Cdk5 fosforyleert Dopamine D2-receptor en dempt downstream-signalering (2013)

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforyleert dopamine D2-receptor en dempt downstream-signalering. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, University of North Dakota, Verenigde Staten

ontvangen: Mei 20, 2013; Aanvaard: November 14, 2013; Gepubliceerd: 31 december 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dit is een open access-artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium mogelijk maakt, op voorwaarde dat de originele auteur en bron worden gecrediteerd.

financiering: Dit werk werd ondersteund door de subsidies (NRF-2012R1A2A2A01012923 en NRF-2012R1A4A1028200) van de Koreaanse overheid (MSIP) en ook ondersteund in het kader van het internationale samenwerkingsprogramma beheerd door NRF van Korea (2012K2A1A2033117) en het Korea Brain Research Institute (KBRI) Fundamenteel onderzoeksprogramma van MSIP (2031-415). SKP was een ontvanger van de 2004 en 2006 Nationale Alliantie voor Onderzoek naar Schizofrenie en Depressie (NARSAD) Young Investigator Awards. De financiers hadden geen rol in onderzoeksontwerp, gegevensverzameling en -analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

Concurrerende belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Introductie

Dopamine-signalering is betrokken bij verschillende hersenfuncties, waaronder motorische coördinatie, stemmingscontrole en beloningsmechanismen [1]. Een belangrijk onderdeel van dopamine signalering bij vertebraten wordt uitgeoefend door striatale medium stekelige neuronen (MSN's) die selectief een subset van dopamine-receptoren tot expressie brengen en dopaminerge input hoofdzakelijk ontvangen van het ventrale tegmentale gebied (VTA) en substantia nigra (SN) [2]. Dopaminereceptoren zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR) met zeven transmembraandomeinen en bestaan ​​uit twee subtypes, D1-achtige en D2-achtige receptoren, die wederzijdse acties in dopamine-signalering mediëren [1]. Bijvoorbeeld, dopamine D1-achtige receptoren (D1, D5) activeren adenylylcyclase door G_aS en verhoog het intracellulaire niveau van cAMP, maar dopamine D2-achtige receptoren (D2, D3, D4) remmen adenylylcyclase door G_ai en verlaag het intracellulaire niveau van cAMP [1], [3].

Onder dopamine-receptoren is de D2-receptor (DRD2) betrokken bij de pathofysiologie van meerdere belangrijke psychiatrische stoornissen waaronder schizofrenie en drugsverslaving [4], zodat veel antipsychotica zich ten minste gedeeltelijk richten op DRD2. Het is ook bekend dat DRD2-activiteit goed correleert met de gedragsconsequenties van drugs van misbruik in diermodellen [5]. Antidepressiva en de werkzaamheid van de stemmingsstabilisator zijn ook in verband gebracht met veranderingen in de celoppervlakte-expressie van DRD2 of stroomafwaartse intracellulaire signalering gemedieerd door PKA, ERK en GSK3 [1], [4], [6]. Ondanks deze cruciale rollen voor DRD2 in de hersenen, zijn de gedetailleerde regulatorische mechanismen die heterogeniteit en complexiteit aan DRD2-eigenschappen verlenen, niet volledig begrepen.

Convergerende bewijsregels geven aan dat er meerdere posttranslationele modificaties zijn betrokken bij het verfijnen van DRD2-activiteit. Uitgebreide glycosylatie van DRD2 werd onthuld in vroege fotoaffiniteitlabels [7]en vorming van disulfidebindingen binnen DRD2 werd ook geïdentificeerd als een belangrijke modificatie voor ligandbinding [8]. Bovendien werden fosforylatieplaatsen van DRD2 aanvankelijk geïdentificeerd door in vitro assay met radio-isotopen, die routes verschaffen voor verschillende regulatorische routes gemedieerd door verschillende kinasen [9]. Inderdaad, eiwitkinase C (PKC) reguleert DRD2-gemedieerde mobilisatie van intracellulair calcium en moduleert de interactie van DRD2 met cytoskeletale eiwitten [10]. Fosforylering door GPCR-kinase 2 (GRK2) reguleert door agonist geïnduceerde resensibilisatiepatronen van DRD2 [11].

Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) is een proline-gestuurd serine / threonine-kinase dat een preferentiële activiteit heeft als gevolg van hersenspecifieke expressie van zijn essentiële activatoren, p35 en p39 [12]. Cdk5 is betrokken bij verschillende neuronale processen, waaronder neuronale migratie en axon-geleiding, en Cdk5 en p35 nul-muizen vertonen afwijkingen in corticale gelaagdheid [13]. Onlangs werd aangetoond dat fosforylatie van WAVE1 en ephexine door Cdk5 de morfogenese van de dendritische wervelkolom reguleert [14]. Verder reguleert Cdk5 ook de oppervlakte-expressieniveaus van de NMDA-receptor, NR2B en NR2A-gemedieerde NMDA-stromen [15], [16]. Het is opmerkelijk dat meerdere bewijsstukken een intieme relatie tussen Cdk5 en het dopamine-systeem suggereren. Cdk5 fosforyleert tyrosinehydroxylase (TH), reguleert de stabiliteit en houdt daarmee de dopaminerge homeostase in stand [17]. In postsynaptische neuronen kan het T75-residu van dopamine en cyclisch-AMP gereguleerd fosfoproteïne-32kD (DARPP-32) worden gefosforyleerd door Cdk5, het kan PKA-activiteit remmen en aldus dopamine DRD1-gemedieerde PKA-signalering antagoniseren [18]. Interessant is dat wanneer cocaïne, een indirecte agonist van dopaminereceptoren, chronisch wordt toegediend in ratten, mRNA- en eiwitniveaus van Cdk5 toenemen in middelgrote stekelige neuronen [19]. Gezamenlijk lijkt Cdk5 betrokken te zijn bij door drugs geïnduceerde synaptische aanpassingen. In deze studie tonen we een functionele interactie van DRD2 en Cdk5 die de rol van Cdk5 in dopamine-signalering verder uitbreiden.

