PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, reguluje działanie kokainy w Nucleus Accumbens (2015)

PLoS ONE. 2015 maja 11;10(5):e0126710. doi: 10.1371/journal.pone.0126710. eKolekcja 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ochno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstrakcyjny

ΔFosB jest stabilnym czynnikiem transkrypcyjnym, który gromadzi się w jądrze półleżącym (NAc), kluczowej części obwodów nagrody w mózgu, w odpowiedzi na przewlekłą ekspozycję na kokainę lub inne narkotyki. Chociaż wiadomo, że ΔFosB heterodimeryzuje z członkiem rodziny Jun, tworząc aktywny kompleks czynników transkrypcyjnych, jak dotąd nie przeprowadzono otwartej eksploracji innych możliwych partnerów wiążących ΔFosB w mózgu. Tutaj, za pomocą testów dwuhybrydowych drożdży, identyfikujemy PSMC5 - znany również jako SUG1, podjednostkę zawierającą ATPazę kompleksu proteasomalnego 19S - jako nowe białko oddziałujące z ΔFosB. Weryfikujemy takie interakcje między endogennym ΔFosB i PSMC5 w NAc i wykazujemy, że oba białka tworzą również kompleksy z innymi białkami regulatorowymi chromatyny związanymi z aktywacją genów. Dalej pokazujemy, że przewlekła kokaina zwiększa jądrowe, ale nie cytoplazmatyczne poziomy PSMC5 w NAc i że nadekspresja PSMC5 w tym regionie mózgu promuje reakcje lokomotoryczne na kokainę. Łącznie odkrycia te opisują nowy mechanizm, który przyczynia się do działań ΔFosB i po raz pierwszy implikuje PSMC5 w indukowanej kokainą plastyczności molekularnej i behawioralnej.

Cytat: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O i in. (2015) PSMC5, ATPaza proteasomu 19S, reguluje działanie kokainy w jądrze półleżącym. PLoS JEDEN 10(5): e0126710. doi:10.1371/journal.pone.0126710

Redaktor akademicki: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, ZJEDNOCZONE KRÓLESTWO

Odebrane: Grudzień 10, 2014; Przyjęty: Kwiecień 7, 2015; Opublikowano: 11 maja 2015 r.

Prawa autorskie: © 2015 Ohnishi i in. To jest artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na warunkach Licencja Creative Commons - uznanie autorstwa, która pozwala na nieograniczone korzystanie, dystrybucję i reprodukcję na dowolnym nośniku, pod warunkiem, że oryginalny autor i źródło zostaną zapisane

Dostępność danych: Wszystkie istotne dane znajdują się w dokumencie.

Finansowanie: Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health, National Institute on Drug Abuse oraz Fundacji Ishibashi i Japan Society for the Promotion of Science (numery KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Konkurencyjne zainteresowania: Autorzy zadeklarowali, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Wprowadzenie

ΔFosB, okrojony produkt z FosB gen należy do rodziny czynników transkrypcyjnych Fos, która obejmuje również c-Fos, pełnej długości FosB, Fra-1 i Fra-2. ΔFosB, podobnie jak inne białka Fos, heterodimeryzuje z białkiem z rodziny Jun — c-Jun, JunB lub JunD — tworząc aktywny kompleks czynnika transkrypcyjnego AP-1 (białko aktywatora-1), który indukuje lub hamuje ekspresję określonych genów docelowych [1,2].

Wykazano, że ΔFosB odgrywa kluczową rolę w uzależnieniu od narkotyków [2]. Wyjątkowo wśród białek rodziny Fos, gromadzi się w jądrze półleżącym (NAc) i innych obszarach mózgu związanych z nagrodą po wielokrotnym podaniu leku ze względu na wysoki poziom stabilności [3,4], w którym pośredniczy brak C-końcowych domen degronowych i fosforylacja przez kilka kinaz białkowych [5-7]. Taka indukcja ΔFosB w NAc pośredniczy w zwiększonych reakcjach behawioralnych na nadużywane narkotyki. Zatem nadekspresja ΔFosB w tym regionie mózgu dorosłych zwierząt, albo przez użycie wektorów wirusowych, albo indukowalnych myszy bitransgenicznych, zwiększa wrażliwość zwierzęcia na aktywujące i nagradzające działanie kokainy i opiatów, a także motywację zwierzęcia do samodzielnego podawania kokaina [7-11]. I odwrotnie, nadekspresja dominujących negatywnych antagonistów ΔFosB powoduje przeciwne fenotypy behawioralne [10-12].

My i inni potwierdziliśmy wcześniej, stosując testy przesunięcia żelowego, że JunD i być może inne białka z rodziny Jun są głównymi partnerami wiążącymi ΔFosB w mózgu in vivo [13-15]. Jednak do tej pory nie przeprowadzono otwartej, bezstronnej oceny partnerów wiążących ΔFosB w mózgu. Tutaj staraliśmy się zidentyfikować nowych partnerów wiążących dla ΔFosB za pomocą testu dwuhybrydowego drożdży [16,17]. Nasze dane ujawniły, że PSMC5, znany również jako SUG1, jest solidnym partnerem ΔFosB zarówno in vitro, jak iw NAc in vivo, gdzie łączy się z ΔFosB jako część indukowanego kokainą kompleksu aktywacji transkrypcji, który zawiera również CBP (białko wiążące CREB ) i p300 - obie acetylotransferazy histonowe (HAT) - jak również BRG1 (białko przebudowujące chromatynę). Dalej pokazujemy, że przewlekła ekspozycja na kokainę zmienia poziomy jądrowe PSMC5, podjednostki zawierającej ATPazę kompleksu proteasomalnego 19S, w NAc i że PSMC5 z kolei kontroluje reakcje behawioralne na kokainę.

