Insulina activează receptorii de insulină (InsRs) din hipotalamus pentru a semnala sațietatea după masă. Cu toate acestea, incidența în creștere a obezității, care are ca rezultat niveluri cronice crescute de insulină, implică faptul că insulina poate acționa și în centrele creierului care reglează motivația și recompensa. Raportăm aici că insulina poate amplifica eliberarea de dopamină dependentă de potențialul de acțiune (DA) în nucleul accumbens (NAc) și caudat-putamen printr-un mecanism indirect care implică interneuroni colinergici striatali care exprimă InsR. În plus, două manipulări diferite ale dietei cronice la șobolani, restricția alimentară (FR) și o dietă obezogenă (OB), modifică în mod opus sensibilitatea eliberării DA striatale la insulină, cu o capacitate de răspuns sporită în FR, dar pierderea capacității de răspuns în OB. Studiile comportamentale arată că nivelurile intacte de insulină din învelișul NAc sunt necesare pentru dobândirea preferinței pentru aroma unei soluții de glucoză pereche. Împreună, aceste date implică faptul că semnalizarea insulinei striatale îmbunătățește eliberarea DA pentru a influența alegerile alimentare.

Este bine stabilit că o creștere susținută a insulinei plasmatice în timpul și după masă activează receptorii de insulină (InsRs) din hipotalamus, ceea ce oferă feedback negativ circuitelor apetitive care scad alimentația ulterioară.^{1, 2, 3}. Insulina din creier este derivată în principal din celulele β pancreatice, cu transport activ de la plasmă la creier la bariera hematoencefalică.^{4, 5, 6, 7, 8}, deși există tot mai multe dovezi pentru sinteza și eliberarea de insulină neuronală, de asemenea^{1, 9}. În special, expresia InsRs nu este limitată la hipotalamus, deși funcția InsR extra-hipotalamice rămâne nerezolvată.^{1, 2, 3}. Având în vedere incidența în creștere a obezității și a diabetului de tip II, în care nivelurile circulante de insulină sunt în permanență crescute și transportul de insulină din creier și sensibilitatea receptorilor sunt scăzute^{3, 8, 10, 11}, este esențial să înțelegem funcția insulinei în regiunile creierului care reglează motivația și recompensa. Regiunile creierului de interes deosebit includ nucleul accumbens (NAc), care mediază efectele benefice atât ale alimentelor, cât și ale medicamentelor.^{12, 13}, și caudat-putamen (CPu), care joacă un rol în comportamentele bazate pe obiceiuri și pofta¹³. InsR-urile sunt exprimate în aceste regiuni, cea mai mare densitate având loc în NAc^{3, 14}; InsR-urile sunt, de asemenea, exprimate de neuronii dopaminergici (DA) din mijlocul creierului, inclusiv cei din zona tegmentală ventrală (VTA) și substanța nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Nivelurile de insulină din creier sunt proporționale cu concentrațiile de insulină plasmatică și cu adipozitatea corpului^{6, 7, 8}, ceea ce duce la ipoteza că insulina ar putea acționa la InsR în aceste regiuni ale creierului pentru a influența recompensa alimentară^{3, 16, 17}.

Studii anterioare în sinaptozomi striatali, celule heterologe, felii de creier și in vivo au arătat că activarea insulinei a InsR conduce la o creștere a captării DA de către transportorul DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Acest proces implică calea de semnalizare a kinazei PI3^{19, 20}și are ca rezultat inserarea DAT în membrana plasmatică¹⁹. Nivelurile circulante de insulină modulează dinamic activitatea DAT striatală, cu o scădere a absorbției DA și a expresiei suprafeței DAT observate în modelele animale de diabet și după restricția alimentară (FR)^{20, 21}. S-a demonstrat că creșterile dependente de insulină ale activității DAT scad concentrația extracelulară de DA evocată ([DA]_o) în VTA²³, reflectând o schimbare a echilibrului între eliberarea și absorbția DA. În concordanță cu rolul stabilit al insulinei în sațietate, microinjecția acută de insulină în VTA poate scădea recompensa alimentară.^{23, 24}, în timp ce șoarecii care nu au InsR în neuronii VTA și SNc DA prezintă un aport crescut de alimente și devin obezi²⁵. Deși insulina poate induce deprimarea pe termen lung a inputului excitator la neuronii VTA DA²⁴, din nou în concordanță cu un rol în sațietate, expunerea la insulină poate crește și rata de declanșare a neuronilor DA, posibil prin scăderea eliberării DA și inhibarea mediată de autoreceptori.²⁵. Efectul net al insulinei asupra eliberării DA striatale este, prin urmare, greu de prezis. Într-adevăr, rezultatele studiilor privind influența insulinei asupra eliberării DA striatale în ex vivo felii¹⁹ și efectul microinjecției locale de insulină în NAc asupra recompensei alimentare²⁶ par a fi contradictorii. Pentru a rezolva acest lucru, am evaluat eliberarea și absorbția DA axonală în micromediul intact al NAc și CPu în ex vivo felii striatale folosind voltametrie ciclică cu scanare rapidă (FCV) și au determinat efectele semnalizării insulinei în NAc asupra comportamentului recompensei in vivo.

Studiile noastre arată că efectul principal al insulinei în NAc și CPu este de a îmbunătăți eliberarea DA, în ciuda creșterii concomitente a absorbției DA. Această reglare dinamică a eliberării DA implică o creștere dependentă de insulină a excitabilității interneuronilor colinergici striatali (ChIs), ceea ce duce la o eliberare îmbunătățită de DA prin activarea receptorilor nicotinici de acetilcolină (ACh) (nAChR). Influența insulinei asupra ChIs și asupra eliberării DA este mediată de InsR. În special, efectul insulinei asupra eliberării DA este amplificat în felii de la șobolani FR, dar este tocit la șobolanii care urmează o dietă obezogenă (OB). Aceste date arată amplificarea eliberării DA în ex vivo feliile de insulină duc la predicția că insulina ar putea acționa ca un semnal de recompensă in vivo. Într-adevăr, studii comportamentale paralele demonstrează un rol al insulinei în învelișul NAc în condiționarea preferințelor de aromă. Împreună, aceste descoperiri indică un nou rol al insulinei ca semnal de recompensă care poate influența alegerea alimentelor

Insulina care acționează la InsR crește eliberarea DA striatală evocată

Examinarea inițială a [DA] evocată local_o monitorizat cu FCV in ex vivo felii striatale de la sobolani cu ad libitum (AL) accesul la alimente și apă a relevat descoperirea neașteptată că aplicarea acută a insulinei într-o serie de concentrații relevante din punct de vedere fiziologic^{1, 4} evocat cu un singur puls crescut [DA]_o (Fig. 1a–c), cu insulină EC₅₀ valori (concentrația la care efectul a fost jumătate maxim) de 2-12 nM (Fig. 1b). [DA] evocat crescut_o a fost deosebit de surprinzător, având în vedere că aceasta a fost însoțită de o creștere semnificativă a ratei maxime (V_max) pentru absorbția mediată de DAT în fiecare subregiune (Tabelul 1), ceea ce ar duce la o scădere competitivă a [DA] evocată_o, după cum sa raportat anterior^{22, 23}. În schimb, am descoperit că evocat [DA]_o a fost amplificată maxim 20-55% cu insulina 30 nM; regiunea cu cel mai mare efect proporțional a fost învelișul NAc, care este subregiunea striată cu cea mai mare expresie InsR^{1, 14}. Feliile expuse la 30 nM de insulină în condiții identice nu au prezentat nicio modificare a conținutului de DA striat (Figura suplimentară 1a), ceea ce implică faptul că insulina modifică reglarea eliberării dinamice, mai degrabă decât pur și simplu reglarea pozitivă a sintezei DA. În special, efectul insulinei asupra [DA] evocată_o s-a pierdut la concentrații suprafiziologice ≥100 nM (Fig. 1b). Acest lucru nu a fost rezultatul creșterii activității DAT care depășește eliberarea, deoarece efectul insulinei asupra V_max s-a pierdut și la aceste concentrații (Tabelul 1). În general, aceste date arată că, în micromediul striat intact, efectul predominant al insulinei asupra [DA] evocată._o este de a crește eliberarea, în ciuda creșterii concomitente a absorbției DA.

  

  

(a) Media evocată cu un singur impuls [DA]_o în înveliș de NAc, miez de NAc și CPu înainte și după insulină (Ins) ilustrate pentru 30 nM; barele de eroare au fost omise, dar vezi (b); săgețile indică momentul stimulului. Creșterea insulinei evocată [DA]_o în carcasă (cu 55±10%), miez (cu 37±5%) și CPU (cu 20±4%) (***P<0.001). (bEfectul insulinei a fost dependent de concentrație într-un interval fiziologic (1-30 nM) în înveliș (n=22–24, F_5,133= 14.471, P<0.001), miez (n=36–76, F_5,308= 16.318, P<0.001) și CPU (n=30–62, F_5,253= 13.763, P<0.001), dar s-a pierdut la ≥100 nM. (c) Înregistrări reprezentative ale [DA] evocate de vârf_o față de timp la un singur loc în miezul NAc în absența aplicării medicamentului (Con), în timpul aplicării insulinei (30 nM) sau când insulina a fost aplicată în prezența unui inhibitor InsR HNMPA (5 μM). (d) Media evocată de vârf [DA]_o date care arată prevenirea efectului insulinei (30 nM) de către HNMPA, antagonistul InsR S961 (1 μM) și inhibitorul PI3K LY294002 (1 μM), dar nu prin inhibitorul IGF-1R PPP (1 μM) (n=29–76; P>0.9 față de insulină singură). Pentru Fig. 1a-d, n=numărul de locuri per subregiune de la 3-6 șobolani pentru fiecare medicament sau concentrație de insulină; ANOVA unidirecțional, testul de semnificație sinceră Tukey (HSD). Vedea Figura complementară 1b, c pentru datele shell NAc și CPU.