Materialen en methoden

Antilichamen

Anti-konijnenserums werden opgewekt tegen peptiden die fosfo-serine 321 (pS321) van de derde intracellulaire lus van DRD2 (D2i3) bevatten. Fosfo-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), werd gebruikt om een ​​peptide-geconjugeerde kolom te maken voor affiniteitszuivering (20401, PIERCE). Anti-pS321 antilichaam werd verrijkt door een affiniteitszuiveringssysteem volgens de instructie van de fabrikant. Gezuiverd fosfo-antilichaam werd opgeslagen in PBS met 0.1% natriumazide en 0.1% gelatine. Anti-muis anti-Cdk5 antilichaam (sc-249) en anti-konijn anti-p35 antilichaam (sc-820) werden gebruikt voor de Western blotting en immunocytochemie van Cdk5 / p35. Anti-muis anti-GFP antilichaam (sc-9996) werd gebruikt voor de immunoprecipitatie en Western blotting van DRD2-GFP. Anti-konijn anti-FLAG antilichaam (sc-807), anti-konijn anti-HA antilichaam (sc-805), anti-muis anti-GST antilichaam (sc-138) en anti-muis anti-GAPDH antilichaam (sc- 32293) werden gekocht van Santa Cruz Biotechnologies.

Dieren

De p35 knock-out muis was een vriendelijk geschenk van Dr. Katsuhiko Mikoshiba van het RIKEN Brain Science Institute in Japan en werd gebruikt voor de primaire neuroncultuur. Primer-sets voor genotypering waren 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC en 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT zoals eerder beschreven [20]. ICR-muizen en Sprague Dawley-ratten werden gebruikt voor de bereiding van hersenlysaat. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Pohang University of Science and Technology Institutional Animal Care and Use Committee.

Plasmideconstructen

Menselijke langzame DRD2 isovorm in een EGFP-N1 plasmidevector en de derde intracellulaire lus van DRD2 (212-373 aminozuurresiduen inclusief de 29 additionele aminozuurresiduen die uniek zijn voor DRD2 lange isovorm) in een pFLAG-CMV-2 plasmidevector werden gebruikt. Humaan Cdk5 werd ingevoegd in een pCMV-HA plasmidevector en humaan p35 werd ingevoegd in een pcDNA 3.1 plasmidevector. Humaan Cdk5 werd onder een cytomegalovirus (CMV) -promoter samen met humaan p35 in een pcDNA 3.1-vector ingevoegd om een ​​construct met dubbele expressie (Cdk5 / p35) voor immunocytochemie, receptorinternalisatietest, [³⁵S] -GTP_γS-bindingstest, radioligandbindingstest en cAMP-enzymimmuuntest.

In vitro Kinase-test

IP-linked in vitro kinase-assay werd als volgt uitgevoerd. Eén hele muizenhersenen werd gelyseerd in 3 mL erytrocyten lysisbuffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) door 20-slagen van een Dounce-homogenisator om gehomogeniseerde hersysysaten te verkrijgen . De lysaten werden geïncubeerd op ijs gedurende 30 min, gesoniceerd en gecentrifugeerd bij 16,000 x g voor 10 min. De supernatanten werden onderworpen aan immunoprecipitatie met anti-konijn-anti-p35-antilichaam om een ​​actief Cdk5 / p35-complex te verkrijgen. Cdk5 / p35 complex en gezuiverd GST-fusie-eiwit werd gemengd met adenosine 5'-trifosfaat, [y-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) en geïncubeerd in kinasebuffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) voor 1 h bij kamertemperatuur [18], [21]. Gezuiverd Cdk5 / p25-complex (14-516, Millipore) werd ook gebruikt voor in vitro kinase-assay zoals hierboven beschreven. De monsterbuffer 2 x monster werd aan het reactiemengsel toegevoegd en gekookt bij 100 ° C. De monsters werden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en de gedroogde gel werd beoordeeld met autoradiografie.