Materiał i metody

Drożdżowe przesiewanie dwuhybrydowe

Komórki drożdży MaV203 (Invitrogen Life Technologies) kotransfekowano pDBLeu kierującym różnymi fragmentami białka ΔFosB, a bibliotekę mózgu myszy subklonowano w pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformowane komórki hodowano na podłożu SC pozbawionym leucyny, tryptofanu i histydyny i zawierającym 10 mM 3-aminotriazolu. Wiązanie między fragmentami FosB i kandydatem na partnera indukuje trzy geny reporterowe (His3, Ura3, LacZ), a indukcja sprawia, że ​​transformanty są zdolne do przeżycia w stosowanych warunkach hodowlanych. Pozytywne klony ponownie przetestowano ze świeżymi fragmentami pDBLeu-ΔFosB w testach retransformacji w komórkach MaV203.

Linie komórkowe

Komórki nerwiaka niedojrzałego Neuro 2A myszy (ATCC) utrzymywano w minimalnym podstawowym podłożu Eagle'a (EMEM) (ATCC), uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w 37°C i 5% CO2. Komórki szczura 1A były prezentem od Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonia) [18] i utrzymywane w Dulbecco's MEM (DMEM) (Life Technologies), uzupełnione 10% FBS w 37°C i 5% CO2. Transfekcję komórek plazmidowym DNA przeprowadzono stosując Effectene (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Konstrukty PSMC5 i ΔFosB

Wytworzono kilka zmutowanych postaci PSMC5, z których każda wyznakowano FLAG na swoim N-końcu, do wykorzystania w eksperymentach z immunoprecypitacją lub transferem genów za pośrednictwem wirusów. Należą do nich: PSMC5-K196M, domena PSMC5-Δcoiled-coil (PSMC5-ΔCC, pozbawiona aminokwasów 27–68), PSMC5-NT (składająca się z N-końcowego fragmentu białka, aminokwasy 1–151) i PSMC5 -CT (składający się z C-końcowego fragmentu białka, 172 aminokwasów) (zob Rys. 1). Wykorzystaliśmy również N-końcowe postacie ΔFosB typu dzikiego ΔFosB, jak również ΔFosB znakowane MYC z mutacją w domenie suwaka leucynowego (mutacja aminokwasów od 182 do 205, o której wiadomo, że zaciera heterodimeryzację białkami z rodziny Jun.6].

miniatur
Ryc. 1. ΔFosB wiąże się z PSMC5 in vitro.

 

A. Schemat ΔFosB, ΔFosB-LZM, w którym domena zamka leucynowego jest zmutowana w celu zatarcia heterodimeryzacji ΔFosB białkami Jun i Δ2ΔFosB, w którym brakuje pierwszych 78 aminokwasów N-końca ΔFosB. B. Schemat PSMC5, PSMC5-NT, który zawiera pierwsze 151 aminokwasów PSMC5, PSMC5-CT, w którym brakuje pierwszych 235 aminokwasów PSMC5, oraz PSMC5-ΔCC, w którym brakuje domeny typu coiled-coil (aminokwasy 28–68) . Domena AAA odpowiada motywowi ATPazy związane z różnymi aktywnościami komórkowymi, obecne w wielu ATPazach. C. 2.4 μg pcDNA3.1-ΔFosB (ścieżki 1–4) lub ΔFosB-LZM (ścieżka 5) kotransfekowano z 2.4 μg znakowanego FLAG PSMC5 lub różnymi mutantami delecyjnymi do komórek Neuro2a. Dwa dni po transfekcji komórki poddano lizie i poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-FLAG, a następnie przeprowadzono analizę Western blot z przeciwciałem anty-ΔFosB lub anty-FLAG. Należy zauważyć, że ΔFosB, ale nie ΔFosB-LZM, silnie wiąże się z PSMC5 lub PSMC5-NT, ale nie z PSMC5-CT lub PSMC5-ΔCC. Dane pokazane na rysunku powtórzono trzykrotnie w każdym z trzech oddzielnych eksperymentów.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Zwierzęta

Do wszystkich eksperymentów użyto samców myszy C11BL/57J w wieku od 6 do 12 tygodni (The Jackson Laboratory). Zwierzęta trzymano w XNUMX-godzinnym cyklu światło-ciemność z dostępem do pożywienia i wody ad libitum i były przyzwyczajone 1 tydzień przed eksperymentem. Zastosowano dwa schematy leczenia kokainą. Aby zbadać biochemiczne skutki kokainy, zwierzętom podawano 7 dziennych dawek kokainy (20 mg/kg) lub soli fizjologicznej i zabijano przez dekapitację 24 godziny po ostatnim zastrzyku. Jest to standardowy protokół, który, jak wykazano, wywołuje liczne odpowiedzi molekularne i komórkowe na lek [7]. Aby zbadać wpływ PSMC5 w jądrze półleżącym na reakcje behawioralne na kokainę, zastosowaliśmy podprogową dawkę leku (7.5, 5 mg / kg; patrz Uczulenie narządu ruchu poniżej) w oparciu o hipotezę, że PSMCXNUMX, podobnie jak ΔFosB, zwiększy wrażliwość zwierzęcia na kokaina [8]. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na górze Synaj.