• Imagine la dimensiune completă (98 KB)

 

 

Deoarece insulina poate acționa și asupra receptorilor factorului de creștere 1 asemănător insulinei (IGF-1R), deși la concentrații care depășesc 100 nM (ref. 1), am căutat să confirmăm că efectul de îmbunătățire al insulinei asupra [DA] evocată_o era dependent de InsR. Acesta s-a dovedit a fi cazul, deoarece efectul a fost prevenit de un inhibitor intracelular al InsR, acidul hidroxi-2-naftalenilmetilfosfonic (HNMPA) și de un antagonist InsR, S961, dar nu de un inhibitor selectiv al IGF-1R, picropodofilina.²⁴ (PPP; Fig. 1c, d și Figura complementară 1b, c). Apoi am examinat implicarea kinazei PI3, care inițiază calea de semnalizare responsabilă de reglarea dependentă de insulină a DAT.¹⁹. La o concentrație de 1 μM, inhibitorul P13K LY249002 singur nu a avut niciun efect asupra [DA] evocată de vârf._o or V_max (n=29–76 de locuri (nucleu NAc) per medicament, P>0.05, analiză unidirecțională a varianței (ANOVA); datele nu sunt afișate), totuși a prevenit efectul insulinei asupra [DA] evocată_o în toate subregiunile striatale (Fig. 1d și Figura complementară 1b, c).

Localizarea InsR-urilor pe axonii DA și ChIs

Creșterea observată în V_max pentru absorbția DA cu niveluri fiziologice de insulină implică prezența InsR pe axonii DA, la fel ca rezultatele anterioare în diferite preparate striatale^{18, 19, 20, 21, 22}. Deși a fost demonstrată expresia funcțională a InsR-urilor pe neuronii DA midencefal^{15, 23, 24, 25}, Expresia InsR pe axonii DA striatali nu a fost raportată. Am abordat acest lucru folosind imunohistochimie. Imunoreactivitatea InsR densă în întregul striat a limitat evaluarea cantitativă a localizării InsR pe axonii DA, care au fost identificate prin imunoreactivitate pentru o enzimă de sinteză a DA, tirozin hidroxilaza (TH). Prin urmare, am adoptat un protocol raportat anterior²⁷, care a implicat numărarea punctului InsR care s-a suprapus cu profilele TH+ în vizualizarea normală a imaginii și numărarea din nou după ce imaginea InsR a fost rotită doar cu 90°. Dacă suprapunerea aparentă a profilurilor InsR și TH+ a fost nespecifică, această procedură ar trebui să dea numărări similare din punct de vedere statistic, indiferent dacă sunt normale sau defazate la 90°. Cu toate acestea, această analiză a arătat o scădere a suprapunerii InsR puncta cu profilele TH+ de 14±9% (n=42 de câmpuri, P<0.01, pereche cu două cozi t-Test; datele nu sunt afișate), confirmând prezența InsR pe axonii DA. Cu toate acestea, mai intrigant, imunomarcarea InsR a striatului a dezvăluit expresie distinctă a InsR pe corpurile celulare mari care au fost identificate ca ChIs striatali prin co-imunomarcare pentru colin acetiltransferaza (ChAT), enzima primară necesară pentru sinteza ACh. Folosind criterii electrofiziologice²⁸ pentru a identifica ChIs în studii preliminare de înregistrare a celulelor întregi, mai mulți neuroni au fost umpluți cu biocitină și apoi procesați pentru imunohistochimie; toate acestea (4/4) au fost imunopozitive atât pentru InsR, cât și pentru ChAT (Fig. 2a). Evaluarea ulterioară a co-localizării InsR și ChAT în NAc a confirmat că practic toți neuronii ChAT+ au exprimat InsR (96%; n=27/28 neuroni în patru secțiuni de la doi șobolani).

  

  

(a) ChI umplut cu biocitină, apoi imunomarcat pentru ChAT și InsR (reprezentând 4/4 ChIs plini cu biocitină); imaginea îmbinată arată co-localizarea; bară de scară, 10 μm. (b-e) Răspunsul Chi striatale la o serie de impulsuri de curent depolarizant (durată de 3 s; 200, 300 și 400 pA; intervale de 120 de s) înainte și după insulină (30 nM). (b) Adaptarea frecvenței de vârf într-un ChI (sus) este observată în pierderea potențialului de acțiune (AP) în timpul injectării curentului, în timp ce creșterea persistă pe tot parcursul pulsului curent în insulină (inferioară); set complet de date prezentat în d. (c) Cursul de timp reprezentativ al creșterii induse de insulină a numărului AP cu fiecare pas curent pentru ChI in b. (d) Rezumatul numărului AP în timpul impulsurilor curente furnizate înainte și la efectul maxim al expunerii la insulină (n=21 stimulări pereche, 7 neuroni, 5 șobolani) (e) Răspunsuri medii care arată efectul insulinei (+Ins) în condiții de control (Con; n=21 stimulări pereche, 7 neuroni, ***P<0.001, pereche cu două cozi t-test), în prezența HNMPA (5 μM) (n=12 stimulări pereche, 4 neuroni, 4 șobolani, P>0.05, pereche cu două cozi t-test), și în prezența PPP (1 μM) (n=18 stimulări pereche, 6 neuroni, 6 șobolani, **P<0.01, testul de rang pereche semnat de Wilcoxon). (f) Media evocată cu un singur impuls [DA]_o în miez NAc înainte și după insulină (30 nM) în mecamilamină (Mec; 5 μM) sau DHβE (1 μM) normalizat la 100% control de vârf (n= 20–40 de locuri per subregiune per condiție de la 3–4 șobolani, P>0.05 versus control, nepereche t-Test). (g) Media evocată cu un singur impuls [DA]_o în porțiunile de creier anterior din controlul heterozigot (Het) și Conversație Șoareci KO înainte și după insulină (30 nM), normalizat la 100% control de vârf. Creșterea insulinei evocată [DA]_o la șoarecii heterozigoți cu 190±23% în coajă NAc, 140±8% în miez NAc și 137±12% în CPU (n=15–25 de site-uri per subregiune de la 3–4 șoareci per genotip, **P<0.01, ***P<0.001 versus control nepereche t-test), dar nu a avut efect asupra [DA] evocată_o în orice subregiune striată a Conversație Șoareci KO (P> 0.1).

• Imagine la dimensiune completă (167 KB)

 

 

Insulina crește excitabilitatea ChI

Pentru a testa funcționalitatea InsR pe ChIs striatale, am examinat efectul insulinei asupra excitabilității ChI folosind înregistrarea cu clemă de curent pentru celule întregi. Excitabilitatea ChI a fost evaluată utilizând o serie de impulsuri de curent depolarizante de 3 s pentru a genera un tren de potențiale de acțiune care a prezentat în mod fiabil adaptarea la frecvența vârfurilor (Fig. 2b), deseori cu pierdere de vârf până la sfârșitul pulsului de curent. În mod surprinzător, insulina (30 nM) a atenuat adaptarea frecvenței de vârf, ducând la o creștere progresivă a numărului potențialului de acțiune în timp (Fig. 2c), cu o creștere maximă (Fig. 2d, de exemplu) observată de obicei între 20 și 50 de minute de expunere la insulină. În absența insulinei, controlul ChIs nu a arătat nicio modificare a numărului de potențiale de acțiune evocate (P>0.05, pereche cu două cozi t-Test; date nu sunt afișate); în comparație cu neuronii de control monitorizați în același interval de timp, neuronii expuși la insulină au prezentat o schimbare semnificativ mai mare a numărului de potențiale de acțiune evocate (control n=12 perechi de stimuli de la patru neuroni, insulina n= 21 de perechi de stimuli de la șapte neuroni, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA cu două căi cu măsuri mixte; datele nu sunt afișate). Efectul insulinei asupra creșterii numărului potențialului de acțiune a fost prevenit de HNMPA, dar nu de inhibitorul selectiv IGF-1R PPP (Fig. 2e), demonstrând că excitabilitatea crescută a ChI de către insulină a fost mediată de InsR.

Creșterea insulinei [DA] evocată_o necesită nAChR și ACh

Studiile anterioare au arătat că ChIs și ACh reglează puternic eliberarea DA striatală prin nAChR pe axonii DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Expresia abundentă a InsR pe ChIs și îmbunătățirea excitabilității ChI observată cu expunerea acută la insulină au sugerat că acești neuroni ar putea fi ținte noi pentru insulină care ar putea duce la eliberarea îmbunătățită de DA. Pentru a testa acest lucru, am examinat efectul insulinei în prezența mecamilaminei, un antagonist nAChR neselectiv sau a dihidro-β-eritroidinei (DHβE), un antagonist selectiv pentru nAChR care conțin subunități β2 (β2*) care sunt îmbogățite pe axonii DA³⁵. Evocat [DA]_o a fost detectat cu ușurință în prezența acestor antagoniști, chiar dacă ambele medicamente au scăzut amplitudinea [DA] evocată cu un singur puls._o (de exemplu, cu 13–26% în miezul NAc), așa cum sa raportat anterior^{29, 30, 31, 32}. În sprijinul rolului pentru ACh și nAChR, efectul insulinei asupra [DA] evocată_o a fost prevenit fie de mecamilamină, fie de DHβE (Fig. 2f). Pentru a confirma implicarea semnalizării ACh striatale în eliberarea DA îmbunătățită cu insulină, am examinat efectul insulinei în ex vivo felii striatale de la șoareci la care expresia ChAT a fost eliminată genetic în structurile creierului anterior (proencefalul Conversație șoareci KO), inclusiv striatul³². Deși ChIs sunt intacte la acești șoareci, sinteza ACh este abolită, ceea ce duce la scăderea, dar încă ușor detectabil [DA] evocat cu un singur puls._o, așa cum s-a descris anterior³². La tovarășii heterozigoți de control, insulina (30 nM) a crescut [DA] evocată_o în carcasa și miezul NAc și în CPU cu 37–90% (Fig. 2g), depășind amplificarea observată în striatul șobolanului (de exemplu, Fig. 1). Cu toate acestea, efectul insulinei asupra [DA] evocată_o a fost absentă în întregul complex striatal din prosencefal Conversație Șoarecii KO, demonstrând că îmbunătățirea mediată de insulină a eliberării DA necesită ACh striat, dar nu transmițători co-eliberați din ChIs, cum ar fi glutamatul³⁶.

