PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstrakcyjny
Indukowane kokainą zmiany w ekspresji genów powodują zmiany w morfologii neuronów i zachowaniu, które mogą leżeć u podstaw uzależnienia od kokainy. Zidentyfikowaliśmy kluczową rolę dimetylacji histonu 3 lizyna 9 (H3K9) i dimetylotransferazy lizynowej G9a w plastyczności strukturalnej i behawioralnej indukowanej kokainą. Powtarzane podawanie kokainy zmniejszyło globalny poziom dimetylacji H3K9 w jądrze półleżącym. Tjego zmniejszenie metylacji histonów było mediowane przez represję G9a w tym regionie mózgu, który był regulowany przez indukowany kokainą czynnik transkrypcyjny ΔFosB. Korzystając z mutagenezy warunkowej i transferu genów za pośrednictwem wirusów, odkryliśmy, że obniżenie poziomu G9a zwiększyło plastyczność dendrytycznych kręgosłupa neuronów jądra półleżącego i zwiększyło preferencje dla kokainy, tym samym ustanawiając kluczową rolę metylacji histonów w długoterminowych działaniach kokainy.
Wprowadzenie
Powtarzająca się ekspozycja na kokainę charakteryzuje się ciągłymi zmianami w ekspresji genów i zmienioną morfologią neuronów w jądrze półleżącym (NAc), kluczowym składniku obwodów nagrody mózgu (1-2). Remodeling chromatyny jest ważny w nieprawidłowych zmianach transkrypcyjnych w tym regionie mózgu, które mogą leżeć u podstaw uzależnienia od kokainy (3-9). Regulacja kokainy struktury chromatyny w NAc wynika częściowo z bezpośrednich indukowanych kokainą modyfikacji maszynerii enzymatycznej chromatyny, co prowadzi do zmian w acetylacji i fosforylacji histonów (4, 7-9); jednak role enzymów kontrolujących metylację histonów nie zostały jeszcze zbadane.
Niedawna analiza promotora obejmująca cały genom z zastosowaniem immunoprecypitacji chromatyny w połączeniu z mikromacierzami (ChIP-Chip) zidentyfikowała zmienione wzorce represji histonowej H3 lizyny 9 (H3K9) i 27 (H3K27) metylacji w określonych promotorach genów w NAc po wielokrotnym leczeniu kokainą (6). Dlatego wyprofilowaliśmy liczne metylotransferazy lizynowe (KMT) i demetylazy (KDM), o których wiadomo, że kontrolują metylację H3K9 lub H3K27 (Rys. 1A). Tylko dwa enzymy, G9a i GLP, wykazywały uporczywą regulację transkrypcji 24 po wielokrotnym podaniu kokainy, gdy ekspresja obu genów była znacząco obniżona. Ponieważ G9a i GLP specyficznie katalizują dimetylację H3K9 (H3K9me2), ich obniżenie przez kokainę jest zgodne ze zmniejszonymi globalnymi poziomami euchromatycznego H3K9me2 obserwowanymi w tym punkcie czasowym (Rys. 1B). Natomiast globalne poziomy heterochromatycznej metylacji H3K27 pozostały niezmienione przez powtarzaną ekspozycję na kokainę (Rys. S1 w obsłudze materiałów online). Ze względu na wysoki poziom aktywności katalitycznej oba in vitro i in vivo (10), postanowiliśmy dalej zbadać funkcjonalne znaczenie represji G9a po wielokrotnym narażeniu na kokainę w NAc. Poziomy białka G9a, podobnie jak poziomy jego mRNA, były znacząco zmniejszone w godzinach 24 po wielokrotnym podaniu kokainy (Rys. S2). Chociaż ekspresja mRNA G9a była zmniejszona przez 35% w NAc, analiza immunohistochemiczna ujawniła skromniejsze zmniejszenie 15% poziomów białka G9a, zgodnie z obserwowanym zmniejszeniem 21% w H3K9me2 po wielokrotnym podawaniu kokainy (Rys. 1B). Ekspresja mRNA G9a była również obniżona w tym regionie mózgu przez 20% po powtarzającym się samopodawaniu kokainy (Rys. S3).
Aby określić, czy zmiany w euchromatycznym H3K9me2 korelują ze zmianami ekspresji genów na całym genomie w NAc, zastosowaliśmy analizy mikromacierzy w celu zbadania profili ekspresji genów indukowanych przez dawkę prowokacyjną kokainy u zwierząt z historią wcześniejszej ekspozycji na kokainę lub bez niej (patrz uzupełnienie listy genów Tabele S1 – S3). Zwierzęta, które otrzymały powtórną kokainę, wykazywały dramatycznie zwiększoną ekspresję genu 1 godzinę po prowokacji kokainą w porównaniu z ostro traktowanymi zwierzętami (Rys. 1C). Ta zwiększona ekspresja genu nadal występowała w odpowiedzi na prowokację kokainą po tygodniu wycofania 1 z powtarzanej kokainy. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami niewielki odsetek genów (~ 10%) wykazywał odczulone odpowiedzi transkrypcyjne po wielokrotnym podaniu kokainy (Rys. 1C; widzieć Tabela S1) (5). Aby bezpośrednio zbadać rolę obniżenia ekspresji G9a w zwiększonej ekspresji genu obserwowanej po powtarzanej kokainie, myszy otrzymały zastrzyki wewnątrz-NAc wirusa Herpes simplex (HSV) wyrażającego albo GFP albo G9a i potraktowano solą fizjologiczną lub powtórzoną kokainą w celu określenia, czy nadekspresja G9a był wystarczający do zablokowania powtarzanego indukowanego kokainą wzmocnienia ekspresji genów. Z zestawu losowo wybranych genów 12 wykazujących podwyższone poziomy ekspresji po powtarzającej się kokainie, zaobserwowaliśmy, że G9a znacząco zmniejszył zwiększoną ekspresję 50% tych genów (Tabela S4).
