PLoS One. 2010; 5(10): e15401.
Abstract
Het voltooien van patronen, de mogelijkheid om volledige geheugens op te halen, geïnitieerd door gedeeltelijke aanwijzingen, is een kritieke eigenschap van het geheugenproces. Er is echter weinig bekend over de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces. Om de rol van dopamine in geheugen recall te bestuderen, hebben we dopamine transporter heterozygote knock-out muizen (DAT+/-), en ontdekten dat hoewel deze muizen normale leer-, consolidatie- en geheugenherinnering bezitten onder volledige cue-omstandigheden, ze specifieke tekortkomingen vertonen in patroonvoltooiing onder gedeeltelijke cue-conditie. Deze vorm van geheugenherinneringstekort bij de heterozygote knockout-muizen met dopaminetransporter kan worden teruggedraaid door een lage dosis van de dopamine-antagonist haloperidol, wat verder bevestigt dat het onvermogen om geheugenpatronen op te halen het gevolg is van dopamine-onbalans. Daarom laten onze resultaten zien dat een delicate controle van het dopamineniveau in de hersenen van cruciaal belang is voor het voltooien van het patroon tijdens het herinneren van het associatieve geheugen.
Introductie
Geheugenoproep omvat een samenvatting van eerder verkregen informatie [1], [2]. Afhankelijk van de toestand van de herinneringsomstandigheden kan het ophalen van herinneringen plaatsvinden met de meeste of alle eerder aangetroffen signalen die verband houden met leren (bijvoorbeeld iemand zien en tegelijkertijd zijn stem horen, of iemands geboorteplaats opnieuw bezoeken die niet veel is veranderd, enz.). Aan de andere kant vindt het ophalen van herinneringen in veel gevallen meestal plaats als er slechts subsets van initiële aanwijzingen aanwezig zijn (bijvoorbeeld bij het reconstrueren van de oude plattegronden van iemands woonplaats terwijl slechts een paar oude oriëntatiepunten onveranderd bleven). Dit staat bekend als patroonvoltooiing, waarbij de hersenen volledige geheugenpatronen reconstrueren en ophalen uit gedeeltelijke externe signalen of zelf geïnitieerde interne processen. Momenteel is er weinig bekend over de feitelijke moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de patroonvoltooiing van geheugenherinnering. Opkomende onderzoeken geven echter aan dat monoaminesignalering een rol kan spelen bij het ophalen van herinneringen [3].
In deze studie hebben we onderzocht hoe de modulerende neurotransmitter dopamine een rol speelt bij het reguleren van het voltooien van geheugenpatronen tijdens gedeeltelijke cue recall. Dopamine is een belangrijke neurotransmitter die cognitie, emotie en beweging kan beïnvloeden. Abnormale dopaminerge overdracht is in verband gebracht met een aantal psychiatrische en neurologische aandoeningen, waaronder aandachtstekort en hyperactiviteitsstoornis (ADHD), schizofrenie en de ziekte van Parkinson [4]-[8]. Hoewel dopaminergische neuronen alleen afkomstig zijn van het ventrale tegmentale gebied en substantia nigra compacta, projecteren hun outputs bijna overal in de hersenen, inclusief de prefrontale cortex, mediale temporale kwab en hippocampus, regio's waarvan bekend is dat ze worden geactiveerd tijdens geheugen retrieval [3], [9]-[14].
Er moet ook worden opgemerkt dat dopamine functioneel gezien cruciaal was voor aandacht en werkgeheugen, gemedieerd door bovenstaande hersengebieden [15]-[18], die beide werden geïmpliceerd in het proces van ophalen van geheugen onder gedeeltelijke cue-omstandigheden [19]. Als het primaire cellulaire mechanisme om dopamine-signalering te beëindigen, heropent de dopaminetransporter (DAT), gelokaliseerd op de neuronale presynaptische terminals, dopamine van de synaptische spleet terug in de dopaminerge neuronen. Als zodanig is DAT een kritisch molecuul bij het reguleren van synaptische niveaus van dopamine, en dientengevolge het bepalen van de temporele duur van dopaminewerkingen op de lokale neurale circuits. Inderdaad resulteert genetische knock-out van het dopaminetransporter-gen in ernstige beperkingen. De homozygote DAT-KO-muizen hebben te maken met duidelijke abnormaliteiten, waaronder groeiachterstand, sterke locomotorische hyperactiviteit en vele andere stoornissen, waaronder gebreken in gewenning en sociale interactie evenals verminderde darmmotiliteit, ademhalingscontrole, enz. [6], [20], [21]. De algehele defecten bij de homozygote DAT-KO-muizen hebben het minder geschikt gemaakt om de rol van dopamine bij het reguleren van geheugenprocessen te onderzoeken.