Influența insulinei asupra [DA] evocată_o este dependent de dieta

Concentrațiile de insulină în plasmă și creier sunt proporționale cu adipozitatea corpului^{6, 7, 8}și ar putea duce la modificări compensatorii ale sensibilității creierului la insulină. Prin urmare, am testat ipoteza conform căreia dieta influențează capacitatea insulinei de a promova eliberarea DA, folosind felii striatale de la șobolani menținute fie pe o dietă cronică FR sau OB față de controalele AL. După cum era de așteptat, nivelurile de insulină plasmatică au fost corelate cu greutatea corporală, cu insulină mai mică în FR decât la șobolanii AL sau OB (Fig. 3a și Tabelul 2). În ciuda acestor diferențe de insulină circulantă, evocarea maximă [DA]_o în carcasa și miezul NAc, iar CPU a fost semnificativ mai scăzută în ex vivo felii striatale din ambele grupuri de dietă în comparație cu AL (Fig. 3b și Suplimentar Fig. 2 a,b), ceea ce implică faptul că factorii în plus față de insulină guvernează [DA] absolut evocat_o. Conținutul de DA striat nu a diferit între grupurile de dietă, indicând o schimbare în reglementarea eliberării mai degrabă decât în ​​sinteza DA (Figura complementară 2c). În concordanță cu o schimbare în reglarea dinamică, sensibilitatea eliberării DA striatale la insulină a fost în mod semnificativ dependentă de dietă. La șobolani FR, concentrații de insulină ≤1 nM, care nu au avut niciun efect în AL (Fig. 1b), evocat crescut [DA]_o (Fig. 3c), reflectând sensibilitatea crescută la insulină, cu CE₅₀ valori în striatul FR (0.4–0.6 nM) care au fost cu aproximativ un ordin de mărime mai mici decât în ​​AL (comparați Figurile 1b și 3c). În contrast izbitor, efectul insulinei a fost pierdut în striatul OB; chiar 30 nM de insulină, care a avut un efect maxim în striatul AL (Fig. 1b), nu a avut efect în OB (Fig. 3c).

  

  

(a) Concentrația de insulină plasmatică este corelată pozitiv cu greutatea corporală în grupurile de hrănire (R=0.76). (b) Media evocată cu un singur impuls [DA]_o în miezul NAc (vezi Figura complementară 2a, b pentru învelișul NAc și CPU) a fost mai mică în FR (38±4%) și OB (25±4%) față de AL (n= 50-60 de locuri de la 5-6 șobolani per grup de dietă, F_2,156=23.337, ANOVA unidirecţional, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Sensibilitatea evocată [DA]_o la insulină a fost crescută în FR, dar a pierdut în OB (n= 21-49 de locații per subregiune per concentrație de la 2-4 șobolani per grup de dietă, ANOVA unidirecțional, Tukey HSD), cu o sensibilitate mai mare la șobolani FR față de AL în toate subregiunile (P<0.001 pentru fiecare regiune; ANOVA în două sensuri; CPU: F_{(conc × dietă; 3,286)}= 10.253; miez: F_{(conc × dietă; 3,353)}= 6.166; coajă: F_{(conc × dietă; 3,195)}= 10.735).

• Imagine la dimensiune completă (124 KB)

 

 

Aceste date implică o relație inversă între sensibilitatea InsR striatală și adipozitatea corpului. Alternativ, totuși, aceste diferențe dependente de dietă ar putea reflecta o sensibilitate modificată la nAChR. Prin urmare, am determinat răspunsul la concentrație la nicotină în miezul NAc din fiecare grup de dietă. Nicotina cauzează desensibilizarea nAChR, care poate fi cuantificată prin compararea raportului [DA]_o evocat de un scurt tren de cinci impulsuri la 100 Hz la evocat cu un singur impuls [DA]_o (raport 5 p:1 p) ca indice al activării/desensibilizării nAChR^{30, 31}. Folosind această abordare, nu am găsit diferențe între grupurile de dietă în ceea ce privește sensibilitatea nAChR în miezul NAc (Fig. 3a–c suplimentară). În plus, raportul de control 5 p: 1 p nu a diferit între grupurile de dietă în miezul NAc (Figura complementară 3d) sau CPu (neilustrat), ceea ce implică faptul că dieta nu modifică reglementarea eliberării DA dependentă de nAChR. Astfel, sensibilitatea InsR striatală pare să fie îmbunătățită la șobolanii FR față de AL, dar absentă la șobolanii OB, cu pierderea reglării eliberării DA striatale la concentrații fiziologice de insulină.

Insulina coajă NAc modulează preferința de aromă condiționată

Preferințele alimentare sunt generate atât de factori pre- și post-ingestivi; mecanismele pentru fiecare nu sunt complet rezolvate, dar dovezile actuale implică semnalizarea NAc DA în ambele^{37, 38}. Având în vedere că nivelurile de insulină din plasmă și din lichidul cefalorahidian (LCR) cresc rapid după creșterea glicemiei periferice⁶și că o creștere a insulinei în striat poate fi detectată în 5 minute de la creșterea insulinei plasmatice⁷, este logic să presupunem că eliberarea periferică de insulină în timpul unei mese ar putea îmbunătăți eliberarea NAc DA și poate contribui la mecanismele de recompensă post-ingestivă. Am adaptat un protocol de preferință de aromă descris anterior³⁷ cu soluții de glucoză îndulcite cu zaharină la șobolani pentru a testa ipoteza că blocarea efectului insulinei endogene prin aplicarea locală a unui anticorp de insulină (InsAb) în NAc ar scădea preferința pentru aroma pereche. Eficacitatea InsAb în blocarea efectelor insulinei a fost testată într-un in vitro testarea captării DA în sinaptozomii striatali. Insulina (30 nM) a provocat o creștere semnificativă a V_max în sinaptozomi din NAc sau CPu (Imagine suplimentară 4), în concordanță cu noastre V_max date din secțiunile striatale (Tabelul 1) și cu studii anterioare^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. În absența insulinei, nici InsAb, nici un anticorp de control imunoglobulina G (IgG) nu a modificat V_max pentru absorbția DA versus control. În prezența IgG, insulina a provocat încă o creștere semnificativă a V_max; cu toate acestea, efectul insulinei asupra V_max s-a pierdut în prezența InsAb (Imagine suplimentară 4).

Pentru a minimiza deteriorarea țesutului și a păstra sensibilitatea țintei țesutului, au fost testate două grupuri de subiecți în care am alternat microinjecția intra-NAc cu o procedură de microinjecție simulată, mai degrabă decât să folosim un singur grup de subiecți și să asociam o soluție aromatizată cu InsAb și alta cu vehicul. În consecință, în timpul sesiunilor de condiționare cu un singur flacon, grupul experimental a primit microinjecții InsAb asociate cu una dintre cele două arome, iar la sesiuni alternante, microinjecții simulate asociate cu cealaltă aromă (Fig. 4a, stânga). Grupul de control a primit microinjecții simulate alternate cu microinjecții fie cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) fie cu IgG. Ambele soluții aromate au conținut glucoză în timpul condiționării. Nu s-a așteptat nicio preferință diferențială între arome în grupul martor-microinjectat, în timp ce preferința era de așteptat să se schimbe către aromă simulată pereche de microinjecție în grupul cu InsAb-microinjectat.

  

  

(a) Diagrama care ilustrează condiționarea cu o sticlă (stânga) și testul cu două sticle (dreapta). (b) Volumul consumat (ml) în timpul sesiunilor de condiționare cu un flacon. A existat o interacțiune semnificativă între sesiunea de condiționare cu perfuzie și tratamentul cu microinjecție (n= 19-20 de șobolani per grup, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 ANOVA mixt cu măsuri repetate în sesiunea de condiționare prin perfuzie). Microinjecția cu InsAb a scăzut semnificativ consumul în comparație cu controlul în timpul celui de-al treilea (t(40)=3.026, **P<0.01) și al patrulea (t(40)=3.052, **P<0.01, protejat cu o singură coadă t-teste) perfuzii. Injecțiile simulate nu au avut niciun efect asupra consumului în niciunul dintre grupuri (F_3,111= 1.110, 2 × 4 ANOVA mixt cu măsuri repetate la sesiunea de condiționare simulată). (c) Volumul consumat în timpul testului de preferință a aromei cu două sticle. A existat o interacțiune semnificativă între aromă și tratamentul cu microinjecție în timpul condiționării (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA mixt în două sensuri cu măsuri repetate asupra aromei). Grupul InsAb a consumat semnificativ mai puțin aroma asociată cu InsAb în comparație cu aroma combinată simulată (t(18) = 2.82, ** P<0.01, protejat cu o singură coadă t-Test); grupul de control nu a arătat preferințe de aromă (t(19) = 0.803, P>0.05, protejat t-Test). Comparând grupurile, șobolanii InsAb au băut semnificativ mai puțin din aroma asociată infuziei (t(40)=1.96, *P<0.05) și mult mai mult din aroma pereche simulată (t(40)=1.77, *P<0.05, protejat cu o singură coadă t-test) decât controale.

• Imagine la dimensiune completă (161 KB)

 

 

În timpul sesiunilor de condiționare cu un flacon, microinjecția cu InsAb a scăzut semnificativ consumul în comparație cu vehiculul în timpul celei de-a treia și a patra perfuzii (Fig. 4b). Prin contrast, ambele grupuri au consumat același volum de soluție în toate cele patru sesiuni de injectare simulată (F_3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA mixt în două sensuri) (Fig. 4b). După un total de opt sesiuni de condiționare, preferința de aromă a fost evaluată într-un test cu două sticle în care șobolanii au avut acces la ambele soluții aromate simultan (Fig. 4a). Analiza statistică a relevat o interacțiune semnificativă între aromă și tratamentul cu microinjecție primit în timpul condiționării (Fig. 4c). Grupul InsAb a consumat semnificativ mai puțin aroma asociată cu InsAb în comparație cu aroma combinată simulată (Fig. 4c), în timp ce grupul de vehicule nu a arătat nicio preferință pentru arome (Fig. 4c), ceea ce implică faptul că semnalizarea insulină intactă a contribuit la selectarea unei soluții calorice dulci. În comparație cu vehiculul, șobolanii microinjectați cu InsAb au băut semnificativ mai puțin din aroma asociată infuziei și semnificativ mai mult din aroma combinată cu injecție simulată (Fig. 4c). Microinjectarea de IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, protejat t-teste) sau PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, protejat t-testele) nu au avut niciun efect asupra preferinței de aromă (datele nu sunt prezentate), argumentând împotriva posibilității ca un efect nespecific al microinjecției cu InsAb să scadă consumul sau preferința de aromă. De asemenea, trebuie remarcat faptul că preferința grupului InsAb la testare nu este o preferință pentru aroma mai puțin nouă, deoarece nu a existat nicio interacțiune între sesiune și tipul de sesiune (perfuzie reală versus perfuzie simulată) pentru grupul InsAb (F_3,54= 1.584, P>0.05, ANOVA în două sensuri). Adică, grupul InsAb nu a consumat mai multă aromă combinată cu infuzie simulată în comparație cu aroma combinată cu infuzie InsAb; mai degrabă, diferențele dintre grupurile de tratament au apărut doar în timpul sesiunilor de condiționare cu perfuzie. În general, aceste date indică faptul că insulina din NAc joacă un rol în consolidarea preferinței pentru o aromă care semnalează o încărcare glicemică.