Aby zidentyfikować zdarzenia transkrypcyjne poprzedzające, które pośredniczą w powtarzanej indukowanej kokainą represji ekspresji G9a, zbadaliśmy możliwą rolę ΔFosB, wysoce stabilnego produktu składania natychmiastowego wczesnego genu fosB. ΔFosB gromadzi się w NAc po wielokrotnej ekspozycji na kokainę, gdzie wiązało się to ze zwiększoną nagrodą za kokainę (11). ΔFosB może działać jako aktywator transkrypcji lub represor w zależności od zaangażowanego genu docelowego (3, 5, 6, 12). Używanie bitransgenicznej NSE-tTA × tetOP-ΔFosB myszy, w których ekspresję ΔFosB można indukować selektywnie w NAc i prążkowiu grzbietowym dorosłych zwierząt (13), zbadaliśmy wpływ wyrażenia ΔFosB na regulację kokainy H3K9me2 i KMT w NAc. Nadekspresja ΔFosB była wystarczająca do zmniejszenia poziomów obu H3K9me2 (Rys. 1D) i wyrażenie G9a (Rys. 1E), w ten sposób naśladując skutki powtarzanej kokainy. W przeciwieństwie do tego, ΔFosB nie zmniejszał ekspresji GLP w tym regionie mózgu i nie miał wpływu na SUV39H1 i EZH2, główne enzymy trimetylujące odpowiednio dla H3K9 i H3K27 (Rys. S4). Aby potwierdzić te dane przy użyciu niezależnego systemu nadekspresji ΔFosB, dorosłe myszy typu dzikiego otrzymały dwustronne wstrzyknięcia wewnątrz NAc wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wyrażających GFP lub ΔFosB. Nadekspresja ΔFosB za pośrednictwem wirusa obniżyła poziom ekspresji G9a w tym regionie mózgu (Rys. 1E).
Taka wyraźna i specyficzna regulacja G9a skłoniła nas do zbadania, czy zmiana ekspresji G9a specyficznie w neuronach NAc reguluje reakcje behawioralne na kokainę. Myszy typu dzikiego otrzymały wstrzyknięcia wewnątrz NAc wektorów HSV eksprymujących GFP lub G9a, a następnie analizowano je za pomocą bezstronnego paradygmatu preferencji miejsca warunkowanego kokainą, który zapewnia pośrednią miarę nagrody leku. Wirusowa nadekspresja G9a w neuronach NAc została potwierdzona po testach behawioralnych (Rys. 2A). Nadekspresja G9a znacząco zmniejszała preferencję dla kokainy w porównaniu ze zwierzętami z nadekspresją GFP (Rys. 2B) i zwiększono poziomy H3K9me2 w NAc (Rys. 2C). Nadekspresja martwego katalitycznie mutanta G9a (G9aH1093K) (14) nie wpłynęło na preferencje kokainy (Rys. 2B) i nie miał wpływu na poziom H3K9me2 w tym regionie mózgu (Rys. 2C).
W celu dalszego zbadania roli G9a w behawioralnym wpływie kokainy, a dokładniej naśladowania powtarzanej indukowanej kokainą represji ekspresji G9a w NAc, dorosły G9afl / fl myszy (14) otrzymały wstrzyknięcia wewnątrz NAc wektorów AAV eksprymujących rekombinazę Cre lub GFP jako kontrolę. Wyłączenie G9a AAV-Cre w NAc, które potwierdzono immunohistochemicznie (Rys. S5), znacząco zwiększył wpływ kokainy w eksperymentach z kondycjonowaniem miejsca i zmniejszył poziomy H3K9me2 w NAc (Rys. 2D, E). Dostępny w handlu inhibitor farmakologiczny G9a i GLP, BIX01294 (15-16), zastosowano do stwierdzenia, czy hamowanie enzymu podobnie wpływa na reakcje behawioralne na kokainę. Rzeczywiście, farmakologiczne hamowanie G9a i GLP znacznie zwiększyło preferencje dla kokainy i zmniejszyło H3K9me2 w NAc (Rys. 2F, G).
Wielokrotne podawanie kokainy zwiększa gęstość kolców dendrytycznych na średnich neuronach kolczystych NAc (17), proces związany z funkcjonalnymi zmianami w pobudzających synapsach glutaminergicznych na te neurony (18-19) i uczulone reakcje behawioralne na lek (17, 20). Postawiliśmy zatem hipotezę, że obniżenie aktywności G9a w NAc przez powtarzaną kokainę może pośredniczyć w zdolności kokainy do regulowania gęstości dendrytycznych kręgów neuronów NAc. Stosując immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z przeciwciałem anty-G9a, zidentyfikowaliśmy kilka przypuszczalnych celów genu G9a w NAc, z których każdy był wcześniej związany z indukowaną kokainą plastycznością dendrytyczną (Rys. 3A) (20-26). Stwierdziliśmy, że powtarzane podawanie kokainy istotnie zmniejszało wiązanie G9a, jak również poziomy H3K9me2, w tych promotorach genów (Rys. 3B). W przeciwieństwie do tego, ostre podawanie kokainy szybko rekrutowało G9a do niektórych z tych samych promotorów genów, zgodnie ze zwiększoną ekspresją G9a obserwowaną w godzinie NAc 1 po ostrej dawce kokainy (Rys. S6). Chociaż wiązanie G9a w określonych promotorach genów koreluje ze zmianami w jego ekspresji, pozostaje niejasne, czy takie zdarzenia są mediowane przez zmienione globalne poziomy G9a w NAc i / lub przez różnice w rekrutacji G9a po ostrym vs powtarzane podawanie kokainy.