Immunoprecypitacja i Western blotting

Komórki Neuro 2A transfekowano dzikimi lub zmutowanymi postaciami PSMC5. Dwa dni po transfekcji komórki przemyto PBS, poddano lizie w buforze RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% dezoksycholan sodu, 10 mM maślan sodu, koktajl inhibitorów proteazy) . Lizaty podzielono i inkubowano z nieimmunologicznymi IgG (Sigma) lub przeciwciałami anty-FLAG (Sigma) przez 3 godziny w 4°C. Immunoprecypitację przeprowadzono z kulkami białka G (Invitrogen), jak opisano [19]. Pokrótce, immunoprecypitowane białka poddano SDS-PAGE i analizowano metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała anty-FosB/ΔFosB (Cell Signaling Technology) w oparciu o opublikowane protokoły [7]. W testach wiązania białek in vivo wykorzystaliśmy oczyszczone frakcje jądrowe z NAc wypreparowanych przez stempel myszy po przewlekłym leczeniu kokainą (20 mg / kg IP dziennie przez 7 dni, z myszami stosowanymi 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu). Koimmunoprecypitację z frakcji jądrowych przeprowadzono stosując zestaw Nuclear Complex Co-IP (Active Motif) zgodnie z instrukcjami producenta. Zastosowano następujące przeciwciała: MYC lub ß-aktyna, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 i histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 i BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) i FLAGA M2, Sigma.

Immunohistochemia

Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi procedurami [20]. Myszy uśpiono i poddano perfuzji wewnątrzsercowej 4% paraformaldehydem w PBS. Mózgi zabezpieczono kriogenicznie 30% sacharozą, a następnie zamrożono i przechowywano w temperaturze -80°C aż do użycia. Skrawki koronowe (40 μm) pocięto na kriostacie i poddano obróbce immunohistochemicznej. Swobodnie pływające skrawki wstępnie inkubowano w buforze blokującym zawierającym 0.3% Triton i 3% normalnej oślej surowicy. ΔFosB wykryto przy użyciu koziego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko N-końcowej części białka (1/1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 wykryto stosując królicze przeciwciało poliklonalne (1/100 Abcam, Cambridge, MA). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego (powiększenie 60x; Zeiss).

Uczulenie narządów ruchu

Wszystkie myszy otrzymywały codziennie dootrzewnowe zastrzyki z soli fizjologicznej przez 3 dni, aby przyzwyczaić je do stresu związanego z zastrzykami. Następnego dnia myszom wstrzyknięto IP solą fizjologiczną lub podprogową dawką kokainy (7.5 mg/kg; patrz powyżej Zwierzęta) i natychmiast umieszczono w nowych skrzyniach lokomotorycznych. Aktywność lokomotoryczną myszy rejestrowano przy użyciu systemu fotowiązek, gdy wiązka ambulatoryjna pękała przez 30 minut. Zabiegi te powtarzano codziennie przez 3 dni.

Transfer genów za pośrednictwem wirusa

Użyliśmy szeroko opublikowanych metod transferu genów za pośrednictwem wirusów [7,8,11,19]. Pokrótce, plazmidy ekspresyjne dla PSMC5 lub dla kilku jego mutantów (patrz konstrukty PSMC5 i ΔFosB powyżej) subklonowano do bicistronowego plazmidu p1005(+) HSV wyrażającego GFP pod kontrolą promotora CMV i PSMC5 lub jego mutantów pod kontrolą promotora CMV. promotor IE4/5. W znieczuleniu ketaminą (100 mg/kg)/ksylazyną (10 mg/kg), myszy umieszczono w narzędziu stereotaktycznym dla małych zwierząt i odsłonięto powierzchnię czaszki. Igły strzykawki o rozmiarze 0.5 zostały użyte do obustronnej infuzji 10 μl wektora HSV do NAc pod kątem 1.6° (AP +1.5; ML +4.4; DV -0.1) z szybkością 2 μl/min. Zwierzęta otrzymujące zastrzyki HSV pozostawiono do wyzdrowienia przez XNUMX dni po operacji przed eksperymentami.

Statistics

Zastosowano ANOVA i testy t Studenta, skorygowane o wielokrotne porównania, z istotnością ustaloną na poziomie p <0.05.

Efekt

PSMC5: nowy partner wiążący ΔFosB

Przeprowadziliśmy wstępne eksperymenty w celu zidentyfikowania odpowiedniego fragmentu ΔFosB, który służył jako przynęta w teście dwuhybrydowym drożdży bez autoaktywacji systemu. Holo-ΔFosB sam indukował aktywność genu reporterowego, podobnie jak N-końcowy fragment białka o długości 1–78 aminokwasów. Jednak skrócony N-końcowy ΔFosB (Ryc. 1A), określany jako Δ2ΔFosB, w którym brakuje pierwszych 78 aminokwasów białka, nie miał takiego efektu. Dlatego użyliśmy Δ2ΔFosB jako białka przynęty.

