Impactul gamma-oryzanolului de orez brun asupra modulației epigenetice a receptorilor dopaminici D2 în striatum cerebral în obezitatea indusă de dieta bogată în grăsimi la șoareci (2017)

Abstract

Scopuri/ipoteză

Consumul excesiv de grăsimi alimentare cauzează obezitate la oameni și rozătoare. Studii recente pe oameni și rozătoare au demonstrat că dependența de grăsimi împărtășește un mecanism comun cu dependența de alcool, nicotină și narcotice în ceea ce privește disfuncția sistemelor de recompensă ale creierului. S-a evidențiat că o dietă bogată în grăsimi (HFD) atenuează semnalizarea receptorului dopaminergic D2 (D2R) în striat, un regulator esențial al sistemului de recompensă a creierului, ducând la supraalimentarea hedonică. Am raportat anterior că constituentul bioactiv specific orezului brun γ-orizanol a atenuat preferința pentru un HFD prin control hipotalamic. Prin urmare, am explorat posibilitatea ca γ-orizanolul să moduleze funcționarea sistemului de recompensă a creierului la șoareci.

Metode

Șoarecii masculi C57BL/6J hrăniți cu HFD au fost tratați pe cale orală cu y-orizanol și au fost evaluate nivelurile striate ale moleculelor implicate în semnalizarea D2R. A fost examinat impactul γ-orizanolului asupra metilării ADN-ului promotorului D2R și modificările ulterioare ale preferințelor pentru grăsimile alimentare. În plus, au fost investigate efectele 5-aza-2′-deoxicitidinei, un inhibitor puternic al ADN metiltransferazelor (DNMT), asupra preferinței alimentare, semnalizării D2R și nivelurilor de DNMT în striat. Efectele inhibitoare ale γ-orizanolului asupra activității DNMT au fost evaluate enzimatic in vitro.

REZULTATE

În striatul de la șoarecii hrăniți cu HFD, producția de D2R a fost scăzută printr-o creștere a metilării ADN-ului regiunii promotoare a D2R. Administrarea orală de γ-orizanol a scăzut expresia și activitatea DNMT, restabilind astfel nivelul D2R în striat. Inhibarea farmacologică a DNMT-urilor de către 5-aza-2′-deoxicitidină a ameliorat, de asemenea, preferința pentru grăsimile alimentare. În concordanță cu aceste constatări, testele enzimatice in vitro au demonstrat că γ-orizanolul a inhibat activitatea DNMT-urilor.

Concluzii/interpretare

Am demonstrat că γ-orizanolul ameliorează hipermetilarea ADN-ului indusă de HFD a regiunii promotoare a D2R în striatul șoarecilor. Paradigma noastră experimentală evidențiază γ-oryzanol ca o substanță antiobezitate promițătoare, cu proprietatea distinctă de a fi un modulator epigenetic nou.

Material suplimentar electronic

Versiunea online a acestui articol (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) conține material suplimentar revizuit de colegi, dar needitat, care este disponibil pentru utilizatorii autorizați.

Cuvinte cheie: Metilarea ADN-ului, dopamină, epigenetică, comportament alimentar, nutriție, obezitate, recompensă, striat, diabet de tip 2

Introducere

Mâncarea excesivă la persoanele obeze are în comun, cel puțin parțial, mecanisme comune cu dependența de alcool, nicotină și narcotice.]. Pe lângă reglarea hipotalamică și hormonală a apetitului, sistemul de recompensă a creierului, în special semnalizarea receptorilor de dopamină, este strâns legat de comportamentul alimentar dependent sau hedonic.]. Un studiu anterior la șobolani a arătat că distrugerea receptorului striatal de dopamină D2 (D2R) de către ARN-ul scurt de interferență mediat de lentivirus a indus rapid deficite de recompensă asemănătoare dependenței și căutarea de hrană asemănătoare constrângerii.]. Din cauza densității reduse a D2R, striatul dorsal este mai puțin receptiv la recompensa alimentară în comparație cu grupurile de control slabe la oameni obezi și rozătoare.-]. În conformitate cu această noțiune, TaqIA alela a ANKK1 Locul genei (care codifică repetarea DRD2/anchirinei și domeniul kinazei care conține 1), care scade producția de D2R striatală, este asociat cu un fenotip obez la om.], în timp ce efectele pierderii în greutate după intervenția chirurgicală bariatrică sunt asociate cu densitatea D2R striatală crescută []. Aceste date sugerează cu tărie importanța D2R striatale ca o nouă țintă terapeutică pentru tratamentul obezității. Cu toate acestea, unele medicamente care au fost dezvoltate care au acționat asupra sistemului de recompensă a creierului au provocat efecte adverse considerabile, inclusiv probleme psihiatrice grave, ducând la eventuala retragere a acestora din clinici.].

Modificările epigenetice sunt esențiale nu numai pentru dezvoltare și diferențiere, ci și pentru că apar ca urmare a schimbărilor de mediu, inclusiv în dieta și stilul de viață.]. Metilarea ADN-ului este un eveniment epigenetic principal pentru stabilitatea expresiei genelor.]. La șobolani, expunerea mamei la o dietă bogată în grăsimi (HFD) modifică intergenerațional metilarea ADN-ului în sistemul central de recompensă la urmași, ceea ce duce la un consum excesiv de HFD de către pui.]. În special, ADN-metiltransferazele (DNMT) joacă un rol critic în reglarea comportamentului de hrănire și a activității fizice., ], sugerând că DNMT-urile ar putea fi ținte terapeutice promițătoare pentru terapia sindromului obezitate-diabet. Foarte important, unele substanțe naturale derivate din alimente, inclusiv acidul cafeic și epigalocatechina, sunt cunoscute că acționează ca inhibitori ai DNMT., ].