Interessant is dat de heterozygote knockout-muizen (DAT+/- muizen), die nog steeds een allel van het functionele DAT-gen bezitten, lijken vrij normaal te zijn in hun algehele grove gedrag [6], [20], [21]. Dus de DAT+/- muizen kunnen een waardevol model vormen voor het bestuderen van enkele van de delicate, maar belangrijke fenotypes, zoals associatieve geheugenprocessen, en gerelateerde mechanismen die worden gereguleerd door dopaminerge schakelingen. Hier hebben we een aantal gedragsparadigma's gebruikt om de functionele gevolgen van dopamine-onbalans op het voltooien van patronen tijdens associatieve geheugenoproep te beoordelen.
Resultaten
Om de rol van dopamine bij het ophalen van het geheugen te onderzoeken, gebruikten we de heterozygote dopamine transporter knock-out muizen (DAT+/-). We hebben een reeks fundamentele gedragsmetingen gebruikt om hun bewegingsactiviteit in het open veld te beoordelen (Figuur 1A), rotarod-optredens (Figuur 1B en 1C), en ontdekte dat deze heterozygote knock-outmuizen volkomen normaal zijn. We hebben ook bevestigd dat de DAT+/- muizen vertonen niet te onderscheiden prestaties op het gebied van angst, zoals gemeten door het verhoogde plus-doolhof (Figuur 1D).
Daarnaast hebben we de basisleer- en geheugenfuncties in de DAT beoordeeld+/- muizen. Ten eerste hebben we de nieuwe objectherkenningstest gebruikt en waargenomen dat deze muizen volledig normale gedragsprestaties vertoonden in de retentietests van één dag in vergelijking met hun wildtype nestgenootcontrole (Figuur 1E). Bovendien vertonen deze muizen ook een normale, door angst geconditioneerde retentie van één dag die niet te onderscheiden is van hun wildtype controlemuizen (Figuur 1F). Daarom suggereren deze resultaten dat de DAT+/- muizen hebben een normale leer- en geheugenfunctie bij deze twee vormen van tests van het primaire geheugen.
De ruimtelijke referentiegeheugentest werd eerder gebruikt om de voltooiing van het patroon van geheugenoproep te beoordelen. We hebben de DAT onderworpen+/- muizen en wildtype controles voor deze taak. Met behulp van het ruimtelijke referentiegeheugenprotocol dat eerder werd beschreven [22]hebben we deze muizen getraind in het waterdoolhof met verborgen platforms. De training bestond uit vier pogingen per dag, met een tussenpoos van een uur. We ontdekten dat zowel de DAT+/- muizen en de wildtype muizen vertoonden vergelijkbare leer- en geheugenconsolidatie in de loop van sessies van 10 dagen en met vergelijkbare zwemsnelheden (Figuur 2A en 2B).
Vervolgens onderzochten we hun herinneringen aan de locatie van het verborgen platform door de sondetest (P1) te gebruiken op dag 11, één dag na de voltooiing van de laatste trainingssessie. Zoals gemeten door de bezetting van het kwadrant, zijn beide DAT+/- muizen en hun controle-nestgenoten konden hun zoektocht concentreren in het doelkwadrant in de aanwezigheid van volledige signalen (Figuur 3A). Bovendien DAT+/- muizen vertoonden ook een sterke voorkeur in het fantoomplatformgebied, en er was geen verschil in vergelijking met de platformbezetting van de controles (Figuur 3B). Bovendien zijn, zoals verwacht, zowel DAT+/- muizen en de wildtype nestgenoten vertoonden een significante toename in het aantal kruisingen (Figuur 3C). Al deze metingen suggereren dus dat DAT+/- muizen kunnen deze taak normaal leren en dit associatieve geheugen normaal terughalen onder volledige omstandigheden.