Liquid Chromatography (LC) -Massaspectrometrie (MS) / MS-analyse

Het recombinante GST-D2i3-eiwit werd geanalyseerd door LC-MS / MS na IP-koppeling in vitro kinasetest. We hebben peptide-identificatie van LC-MS / MS-gegevens uitgevoerd met X !! Tandem (versie Dec-01-2008). Elk RAW-gegevensbestand werd eerst geconverteerd naar mzXML met behulp van de trans-proteomische pijplijn (TPP; versie 4.3). MS / MS-scans in de geconverteerde mzXML's werden vervolgens onderworpen aan het zoeken tegen de UniProt-muizeneiwitsequentiedatabase (release 2010_07) inclusief GST-D2i3-sequentie met X !! Tandem. De tolerantie was ingesteld op 3 Da voor precursorionen en 2 Da voor fragmentionen. Enzymspecificiteit voor trypsine werd gebruikt. Variabele modificatieopties werden gebruikt voor de carbamidomethylatie van cysteïne (57.021 Da), de oxidatie van methionine (15.995 Da), de hydrolyse van asparagine (0.987 Da) en de fosforylering van serine (79.966 Da).

immunoprecipitatie

Immunoprecipitatie werd uitgevoerd op cellysaten in ELB-lysisbuffer. Anti-GFP antilichaam werd toegevoegd aan de lysaten en geïncubeerd voor 3 h bij 4 ° C. Immunocomplexen werden gezuiverd met behulp van eiwit-A-agarose. De precipitaten werden geïncubeerd met SDS-monsterbeladingsbuffer voor 30 min bij 37 ° C en onderworpen aan SDS-PAGE en Western-blots.

GST Pull-down-analyse

10 μg gezuiverd GST en GST-D2i3 werden geïncubeerd met rattenhersenlysaat voor 1.5 h bij 4 ° C. 30 μL van glutathion (GSH) -geconjugeerde Sepharose 4B-korrels (17-0756-01, GE Healthcare) geëquilibreerd met lysisbuffer werd toegevoegd en geïncubeerd voor extra 1 h. Kralen werden verzameld door centrifugatie bij 2,000 xg en gespoeld met lysisbuffer 4-tijden [22], [23]. Precipitaten werden geanalyseerd door Western blotting met behulp van anti-Cdk5 en anti-p35-antilichamen.

immunocytochemie

Getransfecteerde HEK 293-cellen en striatale neuronen gekweekt op dekglaasjes werden eenmaal gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en gefixeerd door onderdompeling in koud 4% paraformaldehyde / PBS voor 30 min. Primair antilichaam werd verdund in de blokkerende oplossing (2% paardenserum en 1% Triton X-100 in PBS). Alexafluor-647-geconjugeerd anti-muis antilichaam (A20990, Invitrogen) en Alexafluor-568-geconjugeerd anti-konijn antilichaam (A11011, Invitrogen) werden gebruikt als secundaire antilichamen. Hoechst werd gebruikt voor kernkleuring. Beelden werden verkregen door confocale microscopie (Olympus, FluoView-1000).

Receptor internalisatietest

24 h na transfectie werden cellen behandeld met 1 μM quinpirol (Q102, Sigma) voor 30 min en 90 min bij 37 ° C. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 2 mL koude PBS en 200 pl porties werden voor elke reactie gebruikt. Geneesmiddelbehandelingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur voor 3 h bij de volgende concentraties; 3 nM [³H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hydrofoob [³H] -spiperon werd gebruikt om totaal tot expressie gebrachte receptoren te merken en hydrofiel sulpiride werd gebruikt om membraneus-receptor-gebonden [³H] -spiperon signalen. Membraangeassocieerde receptorsignalen werden berekend door intracellulaire receptorwaarden af ​​te trekken van de totale tot expressie gebrachte receptorwaarden. Cellen werden gefilterd op een GF / B (Millipore) filter en 3 keer gewassen met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters werden gedroogd en restradioactiviteit werd gemeten met behulp van een vloeistofscintillatieteller [24].

Bereiding van celmembranen

Confluente cellen in 100 mm kweekschalen na transfectie werden gewassen met ijskoude PBS en geoogst in 1 ml HME-buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Gehomogeniseerde lysaten werden gecentrifugeerd met 500 x g gedurende 15 min en de supernatanten werden vervolgens gecentrifugeerd met 36,000 x g gedurende 30 min. Pellets geresuspendeerd in HME-buffer werden gebruikt voor testen.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

Celmembraanfracties werden vooraf geïncubeerd met 1 μM quinpirol (Q102, Sigma) in de testbuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0.01 mM GDP) voor 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) werd toegevoegd tot de eindconcentratie van 3 nM in 30 μL en verder geïncubeerd voor 90 min. 170 μL ijskoude buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂en 0.1 mM GTP) werd toegevoegd om de reactie te stoppen. Membranen werden gefilterd op een GF / B-filter (Millipore) en 3 keer gewassen met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters werden gedroogd en de radioactiviteit werd gemeten met behulp van de scintillatieteller [25], [26].