Raportăm aici că insulina amplifică eliberarea DA striatală într-o manieră dependentă de nAChR prin modularea excitabilității ChI prin InsRs. Rezultatele noastre sugerează că insulina poate servi drept semnal de recompensă, pe lângă rolul său stabilit în semnalarea sațietății. În special, efectul insulinei asupra eliberării DA este modulat de dietă, cu o sensibilitate semnificativ crescută la insulină după FR, dar o pierdere completă a reglării îmbunătățite de insulină pe o dietă OB. Aceste modificări par să reflecte modificări ale sensibilității InsR care sunt invers legate de nivelurile circulante de insulină, având în vedere că nivelurile de insulină plasmatică s-au dovedit a fi dependente de dietă, dar sensibilitatea nAChR nu a fost. În cele din urmă, studiile noastre privind preferința de aromă la animalele care se comportă implică faptul că semnalizarea insulinei în coaja NAc influențează preferințele alimentare, ceea ce nu numai că implică insulina în învățarea legată de alimente, dar confirmă și rolul acesteia ca semnal de recompensă.

Net [DA]_o reflectă echilibrul dintre eliberarea DA și absorbția DA prin intermediul DAT. Dovezi anterioare care arată că insulina poate regla activitatea DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} a condus la predicția că o creștere a insulinei ar trebui să determine o scădere netă a [DA] evocată_o prin absorbția crescută a DA. Cu toate acestea, am constatat că în striat, efectul insulinei este mai complex decât acesta. Deși expunerea la insulină a crescut V_max pentru DAT, efectul principal al insulinei a fost asupra eliberării DA, nu asupra absorbției DA, cu o creștere constantă a [DA] evocată._o într-un interval fiziologic de concentrații de insulină în învelișul și miezul NAc și în CPu. Deși creșterea [DA] evocată_o a revenit la nivelurile de control la o concentrație suprafiziologică de 100 nM, V_max a fost, de asemenea, neschimbat față de control, eliminând un efect predominant asupra DAT ca explicație. În schimb, pierderea efectului asupra absorbției, precum și asupra eliberării implică desensibilizarea InsR sau reglarea în jos a căilor de semnalizare din aval la concentrații mari de insulină. Într-adevăr, InsR suferă endocitoză și degradare rapidă după legarea insulinei în țesuturile periferice¹, cu dovezi emergente pentru pierderea sensibilității neuronale la InsR după expunerea pe termen scurt la niveluri ridicate de insulină sau diete bogate în calorii^{10, 11, 39}.

Efectul dominant al insulinei de a îmbunătăți eliberarea striatală de DA raportat aici contrastează cu rezultatele altor două recente ex vivo studii de felie. În primul, insulina a provocat o scădere a revărsării evocate electric de [³H]DA din felii striatale, deși a crescut [³Overflow H]DA a fost detectat când DAT a fost inhibat²². Având în vedere că a lansat [³H]DA trebuie să scape de absorbția mediată de DAT în tot țesutul pentru a fi detectat în soluția de suprafuziune, acest protocol este deosebit de sensibil la reglementarea DAT. Rezultatele noastre care arată că insulina îmbunătățește eliberarea DA prin activarea ChIs și nAChR, în plus față de creșterea absorbției mediate de DAT, ar explica creșterea aparent paradoxală a creșterii cu insulină.³H]DA overflow văzut când efectele concurente asupra DAT au fost blocate²². Cel de-al doilea studiu a folosit FCV pentru detectarea directă a eliberării somatodendritice de DA în VTA, dar a găsit, de asemenea, un efect predominant al insulinei asupra absorbției de DA, reflectat în scăderea [DA] evocată._o (Ref. 23). Diferențele într-o serie de factori, de la microcircuite locale la mecanismele de eliberare a DA somatodendritice versus axonale⁴⁰, ar putea contribui la această diferență regională. După cum se discută mai jos, totuși, rolurile dependente de regiune ale insulinei sunt probabil să fie complementare, mai degrabă decât contradictorii.

Anterior, se presupunea că orice rol de reglare dependentă de insulină a semnalizării DA este mediat de activarea directă a InsR pe neuronii DA. Arătăm aici că InsR-urile sunt exprimate și pe ChIs striatale și că insulina modulează excitabilitatea ChI pentru a amplifica eliberarea DA striatală, care poate juca un rol esențial în influența insulinei asupra dietei. Chi-urile striatale primesc proiecții de la neuronii nucleilor intralaminari ai talamusului, care prezintă explozie ca răspuns la stimuli senzoriali proeminenti și ajută la stimularea tiparelor de explozie-pauză în Chi-uri care sunt importante în direcționarea atenției, întărire și învățare asociativă.⁴¹. Prin urmare, acțiunea insulinei la InsR asupra ChIs striatale ar putea spori efectul indicațiilor alimentare senzoriale asupra răspunsului striat la arderea talamică, contribuind la o percepție crescută a valorii recompensei unei mese ingerate. Promovarea directă a eliberării DA striatale prin activarea ChI a condus la sugestia că factorii care stimulează ChIs vor avea un rol privilegiat ca declanșatori ai eliberării DA.³³. Datele noastre oferă primele dovezi care susțin acest lucru, cu excitabilitatea ChI îmbunătățită cu insulină și semnalizarea ACh care determină creșteri dinamice ale eliberării DA.

Eliberarea crescută de DA în prezența insulinei pledează, de asemenea, împotriva unei îmbunătățiri a semnalizării ACh într-o măsură care provoacă desensibilizarea nAChR sau activarea receptorului muscarinic ACh (mAChR), oricare dintre acestea poate suprima [DA] evocată de un singur puls._o (ref 29, 30, 31, 42). Astfel, mecanismele raportate aici sunt distincte de activarea ACh a mAChR, care a fost asociată cu aversiunea și sațietatea.⁴³.

Evocat cu un singur impuls [DA]_o a fost mai mică atât la șobolanii FR cât și la OB decât la șobolanii AL; deși aceste rezultate sunt în consonanță cu rapoartele anterioare^{44, 45, 46}, studiile noastre oferă prima comparație sistematică a trei subregiuni striatale din cele două grupuri de dietă pe un interval de timp constant. Mecanismele care stau la baza modificărilor dependente de dietă în eliberarea DA nu au fost elucidate și depășesc domeniul de aplicare al studiilor prezente. Cu toate acestea, având în vedere că nivelurile de insulină plasmatică sunt modificate invers de dietele FR și OB, este puțin probabil ca scăderea [DA] evocată._o în ambele grupuri este o consecință a nivelurilor de insulină dependente de dietă.

Pe de altă parte, modificările sensibilității InsR cu dietă și nivelurile de insulină plasmatică dependente de dietă în consecință oferă cea mai probabilă explicație pentru sensibilitatea crescută la insulină în FR și pierderea răspunsului la insulină în OB. Nu a existat nicio dovadă pentru explicația alternativă a sensibilității modificate la nAChR la șobolani FR sau OB față de AL. Deși constatările noastre sunt printre primele care indică o sensibilitate crescută a InsR striatale cu FR¹⁸, pierderea în greutate poate fi însoțită de scăderea nivelului de insulină în LCR⁷, care ar contribui la creșterea sensibilității eliberării DA la insulină în FR. În schimb, pierderea răspunsului la insulină la șobolanii OB este în concordanță cu dovezile anterioare pentru scăderea sensibilității creierului InsR indusă de creșterea în greutate sau dietele OB^{3, 10, 11}.

Our ex vivo Datele secțiunii susțin ipoteza că insulina poate semnala recompensă, precum și sațietate. Am testat această ipoteză prin blocarea efectului insulinei endogene cu microinjecție bilaterală de InsAb în coaja NAc în timpul condiționării preferințelor de aromă. În concordanță cu un rol în recompensă, blocarea efectului insulinei a scăzut preferința pentru aroma unei soluții care conține glucoză în pereche față de aroma asociată cu semnalizarea insulină intactă. Blocarea insulinei în învelișul NAc a scăzut, de asemenea, consumul unei soluții pereche în timpul condiționării cu un singur flacon, în timp ce microinjecțiile simulate sau de control nu au avut niciun efect asupra consumului. Aceste date sugerează că insulina din învelișul NAc joacă un rol în preferința alimentară. Studiile anterioare au arătat că semnalizarea DA intactă în NAc este necesară pentru dobândirea condiționării aromei.^{37, 38}, confirmând rolul NAc DA în medierea efectelor de întărire ale soluțiilor nutritive. În această lumină, preferința pentru soluția de glucoză asociată cu disponibilitatea insulină intactă pledează împotriva efectului primar al insulinei asupra absorbției DA mediată de DAT în învelișul NAc, deoarece este de așteptat să scadă [DA]_o și, prin urmare, scad consumul aromei asociate de control. Rezultatele noastre sunt, de asemenea, în concordanță cu cele dintr-un studiu anterior în care microinjecția de insulină în învelișul de NAc a crescut timpul în care animalele au fost implicate în autoadministrarea orală de zaharoză, cu o creștere limită a consumului de zaharoză.²⁶, ceea ce a fost opusul consecinței așteptate a absorbției crescute de DA. În general, aceste date comportamentale sunt în concordanță cu influența prezisă a insulinei asupra ChIs striatale și cu eliberarea îmbunătățită de DA. Cu toate acestea, aceste rezultate nu exclud implicarea altor elemente ale microcircuitului striat în comportamentele monitorizate, având în vedere expresia larg răspândită a InsR în tot corpul striat.^{1, 14}.

Studiile raportate aici oferă primele dovezi că insulina joacă un rol în comunicarea valorii calorice și, prin urmare, a efectelor pline de satisfacție ale unei mese, ceea ce are implicații importante pentru influența insulinei atât la subiecții subponderali, cât și la cei obezi. Mai multe studii indică faptul că efectele post-ingestive ale alimentelor, indiferent dacă căile de transducție a gustului sunt intacte⁴⁷, crește eliberarea NAc DA și întărirea pozitivă a comportamentului^{37, 47}. Astfel, răspunsul post-absorbtiv al insulinei poate codifica randamentul glicemic al unei mese și poate contribui la întărirea preferințelor alimentare și a comportamentelor care permit consumul. Cu toate acestea, modificările extreme ale nivelurilor circulante de insulină și ale sensibilității centrale la InsR ar putea avea un rol atât în ​​comportamentul anormal, cât și în comportamentul adaptativ. De exemplu, hipoinsulinemia și suprareglarea compensatorie a sensibilității la InsR la subiecții FR ar putea fi un factor în dispoziția lor de a se înghiți.⁴⁸. În schimb, insensibilitatea centrală la insulină în diabetul de tip II sau obezitatea, oglindită aici la șobolanii OB, ar putea contribui la un sentiment de recompensă diminuat după ingerare, conducând la consumul de alimente cu un indice glicemic ridicat ca compensație.^{49, 50}. Prin urmare, fie o creștere, fie o scădere a sensibilității striatale la insulină ar putea contribui la alimentația patologică, ducând la alimentație excesivă și/sau obezitate.