Om te bepalen of de delicate balans van dopamine essentieel is voor het voltooien van het patroon onder partiële cue-omstandigheden, hebben we de tweede sondetest (P2) de volgende dag uitgevoerd door drie van de vier distale signalen (dag 12) te verwijderen. Om elke mogelijke uitdoving van de vorige recall-sessie te voorkomen, werd nog een blok (4-trials) van de training 1 uur na de P1-sondetest afgeleverd. Tijdens deze proef met partiele cuesonde, terwijl de controlemuizen hun zoektijd in het doelkwadrant bleven concentreren in plaats van de andere kwadranten, bleef de DAT-tijd+/- muizen vertoonden alleen prestaties op kansniveau, gemeten aan de hand van de bezetting van het doelkwadrant (Figuur 3D). Bovendien bevestigde de meting van de bezetting van de fantoomplatformgebieden verder dat deze DAT+/- muizen waren slecht in het onthouden van de platformlocatie (Figuur 3E). Dit terughaaltekort kwam ook tot uiting in het uitblijven van een toename van het aantal perronovergangen (Figuur 3F), terwijl de wildtype nestgenoten volledig in staat waren om gedeeltelijke geheugenherinneringen uit te voeren. Daarom suggereren deze gegevens dat de DAT+/- muizen hebben een tekort aan het ophalen van ruimtelijke referentiegeheugens onder gedeeltelijke cue-omstandigheden.
Ten slotte vroegen we of we de patroonaanvulling in deze DAT konden herstellen+/- muizen met behulp van farmacologische methoden. Er is gemeld dat een lage dosis van de dopamine-antagonist, haloperidol, nuttig zou kunnen zijn bij het verlichten van bepaalde dopaminestoornissen [20]. De reden is dat de lage dosis haloperidol het effect van het verhoogde dopamine in de heterozygote muizen enigszins kan temperen, die onvoldoende heropname van dopamine hebben vanwege het verlies van één allel van het normale dopaminetransporter-gen. We hebben dezelfde reeks muizen op het reddings-experiment toegepast. Op dag 13 en dag 14 onderwierpen we de bovenstaande muizen aan de derde probe-proef (P3) onder volledige cue-omstandigheden en de vierde probe-proef (P4) onder gedeeltelijke cue-omstandigheden. Nogmaals, om elke extinctie tegen te gaan die mogelijk is opgetreden tijdens de probeproef, hebben we nog een blok (4-proeven) uitgevoerd om 1 uur na voltooiing van een P2- of P3-sondetest te trainen. Onze metingen van doelkwadrantbezetting op de P3-sondetest tonen aan dat zowel de DAT+/- muizen en de controle nestgenoten geconcentreerd hun zoektocht in het doelkwadrant in de aanwezigheid van volledige signalen (Figuur 4A). Bovendien werd hun normale geheugenherinnering opnieuw bewezen door de meting van platformbezetting (Figuur 4B) alsmede het aantal oversteken per platform (Figuur 4C). Deze mutante muizen waren dus volledig in staat om ruimtelijk geheugen op te halen onder volwaardige omstandigheden.
Op de dag 14 verwijderden we drie van de vier distale signalen en voerden de vierde probeproeven (P4) uit onder de gedeeltelijke cuepvoorwaarde. We hebben de DAT geïnjecteerd+/- muizen intraperitoneaal met een lage dosis haloperidol (0.002 mg / kg lichaamsgewicht) 30 minuten voor de retentietests. De wildtype nestgenoten kregen een zoutoplossing als een controle toegediend. We ontdekten dat de DAT+/- muizen concentreerden hun zoektijd in het doelkwadrant en vertoonden statistisch vergelijkbare prestaties in vergelijking met de wildtype tegenhangers (Figuur 4E). Ook de meting van de bezetting van de fantoomplatformgebieden bevestigde verder dat deze DAT+/- muizen kunnen de platformlocatie oproepen (Figuur 4F). Hun normale geheugenherinnering werd opnieuw bevestigd door een toename van het aantal platformkruisingen, dat zich op hetzelfde niveau bevond als dat van de wildtype muizen (Figuur 4G). Aldus suggereren deze experimenten dat patroonafrondingsgebreken die oorspronkelijk werden waargenomen in de DAT+/- muizen kunnen worden veroorzaakt door de dopamine-onbalans.
