarheid van piramidale neuronen en verhoogde AMPAR / NMDAR-ratio in piramidale neuronen van dezelfde cellen is waargenomen bij 'verslaafde ratten', maar deze onderzoeken controleerden niet op het effect van elektrische schokken als zodanig (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). De non-dissociatie kan daarom worden verklaard door de dubbele rol van de mPFC in zowel besluitvormingsprocessen als angstintegratie (Peters et al., 2009). Omgekeerd correleert verandering in prikkelbaarheid van piramidale neuronen in de infralimbische cortex met voetschokken (Santini et al., 2008). Dit bewijs sluit de mogelijkheid niet uit dat mPFC een prominente rol speelt bij de beslissing tot intakegesprek. Onze cFos-analyse en observaties van intrinsieke prikkelbaarheid wijzen echter op de OFC en cingulaire cortex. Bovendien verhinderde remming van neuronale prikkelbaarheid in de OFC met DREADD weerstand tegen straf. Dit oorzakelijk verband vertegenwoordigt een belangrijke stap in het begrijpen van de cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de overgang naar verslaving. Toekomstige studies zullen nodig zijn om te testen of dit ook geldt voor het hele scala aan verslavende middelen.

Onze bevindingen zijn in overeenstemming met waarnemingen dat een disfunctie van de OFC de besluitvorming over kosten en baten nadelig kan beïnvloeden (Seo en Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) en kan leiden tot dwangmatig gedrag (Burguière et al., 2013) ). Bij mensen is drugsmisbruik in verband gebracht met een verminderde besluitvorming en een veranderde OFC-functie (Lucantonio et al., 2012; Gowin et al., 2013). Alles bij elkaar genomen komt de activiteit van OFC-neuronen naar voren als een belangrijke bepalende factor voor de overgang naar dwangmatig drugsgebruik (Everitt et al., 2007). Dit sluit niet uit dat er een rol is weggelegd voor door drugs opgewekte plasticiteit bij prikkelende afferenten op MSN's die hier en in andere onderzoeken worden waargenomen (Kasanetz et al., 2010). Het zal interessant zijn om te evalueren of manipulaties gericht op het beheersen van de prikkelbaarheid van de OFC de motivatie bij verslaafden beïnvloeden.

Hier stellen we zelfstimulatie van DA-neuronen voor als een krachtig model om de stadia die tot verslaving leiden te bestuderen. We reproduceren kerncomponenten van drugsverslaving, zoals terugval, synaptische plasticiteit en volharding van consumptie ondanks de negatieve gevolgen. Hoewel het model zeker niet geschikt is om effecten te bestuderen die specifiek zijn voor een bepaald medicijn (bijv. Vergelijk opioïden met psychostimulantia), heeft het verschillende voordelen. Het zorgt voor een precieze temporele controle van de beloning, het activeert heel specifiek alleen de VTA DA-neuronen, en last but not least geeft het de mogelijkheid om muizen veel langer te bestuderen dan bij zelftoediening door medicijnen. Door te focussen op de bepalende gemeenschappelijkheid van verslavende drugs, hopen we de neurale mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan ook niet-substantie-afhankelijke vormen van verslaving (Alavi et al., 2012; Robbins en Clark, 2015) en zo bij te dragen aan een algemene theorie van de ziekte. Optogenetische ziektemodellen laten dus een beslissende stap toe voor een grondig begrip van de neuronale disfunctie die betrokken is bij late stadia van verslaving en zullen nieuwe, rationele behandelingen begeleiden voor een ziekte die momenteel niet te genezen is.

VP, JT en AH voerden de gedragsexperimenten uit, terwijl VP de elektrofysiologische opnames deed en de analyse coördineerde. Het onderzoek is ontworpen en geschreven door alle auteurs.

Het werk werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Foundation en de ERC advanced grant (MeSSI), Carigest SA, de Academic Society of Geneva en de Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT is een MD-PhD student betaald door de Zwitserse Bondsstaat.

Document S1. Aanvullende experimentele procedures en afbeeldingen S1-S6

Tabel S1. Statistische analyse