Radioligand-bindingassay

Bereide celmembranen werden geïncubeerd met 0.01 nM [³H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer) en toenemende concentraties van quinpirol (Q102, Sigma) voor 30 min in de testbuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranen werden gefilterd op een GF / B-filter (Millipore) en 3 keer gewassen met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). De reactie werd beëindigd door snelle filtratie door GF / C-filters. Resterende radioactiviteit werd gemeten met behulp van een vloeistofscintillatieteller [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Getransfecteerde HEK 293-cellen werden voorbehandeld met 10 μM rolipram (R6520, Sigma) voor 1 h en vervolgens behandeld met 0.1 μM forskoline (F6886, Sigma) en toenemende concentraties van quinpirol (Q102, Sigma) voor 30 min. Primaire gekweekte striatale neuronen werden behandeld met 10 μM rolipram voor 1 h, en vervolgens 1 μM dopamine voor 1 h [22]. Cellysaten werden bereid met 0.1 M HCl en cAMP-niveaus werden gedetecteerd door cAMP-enzymimmunoassaykit (Sapphire Bioscience) volgens de instructie van de fabrikant.

Primair gekweekt Striatal Neuron

Het striatale gebied werd geïsoleerd uit het embryonale brein van de muis (E15). Ontleed weefsel werd gedissocieerd in minimale essentiële media (MEM) (11095, Invitrogen) met 0.25% trypsine (T4549-100, Sigma) en 0.1% DNase I voor 6 min bij 37 ° C. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in de plateringsmedia (MEM met 0.01 M HEPES (pH 7.4) en 10% (vol / vol) paardenserum (16050-122, GIBCO)). Neuronen werden gekweekt gedurende 7-dagen in vitro (DIV 7) in MEM met B27-supplement (17504-044, Invitrogen) voordat ze worden toegepast op cAMP-enzymimmuuntests.

Resultaten

Cdk5 fosforyleert Serine 321 in de derde intracellulaire lus van DRD2 in vitro

Om nieuwe Cdk5-substraten te identificeren, hebben we een systematische zoekactie uitgevoerd met (S / T) PX (K / H / R) als de Cdk5-herkenningsconsensussequenties [30] en identificeerde DRD2 als een kandidaat-substraat. De consensussequentie, waaronder serine 321, bevindt zich in de derde intracellulaire lus van DRD2 (D2i3), waarbij verschillende regulerende mechanismen zijn betrokken [3], [10], [11]. De sequentie is evolutionair geconserveerd in DRD2 in gewervelden, wat een functioneel belang van het residu impliceert (Fig. 1A).

Download link:   

• PPT

  PowerPoint-dia

• PNG

  grotere afbeelding (2.08MB)

• TIFF

  originele foto (4.36MB)

Figuur 1. Cdk5 fosforyleert serine 321 in de derde intracellulaire lus van DRD2 in vitro.

(A) Aminozuursequentie-uitlijning die geconserveerde gebieden van de DRD2 van verschillende soorten laat zien (gearceerd). De potentiële Cdk5-fosforyleringssite wordt aangegeven met een asterisk. (B) IP-gekoppeld in vitro kinasetest met recombinante GST-D2i3- en GST-D2i3-mutante eiwitten. Cdk5 / p35-complex verrijkt van muis-hersenextract door anti-p35 immunoprecipitatie werd gebruikt voor kinase-reacties. Een autoradiogram van gefosforyleerde eiwitten wordt getoond samen met Coomassie brilliant blauwe kleuring van dezelfde gel. Pijlpunt geeft radioactief signaal aan dat overeenkomt met GST-D2i3s en open pijlpunt geeft radioactieve signalen van p35 aan. (C) MS / MS-spectrum van het gefosforyleerde peptidefragment van D2i3. De theoretische fragmentatiepatronen worden onder het spectrum getoond. Onder alle fragmentionen worden de gedetecteerde y- en b-ionen in het spectrum aangegeven. Ze₆ en y₇ ionen wijzen sterk op de fosforylatie van serine 321. (D) In vitro kinasetest met gezuiverd Cdk5 / GST-p25-complex met behulp van GST-D2i3 en GST-D2i3-mutante eiwitten. Gefosforyleerde eiwitten werden getoond in een autoradiogram, samen met Coomassie brilliant blue kleuring. Pijlpunt geeft radioactief signaal aan dat overeenkomt met GST-D2i3 en open pijlpunt geeft radioactieve signalen van GST-p25 aan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Om de capaciteit van Cdk5 om D2i3 te fosforyleren te beoordelen, hebben we IP-gekoppeld uitgevoerd in vitro kinase-assays met behulp van een actief Cdk5 / p35-complex verrijkt van muizenhersenenysaat door p35-immunoprecipitatie met gezuiverde recombinante GST-D2i3 (aminozuurresten 212-373) eiwitten als de substraten. We observeerden fosforyleringsignalen in de gezuiverde GST-D2i3- en GST-D2i3 S297A-eiwitten, maar het signaal was aanzienlijk verminderd met GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Om de fosforylatie van serine 321 in de GST-D2i3 verder te verifiëren, hebben we LC-MS / MS-analyse uitgevoerd van de monsters van IP-linked in vitro kinase-assays met behulp van LTQ XL massaspectrometrie. Consequent werden fosforpeptiden die overeenkomen met de massa van fosfo-serine 321-peptiden teruggewonnen (Fig. 1C). Overwegend dat de gegevensafhankelijke acquisitie tijdens LC-MS / MS-analyse ertoe neigt overvloedige eiwitten in het monster te detecteren [31], deze gegevens suggereren dat de serine 321-residu de dominante fosforylatieplaats is van Cdk5 in de D2i3-regio. Om directe fosforylering van serine 321 in de GST-D2i3 door Cdk5 aan te tonen, in vitro kinase-test met behulp van gezuiverd Cdk5 / GST-p25-complex met gezuiverde recombinante GST-D2i3-eiwitten werd uitgevoerd. We identificeerden een significant fosforyleringssignaal in de GST-D2i3 die afwezig was in de GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Alles bij elkaar geven deze resultaten aan dat de D2i3 S321-rest een preferentieel doelwit is voor Cdk5-gemedieerde fosforylering.