Om de mogelijkheid uit te sluiten dat de resultaten voor het fenotype geïnjecteerd met haloperidol in de P4-probe-proef te wijten waren aan overtraining tijdens de herhaalde sondetests, hebben we een andere set DAT gebruikt+/- en besturen nestgenoten en herhaalden het hele experiment. Zoals verwacht, zowel DAT+/- muizen en hun wildtype muizen vertoonden goede leerresultaten in de loop van de 10 dagtrainingen (Figuur 5A). Op dag 11 onderwierpen we deze muizen aan full-cue recall-tests, er is geen significant verschil in testresultaten van geheugenretentie tussen de DAT+/- muizen en de controle nestgenoten zoals gemeten door bezetting in kwadranten (Figuur 5B), doelkwadrantbezetting (Figuur 5C), en het aantal platformovergangen (Figuur 5D). Een uur na de voltooiing van de full-cue probe-test, hebben we deze muizen opnieuw geschoold met nog een blok training om een extinctie-effect te voorkomen. Op dag 12 werden deze muizen onderworpen aan de partial-cue recall-tests. Een lage dosis haloperidol (of zoutoplossing) voor de controles werd intraperitoneaal geïnjecteerd in de muizen 30 minuten voorafgaand aan de gedeeltelijke cueproef. We hebben ontdekt dat deze behandeling inderdaad heeft geresulteerd in de normale prestaties in de mutante muizen. De mutante en controlemuizen vertoonden vergelijkbare prestaties in kwadrantbezetting (Figuur 5E), doelkwadrantbezetting (Figuur 5F), en het aantal platformovergangen (Figuur 5G). De meting van hun zwemsnelheden bracht ook geen verschillen aan het licht (Figuur 5H). Daarom hebben deze gegevens duidelijk aangetoond dat de geredde partial-cue retrieval deficit in de DAT+/- muizen door haloperidol was niet het gevolg van herhaalde overtraining tijdens proeven met meerdere sondes.
Discussie
Hoewel het dopamine-systeem bekend staat als cruciaal voor de regulatie van veel cognitieve processen [8], [16]-[18], [23]-[25]Onze huidige studie levert voor het eerst bewijs dat dopamine-onbalans, als gevolg van het verlies van één allel van het normale dopaminetransportergen, een specifiek tekort veroorzaakte in de patroonvoltooiing tijdens het herinneren van associatief ruimtelijk geheugen. Dit geheugen recall-tekort is alleen duidelijk onder de gedeeltelijk-ruimtelijke cue-omstandigheden, maar niet onder de volledige cue-omstandigheden. Bovendien lijkt dit geheugenherinneringstekort een zeer specifieke vorm van geheugenstoornis te weerspiegelen, omdat brede aspecten van basisgedrag (open veld voortbeweging, rotarod en angst) en andere vormen van geheugen zoals contextuele angstconditionering en nieuwe objectherkenning normaal blijven.
Er zijn verschillende potentiële moleculen en cellulaire scenario's die gezamenlijk kunnen bijdragen aan het waargenomen spatiële gedeeltelijke cue-geactiveerde recall-tekort, waarvan aangenomen wordt dat dopamine een belangrijk kandidaat-molecuul is dat ten grondslag ligt aan dit geheugenproces. Dit komt omdat aandacht en werkgeheugen, voornamelijk gecontroleerd door dopamine signalen, zijn naar verluidt van cruciaal belang voor het ophalen van ruimtelijke herinneringen [15]-[18], [26]. Het is bekend dat dopaminerge neuronen, die alleen afkomstig zijn uit het ventrale tegmentale gebied en substantia nigra compacta, naar bijna overal in de hersenen projecteren, inclusief de prefrontale cortex, de mediale temporale kwab en de hippocampus. [5], [19], [27]-[28], regio's waarvan bekend is dat ze worden geactiveerd tijdens het ophalen van herinneringen en tijdens aandachtsprocessen [3], [9]-[14], [29], [30]. Gezien het brede bewijs dat dopamine essentieel is voor aandacht en werkgeheugen [15]-[18] en dat men denkt dat het genetische polymorfisme in het DAT-gen betrokken is bij ADHD [31]-[33]is het mogelijk dat zowel aandacht als werkgeheugen een rol kunnen spelen bij het voltooien van het patroon van het ophalen van herinneringen onder de gedeeltelijke cue-omstandigheden door middel van DAT-gemedieerde dopamineregulatie. De tekorten aan voltooiing van het geheugenpatroon die worden waargenomen bij de heterozygote mutante DAT-muizen kunnen dus te wijten zijn aan het onvermogen van de muis om te voldoen aan de verhoogde aandachtseisen tijdens gedeeltelijke, op signalen gebaseerde geheugenherinnering als gevolg van synaptische dopamine-verstoring.
