Proc Natl Acad Sci SUA A. 2005 februarie 1; 102(5): 1737-1742.
Abstract
Cocaina, un medicament de abuz, mărește nivelurile de dopamină sinaptică în striatum prin blocarea recaptării dopaminei la terminalele axonale. Cynina dependentă de kinază 5 (Cdk5) și activatorul său p35, proteinele implicate în fosforilarea substraturilor în neuronii postmitotici, s-a dovedit a fi sus-reglementată după expunerea cronică la cocaină. Pentru a examina în continuare efectele inducției Cdk5 și p35 asupra semnalizării striatale a dopaminei, am generat două linii de șoarece transgenice independente în care Cdk5 sau p35 a fost supraexprimat specific în neuroni. Raportăm aici că activitatea Cdk5 crescută, ca urmare a supraexprimării p35, dar nu a supraexprimării Cdk5, duce la atenuarea semnalizării dopaminei mediate de cocaină. Creșterea fosforilării mediate de Cdk5 a fosfoproteinei cu dopamină și cAMP modificată, masa moleculară 32 kDa (DARPP-32) la Thr-75, a fost însoțită de o fosforilare scăzută a DARPP-32 la Thr-34. Creșterea fosforilării mediate de Cdk5 a kinazei kinazei extracelulare 1 la Thr-286 a fost însoțită de scăderea activării kinazei extracelulare cu kinază 1 / 2. Aceste efecte au contribuit la atenuarea fosforilării induse de cocaină a proteinei care leagă elementul de răspuns cAMP, precum și la o inducere mai mică a c-fos în striatum. Aceste rezultate susțin ideea că activitatea Cdk5 este implicată în exprimarea genei modificate după expunerea cronică la cocaină și, prin urmare, influențează schimbările de lungă durată ale funcției neuronale care stau la baza dependenței de cocaină.
Cocaina mărește nivelele de dopamină sinaptică în striatum și modifică expresia genei în neuronii dopaminoceptivi prin activarea căilor intracelulare care propagă semnalul inițial de la receptorul dopaminic D1 la nucleu (1). Expunerea cronică la cocaină reglează în mai mare măsură câțiva factori de transcripție, rezultând modificările pe termen lung ale expresiei genelor care se crede că stau la baza adaptărilor neuronale în dependența de cocaină (2). ΔFosB, identificat ca un factor de transcripție (3) sa dovedit a spori capacitatea de reacție a animalelor la cocaină (4, 5). Prin urmare, se preconizează că identificarea genelor țintă care sunt reglementate prin inducția ΔFosB va contribui la o mai bună înțelegere a mecanismului molecular care stă la baza dependenței de cocaină. Recent, tratamentul cronic al animalelor cu cocaină a demonstrat că reglează expresia kinazei dependentă de ciclin 5 (Cdk5) și a activatorului său p35 în striatum prin inducerea ΔFosB (6, 7).
Cdk5 este membru al familiei de serine / treonin kinaze Cdk. Spre deosebire de alte Cdks care sunt regulatori majori ai progresiei ciclului celular, Cdk5 este implicat în principal în fosforilarea substraturilor în neuronii postmitici (8). Specificitatea neuronală a activității Cdk5 se realizează prin asocierea cu activatorii săi, fie p35, fie p39, care sunt predominant exprimați în neuronii postmitotici (8). În plus față de rolul esențial al Cdk5 în dezvoltarea creierului (9, 10), it a fost, de asemenea, implicat în transmiterea dopaminergică în creierul postnatal (11, 12). Inhibarea activității Cdk5 are ca rezultat eliberarea sporită a dopaminei în striatum, indicând o funcție presinaptică a Cdk5 ca regulator negativ al eliberării dopaminei (11). În plus, Cdk5 modulează eficacitatea semnalizării postsynaptice a dopaminei prin fosforilarea fospoproteinei reglementate de dopamină și cAMP, masa moleculară 32 kDa (DARPP-32) la Thr-75, care transformă DARPP-32 într-un inhibitor al kinazei dependente de cAMP (PKA) (12).