Cdk5 fosforyleert Serine 321 in de derde intracellulaire lus van DRD2 in cellen

Om de fosforylering van serine 321 te identificeren, hebben we antilichaam specifiek voor fosfo-serine 321 (pS321) verhoogd. Samples van de IP-linked in vitro de kinasetest werd geanalyseerd door Western-blotten met behulp van anti-pS321-antilichaam. Blots vertoonden een duidelijke band in de kinasereactie die afhankelijk was van GST-D2i3 (Fig. 2A). Om de mogelijke fosforylering van serine 321 in DRD2 door Cdk5 in cellen te verifiëren, werden anti-GFP immunoprecipitaten van HEK 293-cellen die DRD2-GFP tot expressie brachten en DRD2 S321A-GFP met of zonder HA-Cdk5 en p35 werden geanalyseerd door Western blotting met behulp van anti-GFP en anti-pS321-antilichamen. Karakteristieke vlekkerige bandsignalen door anti-GFP-antilichaam waarvan bekend is dat ze het gevolg zijn van overmatige glycosylatie van DRD2 worden alleen waargenomen in de aanwezigheid van DRD2-GFP, en anti-pS321-antilichaam detecteerde soortgelijke DRD2-signalen alleen met Cdk5 / p35 co-expressie (Fig. 2B) [7]. Om de fosforylering van serine 321 door Cdk5 verder te verifiëren, werden D2i3 (FLAG-D2i3) en mutante vorm van D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) gegenereerd. FLAG-D2i3 en FLAG-D2i3 S321A geëxpresseerd met of zonder HA-Cdk5 en p35 in HEK 293-cellen werden geanalyseerd met een SDS-gel mobiliteitshifttest. Een significante Cdk5-afhankelijke mobiliteitsverschuiving werd waargenomen voor FLAG-D2i3, maar niet voor FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). We hebben ook het fosforyleringsniveau van DRD2 bij Ser321 bepaald na agoniststimulatie. HEK 293-cellen die DRD2-GFP en Cdk5 / p35-complex tot expressie brengen, werden door chinpirol gestimuleerd en anti-GFP-immunoprecipitaten uit de cellysaten werden door middel van Western-blotting met behulp van anti-GFP- en anti-pS321-antilichamen geanalyseerd. We ontdekten dat Cdk5-gemedieerde fosforylatie van DRD2 bij Ser321 niet werd beïnvloed door agoniststimulatie, die verschilt van GRK- en PKC-gemedieerde fosforylaties (Fig. 2D) [32], [33]. Samen geven deze resultaten aan dat Cdk5 de serine 321-resten van DRD2 in de cellulaire omgeving kan fosforyleren.

Download link:   

• PPT

  PowerPoint-dia

• PNG

  grotere afbeelding (1.92MB)

• TIFF

  originele foto (3.5MB)

Figuur 2. Cdk5 fosforyleert serine 321 in de derde intracellulaire lus van DRD2 in cellen.

Cdk5-gemedieerde fosforylering van serine 321 werd geanalyseerd met behulp van anti-pS321-antilichaam. (A) Samples van IP-linked in vitro kinasetest die GST-D2i3-eiwitten gebruikt, werd geanalyseerd met Western-blotting (WB) met aangegeven antilichamen. Pijlpunten geven GST-D2i3s aan. (B) DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP werden uitgedrukt met of zonder HA-Cdk5 en p35 in HEK 293-cellen. Anti-GFP-immunoprecipitaten werden geanalyseerd door Western-blotten met behulp van anti-GFP- en anti-pS321-antilichamen. De beugel geeft DRD2-signalen aan en een open pijlpunt geeft niet-specifieke signalen van de anti-GFP-immunoprecipitaten aan. '% invoer' is% volume totaal lysaat voor een IP-reactie. Zwakke endogene Cdk5-signalen werden aangegeven met asterisken. (C) Gelmobiliteitsverschuivingstest. HEK 293-cellen die zijn getransfecteerd zoals aangegeven, werden geanalyseerd door middel van Western blotting. (D) Getransfecteerde HEK 293-cellen werden behandeld met quinpirol en anti-GFP-immunoprecipitaten werden geanalyseerd door Western blotting met anti-GFP en anti-pS321-antilichamen. Open pijlpunt geeft niet-specifieke signalen van anti-GFP-immunoprecipitaten aan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex en DRD2 zijn fysiek gekoppeld