Opierając się na regulacji G9a wielu genów związanych z plastycznością w NAc, zbadaliśmy bezpośrednio, czy utrzymanie ekspresji G9a w tym regionie mózgu po powtarzanym leczeniu kokainą było wystarczające do zablokowania indukowanego kokainą formowania kręgosłupa dendrytycznego. Korzystając z wcześniejszego protokołu leczenia kokainowego w celu promowania indukcji kręgosłupa dendrytycznego w NAc (20), zbadaliśmy gęstość kręgosłupa u zwierząt, którym wstrzyknięto HSV-GFP lub HSV-G9a. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami zaobserwowaliśmy znaczny wzrost gęstości kręgosłupa dendrytycznego w NAc po leczeniu kokainą, efekt ten został całkowicie zablokowany przez nadekspresję G9a (Rys. 3C). Sama nadekspresja G9a nie była wystarczająca do zmniejszenia gęstości dendrytycznego kręgosłupa NAc przy braku kokainy. Aby uzupełnić te dane, G9afl / fl myszy otrzymały wstrzyknięcia wewnątrz NAc HSV-Cre, a gęstość kręgosłupa oznaczono ilościowo i porównano ze zwierzętami otrzymującymi HSV-GFP pod nieobecność kokainy. Knockdown ekspresji G9a znacząco zwiększył gęstość kręgosłupa na średnich neuronach kolczystych NAc (Rys. 3C).
Biorąc pod uwagę dowody, że obniżenie poziomu G9a w NAc po powtarzanej kokainie odbywa się za pośrednictwem ΔFosB, zbadaliśmy następnie, czy ten czynnik transkrypcyjny jest również zaangażowany w regulację kolców dendrytycznych NAc. Chociaż ΔFosB nie był wcześniej związany przyczynowo z taką plastycznością dendrytyczną, kilka z jego celów, w tym podjednostki Cdk5 i NFκB, było tak zaangażowanych (20-23), a ciągła ekspresja ΔFosB w neuronach NAc koreluje ze zwiększoną gęstością kręgosłupa dendrytycznego po wielokrotnym leczeniu kokainą (27). Po pierwsze, odkryliśmy, że indukcja ΔFosB u myszy transgenicznych pod nieobecność kokainy, która obniżyła ekspresję G9a i H3K9me2 (Rys. 1D, E), zmniejszyło wiązanie G9a do licznych genów związanych z plastycznością, z których wiele również okazało się być bezpośrednim celem samego ΔFosB (Rys. 3D) (3, 6). Następnie wykazaliśmy, że nadekspresja wirusowa ΔFosB w NAc znacznie zwiększała gęstość kręgosłupa dendrytycznego w warunkach podstawowych, podobny do obserwowanego po powtórnym podaniu kokainy (Rys. 3E). Odwrotnie, nadekspresja w NAc ΔJunD, dominującego negatywnego zmutowanego białka, które antagonizuje aktywność transkrypcyjną ΔFosB, blokowała zdolność powtarzanej kokainy do zwiększania formowania kręgosłupa dendrytycznego w NAc (Rys. 3C).
Nasza obserwacja, że ΔFosB reguluje ekspresję G9a w NAc, oraz że ΔFosB i G9a regulują niektóre z tych samych genów docelowych, doprowadziło nas do zbadania innych interakcji między ΔFosB i G9a. Po ostrej kokainie, gdy poziom G9a był podwyższony, wiązanie G9a do fosB gen został zwiększony, podczas gdy po wielokrotnej kokainie, gdy ekspresja G9a została stłumiona, G9a wiązało się z fosB gen został zmniejszony (Rys. 3A). Takie zmniejszenie wiązania G9a po powtarzanej kokainie nie było obserwowane c-fos, gdzie wiązanie G9a jest zwiększone przez powtarzaną kokainę (Rys. S7). Jest to zgodne z faktem, w przeciwieństwie do fosB, c-fos jest stłumiony, nie wywołany, przez chroniczną ekspozycję psychostymulującą (5). Nadekspresja ΔFosB u myszy transgenicznych była wystarczająca do znacznego zmniejszenia wiązania G9a z fosb gen (Rys. 3D). Ponadto nadekspresja G9a była wystarczająca do zmniejszenia zwiększonej ekspresji ΔFosB po powtarzanym podawaniu kokainy (Tabela S4). Dane te sugerują pętlę autoregulacyjną, dzięki której G9a początkowo ogranicza indukcję ΔFosB przez ostre podawanie kokainy. Jednakże, ponieważ ΔFosB gromadzi się przy powtarzającym się narażeniu na lek, represjonuje G9a i tym samym wzmacnia jego własną dalszą indukcję.
Podsumowując, wykazaliśmy, że metylacja lizyny histonowej w NAc jest krytycznie zaangażowana w regulację ekspresji genów neuronalnych w odpowiedzi na kokainę. Represja G9a i H3K9me2 po wielokrotnym podawaniu kokainy sprzyja preferencjom kokainowym, częściowo poprzez aktywację transkrypcyjną licznych genów, o których wiadomo, że regulują nieprawidłowe formy plastyczności dendrytycznej. Zdobycie lepszego zrozumienia genów regulowanych przez takie mechanizmy poprawi naszą wiedzę na temat złożonych biologicznych podstaw uzależnienia od narkotyków i może pomóc w opracowaniu bardziej skutecznych metod leczenia zaburzeń uzależniających.