Am demonstrat recent că componenta bioactivă, specifică orezului brun, γ-orizanol, un amestec de ester al acidului ferulic și mai mulți fitosteroli, atenuează preferința pentru grăsimile alimentare prin scăderea stresului reticulului endoplasmatic hipotalamic (ER).]. La șoareci și iepuri, γ-orizanolul administrat pe cale orală a fost absorbit rapid din intestin și distribuit în principal în creier., ]. Luând împreună aceste constatări, produsele naturale derivate din alimente care acționează asupra sistemului nervos central ar putea fi o alternativă pentru a ameliora în siguranță comportamentul alimentar afectat în obezitate. În acest context, am testat ipoteza că γ-orizanolul ar modifica starea de metilare a ADN-ului în sistemul de recompensă a creierului, rezultând o atenuare a preferinței pentru un HFD la șoareci.

Metode

animale

Șoarecii masculi C57BL/6J în vârstă de șapte săptămâni obținuți de la Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonia) au fost găzduiți (3-4 per cușcă) în condiții lipsite de agenți patogeni specifici la 24°C la o lumină de 12 ore/12 ore/ ciclu întuneric. După o săptămână de aclimatizare, șoarecii în vârstă de 8 săptămâni au fost egalați în funcție de greutate și împărțiți în două sau trei grupuri pentru a fi supuși fiecărui experiment. Șoarecilor li s-a permis accesul liber la hrană și apă. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de etică a experimentelor cu animale al Universității din Ryukyus (nr. 5352, 5718 și 5943).

Administrarea de γ-orizanol și 5-aza-2′-deoxicitidină

Pentru a evalua preferința pentru HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia) a fost administrat șoarecilor de 8 săptămâni prin gavage în timpul testului de alegere a alimentelor, așa cum s-a descris anterior., ]. Pentru celelalte experimente, un HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA) care conține 0.4% y-orizanol a fost fabricat sub formă de pelete. Componentele dietei sunt prezentate în tabelul cu materiale suplimentare electronice (ESM). 1. După 12 săptămâni de hrănire, țesutul a fost colectat din striat și hipotalamus. Aportul zilnic de γ-orizanol, estimat din aportul mediu de hrană al șoarecilor, a fost de aproximativ 320 μg/g greutate corporală. Dozele de γ-orizanol au fost determinate așa cum s-a descris anterior []. 5-aza-2′-deoxicitidina (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) a fost injectată intraperitoneal (0.25 μg/g greutate corporală) de trei ori pe săptămână timp de 12 săptămâni.].

Estimarea preferinței pentru grăsimi alimentare

Pentru a evalua preferințele pentru grăsimile dietetice, testele alimentare au oferit o alegere între mâncare și HFD (D12450B și D12451; Diete de cercetare), așa cum a fost descris anterior.]. Componentele dietei sunt prezentate în Tabelul ESM 1. Pe scurt, șoarecilor li sa permis accesul liber la mâncare și HFD. Aporturile de mâncare și HFD au fost măsurate săptămânal și analizate pentru modificări ale preferinței pentru grăsimile alimentare. Preferința HFD a fost calculată după formula: preferință HFD = [(aportul HFD/aportul total de alimente) × 100].

Secvențierea bisulfiților pentru metilarea ADN-ului

ADN-ul a fost purificat folosind un kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokyo, Japonia). Soluția de ADN a fost amestecată cu 3 mol/l NaOH proaspăt preparat, incubată la 37°C timp de 15 min și adăugată la 5.3 mol/l uree, 1.7 mol/l bisulfit de sodiu și 4.9 mmol/l hidrochinonă. Soluția a fost supusă la 15 cicluri de denaturare la 95°C timp de 30 s și incubare la 50°C timp de 15 minute.]. ADN-ul tratat cu bisulfit a fost purificat folosind MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) și amplificat prin PCR utilizând un KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, SUA) și primeri în jurul situsului CpG al regiunii promotoare a D2R . Secvențele primerului au fost după cum urmează: primer înainte, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3′; primer invers, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3′. Apoi, secvențele adaptorului au fost adăugate și curățate folosind Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, SUA). Probele au fost apoi reunite și încărcate pe un GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japonia) pentru secvențiere conform protocolului producătorului. Nivelul de metilare a fost exprimat ca procent de citozine metilate în toate reziduurile de citozină.

Testul activității DNMT

Analiza activității enzimatice DNMT a fost efectuată utilizând un kit de testare pentru activitate/inhibire a metiltransferazei ADN EpiQuik (Epigentek Group, Brooklyn, NY, SUA) și kit de testare a metiltransferazei EPIgeneous (Cisbio Japonia, Chiba, Japonia) conform protocoalelor producătorului.

Pentru a evalua activitatea inhibitoare a fiecărui compus asupra metilării ADN-ului, formarea de S-adenosil-l-homocisteina (SAH) a fost măsurată în prezența fiecărui compus (20 μmol/l pentru testele de screening), S-adenosil metionină (SAM; 10 μmol/l) și substrat DNMT (4 ng/μl) la 37°C timp de 90 min. Pentru a evalua cinetica Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol/l) a fost incubat cu γ-oryzanol, SAM (5 μmol/l) și concentrația indicată de poli dI-dC la 37°C timp de 90 de minute. DNMT3a (100 μmol/l) și DNMT3b (100 μmol/l) au fost incubate cu γ-orizanol, SAM (5 μmol/l) și concentrația indicată de poli dG·dC la 37°C timp de 120 min. Testele au fost efectuate în patru exemplare. Proteina extrasă (0.75 mg/ml) a fost incubată cu SAM (5 μmol/l), poli dI-dC (5 μg/ml) și poli dG·dC (5 μg/ml) la 40°C timp de 120 de minute și Formarea SAH a fost măsurată.