Aby przeszukać potencjalnych partnerów wiążących, wykorzystaliśmy bibliotekę mózgu myszy subklonowaną w pPC86. Zidentyfikowaliśmy 11 kandydatów na wiążących partnerów. Chociaż białka te obejmowały znanych partnerów heterodimeryzacji ΔFosB, c-Jun i JunD (Tabela 1), zdecydowanie najbardziej rozpowszechnionym kandydatem był PSMC5. Choć było to zaskakujące, było to interesujące odkrycie, ponieważ w jednym raporcie przed laty wykazano, że PSMC5 wiąże się z c-Fos in vitro [21]. Jednak nie ma wcześniejszych doniesień o zaangażowaniu PSMC5 w działania związane z kokainą. Niemniej jednak, ze względu na siłę sygnału PSMC5 w teście dwuhybrydowym drożdży, postanowiliśmy dalej badać możliwe interakcje ΔFosB-PSMC5.

miniatur
Tabela 1. Wyniki dwuhybrydowego badania przesiewowego drożdży z Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Po pierwsze, aby potwierdzić fizyczną interakcję między ΔFosB i PSMC5, przeprowadziliśmy eksperymenty koimmunoprecypitacji in vitro. Odkryliśmy, że PSMC5 ze znacznikiem FLAG (Ryc. 1B), transfekowane do komórek Neuro 2A, skutecznie ściągnęło ΔFosB (Rys 1C). Po drugie, aby zidentyfikować region w PSMC5, który jest odpowiedzialny za jego wiązanie z ΔFosB, wygenerowaliśmy kilka mutantów PSMC5 oznaczonych FLAG (Ryc. 1B) i powtórzono eksperyment z koimmunoprecypitacją. ΔFosB został skutecznie ściągnięty z N-końcowymi 151 aminokwasami PSMC5 (PSMC5-NT), ale nie z C-końcowym fragmentem 172 aminokwasów białka (PSMC5-CT) (Rys 1C). PSMC5 pozbawiony domeny zwiniętej cewki (PSMC5-ΔCC) był również nieskuteczny w wytrącaniu ΔFosB. Odkrycia te sugerują, że PSMC5 wiąże ΔFosB poprzez swoją domenę typu coiled-coil (aminokwasy 27–68). Co więcej, PSMC5 znakowany FLAG nie wytrącił zmutowanej postaci ΔFosB ze zmutowaną domeną suwaka leucynowego (ΔFosB-LZM) (Rys 1C), wskazując, że ΔFosB albo wiąże PSMC5 przez tę domenę, albo, co bardziej prawdopodobne, że heterodimeryzacja ΔFosB jest wymagana do wiązania PSMC5.

Wiązanie PSMC5-ΔFosB w NAc po przewlekłym podawaniu kokainy

Na podstawie tych ustaleń in vitro zbadaliśmy, czy poziomy PSMC5 w NAc zmieniają się w odpowiedzi na przewlekłe podawanie kokainy. Stwierdziliśmy przez frakcjonowanie subkomórkowe i Western blotting, że przewlekła kokaina zwiększa poziomy jądrowe PSMC5 w tym regionie mózgu bez zmiany poziomów cytoplazmatycznych (Ryc. 2A). Efektu tego nie obserwowano po pojedynczych dawkach kokainy (dane nie pokazane). Następnie zbadaliśmy lokalizację PSMC5 i ΔFosB w NAc za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przeanalizowaliśmy myszy 24 godziny po ostatniej powtarzanej dawce kokainy, punkt czasowy, w którym ΔFosB jest jedynym wykrywalnym FosB produkt genu (patrz Nestler 2008). Znaleźliśmy silną immunoreaktywność PSMC5 w NAc, w tym silny sygnał jądrowy. ~ 85% jąder ΔFosB + wybarwionych wspólnie dla PSMC5 (Ryc. 2B). Dodatkowo przeprowadziliśmy eksperymenty koimmunoprecypitacji na ekstraktach NAc i stwierdziliśmy, że po przewlekłym leczeniu kokainą ΔFosB został skutecznie ściągnięty przez przeciwciało anty-PSMC5 (Rys 2C). W przeciwieństwie do tego, analiza NAc nieleczonych wcześniej lekiem (po wielokrotnych wstrzyknięciach soli fizjologicznej) nie wykazała wykrywalnego obniżenia ΔFosB (dane nie pokazane). Dane te są zgodne z naszymi odkryciami w hodowli komórkowej i potwierdzają, że ΔFosB i PSMC5 oddziałują w NAc in vivo.

miniatur
Ryc. 2. Regulacja PSMC5 w mysim NAc.

 

A. Western blotting jądrowych i cytozolowych frakcji NAc myszy traktowanych codziennie solą fizjologiczną lub kokainą (20 mg/kg) przez 7 dni, ze zwierzętami analizowanymi 24 godziny po ostatnim wstrzyknięciu. Kokaina zwiększa jądrowe, ale nie cytozolowe poziomy PSMC5. Histon H3 i ß-aktyna, na które kokaina nie miała wpływu, zastosowano jako kontrole ładowania. Dane to średnia ± SEM (n = 8–10/grupę, *p<0.05). B. Kolokalizacja endogennego PSMC5 (zielony) i ΔFosB (niebieski) w NAc myszy leczonych przewlekle kokainą jak w AC Lizaty jądrowe mysiego NAc po przewlekłym leczeniu kokainą poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-PSMC5 lub mysią IgG jako kontrolą , a następnie Western blot z przeciwciałem anty-FosB / ΔFosB. Rysunek przedstawia interakcje PSMC5-ΔFosB w NAc in vivo. Dane w B i C powtórzono trzykrotnie w każdym z trzech oddzielnych eksperymentów.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 zwiększa ekspresję ΔFosB in vitro