În general, descoperirile noastre dezvăluie un nou rol al insulinei ca semnal de recompensă. Un astfel de rol contrastează cu funcția sa cunoscută ca semnal de sațietate, inclusiv descoperirile recente conform cărora insulina microinjectată în VTA poate scădea hrănirea hedonică și preferința pentru indicii asociate cu recompensa alimentară.^{23, 24}. Acest lucru ridică întrebarea cum pot fi reconciliate roluri aparent opuse pentru insulină în aceste funcții dependente de DA. Răspunsul poate fi că aceste efecte sunt mai degrabă complementare decât contradictorii. Rezultatele prezente indică faptul că insulina din striat comunică valoarea recompensei unei mese ingerate. Un rol dublu în semnalizarea sațietății poate permite pur și simplu insulinei să servească scopului important de a încheia o masă, stabilind în același timp o memorie a calităților sale nutriționale și, astfel, recompensând, întărind astfel repetarea comportamentului ingestiv.

Manipularea animalelor

Procedurile la animale au fost în conformitate cu ghidurile NIH și aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Școala de Medicină din NYU. Toate animalele au fost în ciclul lumină:întuneric de 12 ore, cu lumini aprinse de la 06:00 la 18:00; ex vivo feliile au fost pregătite între orele 08:00 și 12:00. Studiile mecaniciste la șobolani și șoareci AL au fost efectuate în ex vivo felii de la animale găzduite în perechi, în timp ce șobolanii au fost găzduiți individual pentru toate comparațiile grupurilor de dietă și pentru studii comportamentale.

Regimuri de dietă pentru șobolani

Șobolanii adulți Sprague-Dawley masculi (Taconic) aveau vârsta de 8-10 săptămâni la inițierea regimurilor de dietă care durau 21-30 de zile. Șobolanii au fost repartizați semi-aleatoriu în grupurile de dietă: subiecții au fost clasificați în funcție de greutatea inițială, apoi fiecare trio succesiv de șobolani a fost distribuit aleatoriu între grupurile de dietă. Șobolanii AL au avut acces gratuit la mâncarea de șobolan pentru aceeași perioadă ca și șobolanii perechi pe diete FR sau OB. Toți șobolanii aveau acces liber la apă. Restricția alimentară a fost implementată ca și anterior⁵¹; pe scurt, șobolanii au primit zilnic 40-50% din aportul de AL de mâncare standard de șobolan până când greutatea corporală a fost redusă cu 20%, după care hrana a fost titrată pentru a menține această greutate. Șobolanii OB au avut acces gratuit la mâncare de șobolan și ciocolată Ensure, un lichid foarte gustos, cu grăsimi și zahăr moderat.⁵².

creierului anterior Conversație soareci knockout

Șoareci cu o alelă floxată condiționată a Conversație (Conversație^flox) au fost încrucișate cu a Nkx2.1^Cre linie transgenică pentru a produce șoareci la care ablația sintezei ACh este limitată la prosencefal³². Colegii transgenici non-mutant au fost martori; genotipurile lor Cre⁺;Conversație^{flox / +} si Cre^-;Conversație^{flox / flox} sunt denumiți „heterozigoți”. Șoarecii masculi adulți utilizați pentru studiile pe felii au avut ad libitum acces la mâncare și apă.

Ex vivo prepararea feliei și soluții fiziologice

Șobolanii sau șoarecii au fost anesteziați profund cu 50 mg kg^-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) și decapitat. Pentru voltametrie, felii coronale ale creierului anterior (grosimea de 300–400 μm) au fost tăiate pe un microtom cu lamă vibrantă Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) în LCR artificial tamponat cu HEPES (aCSF) rece ca gheață, care conține (în mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glucoză (10); acid HEPES (6.7); KCI (5); sare de sodiu HEPES (3.3); CaCl₂ (2); și MgSO₄ (2), echilibrat cu 95% O₂/ 5% CO₂. Feliile au fost apoi menținute în această soluție la temperatura camerei timp de 1 oră înainte de experimentare^{30, 32, 53}. Pentru electrofiziologie, după anestezie, șobolanii au fost perfuzați transcardic cu soluție rece ca gheață care conținea (în mM): zaharoză (225); KCI (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glucoză (7); ascorbat (1); și piruvat (3) și echilibrat cu 95% O₂/ 5% CO₂. Feliile au fost tăiate în această soluție, apoi transferate într-o cameră de recuperare în aCSF modificat care conține (în mM): NaCI (125); KCI (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glucoză (25); ascorbat (1); piruvat (3); și mio-inozitol (4), echilibrat cu 95% O₂/ 5% CO₂; această soluție a fost inițial la 34 °C, apoi lăsată să se răcească treptat la temperatura camerei⁵⁴. Toate experimentele de voltametrie și fiziologie au fost efectuate într-o cameră de înregistrare submersă la 32 ° C care a fost suprafuzionată la 1.5 ml min.^-1 cu aCSF care conţine (în mM): NaCI (124); KCI (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); și glucoză (10) și albumină serică bovină (BSA, 0.05–0.1 mg ml^-1) echilibrat cu 95% O₂/ 5% CO₂; feliile au fost lăsate să se echilibreze în acest mediu timp de 30 de minute înainte de experimentare.

Voltametrie ciclică cu scanare rapidă

Studiile de eliberare a DA evocate au fost efectuate folosind FCV în felii de creier^{32, 53} preparat din şobolani masculi sau Conversație Șoareci knockout pentru creier anterior și martori heterozigoți (5-8 săptămâni). Studii în Conversație Soarecii knockout au fost orbiti, dar grupurile cu dieta de sobolani au avut fenotipuri evidente care au exclus orbirea. Măsurătorile voltametrice au fost făcute cu un Voltametru Millar (disponibil la cerere specială Dr. Julian Miller de la St Bartholomew's și Royal London School of Medicine and Dentistry, Universitatea din Londra). O formă de undă triunghiulară convențională a fost utilizată pentru FCV, cu un interval de scanare de la -0.7 la +1.3 V (față de Ag/AgCl), o rată de scanare de 800 V s^-1, și interval de eșantionare de 100 ms^{30, 32, 53}. Datele au fost achiziționate folosind o placă A/D DigiData 1200B controlată de software-ul Clampex 7.0 (Dispozitive Moleculare). Eliberarea DA a fost evocată folosind un electrod de stimulare concentric; amplitudinea impulsului stimul a fost de 0.4–0.6 mA și durata a fost de 100 μs^{30, 32, 53}. Stimularea locală cu un singur puls a fost utilizată în miezul NAc și CPu; totuși, a fost folosit un scurt tren de impulsuri de înaltă frecvență (cinci impulsuri la 100 Hz) pentru a amplifica [DA] evocat._o în coajă NAc. Ambele paradigme de stimul evocă eliberarea DA, care este potențial de acțiune și Ca²⁺ dependent, neafectat de glutamat și GABA eliberați concomitent^{42, 55}, și facilitat de ACh eliberat concomitent^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Pentru a cuantifica evocat [DA]_o, electrozii au fost calibrați cu concentrații cunoscute de DA la 32 °C după fiecare experiment în aCSF și în prezența fiecărui medicament utilizat în timpul unui experiment dat.⁵³.

Experimente de voltametrie pentru a evalua efectul insulinei asupra [DA] evocată_o au fost obținute folosind oricare dintre cele două protocoale. Experimentele inițiale pentru a determina cursul în timp pentru efectul insulinei (Sigma, I5523) au fost efectuate prin monitorizarea evocată [DA]_o la fiecare 5 minute într-un singur loc. Insulina a fost aplicată după evocarea consecventă [DA]_o a fost obținut (de obicei 4–5 măsurători); efectul insulinei a fost maxim după 50-60 de minute și apoi a evocat [DA]_o a rămas la acest nivel pe durata experimentului (de obicei 90 de minute expunere totală la insulină; Fig. 1c). Ulterior, efectul insulinei a fost evaluat prin înregistrarea evocată [DA]_o la 4-5 situsuri discrete în felii (+1.5 mm de la bregma) în fiecare dintre cele trei subregiuni striatale în condiții de control (aCSF sau aCSF plus medicament) și din nou la momentul efectului maxim al insulinei (prelevare de probe peste 60-80 min), apoi aceste eșantioane au fost mediate pentru fiecare subregiune. Efectul insulinei s-a diminuat cu timpul după prepararea feliei; pentru a minimiza timpul ex vivo și pentru a optimiza utilizarea animalelor, de obicei, două felii dintr-un animal dat au fost testate în camera de înregistrare în același timp. Medicamentele utilizate pentru a provoca efectul insulinei au fost aplicate cu 15 minute înainte de insulină prin suprafuziune aCSF, inclusiv esterul trisacetoximetil HNMPA (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodofilotoxină (PPP; Tocris), mecamilamină (Tocris) și DHβE (Tocris). După cum este descris în Rezultate, sensibilitatea posibilă modificată a receptorilor nicotinici ACh în rândul grupurilor de dietă a fost testată prin compararea raportului de vârf [DA]_o evocat de 5 p (100 Hz) cu cel evocat de 1 p evocat (raport 5 p:1 p)^{30, 31} în miezul NAc în prezența nicotinei 0–500 nM (Sigma).

Determinarea V _max din evocat [DA]_o tranzitorii în felii striatale

Pentru a evalua modificările induse de insulină în absorbția DA mediată de DAT, partea inițială a fazei de scădere a [DA] evocată_o curbele au fost adaptate ecuației Michaelis–Menten pentru a extrage V_max (constanta ratei maxime de absorbtie)⁵⁶. K_m (care este invers legat de afinitatea DAT pentru DA) a fost fixat la 0.2 μM și se știe a fi similar în toate subregiunile striatale⁵⁷ și neafectate de insulină (vezi Imagine suplimentară 4 legendă).