Testul activității receptorului-γ legat de estrogen

Activitatea potențială antagonistă a γ-orizanolului asupra receptorului-γ legat de estrogen (ERRγ) a fost evaluată utilizând Sistemul de testare Gamma Reporter Receptor legat de estrogen uman (INDIGO Bioscience, State College, PA, SUA) conform protocolului producătorului. Pe scurt, celulele reporter de mamifere non-umane care exprimă constitutiv ERRγ activ au fost expuse la concentrațiile indicate ale fiecărui compus timp de 24 de ore în trei exemplare.

Western blotting

Aceasta a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [] cu anticorpi împotriva D2R (1:500, iepure), transportor de dopamină (DAT; 1:500, iepure), tirozin hidroxilază (TH; 1:1000, iepure) (AB5084P, AB1591P și AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, SUA), traductor de semnal și activator al transcripției 3α (STAT3α; 1:1000, iepure), DNMT1 (1:1000, iepure), DNMT3a (1:1000, iepure) (nr. 8768, 5032 și 3598; Cell Signaling Technology, Tokyo, Japonia), DNMT3b (1 μg/ml, iepure), ERRγ (1:1000, iepure) și β-actină (1:10,000, șoarece) (ab16049, ab128930 și ab6276; Abcam, Cambridge, MA, SUA).

PCR cantitativ în timp real

Expresia genei a fost examinată așa cum a fost descris anterior []. Nivelurile de ARNm au fost normalizate la Rn18s (ARNr 18S). Seturile de primeri utilizate pentru analizele cantitative PCR în timp real sunt rezumate în Tabelul ESM 2.

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. ANOVA unidirecțională și ANOVA cu măsuri repetate urmate de teste de comparație multiple (metoda Bonferroni-Dunn) au fost utilizate acolo unde este cazul. Elevi t testul a fost utilizat pentru a analiza diferențele dintre două grupuri. Diferențele au fost considerate semnificative la p <0.05.

REZULTATE

Inhibarea farmacologică a DNMT-urilor de către 5-aza-dC a atenuat preferința pentru grăsimile alimentare la șoareci

La șoarecii hrăniți cu HFD, metilarea ADN-ului în regiunea promotoare a D2R din striat a fost crescută semnificativ în comparație cu șoarecii hrăniți cu o dietă cu alimente (Fig. ​(Fig.1a).1A). Pe de altă parte, metilarea ADN-ului hipotalamic în regiunea promotoare a D2R a fost aparent mai mare decât cea din striatul sub o dietă cu mâncare.p < 0.01) (Fig. (Fig.1a,1a, f) și nu a fost modificată de HFD (Fig. ​(Fig.1f).1f). La șoarecii hrăniți cu HFD, metilarea ADN crescută în regiunea promotor a D2R din striat a fost normalizată prin tratament cu 5-aza-dC, un inhibitor puternic DNMT (Fig. ​(Fig.1a).1A). În schimb, metilarea ADN-ului în regiunea promotoare a D2R din hipotalamus nu a fost modificată semnificativ prin tratamentul cu 5-aza-dC (Fig. ​(Fig.1f).1f). În striatul șoarecilor masculi în vârstă de 20 de săptămâni hrăniți cu HFD timp de 12 săptămâni, ARNm și nivelurile de proteine ​​ale D2R au fost semnificativ scăzute (Fig. (Fig.1b,1b, k, l). În schimb, nivelurile de receptori de dopamină D1 (D1R, codificați de Drd1), care acționează în mod opus D2R-urilor asupra adenilil-ciclazei și semnalizării intracelulare mediate de cAMP, au fost neschimbate (Fig. ​(Fig.1c).1c). În plus, nu a existat nicio modificare a nivelurilor altor molecule legate de semnalizarea D2R, cum ar fi TH și DAT la nivel de ARNm și/sau proteine ​​(Fig. (Fig.1d,1d, e, k, m). Pe de altă parte, nu au fost observate modificări aparente în hipotalamus, inclusiv pentru D2R (Fig. ​(Fig.1g–m).1g–m). În special, nivelurile de proteine ​​ale D2R și TH din hipotalamus au fost mult mai mici decât cele din striat (Fig. (Fig.1l,1l, m), reflectând posibil importanța relativă a semnalizării receptorilor de dopamină în sistemul de recompensă a creierului în comparație cu hipotalamus.

Fig. 1 

Inhibarea DNMT-urilor de către 5-aza-dC atenuează preferința pentru un HFD prin creșterea D2R-urilor în striatul șoarecilor hrăniți cu HFD. Nivelurile de metilare a ADN-ului în regiunea promotoare a D2R din striat (n = 3) (a) și hipotalamus (n = 3) ...

Pentru a examina dacă metilarea ADN-ului în regiunea promotoare a D2R ar modifica preferința pentru grăsimile alimentare, a fost analizat comportamentul de hrănire al șoarecilor tratați cu 5-aza-dC. După cum era de așteptat, 5-aza-dC a crescut semnificativ nivelurile de ARNm și proteine ​​pentru D2R în striatul șoarecilor hrăniți cu HFD (Fig. (Fig.1b,1b, k, l). Pe de altă parte, nu a existat niciun efect asupra nivelurilor de Drd1, Th și Slc6a3 (codând DAT) în striat, sau la niveluri de Drd2, Drd1, Th și Slc6a3 în hipotalamus (fig. (Fig.1c–e,1c–e, g–m). În timp ce șoarecii tratați cu vehicul au preferat HFD, preferința pentru HFD a fost semnificativ scăzută la șoarecii tratați cu 5-aza-dC (88% din valorile pentru șoarecii tratați cu vehicul) (Fig. ​(Fig.1n).1n). În consecință, tratamentul cu 5-aza-dC a redus creșterea în greutate corporală (Fig. (Fig.11o).