We hebben de mogelijke fysieke interactie tussen het Cdk5 / p35-complex en DRD2 onderzocht, omdat bekend is dat veel Cdk5-substraten fysiek aan het Cdk5 / p35-complex zijn gekoppeld [23], [34], [35]. Eerst werd het GST pull-down experiment uitgevoerd. Gezuiverd recombinant GST-D2i3-eiwit werd geïncubeerd met rattenhersenenysaat en precipitaten van GST-pull-down werden geanalyseerd voor Western-blotting. Zoals getoond in Fig. 3A, endogene Cdk5 en p35 werden geïdentificeerd in de pull-down precipitaten, wat wijst op een fysieke interactie tussen DRD2 en het Cdk5 / p35-complex (Fig. 3A). Bovendien werden HA-Cdk5 en p35 gedetecteerd in de anti-GFP immunoprecipitaten van HEK 293 cellysaten die DRD2-GFP en Cdk5 / p35 tot expressie brengen (Fig. 3B). Daarnaast hebben we immunocytochemische analyses uitgevoerd en waargenomen dat DRD2-GFP, HA-Cdk5 en p35 significante co-localisatiesignalen vertonen in het vliezige gebied van HEK 293-cellen (Fig. 3Cbovenste panelen). We hebben ook co-lokalisatie van DRD2 en Cdk5 / p35 in de neuronale context onderzocht. Consequent toonde DRD2-GFP ook significante co-lokalisatie met endogene Cdk5 en p35 in de gekweekte striatale neuronen (DIV7), verder ondersteunende functionele koppelingen tussen DRD2 en Cdk5 / p35 (Fig. 3C, onderste panelen). De resultaten geven aan dat DRD2 en Cdk5 / p35 een complex kunnen vormen en ondersteunen daarmee het idee dat DRD2 een fysiologisch substraat is van Cdk5.

Download link:   

• PPT

  PowerPoint-dia

• PNG

  grotere afbeelding (3.91MB)

• TIFF

  originele foto (5.35MB)

Figuur 3. Cdk5 / p35 kan een complex vormen met DRD2.

(A) GST-pull-downassay met behulp van gezuiverd recombinant GST-D2i3-eiwit met rattenhersenextract. GST pull-down precipitaten werden onderworpen aan Western-blotanalyse. 'Bead' geeft het pull-down precipitaat zonder GST-eiwitten aan. (B) Immunoprecipitatie van DRD2 en Cdk5 / p35-complex. Anti-GFP IP van lysaten van getransfecteerde cellen werden onderworpen aan Western-blotanalyse. De beugel geeft DRD2-signalen aan en een open pijlpunt geeft niet-specifieke signalen van de anti-GFP-immunoprecipitaten aan. Een overbelichte vlek voor invoer wordt ook rechts getoond. (C) Immunocytochemische analyses van DRD2 en Cdk5 / p35. HEK 293-cellen die DRD2-GFP en Cdk5 / p35 tot expressie brachten werden gekleurd met anti-Cdk5 en anti-p35-antilichamen (bovenste panelen). DRD2-GFP werd alleen tot expressie gebracht in de gekweekte striatale neuronen en gekleurd met anti-Cdk5 en anti-p35-antilichamen (onderste panels). Hoechst werd gebruikt voor kernkleuring. De schaalbalk is 5 μm. Alle afbeeldingen werden verkregen met behulp van confocale microscopie (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-gemedieerde fosforylering van DRD2 verzwakt receptoractiviteit

Er is gerapporteerd dat fosforylatie kritische eigenschappen van GPCR's moduleert, zoals G-proteïnekoppeling, receptor-internalisatie, intracellulaire lokalisatie en associatie met modulator-eiwitten. [9], [11], [24]. Eendoor gonist geïnduceerde receptor-internalisatie is een kritisch regulatieproces van signaaltransductie. We onderzochten Cdk5-gemedieerde modulatie van de internalisatie van DRD2. HEK 293-cellen die DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP met of zonder Cdk5 / p35 tot expressie brengen, werden geïncubeerd met 1 μM quinpirol om door agonist gestimuleerde DRD2-internalisatie te induceren (Fig. 4A). [³H] -spiperonsignalen van cellen die DRD2-GFP tot expressie brachten, waren significant verlaagd na behandeling met 30 min-quinpirol en hersteld bij 90 min. Interessant is dat [³H] -spiperonsignalen van cellen die DRD2-GFP en Cdk5 / p35 tot expressie brachten, waren ook verlaagd bij behandeling met 30 min-quinpirol maar niet hersteld met 90 min (Fig. 4Atweede gedeelte). Anderzijds, [³H] -spiperonsignalen van cellen die DRD2 S321A-GFP tot expressie brachten, werden verminderd met 30 min en hersteld bij 90 min, ongeacht de co-expressie met Cdk5 / p35. Eerdere studies hebben aangetoond dat de geïnternaliseerde DRD2 na langdurige agoniststimulatie terug naar het plasmamembraan recycleert [11]. THet lijkt erop dat Cdk5-gemedieerde fosforylering van DRD2 betrokken is bij de resensibilisatieprocessen na internalisatie van DRD2 via agonist.

Download link:   

• PPT

  PowerPoint-dia

• PNG

  grotere afbeelding (387KB)

• TIFF

  originele foto (1.31MB)

Figuur 4. Cdk5-gemedieerde fosforylering verzwakt DRD2-oppervlakte-expressie en stroomafwaartse signalering.