Înregistrarea întregii celule

Au fost preparate felii de creier de la șobolani masculi în vârstă de 29 până la 35 de zile; condițiile de înregistrare au fost identice cu cele utilizate în studiile de eliberare a DA. Înregistrările cu clemă de curent pentru celule întregi au folosit metode convenționale⁵⁴. Striatale ChIs au fost vizualizate folosind un microscop Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) cu optică de contrast cu interferență diferențială în infraroșu și un obiectiv de imersie în apă × 40. Soluţia pipetă a conţinut (în mM): K-gluconat (129); KCI (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); N / A₂-ATP (2); N / A₃-GTP (0.3); și ajustat la pH 7.2-7.3 cu KOH. Pentru ca neuronii înregistrați să fie evaluați pentru imunoreactivitatea ChAT, 0.3% biocitină a fost inclusă în soluția de pipetă, iar neuronii au fost înregistrați pentru scurt timp (~ 5 min) pentru a minimiza diluția conținutului intracelular. Rezistența pipetei a fost de ~3–5 MΩ. Înregistrările au fost obținute folosind un amplificator Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) și filtrate trece-jos la 2 kHz. ChIs au fost identificate prin criterii electrofiziologice stabilite²⁸; majoritatea au fost activi tonic inițial, dar activitatea sa diminuat variabil după plasare. Cu toate acestea, reacția la injectarea curentă a fost în general robustă și consecventă în timp și, prin urmare, a fost utilizată pentru a investiga efectul insulinei asupra excitabilității ChI (vezi Rezultate). În experimentele pentru a examina rolul InsR și IGF-1R în acest răspuns, fie HNMPA, fie PPP a fost aplicat timp de cel puțin 20 de minute înainte ca un ChI să fie patch-at. Efectele maxime ale insulinei în monoterapie au fost de obicei observate după ~16 minute de expunere, deși în unele celule, creșterea nu a fost maximă până la 50 de minute sau mai mult. Mai mult, în patru din șase neuroni înregistrați în PPP, insulina a provocat o scădere inițială a numărului de vârfuri înainte de a reveni la și de a depăși numărul de vârf. În consecință, în toate experimentele, efectul insulinei a fost cuantificat prin compararea efectului maxim asupra numărului de vârfuri cu numărul de vârfuri evocate imediat înainte de aplicarea insulinei. Diferența aparentă în timpul până la atingerea efectului maxim ar putea reflecta o serie de factori, inclusiv adâncimea celulei înregistrate în felie. Potențialele de acțiune evocate au fost, de asemenea, înregistrate în ChIs în absența insulinei la momente de timp comparabile.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță

Conținutul de DA al feliilor striate de șobolan (grosime de 400 μm) a fost determinat utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție electrochimică⁵⁸. Perechile de felii au fost echilibrate timp de 30 de minute la 32 ° C în aCSF, iar apoi o felie per pereche a fost incubată pentru încă 60 de minute la 32 ° C în aCSF, în timp ce cealaltă a fost incubată în aCSF cu 10 sau 30 nM de insulină. Pentru comparațiile grupurilor de dietă, țesutul striat a fost colectat între 30-60 de minute după recuperare. După incubare, excesul de aCSF a fost îndepărtat cu grijă din felii, o probă de țesut striatal (7-10 mg) a fost cântărită, congelată pe gheață uscată și apoi depozitată la -80 ° C. În ziua analizei, probele au fost sonicate în eluent rece ca gheață, dezoxigenate cu argon⁵⁸, s-a rotit într-o microcentrifugă timp de 2 minute, iar supernatantul a fost injectat direct pe coloana HPLC (BAS, West Lafayette, IN); detectorul a fost un electrod de carbon sticlos setat la 0.7 V față de Ag/AgCl.

imunohistochimie

Pentru etichetarea imunohistochimică, șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (50 mg kg^-1, ip), apoi perfuzat transcardial cu PBS (154 mM NaCI în tampon fosfat 10 mM, pH 7.2) urmat de paraformaldehidă 4% în acest PBS; creierele au fost îndepărtate și secțiunile coronale (20 μm) au fost tăiate și prelucrate convențional^{27, 59}. Imaginile de imunofluorescență au fost obținute cu un microscop confocal Nikon PM 800 echipat cu o cameră digitală controlată de software-ul Spot (Diagnostic Instruments Inc.) și folosind un obiectiv × 100 (apertura numerică = 1.4) sau cu un microscop confocal Zeiss LSM 510 folosind un × 63 obiectiv (apertura numerică=1.2). Laserele au fost Argon (488 nm), He/Ne (543 nm) și He/Ne (633 nm). Filtrele adecvate pentru fiecare laser au fost selectate de software-ul microscopului confocal. Dimensiunea găurii a variat în funcție de obiectivul utilizat și de grosimea secțiunii selectate z-generarea stivei; am ales valoarea optimă indicată de software (de obicei 30 μm). Fișierele digitale au fost analizate cu software de deconvoluție (AutoQuant Imaging), cu imaginile finale procesate folosind Adobe Photoshop 7.0. Toate imaginile au fost ajustate pentru luminozitate și contrast; astfel de ajustări au fost făcute uniform în toate părțile imaginii. Axonii striatali DA au fost identificați folosind doi anticorpi TH: AB152 policlonal de iepure anti-TH (1:800) și monoclonal MAB318 anti-TH de șoarece (1:500) (ambele de la Chemicon). Au fost utilizați trei anticorpi InsR: sc-57342 și sc-09 (1:100; Santa Cruz) și PP5 (un cadou de la Pfizer). Specificitatea fiecăruia a fost demonstrată anterior^{60, 61}, și a fost confirmat în studiile prezente prin absența imunomarcarii cu anticorpi sc-57342 sau PP5 în prezența peptidei de blocare corespunzătoare. Anticorpul ChAT a fost AB144 (1:200; Millipore), iar biotina a fost de la Vector (1:200). Anticorpii secundari utilizați au fost Alexa 488 anti-iepure de măgar (Invitrogen) sau Cy2 anti-iepure de măgar (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), Cy3 anti-capră de măgar (Jackson) și Cy5 anti-șoarece de măgar (Jackson).

Pentru a evalua co-localizarea InsR în axonii TH+, am folosit metode descrise anterior pentru a identifica prezența Kir6.2, subunitatea formatoare de pori a K sensibilă la ATP.⁺ canalele din axonii DA²⁷. Puncta reprezentând InsRs au fost distribuite în imaginile ajustate, indicând faptul că suprapunerea cu imunoreactivitatea TH poate apărea într-o oarecare măsură din întâmplare. Pentru a testa această ipoteză, am numărat suprapunerile InsR/TH în 42 de câmpuri independente în trei secțiuni imunomarcate cu NAc de la doi șobolani. Fișierele digitale InsR au fost apoi rotite cu 90° în sensul acelor de ceasornic și numărătoarea s-a repetat; rotația a scăzut numărul de puncte InsR care s-au co-localizat cu TH în majoritatea câmpurilor (vezi Rezultate). Scăderea numărului de suprapuneri cu rotație²⁷ a indicat proporția de InsR puncta în fiecare câmp striatal asociat cu axonii DA.

ELISA pentru glicemie și insulină

Sângele trunchiului a fost recoltat la momentul decapitării pentru studiile pe felii. Glicemia a fost determinată imediat cu un monitor standard de glucoză din sânge. Pentru insulină, sânge suplimentar a fost colectat în tuburi care conțineau EDTA și centrifugat la 1,500g timp de 15 min; supernatantul (plasma) a fost colectat și depozitat la -80 ° C până la procesare cu un kit ELISA de insulină de șobolan ALPCO.

Amplasarea canulelor și verificarea histologică

Patruzeci și unu de șobolani Sprague-Dawley masculi adulți (Taconic și Charles River) care cântăreau inițial 350-425 g au fost anesteziați cu ketamina (100 mg kg).^-1, ip) și xilazină (10 mg kg^-1, ip) și implantate stereotaxic cu două canule de ghidare cronice (calibrul 26) plasate bilateral la 2.0 mm dorsal față de locurile de perfuzie în învelișul medial NAc⁶² (1.6 mm anterior față de bregma; 2.1 mm lateral față de sutura sagitală, vârfurile înclinate la 8° spre linia mediană, 5.8 mm ventral față de suprafața craniului). Șobolanii au primit banamină (2.0 mg kg^-1, subcutanat) ca analgezic post-chirurgical după recuperarea din anestezie și a doua zi. La o săptămână după operație, șobolanii au fost plasați pe FR (descris mai sus) și menținuți la 80% din greutatea lor de recuperare post-chirurgicală pentru restul studiului. Amplasarea canulei a fost determinată histologic după finalizarea testării comportamentale. Fiecare șobolan a fost ucis cu CO₂, decapitat și creierul îndepărtat și fixat în formol tamponat 10% timp de >48 ore. Secțiunile coronale înghețate (40-μm grosime) au fost tăiate pe un Criostat Reichert-Jung, dezghețate montate pe lame de sticlă acoperite cu gelatină și colorate cu violet de cresil. Datele de la un șobolan dat au fost utilizate numai dacă ambele canule se aflau în învelișul medial de NAc⁶² (inclusiv cochilia/miezul sau marginea cochiliei/tuberculului olfactiv) (Imagine suplimentară 5); pe baza acestor criterii, doi șobolani au fost excluși din analiza finală.

Condiționarea preferințelor de aromă pre-expunere

Șobolanii au primit o noapte (în cușcă de acasă) și șase sesiuni de 30 de minute pe zi de pre-expunere (în camerele de testare) la zaharină de sodiu 0.2% (Sigma) în apă, cu un interval de 48 de ore între sesiuni. Șobolanii au primit apoi două sesiuni de 5 minute pe zi de expunere la zaharină de sodiu 0.2% în 0.05% struguri neindulciți sau cireșe Kool-Aid (Kraft Foods) în apă. Pentru prima sesiune de pre-expunere Kool-Aid, jumătate dintre șobolani au primit soluție cu aromă de cireșe, iar cealaltă jumătate a primit soluție cu aromă de struguri. Aromele au fost inversate la a doua sesiune de pre-expunere Kool-Aid pentru a se asigura că toți șobolanii au luat probe din fiecare aromă. Aportul a fost măsurat pentru toate sesiunile de pre-expunere. Camerele de testare au fost cuști din plastic transparent cu așternut proaspăt. Pentru toate sesiunile de pre-expunere, șobolanii au avut acces la aceeași soluție pe ambele părți ale camerei. Cu excepția sesiunii de pre-expunere peste noapte, toate sesiunile s-au desfășurat într-o cameră de proceduri comportamentale, cu o perioadă de obișnuire de 30 de minute înainte de orice antrenament sau testare.