Materiały i Metody
Zwierzęta i zabiegi
O ile nie zaznaczono inaczej, myszy trzymano od czterech do pięciu na klatkę w kolonii z cyklem 12 godzin światło / ciemność (światła od 7: 00 AM do 7: 00 PM) w stałej temperaturze (23 ° C) z ad libitum dostęp do wody i żywności. Wszystkie protokoły zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC zarówno w UT Southwestern Medical Center, jak i Mount Sinai School of Medicine.
Do eksperymentów z kokainą [immunohistochemia, western blot, ilościowa PCR (qPCR), analiza mikromacierzy i immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)], wykorzystano 8-do 10-tygodniowych samców myszy C57BL / 6J. Zwierzęta otrzymywały codzienne zastrzyki „soli fizjologicznej” (sól fizjologiczna 7, ip), „ostra” kokaina (sól fizjologiczna z 6 + jedno leczenie 20 mg / kg chlorowodorku kokainy, ip) lub „powtarzana” kokaina (leczenie 7 20 mg / kg kokaina-HCl, ip). Myszy uśmiercono w godzinie 1 lub w godzinach 24 po ostatnim zabiegu. W badaniach mikromacierzy zwierzęta były codziennie leczone „solą fizjologiczną” (sól fizjologiczna 15, ip), „ostrą” kokainą (sól fizjologiczna z 14 + leczenie 1 20 mg / kg kokaina-HCl, ip), „powtarzana + ostra” kokaina ( 7 zabiegi z użyciem soli fizjologicznej + zabiegi 8 20 mg / kg kokainy-HCl, ip) lub „powtarzające się odstawienie + ostra” kokaina (leczenie 7 20 mg / kg kokainy-HCl + leczenie 7 solą fizjologiczną + 1 leczenie prowokacyjne 20 mg / kg kokaina-HCl, ip) i poświęcono 1 godzinę po ostatnim zabiegu. W eksperymentach behawioralnych myszy trzymano pojedynczo po operacji i leczono 10 mg / kg kokainy-HCl, ip, jak opisano poniżej. W przypadku analizy kręgosłupa dendrytycznego i walidacji mikromacierzy po zakażeniu HSV-GFP i HSV-G9a-GFP, myszy traktowano „solą fizjologiczną” (zabiegi 5 z solą fizjologiczną, ip) lub „powtarzaną kokainą” (leczenie 5 20 mg / kg kokainy-HCl, ip ) w ciągu dni 3, ponieważ wykazano wcześniej, że protokół wstrzykiwania zwiększa gęstość kręgosłupa neuronów jądra półleżącego (NAc) w czasie ekspresji transgenu wirusa opryszczki zwykłej (HSV) (Dodatkowy ref S1). Myszy użyte do analizy kręgosłupa dendrytycznego uśmiercono godziny 4 po ostatnim zabiegu.
Aby wywołać lokalną delecję transkryptu G9a ograniczonego do neuronów NAc, użyliśmy zmutowanych myszy homozygotycznych dla allelu G9a z floxed, które zostały szczegółowo opisane w innym miejscu (S2). Rekombinacja indukowana przez Cre wytwarza ekson 22 do 25 splatania poza ramką, co prowadzi do bezsensownego rozpadu zmutowanego transkryptu. Użyliśmy myszy z płynem G9a, które były w pełni krzyżowane z myszami C57BL / 6J. Myszom wstrzykiwano sterotaksycznie do NAc z wektorami wirusa związanego z adenowirusami (AAV) (serotyp 2) wyrażającymi GFP lub Cre-GFP między wiekiem 7 a tygodniami 10. Analiza immunohistochemiczna została wykorzystana do weryfikacji skuteczności rekombinacji za pośrednictwem Cre (patrz Dodatkowy rys. S5). Użyliśmy zwierząt, którym wstrzyknięto AAV 21 dni po operacji, ponieważ rekombinacja u myszy G9a z płynem była stabilna i maksymalna w tym punkcie czasowym, zgodnie z opublikowanymi raportami (S3-S4). Eksperymenty z nadekspresją G9a i ΔJunD przeprowadzono podobnie przy użyciu wektorów wirusa HSV eksprymujących GFP, G9a-GFP typu dzikiego, katalitycznie martwego G9aH1093K-GFP lub ΔJunD-GFP (patrz S2 po szczegóły dotyczące opracowania konstrukcji G9a). Myszy z nadekspresją HSV stosowano 3 dni po operacji, ponieważ nadekspresja była maksymalna w tym punkcie czasowym, jak obserwowano za pomocą immunohistochemii. Ze względu na przejściowy charakter ekspresji HSV i znacznie bardziej stabilną naturę ekspresji AAV, wektory HSV zastosowano w eksperymentach wymagających szybkiej, krótkotrwałej ekspresji transgenu, podczas gdy wektory AAV zastosowano w eksperymentach wymagających wydłużonych okresów ekspresji transgenu. W szeroko zakrojonych wcześniejszych badaniach wykazano, że oba wektory zakażają tylko ciała komórek neuronalnych w obrębie wstrzykniętego obszaru mózgu, bez infekcji neuronów aferentnych lub eferentnych.
Do eksperymentów behawioralnych z zastosowaniem farmakologicznego inhibitora G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), myszy wszczepiono sterotaksycznie do NAc dwiema podskórnymi mini-pompami, jak również dwustronnymi kaniulami prowadzącymi. Mini-pompy aktywowano 12 godziny przed implantacją, rozpoczynając ciągłe dostarczanie (0.25 μl / godzinę) dowolnego nośnika (5 hydroksypropylo-β-cyklodekstryna) lub leku w dniach 14, podczas którego przeprowadzono oceny behawioralne.