γ-orizanolul scade nivelurile de DNMT în striatul șoarecilor hrăniți cu HFD

După cum am raportat anterior [], administrarea orală de γ-orizanol la șoareci masculi prin gavaj a atenuat semnificativ preferința pentru un HFD (93% din valorile pentru șoarecii tratați cu vehicul) (Fig. (Fig.2a),2a), rezultând o atenuare aparentă a creșterii în greutate corporală (Fig. ​(Fig.2b).2b). Prin urmare, am explorat impactul potențial al γ-orizanolului asupra modulării epigenetice a D2R în striat.

Fig. 2 

Efectul inhibitor al γ-orizanolului asupra DNMT-urilor la șoarecii hrăniți cu HFD. preferinta HFD (a) și greutatea corporală (b) la șoarecii tratați cu γ-orizanol în timpul testelor de alegere a hranei pentru mâncare vs HFD (n = 4 cuști; trei șoareci pe cușcă). Nivelurile de ARNm pentru ...

La mamifere, există trei DNMT majore - DNMT1, 3a și 3b. DNMT1 funcționează pentru a menține metilarea ADN-ului, în timp ce DNMT3a și 3b joacă un rol în facilitarea metilării ADN-ului de novo.]. Pentru a explora impactul potențial al γ-oryzanolului asupra DNMT-urilor in vivo, am evaluat nivelurile de DNMT în creierul șoarecilor hrăniți cu HFD. Deși HFD per se nu a avut niciun efect asupra nivelurilor de ARNm și proteine ​​ale DNMT-urilor nici în striat, fie în hipotalamus, suplimentarea cu γ-orizanol a scăzut semnificativ nivelurile de DNMT în striat, dar nu și în hipotalamus (Fig. (Fig.2c–e,2c–e, g–i, k–n). Aceste date ridică posibilitatea ca γ-orizanolul să regleze nivelurile de DNMT într-o manieră specifică striatului. Într-o manieră similară, 5-aza-dC a scăzut semnificativ nivelurile de ARNm de DNMT3a și 3b în mod preferențial în striat (ESM Fig. 1anunț).

Pe baza unui studiu anterior care arăta că nivelul ARNm al DNMT1 a fost reglat pozitiv, cel puțin parțial, de receptorul nuclear ERRγ.], am examinat efectul potențial al γ-orizanolului asupra activității ERRγ. În celulele de mamifere non-umane care exprimă constitutiv ERRγ activ, 4-hidroxi tamoxifenul, un agonist invers puternic al ERRγ, a scăzut semnificativ activitatea ERRγ. De notat, γ-orizanolul a scăzut parțial activitatea ERRγ (o reducere cu aproximativ 40% a valorii înnăscute) (Fig. ​(Fig.3a).3A). Important, ERRγ a fost foarte exprimat în striat, dar nu și în hipotalamus (Fig. ​(Fig.3b–d).3b–d). Spre deosebire de situația pentru striat, γ-orizanolul a crescut semnificativ nivelurile de proteine ​​ale DNMT1 numai în hipotalamus (Fig. (Fig. 2k, 2k, l). Aceste rezultate ar putea fi explicate, cel puțin parțial, prin descoperirea noastră că STAT3α, un regulator pozitiv al nivelului DNMT1 [], a fost exprimat abundent în hipotalamus, dar nu și în striat (Fig. (Fig.33de exemplu).

Fig. 3 

Impactul γ-orizanolului asupra activității ERRγ și STAT3α. (a) Efectul inhibitor al γ-orizanolului asupra ERRγ in vitro. Curbele doză-răspuns ale activităților ERRγ cu γ-orizanol (cercuri negre), acid ferulic ...

Pentru a evalua în continuare impactul γ-orizanolului asupra activității DNMT-urilor in vivo, formarea SAH, un produs secundar al metilării ADN-ului și, de asemenea, un inhibitor puternic al DNMT-urilor, a fost evaluată la șoarecii tratați cu γ-orizanol hrăniți cu HFD. Nu au existat modificări semnificative în formarea SAH nici în striat, nici în hipotalamus între șoarecii hrăniți cu HFD și hrăniți cu alimente (Fig. (Fig.2f,2f, j). În mod vizibil, γ-orizanolul a scăzut semnificativ formarea de SAH în striat (Fig. (Fig.2f)2f) dar nu în hipotalamus (Fig. (Fig.2j),2j), sugerând că γ-orizanolul poate suprima activitatea DNMT-urilor într-o manieră specifică striatumului la șoarecii hrăniți cu HFD.

Analize enzimatice asupra proprietăților inhibitorii ale γ-orizanolului pentru DNMT in vitro

Apoi am evaluat impactul γ-orizanolului asupra activității DNMT in vitro. Au fost evaluate potențele inhibitoare ale y-orizanolului, acidului ferulic, 5-aza-dC, haloperidolului (un antagonist reprezentativ D2R), quinpirol (un agonist reprezentativ D2R) și SAH împotriva DNMT. Ca control pozitiv, SAH a atenuat puternic activitățile DNMT într-o manieră dependentă de doză (Fig. ​(Fig.4a–f).4a–f). După cum era de așteptat, haloperidolul și quinpirolul nu au arătat niciun efect asupra activităților DNMT (ESM Fig. 2). În mod vizibil, γ-orizanolul a inhibat semnificativ activitățile DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol/l), 3a (IC50 = 22.3 μmol/l) și 3b (inhibare maximă 57%) (Fig. ​(Fig.4d–f).4d–f). În schimb, activitatea inhibitorie a acidului ferulic, un metabolit al γ-orizanolului, a fost mult mai mică decât cea a γ-orizanolului (Fig. (Fig.44d–f).