Condiționare cu o sticlă

Studiile anterioare au arătat că microinjecția de InsAb în hipotalamusul ventromedial poate bloca efectul insulinei asupra comportamentului alimentar și secreției de glucagon.^{63, 64}. Aici am folosit această abordare pentru a evalua un posibil rol al insulinei în consolidarea alegerii alimentelor. Șobolanii au fost repartizați semi-aleatoriu pe baza volumului mediu de aport pre-expunere în două grupuri, martor sau experimental (InsAb). În grupul de control, șobolanii au primit vehicul (microinjecție PBS; 137 mM NaCl și 2.7 mM KCl în tampon fosfat 10 mM) sau IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl)^-1 în PBS, așa cum este primit) microinjecție în coajă de NAc înainte de a consuma una dintre cele două soluții aromate și o microinjecție simulată înainte de a consuma cealaltă soluție aromatizată. În grupul experimental, șobolanii au primit microinjecție cu coajă de NAc de InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl de 1 μg μl^-1 în PBS, așa cum este primit) înainte de expunerea la o soluție aromatizată și microinjecție simulată înainte de expunerea la cealaltă. Au fost utilizate două seturi de subiecți cu alternanță între microinjecție de fluid și microinjecție simulată, astfel încât numărul total de microinjecții a fost limitat la patru, reducând astfel la minimum posibilele leziuni tisulare și pierderea sensibilității la locul de microinjecție.⁶⁵. Pentru microinjectarea fluidului, soluția de control sau InsAb a fost încărcată în două tuburi PE-30 de 50 cm, atașate la un capăt la seringi Hamilton de 5 μl umplute cu apă distilată și la celălalt capăt la canule de injector de calibrul 31, care se extindeau 2.0 mm. dincolo de ghidajele implantate. Volumele de perfuzie de 0.5 μl au fost livrate în decurs de 90 s la o viteză de 0.005 μl s^-1; injectorul a fost lăsat pe loc timp de ~60 s pentru a permite timp pentru difuzie, apoi injectorul a fost înlocuit cu stilul.

Șobolanii au fost transferați direct în camerele comportamentale în 2 minute de la finalizarea microinjecției sau a microinjecției simulate. Soluțiile de condiționare au conținut zaharină de sodiu 0.2%, struguri sau cireșe Kool-Aid 0.05% neindulciți și glucoză 0.8%. Accesul la soluție a fost limitat la 30 de minute pe sesiune. Aromă pereche și partea din cameră cu acces la băut au fost repartizate semi-aleatoriu și contrabalansate în fiecare grup. Intervalul dintre microinjecții a fost de cel puțin 72 de ore, alternând între sesiuni de perfuzie și simulare pentru un total de opt sesiuni de condiționare.

Test de preferință pentru două sticle

La patruzeci și opt de ore după ultima sesiune de condiționare, șobolanii au fost plasați în camere de testare cu acces simultan la ambele arome de condiționare; soluțiile au fost zaharină sodică 0.2% în Kool-Aid de struguri sau cireș 0.05%, fără glucoză. Testarea a avut loc pe parcursul a 2 zile (60 de minute pe zi). Poziția tubului de băut care conține soluție simulată pereche sau perfuzie a fost alternată pentru a se asigura că fiecare șobolan a fost testat pentru consumul fiecărei soluții pe ambele părți ale cuștii. Aportul fiecărei soluții aromate a fost mediatizat pentru cele două zile de testare pentru a determina preferința.

[³Captarea H]DA în sinaptozomii striatali pentru a evalua eficacitatea InsAb

Sinaptozomi striatali^{21, 66} au fost preparate de la șobolani AL (masculi, 350–400 g), cu NAc (coaja și miez) și CPu disecate și preparate separat. Țesutul din fiecare regiune a fost omogenizat în 15 volume dintr-o soluție de zaharoză 0.32 M rece ca gheață într-un omogenizator de sticlă cu pistil de teflon acţionat cu motor; după clătire și centrifugare, granula finală a fost resuspendată în zaharoză 0.32 M rece ca gheață^{21, 66}. Înainte de a iniția [³Testul de absorbție a H]DA⁶⁶, alicote sinaptozomale într-un volum total de 180 μl de tampon de absorbție au fost incubate într-un agitator timp de 15 minute la 30 °C în prezența sau absența insulinei 30 nM, în vehicul (PBS) sau în InsAb (diluție finală 1:500) , în IgG (diluție finală 1:500) sau în vehicul. Tampon de absorbție conținut (în mM): NaCI (122); N / A₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCI (5); MgSO₄ (1.2); glucoză (10), CaCI₂ (1); nialamidă (0.01); tropolon (0.1); şi acid ascorbic (0.001), pH 7.4. Absorbția de [³H]DA a fost inițiat prin distribuirea rapidă a 20 μl din fiecare suspensie sinaptozomală în plăcile cu 96 de godeuri cu concentrații diferite de DA (0.003–1.0 μM) și [³H]DA (5 nM); după 5 minute într-un agitator cu plăci la 25 °C, absorbția a fost încheiată prin filtrare la rece, rapidă în vid⁶⁶. Numărările per godeu au fost convertite în pmol, apoi corectate la mg de proteină totală pe minut. Toate testele au fost efectuate în trei exemplare și repetate de cel puțin patru ori; V_max și K_m au fost calculate folosind software-ul Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Marea Britanie).

analize statistice

Datele sunt date ca mijloace±sem; semnificația a fost evaluată folosind pereche sau nepereche Student's t-teste sau ANOVA, dacă nu se indică altfel. Pentru datele de voltametrie, n este numărul de locuri de înregistrare, având în vedere că variabilitatea de la un loc la altul într-o subregiune striatală este mai mare decât variabilitatea între animale sau între felii^{30, 32, 55, 56}; numărul animalului este notat pentru fiecare set de date. CE₅₀ pentru efectul insulinei și nicotinei asupra evocatei de vârf [DA]_o a fost calculat folosind Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pentru datele electrofiziologice, semnificația statistică a fost evaluată folosind pereche t-teste sau un test Wilcoxon în Prism 6.0 sau un ANOVA mixt în două sensuri în SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Pentru evaluarea implicării insulinei în condiționarea preferinței de aromă, au fost finalizate două studii complete folosind protocoale care au fost identice, cu excepția tratamentului vehicul utilizat. În primul studiu, 10 șobolani au primit infuzii de vehicul cu PBS și 9 au primit perfuzii de InsAB. În cel de-al doilea studiu, 10 șobolani au primit perfuzii cu vehicul de IgG și 10 au primit perfuzii cu InsAb. Nu a existat o diferență semnificativă între cele două grupuri de vehicule (PBS sau IgG) în timpul sesiunilor de condiționare a perfuziei (F₁₉= 0.619, ANOVA mixt în două sensuri) cu măsuri repetate în sesiunea de condiționare prin perfuzie) sau la test (F₁₉=0.012, ANOVA mixtă în două sensuri cu măsuri repetate asupra aromei). În consecință, cele două experimente au fost combinate pentru analiză. Pentru această analiză, a fost utilizat un ANOVA mixt 2 × 4 (cu măsuri repetate în ziua condiționării perfuziei) pentru a determina efectele tratamentului cu microinjecție în timpul condiționării, urmat de protejat. t-testele (o coada pentru a determina in ce sedinte de conditionare tratamentul cu microinjectie a scazut volumul de aport). Aceeași analiză a fost efectuată pentru sesiunile de condiționare simulată. Pentru a determina efectul tratamentului de condiționare în timpul unui test de preferință a aromei în două sticle, datele au fost analizate utilizând un ANOVA mixt în două sensuri (cu măsuri repetate asupra aromei), urmat de protejat. t-teste (o coadă pentru a testa ipoteza că InsAb ar scădea preferința).