Ponieważ PSMC5 jest znanym członkiem kompleksu proteasomu, przetestowaliśmy, czy reguluje poziomy ΔFosB przy użyciu komórek Rat 1A. Nadekspresja PSMC5 nie miała wpływu na podstawowe poziomy ΔFosB, ale powodowała niewielkie, ale znaczące zwiększenie indukcji ΔFosB po stymulacji komórek surowicą (Ryc. 3A). Podobny trend zaobserwowano dla pełnej długości FosB, ale efekt nie osiągnął istotności statystycznej. I odwrotnie, supresja endogennej ekspresji PSMC5 w komórkach szczura 1A, osiągnięta przez zastosowanie siRNA ukierunkowanych na PSMC5, nie wpłynęła na podstawowe poziomy ΔFosB, ale silnie hamowała indukcję ΔFosB przez stymulację surowicy (Ryc. 3B). Podobne efekty zaobserwowano dla pełnej długości FosB. Dane te sugerują, że PSMC5 nie promuje proteasomalnej degradacji ΔFosB, jak można by się spodziewać jako podjednostka rdzenia proteasomu, ale zamiast tego jest wymagany do maksymalnej akumulacji FosB produkty genów in vitro, być może poprzez stabilizację białek.

miniatur
Ryc. 3. Regulacja PSMC5 ekspresji FosB/ΔFosB w komórkach Rat 1A.

 

A. Komórki szczura 1A transfekowano 4 μg PSMC5 lub kontrolnym DNA. Nadekspresja PSMC5 nie miała wpływu na podstawowe poziomy ekspresji białka FosB lub ΔFosB, jak określono metodą Western blotting, ale spowodowała niewielki, ale znaczący wzrost indukcji ΔFosB przez stymulację surowicą (F(2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Komórki szczura 1A transfekowano 5 pmolami jednego z dwóch siRNA lub wymieszanego RNA (kontrola). Oba siRNA skutecznie obniżyły poziomy białka PSMC5 w porównaniu z warunkami kontrolnymi (siRNA nr 1, 23 ± 5% kontroli; siRNA nr 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Knockdown PSMC5 nie miał wpływu na podstawowe poziomy FosB lub ΔFosB, ale osłabiał indukcję zarówno FosB, jak i ΔFosB przez stymulację surowicy (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB i PSMC5 tworzą kompleksy z CBP, p300 i BRG1 w NAc

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy transkrypcyjne, za pomocą których PSMC5 może wpływać na funkcję ΔFosB, zbadaliśmy możliwych dodatkowych partnerów wiążących dla dwóch białek w NAc w przewlekłych warunkach leczenia kokainą. Istnieje jedno doniesienie, że PSMC5 wiąże się z CBP – HAT – i zwiększa acetylację histonu H3 na proksymalnym promotorze MHC-II w komórkach HeLa [22]. Co więcej, myszy z niedoborem CBP wykazują zmniejszoną wrażliwość behawioralną na kokainę, jak również zmniejszoną acetylację histonów w FosB promotor [23]. W ten sposób przetestowaliśmy, czy PSMC5 może wiązać się z ΔFosB jako część kompleksów, które zawierają również CBP i być może inne aktywatory transkrypcji.

Najpierw wykazaliśmy, że ΔFosB skutecznie obniżył zarówno CBP, jak i p300, pokrewny HAT, w komórkach Neuro2A (Ryc. 4A). W przeciwieństwie do tego, zmutowana postać ΔFosB z zamkiem leucynowym, zgodnie z oczekiwaniami, nie wykazywała tej aktywności. Podobnie PSMC5 skutecznie obniżyło CBP i p300 (Ryc. 4B). Co ciekawe, efekt ten zaobserwowano również dla PSMC5-ΔCC, który nie obniżył ΔFosB, co wskazuje, że PSMC5 oddziałuje z CBP i p300 poprzez inne domeny białka i niezależnie od jego wiązania z ΔFosB.

miniatur
Ryc. 4. ΔFosB i PSMC5 oddziałują z CBP, p300 i BRG1 in vitro i in vivo.

 

A. Komórki Neuro2A transfekowano 2.4 μg znakowanego MYC ΔFosB lub znakowanego MYC ΔFosB-LZM. Ekstrakty komórkowe poddano immunoprecypitacji przeciwciałem anty-CBP lub anty-p300, a osady poddano analizie Western blot z tym samym przeciwciałem lub przeciwciałem anty-MYC. Zarówno CBP, jak i p300 oddziałują z ΔFosB i takie interakcje wymagają nienaruszonego zamka leucynowego. B. Komórki Neuro2A transfekowano 2.4 μg znakowanego FLAG PSMC5 lub znakowanego FLAG PSMC5-ΔCC. Ekstrakty komórkowe poddano immunoprecypitacji przeciwciałem anty-CBP lub anty-p300, a osady poddano analizie Western blot z tym samym przeciwciałem lub przeciwciałem anty-FLAG. Zarówno CBP, jak i p300 wchodzą w interakcje z PSMC5 i takie interakcje nie wymagają domeny CC. C. Lizaty jądrowe mysiego NAc po przewlekłym leczeniu kokainą poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-CBP lub anty-p300. Późniejsza analiza Western blot powstałych osadów z przeciwciałem anty-FosB/ΔFosB wykazała endogenne interakcje między ΔFosB i CBP/p300. D. Porcje tych samych lizatów jądrowych poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-BRG1 lub anty-PSMC5, a następnie Western blotting osadów z przeciwciałem anty-FosB/ΔFosB lub anty-BRG1. Wyniki pokazują endogenne interakcje między ΔFosB i BRG1 oraz BRG1 i PSMC5. E. Schematyczna ilustracja transkrypcyjnego kompleksu aktywacyjnego złożonego z heterodimerów ΔFosB:JunD oddziałujących z CBP/p300, BRG1 i PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Aby potwierdzić, że te interakcje występują również in vivo, podawaliśmy kokainę przewlekle w celu indukcji poziomów ΔFosB i jądrowego PSMC5, a następnie immunoprecypitowanych ekstraktów NAc z przeciwciałami anty-CBP lub anty-p300. Zgodnie z naszymi danymi z hodowli komórkowych, immunoprecypitacja CBP lub p300 skutecznie obniżyła ΔFosB (Rys 4C). Zbadaliśmy, czy BRG1, podstawowa podjednostka kompleksu przebudowy chromatyny SWI-SNF, może również wiązać się z ΔFosB i PSMC5, w oparciu o nasze wcześniejsze odkrycie, że BRG1 jest rekrutowany do pewnych docelowych genów ΔFosB w porozumieniu z ich aktywacją w NAc po przewlekłej kokainie [24]. Stwierdziliśmy, że immunoprecypitacja BRG1 obniżyła ΔFosB w ekstraktach NAc i że immunoprecypitacja PSMC5 podobnie współstrącała endogenny BRG1 (Rys. 4D). Podsumowując, wyniki te sugerują, że ΔFosB-PSMC5 tworzy kompleksy w NAc, które obejmują również CBP / p300 i BRG1 (Rys. 4E).