Onze bevinding dat een verstoord dopamine-evenwicht resulteerde in een tekort aan geheugenherstel is ook interessant in het licht van de klinische dementie die wordt waargenomen bij Parkinson-patiënten. Deze patiënten lijken meestal het vermogen te behouden om nieuwe herinneringen te leren, te consolideren en op te slaan, maar zijn ernstig beperkt in het ophalen van herinneringen, vooral onder gedeeltelijke externe signalen of zelfgeïnitieerde herinneringen. [34], [35]. Dit tekort is vooral diepgaand wanneer er geen expliciete aanwijzingen waren [8], [23], [34]-[36], wat verder aangeeft dat dopamine mogelijk betrokken is bij het geheugenherinneringsproces. Deze soorten geheugenstoornissen bij Parkinson-patiënten staan in schril contrast met de geheugenstoornissen in andere neurotransmittersystemen [37] of de vroege dementie bij Alzheimerpatiënten die doorgaans slecht zijn in het leren en consolideren van nieuwe herinneringen, terwijl het vermogen om oude herinneringen op te roepen behouden blijft [34], [35]. Dit illustreert de noodzaak om verschillende therapeutische strategieën te ontwikkelen vanwege de verschillende kwetsbaarheden voor verschillende moleculaire en temporele processen in geheugencircuits.
Onze demonstratie dat patroonopvolging volledig kan worden gered door injectie van haloperiodol op het moment van recall, versterkt het idee over de rol van gebalanceerde dopaminegehalten bij het ophalen van geheugen. Dit farmacologische reddingsexperiment levert aanvullend bewijs voor de temporele specificiteit die het partiële cue-gebaseerde recall-tekort veroorzaakt. Opgemerkt moet worden dat dopamine-disfuncties in DAT+/- muizen en bij Parkinson-patiënten verschillen behoorlijk van elkaar, maar beide leiden tot tekorten bij het terughalen van patronen. Deze gemeenschappelijkheid ondersteunt collectief het idee dat de delicate balans van het dopaminesysteem cruciaal is voor het ophalen van het geheugen, en onbalans in beide richtingen (omhoog of omlaag) zou tekortkomingen in de voltooiing van het geheugenpatroon veroorzaken tijdens het terugroepen. Belangrijk is dat we erop willen wijzen dat onze huidige analyse niet mag worden geïnterpreteerd als bewijs voor het gebruik van de DAT-mutante muizen als een model van de ziekte van Parkinson. Anderzijds, in vivo meting van dopamine in DAT-homozygote knockout-muizen toont een significante vermindering in dopamine-afgifte veroorzaakt door burst-stimulatie [38]-[40]. Dit geeft aan dat het vermogen om de neurale activiteit te vertalen in dopaminesignalen in de verschillende hersengebieden van knock-outmuizen mogelijk tekortschiet. Het is denkbaar dat verminderde veranderingen in de dopamineratio kunnen leiden tot veranderde fysiologische veranderingen in de schietpatronen binnen de neurale circuits die betrokken zijn bij geheugenverwerking. Momenteel is het niet bekend of de vergelijkbare verandering ook optreedt bij de heterozygote knock-outmuizen van DAT of bij patiënten met de ziekte van Parkinson.