Fig. 4 

Efectul inhibitor al γ-orizanolului asupra DNMT-urilor in vitro. Teste de screening cu randament ridicat pentru potențialii inhibitori ai DNMT1 (a), DNMT3a (b) și DNMT3b (c). Potențiale inhibitoare împotriva DNMT pentru γ-orizanol, acid ferulic (un metabolit al γ-orizanol), ...

Am investigat în continuare proprietățile inhibitoare ale γ-orizanolului pe DNMT. Formarea SAH a fost măsurată pentru a evalua activitatea inhibitoare a γ-orizanolului pe DNMT in vitro. Datele despre formarea SAH în timpul metilării ADN-ului mediată de DNMT indică un model saturabil al cineticii Michaelis-Menten atât pentru prezența, cât și pentru absența γ-orizanolului (Fig. ​(Fig.4g–i).4g–i). În metilarea ADN-ului mediată de DNMT1, analiza Eadie-Hofstee a demonstrat că γ-orizanolul nu a arătat niciun efect asupra V max de formare a SAH (vehicul, 597 pmol/min; γ-orizanol 2 μmol/l, 619 pmol/min; γ-orizanol 20 μmol/l, 608 pmol/min), în timp ce γ-orizanol aparent a crescut K m (vehicul, 0.47 μg/ml; γ-orizanol 2 μmol/l, 0.67 μg/ml; γ-orizanol 20 μmol/l, 0.89 μg/ml) (Fig. ​(Fig.4j).4j). Aceste rezultate sugerează că y-orizanolul inhibă DNMT1 cel puțin parțial într-o manieră competitivă. Pe de altă parte, pentru metilarea ADN-ului mediată de DNMT3a și 3b, γ-orizanolul a scăzut V max de formare a SAH (DNMT3a: vehicul, 85.3 pmol/min; γ-orizanol 2 μmol/l, 63.1 pmol/min; γ-orizanol 20 μmol/l, 42.5 pmol/min; DNMT3b: vehicul, 42.3 pmol/min; γ -orizanol 2 μmol/l 28.0 pmol/min, γ-orizanol 20 μmol/l, 15.0 pmol/min) și, în mod similar; K m pentru această reacție (DNMT3a: vehicul, 0.0086 μg/ml; γ-orizanol 2 μmol/l, 0.0080 μg/ml; γ-orizanol 20 μmol/l, 0.0058 μg/ml; DNMT3b: vehicul, 0.0122 μg/ml; orizanol 2 μmol/l, 0.0097 μg/ml γ-orizanol 20 μmol/l, 0.0060 μg/ml) (Fig. (Fig. 4k, 4k, l). Aceste rezultate sugerează că y-orizanolul inhibă DNMT3a și 3b cel puțin parțial într-o manieră necompetitivă.

γ-orizanolul crește nivelurile de D2R în striatul șoarecilor hrăniți cu HFD

Apoi am testat posibilitatea ca γ-orizanolul să crească conținutul de D2R striat printr-o inhibare a DNMT. La șoarecii hrăniți cu HFD, administrarea orală de γ-orizanol a scăzut semnificativ metilarea ADN-ului striat în regiunea promotoare a D2R (Fig. (Fig.5a),5a), în timp ce nu a făcut acest lucru în hipotalamus (Fig. ​(Fig.5f).5f). În conformitate cu aceste constatări, nivelurile de ARNm și proteine ​​ale D2R au fost reciproc crescute (Fig. (Fig.5b,5b, g, k, l). Similar cu datele privind tratamentul cu 5-aza-dC (Fig. (Fig.1),1), nu au existat efecte evidente asupra nivelurilor de ARN și proteine ​​ale Drd1, Th și Slc6a3 (DAT) în striat și fără efecte asupra nivelurilor de Drd1, Th și Slc6a3 în hipotalamus (fig. (Fig.5c–e,5c–e, h–k, m).

Fig. 5 

Inhibarea DNMT-urilor de către γ-orizanol atenuează preferința pentru un HFD prin creșterea D2R-urilor în striatul șoarecilor hrăniți cu HFD. Nivelurile de metilare a ADN-ului regiunii promotoare a D2R din striat (n = 3) (a) și hipotalamus ...

Studiile anterioare au arătat că nivelurile de D2R și DNMT1 sunt reglate de stresul ER și inflamația, cel puțin parțial, prin intermediul NF-kB., , ]. Prin urmare, am examinat nivelurile genelor ER legate de stres și inflamație. După cum sa demonstrat anterior [], HFD a crescut expresia genelor care codifică TNF-α (TNFa), proteina chemoatractantă monocitară-1 (MCP-1) (Ccl2), proteină omoloagă C/EBP (A toca), DnaJ 4 localizat în ER (ERdj4) (Dnajb9) și forma îmbinată a proteinei de legare a casetei X 1 (Xbp1s) în hipotalamus, dar nu în striat (Fig. ​(Fig.6).6). În special, suplimentarea HFD cu γ-orizanol a scăzut semnificativ expresia crescută a Ccl2, A toca, Dnajb9 și Xbp1s exclusiv în hipotalamus, dar nu în striat (Fig. (Fig.66).

Fig. 6 

Exprimarea genelor proinflamatorii și legate de stresul ER în striat și hipotalamus. Nivelurile de ARNm pentru TNFa (a, f), Ccl2 (b, g), A toca (c, h), Dnajb9 (d, i), și forma activă de îmbinare a Xbp1 (Xbp1s) (e, j) în striat (n = 8) ...