Nadekspresja PSMC5 zwiększa reakcje lokomotoryczne na kokainę

Wybitne wiązanie PSMC5 z ΔFosB w NAc skłoniło nas do zbadania, czy zwiększenie poziomów PSMC5 w tym regionie mózgu reguluje reakcje behawioralne na kokainę. Wygenerowaliśmy wektor wirusa opryszczki pospolitej (HSV), który nadeksprymuje PSMC5 typu dzikiego lub jednego z jego mutantów i zweryfikowaliśmy wektory w NAc in vivo (Ryc. 5A). Ekspresja PSMC5 za pośrednictwem wirusów dominuje w jądrze komórkowym (Ryc. 5B). Myszy z nadekspresją PSMC5 typu dzikiego nie wykazywały zmienionych odpowiedzi na początkowe dawki kokainy, ale wykazywały zwiększoną aktywację lokomotoryczną w odpowiedzi na powtarzane dawki kokainy w porównaniu z myszami kontrolnymi wykazującymi ekspresję GFP. W przeciwieństwie do tego myszy z nadekspresją zmutowanej formy PSMC5 pozbawionej domeny typu coiled-coil (PSMC5-ΔCC) nie wykazywały tego efektu (Ryc. 5B). Co ciekawe, nadekspresja PSMC5-K196M, któremu brakuje aktywności ATPazy białka typu dzikiego, również nasiliła reakcje lokomotoryczne kokainy.

miniatur
Ryc. 5. Nadekspresja PSMC5 w NAc zwiększa reakcje lokomotoryczne na kokainę.

 

A. Reprezentatywna ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV w środkowej NAc. AC, spoidło przednie. Podregiony rdzenia i powłoki NAc zaznaczono na rysunku. B. Reprezentatywne większe powiększenia (60x) barwienia immunohistochemicznego PSMC5 w neuronach NAc po wstrzyknięciu HSV-PSMC5 pokazujące, że białko jest głównie jądrowe, co zaznaczono przez barwienie DAPI. C. Myszy otrzymały obustronne wstrzyknięcia HSV do NAc, a następnie codzienne wstrzyknięcia IP podprogowych dawek kokainy (7.5 mg/kg). Reakcje lokomotoryczne przedstawiono w odpowiedzi na pierwszą i ostatnią z 3 dziennych dawek leku. Nadekspresja PSMC5 lub PSMC5-K196M zwiększa reakcje lokomotoryczne na powtarzaną kokainę, efekt nie obserwowany w przypadku PSMC5-ΔCC. Nie było znaczącego wpływu transgenów na reakcje lokomotoryczne na początkowe dawki kokainy. ANOVA F(3,125) = 4.163, *p<0.05 w teście posthoc Dunnetta.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Dyskusja

Wyniki niniejszego badania ujawniają nowy mechanizm, dzięki któremu ΔFosB pośredniczy w swoim wpływie na mózg oraz nowy mechanizm związany z działaniem kokainy. Stosując obiektywne podejście, test dwuhybrydowy drożdży, zidentyfikowaliśmy PSMC5 jako nowego partnera wiążącego dla ΔFosB. Potwierdziliśmy to odkrycie zarówno w hodowanych komórkach in vitro, jak iw NAc in vivo, wykazując silne wiązanie PSMC5-ΔFosB. Co ważne, poziomy jądrowe PSMC5 są indukowane w NAc przez przewlekłe podawanie kokainy. Wykazaliśmy dalej, że wiązanie PSMC5-ΔFosB zachodzi wspólnie z kilkoma innymi białkami aktywującymi transkrypcję, mianowicie CBP i p300 (dwa HAT) oraz BRG1 (kluczowy składnik kompleksów przebudowy chromatyny SWI-SNF). Łącznie nasze odkrycia potwierdzają hipotezę, że PSMC5 jest częścią kompleksu aktywacji transkrypcji, który jest rekrutowany do przynajmniej niektórych genów indukowanych ΔFosB podczas przebiegu przewlekłego podawania kokainy (Rys. 4E). Zgodne z tą hipotezą jest dodatkowe odkrycie, że nadekspresja PSMC5 w NAc, podobnie jak nadekspresja samego ΔFosB, promuje reakcje behawioralne na kokainę. W przyszłych badaniach interesujące byłoby śledzenie tych obserwacji in vivo z charakterystyką interakcji PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 za pomocą testów reporterowych in vitro.