Hoewel er weinig bekend is over de neurale circuits die geactiveerd worden tijdens het herinneren van het ruimtelijk geheugen, is het waarschijnlijk dat het meerdere regio's recrutert, inclusief de prefrontale cortex, de mediale cortex en de hippocampus. Dit past goed bij het anatomische bewijs dat de dopaminergische output van het ventrale tegmentale gebied zwaar uitsteekt naar het ventrale CA1-gebied en de entorhinale cortex[13], [28]. Deze prefrontale hippocampus-VTA-lus kan een cruciale rol spelen voor het genereren van contextuele vertrouwdheid, die op zijn beurt de voltooiing van het patroon bevordert tijdens gedeeltelijk op cues gebaseerd herinneren van ruimtelijk geheugen door het faciliteren van dopamine-gereguleerde aandacht [3], [14], [26], [28]. Het zal in toekomstige studies belangrijk zijn om de anatomische loci waaruit de waargenomen patroonafrondingstekorten voortkomen, verder te definiëren. Het zou vooral interessant zijn om kandidaat-plaatsen zoals de voorste cingulaire cortex, de temporale cortex en de hippocampus te onderzoeken met behulp van farmacologische, genetische en grootschalige in vivo opnametechnieken. [11], [41]-[44]. Het is ook belangrijk om te beoordelen of genetische compensatie of langzame veranderingen in de mutante hersenen bijdragen aan de waargenomen terugroeptekorten. Er zijn ook aanwijzingen dat andere neurotransmittersystemen ook een cruciale rol kunnen spelen bij de regulering van het ophalen van herinneringen [3], [37], [45], [46]en het zou zeer interessant zijn om hun dynamische interacties tussen de gedeeltelijke cue-getriggerde patroonaanvulling en de volledige cue-gebaseerde geheugenopname te onderzoeken en te vergelijken. Concluderend suggereert onze studie dat een delicaat evenwicht in dopamine niveaus cruciaal is voor het voltooien van patronen tijdens het associatief herinneren van ruimtelijk geheugen.
Materialen en methoden
Ethische verklaringen
Alle dieren die in het onderzoek zijn beschreven, zijn uitgevoerd volgens de NIH-richtlijnen en goedgekeurd door het Institutional IACUC-comité van Medical College of Georgia (goedkeuring AUP-nummer: BR07-11-001).
Productie en genotype van mutante muizen
De DAT-muizen waren een genereus geschenk van het laboratorium van Dr. XiaoXi Zhuang van de Universiteit van Chicago. Fokken en genotypering van DAT heterozygote knock-out muizen zijn hetzelfde als beschreven [6]. Voor onze experimenten werden zowel mannelijke als vrouwelijke muizen evenveel gebruikt in een verhouding van 1![[verhouding]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR voor DAT+/- muizen werd gevolgd door protocol zoals beschreven [6]. Alle muizen werden onder standaardomstandigheden (23.1 ° C, 50.5% vochtigheid) gehouden in de dierenfaciliteit van het Medical College of Georgia. Alle experimenten werden uitgevoerd in een geluiddichte en gespecialiseerde gedragskamer. Alle onderzoekers waren blind voor het genotype van het individuele dier.
Toekenning van herkenning door nieuwe objecten
Het experimentele protocol was hetzelfde als eerder beschreven [37], [47]. In het kort, muizen werden afzonderlijk gewend aan een doos met een open veld (20 20 x 10 hoge inch) gedurende 3-dagen. Tijdens de trainingssessies werden twee nieuwe objecten in het open veld geplaatst en het dier mocht verkennen voor 15 min. De tijd besteed aan het verkennen van elke objecten werd vastgelegd. Tijdens de recall-tests van één uur werd het dier teruggeplaatst in dezelfde doos, waarin een van de bekende objecten tijdens de training werd vervangen door een nieuw object en vrij kon worden geëxploreerd voor 15 min. Een voorkeurindex, een verhouding van de tijd besteed aan het verkennen van een van de twee objecten (trainingssessie) of de nieuwe (retentiesessie) over de totale tijd besteed aan het verkennen van beide objecten, werd gebruikt om het herkenningsgeheugen te meten.