Aceste observații sugerează că Cdk5 și p35 sunt regulatori în aval ai activării prelungite a semnalizării dopaminei după expunerea cronică la cocaină și, prin urmare, la dependența de cocaină. Pentru a aborda în continuare rolul Cdk5 asupra semnalizării dopaminei striate, am generat două linii de șoarece transgenice în care fie Cdk5, fie p35 a fost supraexprimat în mod specific în neuroni sub controlul promotorului p35. Constatarile noastre au aratat ca activitatea Cdk5 a fost up-reglementate cu niveluri crescute de proteine p35, dar nu Cdk5 proteine, sugerand ca nivelul de proteine p35 este de limitare a ratei pentru activitatea Cdk5. Oferim aici in vivo dovezile că creșterea activității Cdk5, ca rezultat al supraexprimării p35, duce la atenuarea semnalizării dopaminei mediate de cocaină la nucleu printr-o inhibare a cascadelor PKA și kinazei extracelulare a kinazei (ERK).
Materiale și metode
Anticorpi. Anticorpii policlonali la Cdk5 (C-8) și p35 (C-19) au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology. Antagoniștii dependenți de fosforilare și -independenți față de ERK kinaza (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 și proteina de legare a elementului de răspuns al cAMP (CREB) au fost obținute de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anticorpii pentru fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12) și c-fos (14) au fost utilizați așa cum s-a descris. Un anticorp pentru actină a fost achiziționat de la Sigma.
Animale experimentale. Mai demult am clonat gena p35 de șoarece Cdk5r1, care codifică proteina p35 și a caracterizat structura sa genomică (15). Pentru a genera șoarece transgenic cu supraexprimare neuronală a p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoFragmentul RI care conține regiunea promotorului 1.2-kb a fost subclonat într-o plasmidă pGEM9Z (-) și o etichetă 45-bp derivată din SV40 a fost inserată în KPNI amplasat în aval de poli (A+) semnal (Fig. 1A). Eticheta conținea a SpeSite-ul pentru genotiparea animalelor. Fragmentul 6-kb a fost excitat din plasmidă și purificat, urmat de injectarea pronucleară a transgenei pentru a genera șoarecii transgenici. Pentru a examina profilul de expresie al transgenei sub controlul de reglare al promotorului 1.2-kb p35 in vivo, un șoarece dublu transgenic (Tgp35; p35 - / -) a fost generat în continuare prin utilizarea unei strategii de creștere în două etape prin care șoarecele Tgp35 a fost regenerat într-un fond endogen p35-null. Celelalte modele de șoarece folosite în acest studiu au inclus p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- și un șoarece transgenic cu supraexprimare neuronală a Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotipurile acestor șoareci au fost determinate prin efectuarea fie a analizei Southern blot, fie prin PCR pe ADN genomic izolat din biopsii cozii. Șoarecii au fost adăpostiți sub un ciclu de lumină 12-h / 12-h închis. Toate îngrijirile au fost acordate în conformitate cu ghidurile instituțiilor naționale de sănătate privind îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și experimentale.
Analiza Southern Blot. ADN-ul genomic extras din biopsii cozii a fost digerat cu EcoRI și SpeI, electroforeză pe un gel de agaroză 0.9% și transferată pe o membrană din nailon. Membrana a fost hibridată cu un primer amorsat 32P-marcat la 42 ° C peste noapte. Sonda 485-bp pentru genotiparea șoarecilor p35 knockout (p35 - / -) și Tgp35 a fost generată prin PCR utilizând următoarele primeri: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'și 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Membrana hibridată a fost spălată de două ori în 2XSSC / 0.1% SDS la 42 ° C pentru 10 min și de două ori în 0.1XSSC / 0.1% SDS la 65 ° C pentru 20 min și expusă la filmul cu raze X.