Zaangażowanie PSMC5 w działanie kokainy jest zupełnie nowe. Zidentyfikowany początkowo jako członek dużej rodziny ATPaz, które zawierają proteasom, PSMC5 przez lata wykazano, że wchodzi w interakcje z kilkoma czynnikami transkrypcyjnymi, w tym c-Fos, p53, jądrowymi receptorami hormonów i składnikami podstawowego kompleksu transkrypcyjnego.25] jednak na przestrzeni lat przeprowadzono niewiele badań funkcjonalnych [26]. Jego najlepiej poznanym działaniem jest promowanie aktywności czynników transkrypcyjnych MYC w hodowanych komórkach [27]. Implikacja PSMC5 w mechanizmach transkrypcyjnych sugeruje potencjalną rolę ubikwitynacji-proteasomalnej aktywności w regulacji transkrypcji genów, ale udział PSMC5 w takiej regulacji pozostaje do tej pory praktycznie niezbadany [28,29].

Niewiele wiadomo na temat funkcji PSMC5 w mózgu. Wcześniejsze badanie wykazało powszechną ekspresję mRNA PSMC5 w mózgu [30], ale jego aktywność funkcjonalna pozostaje niezbadana. Nasze odkrycia skłaniają teraz do dalszych badań tego interesującego białka, aby lepiej zrozumieć jego rolę w regulacji transkrypcji genów i jego związek z funkcją ubikwitynacji-proteasomów w mózgu. W wiązaniu PSMC5 z ΔFosB pośredniczy domena zwiniętej cewki PSMC5. Co więcej, zdolność PSMC5 do promowania odpowiedzi lokomotorycznych na kokainę, wymagając domeny typu coiled-coil, nie wymaga aktywności ATPazy, która jest nieodłączna dla białka. Wyniki te stwarzają możliwość, że przynajmniej w naszym systemie główna aktywność PSMC5 może być pośredniczona przez jego wiązanie z ΔFosB i innymi transkrypcyjnymi białkami regulatorowymi, a nie przez jego aktywność związaną z proteasomami per se. Potrzebne są dalsze prace, aby bezpośrednio przetestować to i alternatywne możliwości. Hipoteza, że ​​nadekspresja PSMC5 za pośrednictwem wirusów zwiększa reakcje lokomotoryczne na kokainę poprzez interakcje z ΔFosB, jest wiarygodna, pomimo stosowania 3-dniowego schematu leczenia kokainą, ponieważ wiadomo, że znaczne poziomy ΔFosB gromadzą się w mózgu w tym przedziale czasowym [3].

Obecne odkrycia dodatkowo potwierdzają użyteczność stosowania obiektywnych, otwartych podejść eksperymentalnych w badaniu molekularnych podstaw regulacji mózgu. Nasza początkowa uwaga na PSMC5 opierała się wyłącznie na jego wyraźnym wiązaniu z ΔFosB w teście dwuhybrydowym drożdży, ale wydaje się, że jest ważnym składnikiem zmian transkrypcyjnych, które są rekrutowane w NAc przez wielokrotne podawanie kokainy. Obecne badania koncentrują się na lepszym zrozumieniu szczegółowych mechanizmów, za pomocą których poziomy jądrowe PSMC5 są indukowane przez kokainę, a z kolei, przez które PSMC5 przyczynia się następnie do indukowanych kokainą kompleksów aktywacji transkrypcji. Tymczasem nasz test dwuhybrydowy na drożdżach ujawnił kilka dodatkowych domniemanych partnerów wiążących ΔFosB (Tabela 1), które obecnie również uzasadniają bezpośrednie badanie w modelach kokainowych. Razem praca ta przyczynia się do lepszego zrozumienia złożonych mechanizmów molekularnych, poprzez które kokaina zmienia funkcję NAc.

Podziękowanie

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu ds. Narkomanii oraz Fundacji Ishibashi i Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (numery KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Autorskie Wkłady

Wymyślił i zaprojektował eksperymenty: YHO YNO EJN. Eksperymenty wykonali: YHO YNO PJK RN. Przeanalizowałem dane: YHO YNO EJN. Przekazane odczynniki/materiały/narzędzia analityczne: TN MO OY AN RN TT. Napisał artykuł: YHO EJN.