Discuție

Constatarea majoră din prezentul studiu este că γ-orizanolul acționează ca un inhibitor puternic al DNMT în striatul șoarecilor, atenuând astfel, cel puțin parțial, preferința pentru un HFD prin modularea epigenetică a D2R striatale. În striatul de la șoarecii hrăniți cu HFD, nivelurile de D2R au fost semnificativ scăzute, în timp ce cele ale D1R, TH și DAT nu au fost modificate (Fig. (Fig.1b–e,1b–e, k–m). Aceste date sunt în concordanță cu ideea că dereglarea D2R striatală joacă un rol critic în percepția recompensei alimentare atunci când este pe un HFD, ducând la supraconsumul hedonic de HFD la animalele obeze.]. În studiul de față, tratamentul șoarecilor hrăniți cu HFD cu 5-aza-dC a crescut semnificativ nivelurile de D2R striatal (Fig. (Fig.1b,1b, k, l) posibil printr-o reducere a nivelului de metilare a ADN-ului în regiunea promotor a D2R (Fig. (Fig.1a),1a), și, în consecință, a atenuat preferința pentru grăsimile alimentare (Fig. ​(Fig.1n).1n). Această constatare susține, de asemenea, un rol critic al D2R striatale în percepția recompensei alimentare atunci când este pe un HFD.

Testul nostru in vitro a demonstrat că activitatea inhibitoare a γ-orizanolului împotriva DNMT-urilor a fost aparent mai puternică decât cea a metabolitului său acid ferulic (Fig. ​(Fig.4d–f),4d–f), sugerând importanța structurii complete a γ-orizanolului pentru acțiunea sa inhibitoare asupra DNMT. La șoarecii hrăniți cu HFD, studiile noastre sugerează că, după administrarea orală, γ-orizanolul ajunge la creier ca o structură completă și scade nivelurile și activitățile DNMT-urilor în mod preferențial în striat, cu o scădere consecutivă a metilării ADN-ului în regiunea promotoare a D2R în striat. Mai mult, studiile noastre in vitro au demonstrat că γ-orizanolul acționează ca un antagonist parțial împotriva ERRγ, care servește în primul rând ca un regulator pozitiv pentru producția de DNMT1.] și, în consecință, a scăzut activitatea DNMT1 (Fig. ​(Fig.3a).3A). De notat, ERRγ a fost foarte exprimat în striat, dar nu și în hipotalamus la șoareci (Fig. ​(Fig.3b).3b). Aceste date sugerează că y-orizanolul are potențialul de a scădea nivelul ARNm al DNMT1, cel puțin parțial, prin inhibarea ERRγ. Spre deosebire de striatul, γ-orizanolul nu a arătat niciun efect asupra nivelului de D2R în hipotalamus de la șoarecii hrăniți cu HFD (Fig. (Fig. 5g, 5g, k, l).

Pe de altă parte, am demonstrat că γ-orizanolul a crescut semnificativ nivelurile de DNMT1 în hipotalamus, dar nu și în striat (Fig. (Fig. 2k, 2k, l). S-a demonstrat că STAT3 mărește conținutul de DNMT1 în celulele maligne de limfom T.]. În special, am demonstrat anterior că γ-orizanolul a crescut semnificativ fosforilarea STAT3 indusă de leptină în hipotalamus de la șoarecii hrăniți cu HFD.]. De asemenea, trebuie remarcat faptul că STAT3α a fost exprimat în mod substanțial în hipotalamus, dar nu și în striatul la șoareci (Fig. ​(Fig.3e–g).3de exemplu). Aceste date ne tentează să speculăm că diferența aparentă în efectul γ-orizanolului asupra nivelurilor de DNMT1 dintre hipotalamus și striat poate fi atribuită, cel puțin parțial, conținutului specific regiunii de STAT3α și ERRγ din creierul șoarecilor ( Smochin. ​(Fig.3b–g).3b–g). În mod colectiv, pare să existe un model reciproc de exprimare a ERRγ și STAT3α între striat și hipotalamus la șoareci. Pe baza rezultatelor noastre, este, prin urmare, rezonabil să se speculeze că în striatum, unde producția de ERRγ este abundentă, γ-orizanolul poate scădea în mod preferențial nivelul ARNm și activitatea enzimatică a DNMT1 ca regulator negativ al ERRγ. În schimb, în ​​hipotalamus, unde producția de STAT3α este dominantă, γ-orizanolul poate crește în mod preferențial nivelurile de DNMT1.

Un studiu recent a demonstrat că o atenuare a semnalizării D2R striatale indusă de un HFD dereglează comportamentul de hrănire.], sugerând importanța potențială a inhibării DNMT-urilor striatale pentru tratamentul obezității. Pe de altă parte, un studiu anterior a demonstrat posibilitatea ca starea metilării ADN-ului genei receptorului melanocortinei 4 exprimată în nuclee hipotalamice specifice ar putea modula formele transgeneraționale de obezitate la șoarecii galbeni viabile agouti.]. Deși sunt justificate studii suplimentare pentru a elucida mecanismele de bază, aceste studii sugerează importanța metilării ADN-ului specific țesuturilor, genelor și secvenței în patofiziologia obezității induse de HFD.

Am raportat recent că HFD a crescut nivelul de D2R în insulele pancreatice ale șoarecilor., ]. Este probabil ca o astfel de creștere să fie mediată, cel puțin parțial, de stresul ER și inflamația prin intermediul NF-kB, deoarece există mai multe elemente care răspund la NF-kB în regiunea promotoare a D2R., ]. Mai mult, un studiu recent a arătat că TNF-α și IL-1β cresc nivelul și activitatea DNMT1 în țesutul adipos de la șoarecii hrăniți cu HFD.]. Foarte important, studiul de față a demonstrat că HFD a indus stresul ER și inflamația de preferință în hipotalamus, dar nu și în striat (Fig. ​(Fig.6).6). Mecanismele aprofundate ale metilării și demetilării ADN-ului specifice țesutului, regiunii și site-ului în paradigma noastră experimentală trebuie să aștepte investigații suplimentare.