Dla eksperymentów z nadekspresją osFosB [western blotting, qPCR i ChIP], męski bitransgeniczny NSE-tTA × tetOP-ΔFosB myszy (10 tygodniowo), przy czym pod nieobecność doksycykliny, pochodnej tetracykliny (8 tygodni bez doksycykliny), zwierzęta wykazywały silną konstytutywną ekspresję ΔFosB o ograniczonej prążkowiu (S5). Nadekspresję ΔFosB u tych myszy potwierdzono za pomocą qPCR. Aby potwierdzić wyniki za pomocą NSE-tTA × tetOP-ΔFosB myszom, samce myszy C8BL / 57J w wieku 6 typu dzikiego wstrzyknięto sterotaksycznie wewnątrz NAc wektorami AAV eksprymującymi GFP lub ΔFosB-GFP. W tym przypadku zastosowano wektory AAV, aby zapewnić maksymalną ekspresję ΔFosB w 8 tydzień po zabiegu, pozwalając na bezpośrednie porównanie między myszami zakażonymi wirusowo i bitransgenicznymi ΔFosB. Nadekspresję wirusową potwierdzono przy użyciu qPCR w 8 tydzień po zabiegu chirurgicznym (stemple NAc z miernikiem 15 wycięto pod miejscem wstrzyknięcia). Myszy z nadekspresją AAV-GFP i AAV-ΔFosB-GFP, które nie były stosowane do qPCR traktowano solą fizjologiczną (sól fizjologiczna 14, ip) lub kokainą powtarzaną (14 leczenie 30 mg / kg kokainy-HCl, ip) rozpoczynając od 6 tygodni po Chirurgia. 4 dni po ostatnim zabiegu, mózgi utrwalono za pomocą 4% paraformaldehydu, podzielono na wibronomy i użyto do analizy kręgosłupa dendrytycznego.
Analiza Western blot
Skrawki NAc z miernikiem 14 pobrano z przekrojów czołowych 1 mm uzyskanych przy użyciu mysiej matrycy mózgu ze stali nierdzewnej i poddano sonikacji w buforze do lizy 1 M HEPES (1% SDS) zawierającym inhibitory proteazy i fosfatazy. 10-Próbki 30 μg całkowitego białka poddano elektroforezie na żelach 18% SDS. Białka przeniesiono na membrany PVDF i inkubowano z anty-H3K9me2 (mysim monoklonalnym, 1: 500), anty-β-tubuliną (mysie monoklonalne, 1: 60,000), anty-całkowitym histonem H3 (poliklonalne królicze, 1: 5,000), anty-GFP (stosowany do weryfikacji równej ekspresji wirusa w tkance dziurkowanej) (poliklonalny królik, 1: 1000), anty-H3K27me3 (królicze poliklonalne, 1: 500) lub przeciwciała przeciw aktynie (mysie monoklonalne, 1: 60,000) przez noc w 4 ° C (wszystkie błony zablokowano w mleku 5% lub albuminie surowicy bydlęcej 5%). Błony inkubowano następnie z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi peroksydazą (1: 15,000-1: 60,000 w zależności od użytego pierwotnego przeciwciała) i prążki wizualizowano za pomocą podłoża SuperSignal West Dura. Prążki oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania NIH Image J Software i prążki H3K9me2 znormalizowano do aktyny lub β-tubuliny i do całkowitego histonu H3 w celu kontroli dla równego obciążenia. Powtarzająca się kokaina nie miała wpływu na poziom aktyny (Rys. S8) lub całkowity histon 3 (Rys. S1) w NAc. Ponadto zakażenie HSV-G9a-GFP i HSV-G9aH1093K-GFP nie miało wpływu na całkowite poziomy β-tubuliny w NAc (Rys. S8).
Immunohistochemia
Myszy uspokojono śmiertelną dawką hydratu chloralu i perfundowano 4% paraformaldehydem przed analizą pojedynczą lub podwójną immunohistochemią, jak opisano wcześniej (S6). W skrócie, mózgi po utrwaleniu inkubowano w temperaturze pokojowej przez noc w 30% sacharozie przed podziałem na 35 μm (mózgi użyte do analizy kręgosłupa dendrytycznego pocięto na wibronome na skrawkach 100 μm przy braku 30% sacharozy). Swobodnie pływające skrawki NAc przemyto 1X PBS, zablokowano (3% normalna surowica osła, 0.1% tritonX, 1X PBS) i później inkubowano z anty-GFP (poliklonalny kurczak, 1: 8000) i / lub anty-G9a (poliklonalny królik) , 1: 500) przeciwciała w roztworze blokującym. Skrawki analizowane pod kątem kolców dendrytycznych inkubowano z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-GFP w 1: 200. Po całonocnej inkubacji skrawki NAc przepłukano razy 3 dla 10 minut 1X PBS, a następnie inkubowano z Cy2 i / lub Cy3 fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokującym 1X PBS dla 2 godzin. Skrawki użyte do badań morfologicznych inkubowano w drugorzędowym przeciwciele przez noc w temperaturze pokojowej. Ko-barwienie jądrowe uzyskano przez inkubację skrawków w 1X PBS zawierającym DAPI (1: 50,000) dla minut 10. Sekcje ponownie przemyto, a następnie odwodniono etanol i zamontowano DPX. Wszystkie skrawki obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Izolacja RNA i qPCR
Dwustronne stemple NAc o średnicy 14 AWG homogenizowano w Trizolu i poddawano obróbce zgodnie z instrukcjami producenta. RNA oczyszczono na kolumnach RNAesy Micro, a spektroskopia potwierdziła, że racje RNA 260/280 i 260/230 były> 1.8. RNA poddano następnie odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu Bio-Rad iScript. cDNA oznaczono ilościowo metodą qPCR przy użyciu SYBR Green. Każdą reakcję prowadzono w dwóch lub trzech powtórzeniach i analizowano zgodnie z metodą ΔΔCt, jak opisano wcześniej, przy użyciu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu (GAPDH) jako kontroli normalizacyjnej (S7). Widzieć tabela dodatkowa S5 dla sekwencji starterów mRNA.