(A) DRD2-oppervlakte-expressie gemeten met [³H] -spiperonbindingstest. Getransfecteerde HEK293-cellen werden gedurende de aangegeven tijd met 1 μM-quinpirol gestimuleerd en geoogst, gevolgd door 3 nM [³H] -spiperonbehandeling gedurende 3 uur. De radioactiviteit werd gemeten en de oppervlaktesignalen werden berekend. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; One-way ANOVA met Dunnett post-hoc-test: vergelijk alle kolommen versus controlekolom). (B) [³⁵S] -GTP_γS-bindingstest. Celmembranen werden bereid uit de cellen die waren getransfecteerd zoals aangegeven. Membraanpreparaten werden geïncubeerd met 1 μM quinpirole gevolgd door 3 nM [³⁵S] -GTP_γS gedurende 90 minuten. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; One-way ANOVA met Bonferroni post-hoc-test: vergelijk alle paren kolommen). (C) Quinpirole-concurrerende [³H] -spiperonbindingstest. Membraanpreparaten van getransfecteerde cellen werden geïncubeerd met 0.01 nM [³H] -spiperon en toenemende concentraties quinpirol gedurende 30 minuten. Niet-lineaire regressie werd verkregen door GraphPad. Foutbalken geven gemiddelde ± SE (n = 3) aan. (D) cAMP-enzymimmunoassays in getransfecteerde HEK 293-cellen. Getransfecteerde cellen werden gedurende 10 uur voorbehandeld met 1 µM rolipram en vervolgens samen behandeld met 0.1 µM forskoline en toenemende concentraties quinpirol gedurende 30 minuten. Niet-lineaire regressie werd verkregen door GraphPad. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE (n = 4; ** p <0.01; tweezijdig t-testen). (E) Gekweekte striatale neuronen van wildtype en p35 knock-out embryo's (DIV 7) werden behandeld met 10 μM rolipram voor 1 h gevolgd door 1 μM dopamine voor 1 h. Foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SE (n = 4; **p<0.01; tweezijdig t-testen).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

We evalueerden verder een mogelijke verandering van door agonist gestimuleerde G-proteïnekoppeling met DRD2 geassocieerd met Cdk5-gemedieerde fosforylatie met [³⁵S] -GTP_γS-bindingstest [25], [26]. DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP met of zonder Cdk5 / p35 werden uitgedrukt in HEK 293-cellen. Membranen werden bereid en gestimuleerd met 1 μM quinpirole en verder toegestaan ​​[³⁵S] -GTP_γS opname. DRD2-GFP en Cdk5 / p35 tot expressie brengende celmembraan vertoonden een significante verslechtering [³⁵S] -GTP_γS-binding in vergelijking met alle andere celmembranen (Fig. 4B). Deze resultaten geven aan dat Cdk5-gemedieerde fosforylatie de door agonist gestimuleerde G-eiwitbinding bij DRD2 naar beneden reguleert.

Bovendien, quinpirole-concurrerende [³H] -spiperon-bindingsassays werden uitgevoerd om elke mogelijke verandering in agonist-affiniteit bij DRD2 door Cdk5-gemedieerde fosforylering te onderzoeken. Competitieve binding van [³H] -spiperon bij de behandeling van toenemende concentraties van quinpirol aan het membraanpreparaat van getransfecteerd werd gemeten. Concurrerende binding van quinpirol en [³H] -spiperon op DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP maakten soortgelijke logK_i waarden (-9.789 voor DRD2-GFP; -9.691 voor DRD2 S321A-GFP), wat aangeeft dat de affiniteit van ligand voor DRD2 niet significant wordt beïnvloed door Cdk5-gemedieerde fosforylering op DRD2 (Fig. 4C).

Cdk5-gemedieerde fosforylatie Reguleert de DRD2-cAMP-signaalpad

Vervolgens hebben we onderzocht of de modificatie van DRD2 door Cdk5 downstream signaleringsroutes beïnvloedt. We volgden DRD2-gemedieerde remming van door forskoline gestimuleerde cAMP-productie door adenylylcyclase in de cellen die DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP tot expressie brachten met cAMP-enzymimmuuntest. Cellen die DRD2 tot expressie brachten vertoonden verlaagde cAMP-niveaus in respons op quinpirol op een dosisafhankelijke manier. Opmerkelijk was dat co-expressie van Cdk5 / p35 de maximale remming van cAMP-vorming significant verminderde (Fig. 4D, linkerpaneel). Aan de andere kant, in de DRD2 S321A-GFP tot expressie brengende cellen, werden de cAMP-formaties effectief geremd in reactie op behandeling met quinpirole ongeacht de expressie van Cdk5 / p35 (Fig. 4D, rechter paneel). Deze resultaten geven aan dat Cdk5-gemedieerde fosforylering van DRD2 de remmende activiteit van DRD2 op de stroomafwaartse cAMP-signaalroute verzwakt. Om de verschijnselen in een meer fysiologisch relevante omgeving verder te bevestigen, maakten we gebruik van primaire gekweekte neuronen van knockout-embryo's die deficiënt zijn in p35, een essentiële Cdk5-activator. Primaire gekweekte striatale neuronen werden behandeld met 1 μM dopamine en geanalyseerd door middel van cAMP enzym immunoassay. Neuronen van p35 knock-out muizen vertoonden verlaagde cAMP-niveaus vergeleken met wild-type neuronen wanneer gestimuleerd met dopamine (Fig. 4E). Tsamen concludeerden we dat Cdk5-gemedieerde fosforylatie van DRD2 resulteert in een afname van de remmende tonus op de cAMP-route die DRD2 uitoefent.