Cum se citează acest articol: Stouffer, MA et al. Insulina îmbunătățește eliberarea de dopamină striatală activând interneuronii colinergici și, prin urmare, semnalează recompensa. Nat. commun. 6:8543 doi: 10.1038/ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Receptorii de insulină și acțiunea insulinei în creier: revizuire și implicații clinice. Neurosci. Comportament biologic. Rev. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Articol
   • Afișați contextul
2. Gerozissis, K. Insulina cerebrală, homeostazia energiei și glucozei; gene, mediu și patologii metabolice. EURO. J. Pharmacol. 585, 38–49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Articol
6. Afișați contextul
7. CAS
8. PubMed
9. Articol
10. Afișați contextul
11. CAS
12. PubMed
13. Articol
14. Afișați contextul
15. CAS
16. PubMed
17. Articol
18. Afișați contextul
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Articol
23. Afișați contextul
24. ISI
25. PubMed
26. Articol
27. Afișați contextul
28. CAS
29. PubMed
30. Articol
31. Afișați contextul
32. Afișați contextul
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Articol
37. Afișați contextul
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Articol
42. Afișați contextul
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Afișați contextul
47. ISI
48. PubMed
49. Articol
50. Afișați contextul
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Articol
55. Afișați contextul
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Articol
60. Afișați contextul
61. Afișați contextul
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Articol
66. Afișați contextul
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Articol
71. Afișați contextul
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Articol
76. Afișați contextul
77. PubMed
78. Articol
79. Afișați contextul
80. Afișați contextul
81. CAS
82. PubMed
83. Articol
84. Afișați contextul
85. ISI
86. PubMed
87. Articol
88. Afișați contextul
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Articol
93. Afișați contextul
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Articol
98. Afișați contextul
99. CAS
100. PubMed
101. Articol
102. Afișați contextul
103. Afișați contextul
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Articol
108. Afișați contextul
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Articol
113. Afișați contextul
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Articol
118. Afișați contextul
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Articol
123. Afișați contextul
124. PubMed
125. Articol
126. Afișați contextul
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Articol
131. Afișați contextul
132. CAS
133. PubMed
134. Articol
135. Afișați contextul
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Articol
140. Afișați contextul
141. CAS
142. PubMed
143. Articol
144. Afișați contextul
145. ISI
146. PubMed
147. Articol
148. Afișați contextul
149. Afișați contextul
150. Afișați contextul
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Articol
155. Afișați contextul
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Articol
160. Afișați contextul
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Articol
165. Afișați contextul
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Articol
170. Afișați contextul
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Afișați contextul
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Articol
179. Afișați contextul
180. PubMed
181. Articol
182. Afișați contextul
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Articol
187. Afișați contextul
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Articol
192. Afișați contextul
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Articol
197. Afișați contextul
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Articol
202. Afișați contextul
203. Afișați contextul
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Afișați contextul
208. Afișați contextul
209. Afișați contextul
210. Afișați contextul
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Articol
215. Afișați contextul
216. CAS
217. PubMed
218. Articol
219. Afișați contextul
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Afișați contextul
224. Afișați contextul
225. CAS
226. PubMed
227. Articol
228. Afișați contextul
229. ISI
230. PubMed
231. Articol
232. Afișați contextul
233. Afișați contextul
234. ISI
235. PubMed
236. Articol
237. Afișați contextul
238. Afișați contextul
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Articol
243. Afișați contextul
244. Afișați contextul
245. Vogt, MC & Bruning, JC Semnalizarea insulinei SNC în controlul homeostaziei energetice și al metabolismului glucozei - de la embrion până la bătrânețe. Tendințe Endocrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankov, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identificarea insulinei în creierul șobolanului. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Transport mediat de receptor al insulinei prin celulele endoteliale. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Răspunsurile la insulină și nivelurile de glucoză din plasmă și lichidul cefalorahidian în timpul postului și al realimentării la șobolan. Physiol. Comportament. 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Permeabilitatea diferențială a barierei hemato-encefalice la două peptide pancreatice: insulina și amilina. Peptide 19, 883–889 (1998).
250. Banks, WA Sursa de insulină cerebrală. EURO. J. Pharmacol. 490, 5–12 (2004).
251. Nemoto, T. et al. Noi perspective privind sinteza insulinei și secreția acesteia în hipocampul și cortexul cerebral de șobolan: reducerea indusă de amiloid-β1-42 a nivelului de proinsulină prin glicogen sinteta kinaza-3β. Semnal celular. 26, 253–259 (2014).
252. De Souza, CT et al. Consumul unei diete bogate in grasimi activeaza un raspuns proinflamator si induce rezistenta la insulina in hipotalamus. Endocrinologie 146, 4192–4199 (2005).
253. Anthony, K. et al. Atenuarea răspunsurilor evocate de insulină în rețelele cerebrale care controlează apetitul și recompensa în rezistența la insulină: baza cerebrală pentru controlul afectat al consumului de alimente în sindromul metabolic? Diabet 55, 2986–2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Neuroștiința recompenselor naturale: relevanță pentru drogurile care creează dependență. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF și Volkow, ND Neurocircuitele dependenței. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA et al. Localizarea și caracterizarea receptorilor de insulină în creierul de șobolan și glanda pituitară folosind in vitro autoradiografie și densitometrie computerizată. Endocrinologie 121, 1562–1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Expresia receptorilor pentru insulină și leptină în zona tegmentală ventrală/substanța neagră (VTA/SN) a șobolanului. Brain Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC et al. Semnalizarea insulinei și dependența. Neuropharmacology 61, 1123–1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Semnale de reglementare energetică și recompensă alimentară. Pharmacol. Biochim. Comportament. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA et al. Privarea de hrană scade ARNm și activitatea transportorului de dopamină la șobolan. Neuroendocrinologie 68, 11–20 (1998).
261. Carvelli, L. et al. Reglarea PI 3-kinazei a captării dopaminei. J. Neurochem. 81, 859–869 (2002).
262. Williams, JM et al. Hipoinsulinemia reglează transportul invers al dopaminei indus de amfetamine. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Restricția alimentară cronică și funcția de transportator de dopamină în striatul șobolanului. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN et al. Insulina modulează funcția de transportator de monoamine sensibile la cocaină și comportamentul impulsiv. J. Neurosci. 31, 1284–1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulina din zona tegmentală ventrală reduce hrănirea hedonică și suprimă concentrația de dopamină prin recaptarea crescută. EURO. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. et al. Insulina induce deprimarea pe termen lung a neuronilor dopaminergici din zona tegmentală ventrală prin endocannabinoizi. Nat. Neurosci. 16, 300–308 (2013).
267. Konner, AC et al. Rolul semnalizării insulinei în neuronii catecolaminergici în controlul homeostaziei energetice. Cell Metab. 13, 720–728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulina acționează la diferite locuri ale SNC pentru a scădea aportul acut de zaharoză și autoadministrarea zaharozei la șobolani. A.m. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388–R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Reglarea subsecundă a eliberării dopaminei striatale prin K pre-sinaptic_ATP canale. J. Neurochem. 118, 721–736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Diversitatea funcțională și specificitatea interneuronilor neostriatali. Curr. Opinează. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. și Dani, JA Activitatea colinergică nicotinică endogenă reglează eliberarea de dopamină în striat. Nat. Neuroști. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rice, ME & Cragg, SJ Nicotina amplifică semnalele de dopamină legate de recompensă în striat. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Modularea dependentă de frecvență a eliberării dopaminei de către nicotină. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME și Machold, RP Reglarea opusă a eliberării de dopamină striatală și a comportamentului motor explorator de către aporturile colinergice ale creierului anterior și ale trunchiului cerebral. Nat. comun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. et al. Eliberarea de dopamină striatală este declanșată de activitatea sincronă în interneuronii colinergici. Neuron 75, 58–64 (2012).
276. Cachope, R. et al. Activarea selectivă a interneuronilor colinergici îmbunătățește eliberarea fazică de dopamină accumbal: dând tonul procesării recompensei. Cell Rep. 2, 1–9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP și Wonnacott, S. Localizarea presinaptică a imunoreactivității subunității beta2 a receptorului nicotinic de acetilcolină în neuronii dopaminergici nigrostriatali de șobolan. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ et al. Interneuronii colinergici mediază transmiterea glutamatergică rapidă dependentă de VGluT3 în striat. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Activarea receptorilor de tip dopamină D1 din nucleul accumbens este critică pentru dobândirea, dar nu și expresia, a preferințelor de aromă condiționate de nutrienți la șobolani. EURO. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamina și preferințele alimentare învățate. Physiol. Comportament. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Semnalizarea centrală a insulinei este atenuată de expunerea pe termen lung la insulină prin fosforilarea serinei substratului receptorului de insulină-1, degradarea proteazomală și degradarea receptorului de insulină lizozomal. Endocrinologie 151, 75–84 (2010).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Eliberarea de dopamină în ganglionii bazali. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Contribuții talamice la comutarea și consolidarea comportamentală legate de ganglionii bazali. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. et al. Receptorii muscarinici striatali promovează dependența de activitate a transmiterii dopaminei prin subtipuri distincte de receptori pe interneuronii colinergici în striatul ventral versus dorsal. J. Neurosci. 30, 3398–3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens echilibru dopamină-acetilcolină în abordare și evitare. Curr. Opinează. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Mâncarea restricționată cu scădere în greutate scade selectiv dopamina extracelulară în nucleul accumbens și modifică răspunsul dopaminei la amfetamină, morfină și aportul alimentar. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Geiger, BM et al. Deficiențe ale neurotransmisiei dopaminei mezolimbice în obezitatea alimentară la șobolani. Neuroscience 159, 1193–1199 (2009).
288. Morris, JK et al. Rezistența la insulină afectează funcția dopaminei nigrostriatale. Exp. Neurol. 231, 171–180 (2011).
289. De Araujo, IE et al. Recompensă alimentară în absența semnalizării receptorilor gustativi. Neuron 57, 930–941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Relația dintre obezitate și răspunsul striat tocit la alimente este moderată de alela TaqIA A1. Science 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ et al. Dopamina cerebrală și obezitatea. Lancet 357, 354–357 (2001).
292. Johnson, PM & Kenny, PJ Receptorii de dopamină D2 în disfuncția recompensă asemănătoare dependenței și alimentația compulsivă la șobolanii obezi. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Efectele de recompensare și de activare a locomotorii ale agoniştilor direcţi ai receptorilor dopaminergici sunt sporite de restricţia alimentară cronică la șobolani. Psychopharmacology (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Apărarea punctelor de referință diferite ale greutății corporale la șobolanii obezi și rezistenți induși de dietă. A.m. J. Physiol. 274, R412–R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Monitorizarea eliberării de dopamină axonală și somatodendritică folosind voltametrie ciclică cu scanare rapidă în bucăți de creier. Metode Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Reglarea activității neuronilor GABAergici a substanței negre pars reticulata de către H₂O₂ prin canale sensibile la acidul flufenamic și K_ATP canale. Față. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Reglarea limitată a eliberării de dopamină somatodendritică prin Ca sensibil la tensiune²⁺ canalele au contrastat cu reglarea puternică a eliberării axonale de dopamină. J. Neurochem. 96, 645–655 (2006).
298. Li, X. et al. Transmiterea striatală îmbunătățită a dopaminei și performanța motrică cu supraexpresia LRRK2 la șoareci este eliminată de mutația familială a bolii Parkinson G2019S. J. Neurosci. 30, 1788–1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Determinarea parametrilor de eliberare și absorbție din dinamica dopaminei evocată electric măsurată prin voltametrie în timp real. J. Neurosci. Metode 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ este un modulator endogen nou al eliberării sinaptice de dopamină. J. Neurofiziol. 85, 2468–2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Identificarea imunocitochimică a proteinelor implicate în eliberarea dopaminei din compartimentul somatodendritic al neuronilor dopaminergici nigrali. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. et al. Receptorul de insulină în nervul periferic de șobolan: locația sa și izoformele de îmbinare alternativ. Diabet Metab. Res. Rev. 16, 354–363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. et al. Insulina provoacă hipertermie prin inhibarea directă a neuronilor sensibili la cald. Diabet 59, 43–50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates 6th edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Hrănire crescută ca răspuns la injectarea bilaterală de anticorpi de insulină în VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA et al. Influența insulinei în hipotalamusul ventromedial asupra secreției pancreatice de glucagon in vivo. Diabet 59, 1521–1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Localizarea mecanismelor de recompensare a medicamentelor prin injecții intracraniene. Synapse 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interacțiunea dintre un analog de hidroxipiperidină al 4-(2-benzhidriloxi-etil)-1-(4-fluorobenzil)piperidină și aspartat 68 în transportorul uman de dopamină. EURO. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Descărcați referințe

Aceste studii au fost susținute de granturile NIH DA033811 (MER, KDC și MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) și un NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 a fost un cadou generos de la Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Anticorpul PP5 a fost un cadou generos de la Pfizer. Mulțumim Dr. Charles Nicholson, Școala de Medicină NYU pentru software-ul de extras V_max valorile din datele FCV.