Analiza mikromacierzy DNA
Cztery grupy (niezależne replikaty biologiczne 3 na grupę) wykorzystano do badania mikromacierzy, łącznie z mikromacierzami 12. 1 godzina po ostatnim wstrzyknięciu kokainy, zwierzęta szybko dekapitowano i mózgi usunięto i umieszczono na lodzie. Rozcięcia NAc pobrano za pomocą stempla igłowego 15 i szybko zamrożono w suchym lodzie, aż do ekstrakcji RNA. Dwustronne stemple połączono z czterech zwierząt na powtórzenie, łącznie myszy 12 na grupę. Izolację RNA, przetwarzanie mikromacierzy i analizę danych przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (S8). W skrócie, RNA wyizolowano i oczyszczono, jak opisano powyżej, i sprawdzono pod kątem jakości za pomocą Agilent's Bioanalyzer. Odwrotną transkrypcję, amplifikację, znakowanie i hybrydyzację z macierzami Illumina MouseWG-6 v2.0 przeprowadzono stosując standardowe procedury rdzenia mikromacierzy UT Southwestern. Surowe dane odjęto w tle i znormalizowano kwantylowo za pomocą oprogramowania Beadstudio. Znormalizowane dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania GeneSpring, a listy genów wygenerowano przy użyciu kryteriów istotności 1.3-krotnej wartości odcięcia w połączeniu z nieostrożną wartością odcięcia p <0.05.
Utrzymujemy wysoki poziom zaufania do tych danych z kilku powodów. Po pierwsze, wszystkie zwierzęta były traktowane, leczone i zabijane w tym samym czasie, w tych samych warunkach. Podobnie, wszystkie przetwarzanie RNA i macierzy zostało przeprowadzone w tym samym czasie. Po drugie, wykonaliśmy trzykrotne macierze i połączyliśmy wiele zwierząt na próbkę macierzy, tym samym minimalizując różnice wynikające z indywidualnej zmienności i zwiększając moc statystyczną (S9). Po trzecie, kryteria analizy danych zastosowane w naszym badaniu są zalecane przez projekt kontroli jakości MicroArray, ponieważ kryteria te zostały zatwierdzone w celu zapewnienia wysokiego stopnia odtwarzalności wewnątrzzakładowej oraz powtarzalności między i wewnątrzplatformowej (S10-S11).
Konstrukcja wektorów wirusowych
Ze względu na ograniczenia wielkości insercji wektora wirusowego, sekwencje kodujące dla G9a typu dzikiego (G9a) lub katalitycznie martwego G9a (G9aH1093K) subklonowano do bicistronowego plazmidu p1005 + HSV wyrażającego GFP pod kontrolą promotora ludzkiego wczesnego cytomegalowirusa (CMV) (G9a rozmiar wstawki wynosił ~ 3.96 kb, który przekracza maksymalny rozmiar wstawienia dla wektorów AAV-2). Promotor IE4 / 5 napędza ekspresję G9a. Fragmenty subklonowano do bicistronowego plazmidu HSX p1005 + przez ligacje tępych końców z traktowanym Klenowem PmeI i EcoRI trawionym G9a (z pcDNA3.1) i traktowanym CIP p1005 + po trawieniu EcoRI. W celu wytworzenia HSV-ΔJunD-GFP, sekwencję kodującą ΔJunD flankowaną przez miejsca restrykcyjne EcoRI wytworzono przez PCR stosując startery oligonukleotydowe zawierające miejsce EcoRI. Produkt PCR następnie ligowano do miejsca EcoRI wektora p1005 +. Miejscową ekspresję rekombinazy Cre w neuronach NAc osiągnięto przez dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa przy użyciu wektora AAV, jak opisano (S12). GFP lub N-końcową fuzję GFP z Cre subklonowano do rekombinowanego wektora AAV-2 zawierającego promotor CMV z sekwencją akceptora dawcy splicingu i sygnałem poliadenylacji. Wszystkie insercje wektora potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy. Wektory wirusowe wytworzono przy użyciu potrójnej transfekcji, metody bez pomocy, jak opisano wcześniej (S13). Oczyszczony wirus przechowywano w -80 ° C. Jakość wirusa oceniano na podstawie miana zakaźnego ocenianego w komórkach HEK293. Wirusy AAV-ΔFosB-GFP były podobnie przygotowane. Dla HSV-Cre ekspresja Cre była napędzana przez promotor IRES, w przeciwieństwie do promotora IE4 / 5, w celu zminimalizowania ekspresji Cre i zapobiegania toksyczności neuronów (patrz S14 do budowy wirusów). We wszystkich przypadkach potwierdzono nadekspresję wirusa in vitro i in vivo, przez qPCR, a wirusy potwierdzono immunohistochemicznie, aby wykazać ekspresję ograniczoną do NAc po operacji.