Discussie

We hebben DRD2 geïdentificeerd als een nieuw substraat van Cdk5. De fosforylatie lijkt de expressie van DRD2 naar beneden te reguleren door het lot van DRD2 na receptor-internalisatie te beïnvloeden, waardoor DRD2 G wordt verminderd_i-koppeling en stroomafwaartse cAMP-route. Aangezien de fosforylatieresidu S321 zowel in lange als korte isovormen van DRD2 voorkomt, kan het in dit onderzoek voorgestelde mechanisme een algemene regelingswijze in DRD2-gemedieerde signalering zijn.

DRD2 in middelgrote stekelige neuronen is niet alleen beschouwd als een belangrijk dopaminereceptorsubtype maar is ook erkend voor zijn gevoeligheid voor veranderingen in beschikbaarheid als reactie op omgevingsstimuli. Agonist-geïnduceerde desensibilisatie en resensitisatie van DRD2 zijn uitgebreid bestudeerd [11], [24]. In het bijzonder hebben een aantal onderzoeken aangetoond dat de effecten van blootstelling aan chronische psychostimulantia, zoals cocaïne en amfetamine, die het extracellulaire niveau van dopamine in de striatale synaps verhogen, gepaard gaan met dynamische postsynaptische veranderingen van DRD2 [36]. Sterker nog, van chronische cocaïnegebruikers is bekend dat ze een gereduceerd DRD2-gehalte in het striatale gebied hebben en de beschikbaarheid van DRD2 in de nucleus accumbens (NAcc) vertoont een negatieve correlatie met het gedrag van zoeken naar en versterken van muizen en primaten [37]-[39]. Deze bevindingen geven aan dat de functionaliteit van DRD2 zeer gevoelig is voor adaptieve of compensatoire regulering als reactie op verschillende stimuli, waaronder blootstelling aan chronische drugs. Onze resultaten laten zien dat de S321-rest in de derde intracellulaire lus van DRD2 gefosforyleerd kan worden door Cdk5, wat resulteert in een afname van de remmende invloed van DRD2 op de cAMP-route. Deze interactie stelt een nieuw regulerend mechanisme voor dat geassocieerd is met Cdk5 in dopaminoceptieve neuronen die mogelijk verband houden met de dynamische aard van de oppervlakbeschikbaarheid van DRD2.

Opgemerkt moet worden dat Cdk5 bekend staat als een belangrijke component bij het bewerkstelligen van adaptieve veranderingen van de neuronale omgeving. Structurele en functionele veranderingen van dendritische stekels in de neuronen van het limbische circuit zijn bijvoorbeeld een van de gevolgen van herhaalde psychostimulantblootstelling [40]. Deze veranderingen gaan gepaard met verschillende moleculaire veranderingen, waaronder de inductie van cAMP-responselement-bindend eiwit (CREB) en ΔFosB, transcriptiefactoren die een blijvende opwaartse regulatie vertonen als reactie op chronische cocaïneadministratie. [41], [42]. Belangrijk is dat Cdk5 een doelwit is van ΔFosB [19], en veel kritische componenten die betrokken zijn bij dendritische wervelkolomdynamica, zoals PSD-95, p21-geactiveerd kinase (PAK), β-catenine en spinophiline, werden gerapporteerd als Cdk5-substraten [43]-[46]. Consequent lokken genetische of farmacologische manipulaties van Cdk5-activiteit veranderingen van de morfologie van de dendritische wervelkolom en gedragsreacties tegen cocaïne uit, hetgeen een cruciale rol voor Cdk5 in de moleculaire en morfologische veranderingen van mesolimbische dopamine-circuits betekent [47], [48]. Onze resultaten die aantonen dat DRD2 een nieuw doelwit is van Cdk5 biedt extra inzicht in de adaptieve veranderingen van het dopaminesysteem als reactie op blootstelling aan chronische geneesmiddelen vanwege de daaropvolgende ΔFosB-gemedieerde opwaartse regulatie van Cdk5 kan een tonische toename in de fosforylatie van DRD2 veroorzaken . Bovendien is bekend dat DRD2 tal van cellulaire processen beïnvloedt, waaronder de regulatie van cAMP- en MAP-kinase-routes en stroomafwaartse transcriptionele gebeurtenissen. [42], [49]. De bevindingen in dit onderzoek kunnen dus niet alleen een directe regulatie van DRD2 door Cdk5 weergeven, maar ook een nieuw inzicht verschaffen in de adaptieve reacties van het dopaminesysteem op chronische blootstelling aan geneesmiddelen.

Bijdragen van auteurs

Bedacht en ontwierp de experimenten: JJ YUP DH SKP. Voer de experimenten uit: JJ YUP DKK YK. Analyse van de gegevens: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Bijgedragen reagentia / materialen / analyse-instrumenten: YHS. Schreef het blad: JJ SKP.