Open veld- en rotastaaftests
De protocollen waren hetzelfde als beschreven [48]. Voor het meten van de activiteit in het open veld werden de muizen in een open veld geplaatst, gemaakt van een 14 × 14 inch zwarte doos. Het vak werd gemarkeerd door 2 × 2 inch kleine vierkante roosters (7-vierkantjes door 7-vierkantjes met 49-vierkanten in totaal). De open-veldactiviteit van dieren werd gemeten aan de hand van het aantal kruisjes dat de muizen binnen de 3-minutenperiode gepasseerd waren. Voor het meten van de Rota-staaftest werden de muizen geplaatst op een versnellende roterende houtstaaf. De staaf is 12 inch lang en 1 inch in diameter. De initiële rotatiesnelheid was 4 rpm en vervolgens gestaag versneld tot 40 rpm. De prestatie werd gemeten aan de hand van de hoeveelheid tijd (in seconden) dat muizen tijdens de vijf minuten of de recall-tests van één uur op de draaiende staaf bleven.
Verhoogde Plus Maze Tests
De protocollen waren hetzelfde als beschreven [49]. Het verhoogde plus-doolhof is gemaakt van roestvrij staal, dat matzwart is geverfd, en bestaat uit vier armen (twee open zonder muren en twee omsloten door 15.25 cm hoge wanden) 30 cm lang en 5 cm breed. Elke arm van het doolhof is zodanig bevestigd aan stevige metalen poten dat deze 40 cm boven de tafel waarop deze rust, is opgeheven. De activiteit werd vastgelegd met een digitale camera (Logitech-camera, modelnr. N231) die 130 cm boven het doolhof werd geplaatst. Het testen vond plaats onder zwak licht (één 40-W en één 60-W zachte witte gloeilamp, beide onder een hoek om indirecte verlichting op het doolhof te creëren) tijdens de lichte fase van de circadiane cyclus (tussen 0900 h en 1400 h). Het doolhof werd tussen tests schoongemaakt met 5% azijnzuur. Witte ruis (30 dB) gemaskeerde externe achtergrondgeluiden. Op de testdag werden dieren in de testruimte in hun huiskooien gebracht en elk paar dieren werd vervolgens uit de thuiskooi verwijderd en in een aparte opslaghouder geplaatst voor 5 min voordat het in het doolhof werd geplaatst. Dieren werden individueel in het midden van het doolhof geplaatst, waarbij de koppositie tussen muizen werd gecompenseerd en het gedrag werd geregistreerd voor 5 min. de tijd besteed aan de open arm en de gesloten arm (toen alle vier de poten van het knaagdier zich op de open of gesloten arm bevonden) werden geregistreerd en geanalyseerd.
Contextural Fear Conditioning
Fear-conditioning werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [45]. Het experiment werd uitgevoerd in een systeem voor angstconditionering, een kamer in een degelijke verzwakte doos met een huisverlichting op het plafond en een roestvrijstalen roostervloer (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). De roostervloer was verbonden met een schokgenerator en een gehoorsignaal afkomstig van een luidspreker bevestigd aan de wand van de kamer. Alle stimuli werden automatisch geregeld met behulp van een personal computer met een Graphic State-programma. Een videocamera werd voor de kooi geplaatst om gedrag op te nemen. Muizen werden gedurende 3 dagen behandeld en vervolgens gewend aan de trainingskamer voor 5 min. De geconditioneerde stimulus (CS) die werd gebruikt, was een 85 dB-geluid bij 2.8 kHz, terwijl de ongeconditioneerde stimulus (VS) een ononderbroken gecodeerde voetschok was bij 0.8 mA voor 2 s. Na een enkele gelijktijdig beëindigende CS / US-paring, bleef het dier in de kamer voor nog een 30 s voor het meten van onmiddellijk bevriezen. Tijdens de retentietest werd elke muis terug in dezelfde kamer geplaatst en de bevriezingsreacties werden geregistreerd voor 5 min (contextuele bevriezingreactie). Alle tests werden op video opgenomen onder rood licht. Totale bevriezingstijd werd gemeten als een index van angstgeheugen. Bevriezend gedrag werd gedefinieerd als een volledig gebrek aan beweging, uitgezonderd ademhaling. Bevriezingsgedrag werd gescoord door software (Coulbourn Instruments) en omgezet in bevriezingsreactie [bevriezingsreactie 
= (totale vriestijd / totale testtijd) × 100%].