Chirurgia stereotaktyczna
Pod znieczuleniem ketaminą (100 mg / kg) / ksylazyną (10 mg / kg), myszy umieszczono w aparacie stereotaktycznym dla małych zwierząt, a powierzchnię czaszki odsłonięto. Do obustronnego podania 0.5 μl wirusa do NAc użyto trzydziestu trzech igieł strzykawkowych pod kątem 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) z szybkością 0.1 μl / min. Zwierzęta otrzymujące wstrzyknięcia HSV pozostawiono do odzyskania przez 2 dni po zabiegu chirurgicznym, podczas gdy myszy stosowane do testów behawioralnych otrzymujących wektory AAV pozostawiono do odzyskania przez 20 dni przed poddaniem warunkowaniu miejsca. Czasy te są zgodne z okresami maksymalnej ekspresji transgenu za pośrednictwem wirusa dla dwóch wektorów. W przypadku infuzji BIX01294 każda z dwóch mini-pomp była umieszczona podskórnie na plecach myszy. Umiejscowienie kaniuli uzyskano przez wywiercenie dwóch małych otworów czaszkowych powyżej NAc i przez dostarczenie kaniuli z bregmy (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Myszom umożliwiono powrót do zdrowia po operacji 4 na 5 dni przed rozpoczęciem procedury kondycjonowania miejsca na kokainę, jak opisano poniżej.
Uwarunkowana preferencja miejsca
Procedurę warunkowania miejsca przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, z następującymi modyfikacjami (S7). W skrócie, 3 dni po wlewach wewnątrz NAc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP lub HSV-GFP, myszy umieszczono w komorach kondycjonujących, które składają się z trzech różnych środowisk. Myszy, które wykazywały znaczną preferencję dla którejkolwiek z dwóch komór kondycjonujących, wykluczono z badania (<10% wszystkich zwierząt). Grupy kondycjonujące zostały następnie zbilansowane, aby dostosować się do jakichkolwiek obciążeń komory, które mogą nadal istnieć. W kolejnych dniach zwierzętom wstrzyknięto sól fizjologiczną i zamknięto w jednej komorze po południu na 30 minut, a następnie wstrzyknięto kokainę (10 mg / kg, ip) i umieszczono na 30 minut w drugiej komorze wieczorem na 2 dni (dwa sól fizjologiczna i dwie pary kokainy). W dniu testu myszy umieszczano z powrotem w aparacie bez leczenia na 20 minut i testowano, aby ocenić, którą stronę preferują. Reakcje lokomotoryczne na kokainę oceniano za pomocą przerw wiązki w komorach połączonych z kokainą, aby zapewnić skuteczność leczenia. W przypadku eksperymentów AAV i BIX01294 CPP zastosowano nieco zmodyfikowany protokół. Zwierzętom ponownie wstrzykiwano sól fizjologiczną lub kokainę (10 mg / kg, ip) i trzymano je w specjalnych komorach na 30-minutowe sesje, ale zamiast tego były kondycjonowane tylko raz dziennie przez 4 dni, a następnie test 5 dnia (zwierzęta kondycjonowano wieczorem i na przemian zabiegi pielęgnacyjne). Dla wszystkich grup oceniono wyjściową lokomocję w odpowiedzi na sól fizjologiczną, aby upewnić się, że na lokomocję nie wpłynęło leczenie wirusami lub inhibitorami.
Dożylne zażywanie kokainy
Uzyskano samce szczurów Long-Evans o wadze 230 – 250 g na początku eksperymentu. Zostały one umieszczone w środowisku o kontrolowanej wilgotności i temperaturze w odwróconym cyklu 12 godziny światło / ciemność (światła wyłączone przy 9: 00 am) z ad libitum dostęp do żywności i wody. Szczury mogły aklimatyzować się w swoim nowym środowisku i były obsługiwane codziennie przez 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institute of Health dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich używania i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Mount Sinai. Sprzęt do samodzielnego podawania wyposażono w wiązki podczerwieni do pomiaru zachowania lokomotorycznego. Samodzielne podawanie przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (S15-S16) z cewnikami wszczepionymi do prawej żyły szyjnej pod znieczuleniem izofluranem (2.4–2.7%). Cewniki przepłukano 0.1 ml roztworu soli zawierającego 10 U heparyny i ampicylinę (50 mg / kg). Po tygodniu od rekonwalescencji po operacji, podczas ciemnej fazy cyklu światło / ciemność rozpoczął się trening samodzielnego podawania. Zwierzętom umożliwiono 3-godzinny codzienny dostęp do kokainy (0.75 mg / kg / wlew) w schemacie wzmacniania o ustalonym stosunku-1 (FR1), gdzie 1 aktywna dźwignia naciskowa dawała pojedynczy wlew leku. Szczury ustabilizowały spożycie kokainy po 6 dniach (<15% zmiany wskaźnika odpowiedzi w ciągu 3 kolejnych dni, z co najmniej 75% odpowiedzi na wzmocnionej dźwigni). 24 godziny po ostatniej sesji samodzielnego podawania szczurom szybko dekapitowano, mózgi szybko usuwano i przetwarzano w celu izolacji RNA i qPCR.
Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)
Świeże stemple NAc były usieciowane formaldehydem i przygotowane do ChIP, jak opisano wcześniej (S17-S18) z drobnymi modyfikacjami. W skrócie, stemple NAc do pomiaru 4 14 na zwierzę (zwierzęta 5 zebrane na próbkę) zebrano, sieciowano 1% formaldehydem i wygaszono glicyną 2 M przed zamrożeniem w -80 ° C. 1 dzień przed sonikacją próbki, wytworzono kulki magnetyczne przeciwko króliczym / mysim owcom (w zależności od przeciwciała precypitacyjnego) przez inkubację odpowiednich kulek magnetycznych z anty-G9a (poliklonalna klasa ChIP królika) lub anty-H3K9me2 (mysi monoklonalny stopień ChIP) przeciwciała przez noc w 4 ° C przy stałej rotacji w roztworze blokowym. Sonikację tkanek i ścinanie chromatyny przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (S17). Po sonikacji równe stężenia chromatyny przeniesiono do nowych probówek, a ~ 5% produktów końcowych zapisano, aby służyły jako kontrole „wejściowe”. Po dokładnym przemyciu i ponownym zawieszeniu sprzężonych mieszanin kulka / przeciwciało, do każdej próbki chromatyny dodano równe objętości mieszanin przeciwciało / kulka (~ 7.5 μg przeciwciało / próbka) i inkubowano przez ~ 16 godziny przy stałej rotacji w 4 ° C. Próbki następnie przemywano i odwrotnie sieciowano w 65 ° C przez noc przed oczyszczeniem DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR. Po oczyszczeniu DNA próbki poddano qPCR i znormalizowano do odpowiednich kontroli „wejściowych”, jak opisano wcześniej (S17). Przeprowadzono również normalne immunoprecypitacje mysiej IgG z użyciem mysiego poliklonalnego przeciwciała anty-IgG w celu kontroli w celu odpowiedniego wzbogacenia wzmocnienia sygnału. Fosforybozylotransferazę adeninową (APRT) zastosowano jako kontrolę negatywną w eksperymentach z nadekspresją kokainy i ΔFosB. Widzieć Tabela uzupełniająca S5 dla sekwencji starterów promotorowych.
Analiza kręgosłupa dendrytycznego
Aby zbadać rolę G9a w regulacji morfologii neuronów in vivo, zastosowaliśmy metody opisane wcześniej z następującymi modyfikacjami (S1). Trzy dni po wstrzyknięciu HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (wszystkie wirusy zastosowano w myszach typu dzikiego C57Bl / 6J) lub HSV-Cre-GFP (stosowane w G9afl / fl myszy), gdy ekspresja wirusa była maksymalna, myszy poddano perfuzji, mózgi poddano krioprotekcji i później podzielono na 100 μm na wibratomie. Skrawki następnie barwiono immunologicznie stosując przeciwciało przeciw GFP jak opisano powyżej (patrz Immunohistochemistry). Aby ocenić wpływ nadekspresji G9a i nokautu na liczbę kręgosłupa, a także wpływ nadekspresji unJunD, zmierzyliśmy liczbę kolców na neurytach 1 – 2 na neuron równych co najmniej 299 μm dendrytów wtórnych z pożywki NAc wyrażającej GFP neurony kolczaste (MSN). Biorąc pod uwagę, że MSN są morfologicznie różne od innych populacji neuronów w NAc, jak również wcześniejsze doniesienia wskazujące, że HSV infekuje przede wszystkim neurony eksprymujące DARPP-32 w tym regionie mózgu (S19), jesteśmy przekonani, że MSN zostały ocenione wyłącznie w tych badaniach. Dla każdego zwierzęcia zbadaliśmy neurony ~ 6 – 8 u zwierząt 3 – 4 na grupę (grupy 7), po czym uzyskano średnią wartość dla każdego zwierzęcia do analizy statystycznej. Eksperymenty zaprojektowane w celu zbadania wpływu nadekspresji ΔFosB na gęstość kręgosłupa NAc przeprowadzono podobnie jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że wektory AAV zastosowano do ekspresji GFP lub ΔFosB-GFP przez dłuższy czas (tygodnie 8). Wszystkie obrazy HSV przechwytywano za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem do zanurzania w oleju 100X (obrazy AAV rejestrowano za pomocą obiektywu do zanurzania w oleju 63X). Obrazy uzyskano za pomocą zestawu otworkowego w dowolnej jednostce 1 i rozmiaru ramki 1024 × 1024. Długość dendrytyczną mierzono za pomocą oprogramowania NIH Image J, a liczby kręgosłupa były liczone na ślepo przez głównego eksperymentatora, ponieważ slajdy były kodowane przed skanowaniem eksperymentalnym. Obliczono średnią liczbę kolców na 10 μm dendrytu.
Analiza statystyczna
Przeprowadzono jedno- i dwukierunkowe analizy ANOVA w celu określenia istotności warunkowanej preferencji miejsca i analizy kręgosłupa dendrytycznego z więcej niż dwiema grupami. Testy t-Studenta wykorzystano do innych porównań, w tym qPCR, Western blotting, analizę dendrytyczną kręgosłupa porównując HSV-GFP z HSV-Cre w G9afl / fl myszy, analizy mikromacierzy (patrz powyżej) i doświadczenia z immunoprecypitacją chromatyny. Zaplanowane testy t Studenta zastosowano po dwukierunkowej analizie ANOVA gęstości kręgosłupa dendrytycznego po nadekspresji ΔFosB z potwierdzeniem istotnych głównych efektów leczenia lekiem i wirusem. Wszystkie wartości zawarte w legendzie do rycin reprezentują średnią ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Szczegółowe analizy statystyczne dla Ryc. 1-3 w tekście głównym podane są: Szczegółowe legendy figurujące w tym statystyki.
Przypisy
Oświadczam, że żaden z materiałów zawartych w manuskrypcie zatytułowanym Niezbędna rola metylotransferazy histonowej G9a w plastyczności indukowanej kokainą zostały wcześniej opublikowane lub są rozważane gdzie indziej, w tym w Internecie.
Wszystkie prace związane z wykorzystaniem zwierząt były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i IACUC zarówno w University of Texas Southwestern Medical Center, jak i Mount Sinai School of Medicine.
Odniesienia i uwagi
;