Împreună cu raportul nostru anterior, care arată că γ-oryzanolul atenuează preferința pentru un HFD prin reglarea hipotalamică a stresului ER la șoareci.], γ-orizanolul reprezintă, de asemenea, o proprietate unică de ameliorare a dereglării atât hedonice, cât și metabolice a comportamentului de hrănire. Deoarece unele medicamente antiobezitate care au fost dezvoltate sunt cunoscute că provoacă efecte adverse critice [], se anticipează că o abordare naturală bazată pe alimente față de sistemul de recompensare a creierului va trata în siguranță sindromul obezitate-diabet []. În această paradigmă, γ-orizanolul este un candidat promițător împotriva obezității, cu o proprietate distinctă de a fi un modulator epigenetic.

 

Material suplimentar electronic

 

MES(256K, pdf) 

(PDF 256 kb)

Mulţumiri

Suntem recunoscători lui S. Okamoto (Universitatea din Ryukyus, Japonia) pentru revizuirea manuscrisului. Mulțumim lui M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato și C. Noguchi (Universitatea din Ryukyus, Japonia) pentru asistența de secretariat.

Abrevieri

5-aza-dC5-aza-2′-deoxicitidină
D1RReceptorul de dopamină D1
D2RReceptorul de dopamină D2
DATTransportor de dopamină
DNMTADN-metiltransferaza
ERReticulul endoplasmatic
ERRReceptor legat de estrogen
HFDDieta bogată în grăsimi
SAHS-adenosil-l-homocisteină
SAMS- Adenosil metionină
STAT3αTraductor de semnal și activator al transcripției 3α
THTirozin hidroxilază
 

notițe

Disponibilitatea datelor

Seturile de date generate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător la solicitări rezonabile.

Finanțare

Această activitate a fost susținută parțial de Grants-in-Aid de la Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 și 24591338), Consiliul pentru Știință, Tehnologie și Inovare (CSTI), Programul interministerial de promovare a inovației strategice (SIP) „Tehnologii pentru crearea agriculturii, silviculturii și pescuitului de generație următoare”, Fundația Lotte, Fundația Japoniei pentru Enzimologie Aplicată, Organizația pentru Dezvoltarea Noii Energii și Tehnologii Industriale (NEDO), Proiectul pentru formarea rețelei de științe a vieții (domeniul farmaceutic) ) (Prefectura Okinawa, Japonia) și Proiectul de promovare a grupării medicale din Prefectura Okinawa, Japonia, împreună cu un grant de la Prefectura Okinawa pentru promovarea medicinei avansate (Prefectura Okinawa, Japonia).

Dualitate de interes

Autorii declară că nu există o dualitate de interes asociată cu acest manuscris.

Declarație de contribuție

CK și HM au conceput cercetarea. CK și TK au efectuat experimentele și au analizat datele. TK, CS-O, CT, MT, MM și KA au contribuit la interpretarea datelor. CK și HM au scris manuscrisul. Toți autorii au contribuit la interpretarea datelor. Toți autorii s-au alăturat revizuirii manuscrisului și au aprobat versiunea finală a acestuia. HM este garantul acestei lucrări, a avut acces deplin la toate datele și își asumă întreaga responsabilitate pentru integritatea datelor și acuratețea analizei datelor.

Note de subsol

 

Material suplimentar electronic

Versiunea online a acestui articol (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) conține material suplimentar revizuit de colegi, dar needitat, care este disponibil pentru utilizatorii autorizați.

 