Ruimtelijke referentiegeheugentests
De ruimtelijke referentiegeheugentest was het waterdoolhof met verborgen platforms. We volgden het protocol zoals eerder beschreven door Nakazawa et al. [22]. De training bestond uit vier pogingen per dag, met een tussenpoos van één uur. De beweging van muizen werd gevolgd door een videocamera en gemeten door software (Noldul Information Technology, Nederland). De ontsnappingslatentie naar het perron, evenals de kwadrantbezetting en het passeren van het perron werden allemaal geregistreerd en geanalyseerd. Het zwembad heeft een diameter van 118 cm en het platform heeft een diameter van 9.5 cm. Er werden vier sondetests uitgevoerd. De eerste probe-test (P1) werd uitgevoerd op de dag na de laatste trainingssessie onder full-cue-omstandigheden (dag 11). De tweede probe-test (P2) werd uitgevoerd op dag 12 onder gedeeltelijke signalen (door drie van de vier visuele signalen te verwijderen die aan de zwarte vliesgevel hingen). Voor de DAT+/- muizen, we hebben de derde probe-proef (P3) uitgevoerd op dag 13 onder volledige cue-omstandigheden en vierde probe-proef (P4) op dag 14 onder gedeeltelijke cue-omstandigheden. Nog een blok (4-trials) van training werd 1 uur na P1-, P2- en P3-sondetests afgeleverd, om eventuele extincties die mogelijk tijdens de probeproef zijn opgetreden, tegen te gaan. Om het samenstellende effect van waarschijnlijke overtraining vóór P4 uit te sluiten (sondetest met partiële cue en haloperidol-injectie), onderwierpen we bovendien een andere groep+/- muizen evenals hun controle van wildtype nestgenoten tot twee aanvullende sondetests (P3 ′ en P4 ′ proeven). De P3 ′ sondetest werd één dag na de laatste trainingssessie uitgevoerd onder volledige omstandigheden (dag 10). De P4'-sondetest werd uitgevoerd op dag 11 onder partiële cue-omstandigheden. Tijdens al onze sondetests werd het platform verwijderd en mochten de muizen even lang in het zwembad zwemmen als tijdens de training (60 sec). De tijd die in elk kwadrant werd doorgebracht, werd geregistreerd. Om het dopaminegehalte te herstellen [6], [20], [21], muizen van DAT+/- en controlegroepen werden allemaal intraperitoneaal geïnjecteerd met ofwel haloperidol (0.002 mg / kg lichaamsgewicht) of met zoutoplossing 30 minuten voor de P4- en P4'-probeproeven.
Data-analyse
Om rekening te houden met intra-dier-correlaties tussen herhaalde metingen, werden lineaire gemengde modellen gebruikt om de gedragsprestaties in het Morris-waterlabyrint te schatten, nieuwe objectherkenning, contextuele angstconditionering en rota-rod-tests. De Tukey-Kramer-methode werd gebruikt om de significantie van die gedragsmetingen tussen DAT te bepalen+/- muizen en de controle nestgenoten. In het open veld en verhoogde plus doolhof-tests werden One-way ANOVA en post-hoc Dunnett-test gebruikt om genotype-effecten te bepalen. Continue variabelen worden gepresenteerd als de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM). De gegevens werden geanalyseerd met SPSS-versie 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Verschillen werden als significant beschouwd wanneer P <0.05.
Dankwoord
We bedanken Dr. Xiaoxi Zhuang van de Universiteit van Chicago voor het verstrekken van DAT+/- KO-muizen en Brianna Klein voor technische assistentie bij experimenten.
voetnoten
Concurrerende interesses: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.
financiering: Dit onderzoek werd ondersteund door fondsen van NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance en Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10140900500) (allemaal aan JZT). National Science Foundation of China (81000592), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 en 10JC1411200), Shanghai Municipal Education Commission (11ZZ103) aan FL en XMS. De financiers hadden geen rol bij de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit tot publicatie of de voorbereiding van het manuscript.
;