Tratament medicamentos. Cocaina (Sigma) a fost dizolvată în soluție salină sterilă. Animalele au fost injectate ip cu cocaină (15 mg / kg) sau cu un volum egal de soluție salină la vârsta de 3 luni și uciși prin decapitare la momente diferite de timp (15, 30, 60 și 120 min) după injectare. Creierii au fost îndepărtați rapid și răciți în PBS răcit cu gheață. Striatele au fost apoi disecate și supuse analizei Northern sau Western blot. Pentru analiza imunohistochimică, secțiunile striatale au fost obținute de la șoareci 2 h după injectare.
Analiza Northern Blot. ARN-ul total a fost extras din striat cu reactiv TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) și supus analizei Northern blot așa cum este descris18). Pentru detectarea ARN-ului c-fos, s-a folosit un fragment 189-bp al ADNc c-fos de șoarece ca o probă așa cum s-a descris19). Nivelurile de ARN c-fos au fost cuantificate prin măsurarea densității optice a benzii specifice prin utilizarea unui sistem de analiză a imaginii cu software de imagine nih, Versiunea 1.62.
Analiza Western Blot. Țesuturile stricoase au fost sonicate în 1% SDS și fierte pentru 10 min. Concentrația de proteină din fiecare probă a fost determinată prin analiza proteinei BCA (Pierce). Cantități egale de proteină au fost separate prin SDS / PAGE înainte de a fi transferate pe o membrană de nitroceluloză. Membranele au fost blocate în 1 × PBS conținând 5% lapte degresat și 0.05% Tween 20 și incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C. Incubarea cu IgG anti-șoarece sau iepure conjugat cu peroxidază (Sigma) a fost efectuată la temperatura camerei pentru 60 min. S-a detectat un semnal prin chemiluminiscență îmbunătățită (Pierce), iar densitățile optice ale benzilor au fost cuantificate așa cum s-a descris mai sus.
Analiza kinazei Cdk5. Straturile lizate au fost preparate cu un tampon de liză constând din 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil / 1 pg / ml aprotinină / ml leupeptină / inhibitori ai fosfatazei (amestec inhibitor al fosfatazei I și II, Sigma). Lizatele au fost imunoprecipitate cu anticorpi anti-Cdk1 (C-5) sau anti-p8 (C-35). Imunoprecipitatile Cdk19 au fost preparate prin incubarea 5 μl de lizat (corespunzând 300 pg de proteină) cu anticorp anti-Cdk300 (5 pg) peste noapte la 3 ° C urmată de o incubare ulterioară cu 4 μl de perle de proteină A-agaroză (25 % suspensie în tamponul de lizare, Santa Cruz Biotechnology) pentru 50 h la 3 ° C. Pentru prepararea imunoprecipitațiilor p4, 35 μl de lizat (corespunzător 500 mg de proteină) a fost incubat cu anticorp anti-p1 (35 pg) așa cum s-a descris mai sus. Imunoprecipitatile s-au spălat de două ori cu tamponul de liză și de două ori cu un tampon de kinază constând din 3 mM Tris-HCI, pH 50 / 7.4 mM MgCI2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendată în 60 μl de tampon kinază. Activitatea kinazei a fost măsurată prin utilizarea histonei H1 ca substrat (18).
Imunohistochimie. Șoarecii au fost anesteziați prin injecții ip de avertin (250 mg / kg, Fluka) și perfuzate transcardial cu tampon fosfat de sodiu 0.1 M, pH 7.4, urmată de Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), un fixativ fără reticulare. Creierii disecați au fost în continuare fixați în același fixativ peste noapte la 37 ° C. Apoi, creierele au fost înglobate în parafină, tăiate în secțiuni coronale groase 5-μm și supuse imunohistochimiei prin utilizarea tehnicii complexe avidin-biotină-peroxidază (Vector Laboratories) cu diaminobenzidină ca substrat. Secțiunile au fost incubate cu un anticorp policlonal purificat prin afinitate împotriva c-fos peste noapte la 4 ° C. Specificitatea de colorare a fost evaluată prin omisiunea anticorpului primar.