Referencje

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Natychmiastowe wczesne geny: dziesięć lat później. Trendy Neurosci 18: 66–67. pmid:7537412 doi: 10.1016/0166-2236(95)80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkrypcyjne mechanizmy uzależnienia: rola deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245–3255. doi: 10.1098/rstb.2008.0067. pmd:18640924
  3. Zobacz artykuł
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Zobacz artykuł
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Zobacz artykuł
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Zobacz artykuł
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Zobacz artykuł
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Zobacz artykuł
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Zobacz artykuł
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Zobacz artykuł
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Zobacz artykuł
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Zobacz artykuł
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Zobacz artykuł
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Zobacz artykuł
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Zobacz artykuł
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Zobacz artykuł
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Zobacz artykuł
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Zobacz artykuł
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Zobacz artykuł
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Zobacz artykuł
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Zobacz artykuł
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Zobacz artykuł
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Zobacz artykuł
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Zobacz artykuł
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Zobacz artykuł
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Zobacz artykuł
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Zobacz artykuł
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Zobacz artykuł
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Zobacz artykuł
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Zobacz artykuł
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Zobacz artykuł
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y i in. (1994) Indukcja długotrwałego kompleksu AP-1 złożonego ze zmienionych białek podobnych do Fos w mózgu przez przewlekłą kokainę i inne przewlekłe terapie. Neuron 13: 1235–1244. pmid:7946359 doi: 10.1016/0896-6273(94)90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB zmutowane myszy: Utrata przewlekłej indukcji kokainy białek związanych z Fos i zwiększona wrażliwość na psychomotoryczne i satysfakcjonujące efekty kokainy. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid:9294222 doi: 10.1073/pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulacja stabilności ΔFosB przez fosforylację. J Neurosci 26: 5131–5142. pmid:16687504 doi: 10.1523/jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A i in. (2007) Brak konserwatywnej C-końcowej domeny degronu przyczynia się do wyjątkowej stabilności ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009–3019. pmd:17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M i in. (2013) Reakcje behawioralne i strukturalne na przewlekłą kokainę wymagają pętli sprzężenia zwrotnego obejmującej ΔFosB i CaMKII w powłoce jądra półleżącego. J Neurosci 33: 4295–4307 doi: 10.1523/JNEUROSCI.5192-12.2013. pmd:23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM i in. (1999) Ekspresja czynnika transkrypcyjnego ΔFosB w mózgu kontroluje wrażliwość na kokainę. Natura 401: 272–276. pmd:10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB zwiększa zachętę do używania kokainy. J Neurosci 23: 2488–2493. pmd:12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacja ekspresji genów i nagrody za kokainę przez CREB i DFosB. Nat Neurosci 11: 1208–1215. pmid:14566342 doi: 10.1038/nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB i in. (2006) ΔFosB: Zasadnicza rola ΔFosB w jądrze półleżącym w działaniu morfiny. Natura Neurosci 9: 205–211. pmid:16415864 doi: 10.1038/nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P i in. (2003) Indukowalna, specyficzna dla obszaru mózgu ekspresja dominującego negatywnego mutanta c-Jun u myszy transgenicznych zmniejsza wrażliwość na kokainę. Mózg Res 970: 73–86. pmid:12706249 doi: 10.1016/s0006-8993(03)02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y i in. (1995) Regulacja delta FosB i białek podobnych do FosB przez napady elektrowstrząsowe i leczenie kokainą. Mol Pharmacol 48: 880-889. pmd:7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA i in. (1998) Istotna rola genu fosB w molekularnych, komórkowych i behawioralnych działaniach napadów elektrowstrząsowych. J Neurosci 18: 6952–6962. pmd:9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) Parkinsonizmowi MPTP towarzyszy trwała ekspresja białka podobnego do D-FosB w szlakach dopaminergicznych. Mol mózgu Res 53: 41-52. pmid:9473580 doi: 10.1016/s0169-328x(97)00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Konwersja eukariotycznego inhibitora transkrypcji w aktywator. Cela 55: 443–446. pmid:3180218 doi: 10.1016/0092-8674(88)90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) The two-hybrid system: metoda identyfikacji i klonowania genów dla białek, które oddziałują z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578–9582. pmid:1946372 doi: 10.1073/pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferacyjna aktywacja spoczynkowych komórek Rat-1A przez delta FosB. Mol Cell Biol 13:4157-4166. pmid:8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Istotna rola poli(ADP-rybozylacji) w działaniu kokainy. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005–2010. doi: 10.1073/pnas.1319703111. pmd:24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Wyraźne wzorce indukcji ΔFosB w mózgu przez narkotyki. Synapsa 62: 358–369. doi: 10.1002/syn.20500. pmd:18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 i c-Fos w jądrowym proteasomie 26S. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236–8240. pmid:8710853 doi: 10.1073/pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regulacja acetylacji proksymalnego promotora głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II przez proteasomalną ATPazę Sug19 1S. Mol Cell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128/MCB.00535-08. pmd:18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) Białko wiążące CREB kontroluje odpowiedź na kokainę przez acetylowanie histonów na promotorze fosB w prążkowiu myszy. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186–19191. pmid:16380431 doi: 10.1073/pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Przebudowa chromatyny jest kluczowym mechanizmem leżącym u podstaw plastyczności indukowanej kokainą w prążkowiu. Neuron 48: 303–314. pmid:16242410 doi: 10.1016/j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Podwójne funkcje regulatorów transkrypcji: mit czy rzeczywistość. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002/(sici)1097-4644(1999)75:32+<32::aid-jcb5>3.0.co;2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Regulacyjne interakcje podjednostek proteasomu 26S, złożony problem. Trendy Biochem Sci 25:83–88. pmid:10664589 doi: 10.1016/s0968-0004(99)01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikacja układu ubikwityna/proteasom w transkrypcji regulowanej przez myc. Cykl komórkowy 2–5: 403–407. doi: 10.4161/cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubikwityna i proteasomy w transkrypcji. Annu Rev Biochem 81: 177–201. doi: 10.1146/annurev-biochem-052110-120012. pmd:22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasom: narzędzie użytkowe do transkrypcji? Curr Op Genet Dev 16: 197–202. pmd:16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identyfikacja konserwatywnego filogenetycznie członka rodziny CAD Sug1, który ulega różnej ekspresji w mysim układzie nerwowym. Dev Neurobiol 33: 877-890. doi: 10.1002/(sici)1097-4695(199712)33:7<877::aid-neu2>3.0.co;2-5