Referinte

1. DiLeone RJ, Taylor JR, Picciotto MR. Unitatea de a mânca: comparații și distincții între mecanismele de recompensă alimentară și dependența de droguri. Nat Neurosci. 2012;15:1330–1335. doi: 10.1038/nn.3202. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
2. Kenny PJ. Mecanisme celulare și moleculare comune în obezitate și dependență de droguri. Nat Rev Neurosci. 2011;12:638–651. doi: 10.1038/nrn3105. [PubMed] [Cross Ref]
3. Johnson PM, Kenny PJ. Receptorii de dopamină D2 în disfuncția recompensă asemănătoare dependenței și alimentația compulsivă la șobolanii obezi. Nat Neurosci. 2010;13:635–641. doi: 10.1038/nn.2519. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
4. Stice E, Spoor S, Bohon C, Small DM. Relația dintre obezitate și răspunsul striat tocit la alimente este moderată de alela TaqIA A1. Ştiinţă. 2008;322:449–452. doi: 10.1126/science.1161550. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
5. Geiger BM, Haburcak M, Avena NM, Moyer MC, Hoebel BG, Pothos EN. Deficiențe ale neurotransmisiei dopaminei mezolimbice în obezitatea alimentară la șobolani. Neuroștiință. 2009;159:1193–1199. doi: 10.1016/j.neuroscience.2009.02.007. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
6. Nobil EP. Dependența și procesul său de recompensă prin polimorfisme ale genei receptorului de dopamină D2: o revizuire. Eur Psihiatrie. 2000;15:79–89. doi: 10.1016/S0924-9338(00)00208-X. [PubMed] [Cross Ref]
7. Wang GJ, Tomasi D, Backus W, et al. Distensia gastrică activează circuitele de sațietate din creierul uman. NeuroImage. 2008;39:1824–1831. doi: 10.1016/j.neuroimage.2007.11.008. [PubMed] [Cross Ref]
8. Janero DR, Makriyannis A. Antagonişti ai receptorilor canabinoizi: oportunităţi farmacologice, experienţă clinică şi prognostic translaţional. Expert Opină Droguri Emergente. 2009;14:43–65. doi: 10.1517/14728210902736568. [PubMed] [Cross Ref]
9. Jaenisch R, Bird A. Reglarea epigenetică a expresiei genelor: modul în care genomul integrează semnalele intrinseci și de mediu. Nat Genet. 2003;33(Suppl):245–254. doi: 10.1038/ng1089. [PubMed] [Cross Ref]
10. Ong ZY, Muhlhausler BS. Hrănirea mamei cu „junk-food” a barajelor de șobolani modifică alegerile alimentare și dezvoltarea căii de recompense mezolimbice la urmași. FASEB J. 2011;25:2167–2179. doi: 10.1096/fj.10-178392. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
11. Barres R, Osler ME, Yan J, et al. Metilarea non-CpG a promotorului PGC-1alfa prin DNMT3B controlează densitatea mitocondrială. Cell Metab. 2009;10:189–198. doi: 10.1016/j.cmet.2009.07.011. [PubMed] [Cross Ref]
12. Lee WJ, Zhu BT. Inhibarea metilării ADN-ului de către acidul cafeic și acidul clorogenic, doi polifenoli obișnuiți de cafea care conțin catecoli. Carcinogeneza. 2006;27:269–277. doi: 10.1093/carcin/bgi206. [PubMed] [Cross Ref]
13. Fang MZ, Wang Y, Ai N și colab. Polifenolul (-)-epigalocatechin-3-galatul de ceai inhibă ADN-metiltransferaza și reactivează genele atenuate de metilare în liniile de celule canceroase. Cancer Res. 2003;63:7563–7570. [PubMed]
14. Kozuka C, Yabiku K, Sunagawa S, et al. Orezul brun și componenta sa, gama-orizanolul, atenuează preferința pentru dieta bogată în grăsimi prin scăderea stresului reticulului endoplasmatic hipotalamic la șoareci. Diabet. 2012;61:3084–3093. doi: 10.2337/db11-1767. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
15. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, et al. Gamma-Oryzanol protejează celulele beta pancreatice împotriva stresului reticulului endoplasmatic la șoarecii masculi. Endocrinologie. 2015;156:1242–1250. doi: 10.1210/en.2014-1748. [PubMed] [Cross Ref]
16. Kozuka C, Yabiku K, Takayama C, Matsushita M, Shimabukuro M, Masuzaki H. O abordare nouă bazată pe știința alimentelor naturale pentru prevenirea și tratamentul obezității și diabetului de tip 2: studii recente asupra orezului brun și γ-oryzanol. Obes Res Clin Pract. 2013;7:e165–e172. doi: 10.1016/j.orcp.2013.02.003. [PubMed] [Cross Ref]
17. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, et al. Un nou mecanism insulinotrop al gamma-orizanolului derivat din cereale integrale prin suprimarea semnalizării receptorului D local al dopaminei în insulă de șoarece. Br J Pharmacol. 2015;172:4519–4534. doi: 10.1111/bph.13236. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
18. Karahoca M, Momparler RL. Analiza farmacocinetică și farmacodinamică a 5-aza-2′-deoxicitidinei (decitabină) în proiectarea programului său de dozare pentru terapia cancerului. Clin Epigenetica. 2013;5:3. doi: 10.1186/1868-7083-5-3. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
19. Rein T, Zorbas H, DePamphilis ML. Originile de replicare active la mamifere sunt asociate cu un grup de dinucleotide mCpG cu densitate mare. Mol Cell Biol. 1997;17:416–426. doi: 10.1128/MCB.17.1.416. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
20. Tanaka T, Masuzaki H, Yasue S, et al. Semnalizarea centrală a melanocortinei restabilește fosforilarea protein kinazei activată de AMP în mușchii scheletici la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Cell Metab. 2007;5:395–402. doi: 10.1016/j.cmet.2007.04.004. [PubMed] [Cross Ref]
21. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. ADN-metiltransferazele Dnmt3a și Dnmt3b sunt esențiale pentru metilarea de novo și dezvoltarea mamiferelor. Celulă. 1999;99:247–257. doi: 10.1016/S0092-8674(00)81656-6. [PubMed] [Cross Ref]
22. Zhang Y, Wang L. Inhibarea SHP a receptorului nuclear a exprimării Dnmt1 prin ERRγ FEBS Lett. 2011;585:1269–1275. doi: 10.1016/j.febslet.2011.03.059. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
23. Zhang Q, Wang HY, Woetmann A, Raghunath PN, Odum N, Wasik MA. STAT3 induce transcripția genei ADN metiltransferazei 1 (DNMT1) în limfocitele T maligne. Sânge. 2006;108:1058–1064. doi: 10.1182/blood-2005-08-007377. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
24. Bontempi S, Fiorentini C, Busi C, Guerra N, Spano P, Missale C. Identificarea și caracterizarea a două situsuri de factor nuclear-kappaB în regiunea de reglare a receptorului dopaminergic D2. Endocrinologie. 2007;148:2563–2570. doi: 10.1210/en.2006-1618. [PubMed] [Cross Ref]
25. Kim AY, Park YJ, Pan X, et al. Hipermetilarea ADN-ului indusă de obezitate a genei adiponectinei mediază rezistența la insulină. Nat Commun. 2015;6:7585. doi: 10.1038/ncomms8585. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
26. Ozcan L, Ergin AS, Lu A, et al. Stresul reticulului endoplasmatic joacă un rol central în dezvoltarea rezistenței la leptine. Cell Metab. 2009;9:35–51. doi: 10.1016/j.cmet.2008.12.004. [PubMed] [Cross Ref]
27. Waterland RA, Travisano M, Tahiliani KG, Rached MT, Mirza S. Suplimentarea donatorului de metil previne amplificarea transgenerațională a obezității. Int J Obes. 2008;32:1373–1379. doi: 10.1038/ijo.2008.100. [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]