REZULTATE
Generarea de șoareci transgenici cu supraexprimare neuronală a p35. Transgena utilizată pentru a obține o exprimare neuronală crescută a p35 a cuprins fragmentul 6-kb al genei p35 de șoarece clonată conținând promotorul 1.2-kb și întreaga secvență de codificare a p35Fig. 1 A). Genotipurile de șoareci au fost determinate prin analiza Southern blot utilizând o probă care a fost proiectată pentru a distinge șoarecii p35 - / - și Tgp35 de șoareci de tip sălbatic (Fig. 1 A și B). Pentru a examina expresia transgenei sub controlul promotorului 1.2-kb p35, am generat șoareci transgenici dublu (Tgp35; p35 - / -) în care expresia p35 a fost condusă numai de la transgen. Expresia p35 la șoareci Tgp35; p35 - / - a fost observată numai în creier (Fig. 1C), unde modelul de exprimare spațială a fost similar cu cel al șoarecilor de tip sălbatic (Fig. 1D). Lipsa de p35 sa dovedit a avea ca rezultat structura anormală de stratificare în cortexul cerebral și hipocampul șoarecilor (10). Cu toate acestea, șoarecii Tgp35; p35 - / - au prezentat o salvare completă a fenotipului creierului p35 - / - (Fig. 1E). Aceste date indică faptul că promotorul 1.2-kb p35 a controlat expresia transgenei cu un profil de expresie similar celui al p35 din gena p35 endogenă.
Nivelul proteinei p35 este limita de viteză pentru reglementarea în sus a activității Cdk5. Am examinat efectele dozelor genice ale genelor care codifică p35 și Cdk5 la exprimarea proteinei în extracte striatale de la șoareci p35 - / -, p35 +/-, sălbatic, Tgp35, Cdk5 +/- și TgCdk5 la vârsta de 3 luni. Nivelurile de proteine p35 și Cdk5 au corelat bine cu dozele genetice, respectiv (Fig. 2 A și B). Tgp35 au prezentat o creștere ≥ 1.6-ori a nivelului proteinei p35 comparativ cu șoarecii de tip sălbatic, în timp ce nivelurile de proteine Cdk5 nu au fost afectate de nivelurile diferite ale proteinei p35. TgCdk5 au prezentat o creștere ≥ 1.9-ori a nivelului de proteine Cdk5 comparativ cu șoarecii de tip sălbatic, în timp ce nivelurile de proteine p35 nu au fost afectate de nivelurile diferite ale proteinei Cdk5. Pentru a examina efectele diferitelor cantități de proteină p35 asupra activității Cdk5, Cdk5 a fost imunoprecipitat din extracte striatale cu anticorp anti-Cdk5 și a fost măsurată activitatea kinazei. În mod similar, pentru a examina efectele diferitelor cantități de proteină Cdk5 asupra activității kinazei, p35 a fost imunoprecipitat din extracte striatale cu anticorp anti-p35 și a fost măsurată activitatea kinazei. Activitatea Cdk5 sa corelat bine cu nivelul proteinei p35, dar nu cu nivelul proteinei Cdk5 (Fig. 2 C și D). Aceste rezultate au arătat că cantitatea de proteină p35 este un factor limitator al vitezei pentru activitatea Cdk5. Prin urmare, am folosit șoareci Tgp35 pentru a investiga efectele creșterii activității Cdk5 asupra semnalizării dopaminei striate.
Cromina indusă de cocaină a DARPP-32 la Thr-34 este atenuată la șoarecii Tgp35. Funcția DARPP-32 depinde de starea sa de fosforilare la situri multiple (20). PKA fosforilează DARPP-32 la Thr-34, în timp ce Cdk5 fosforilează DARPP-32 la Thr-75. Astfel, am examinat starea de fosforilare a DARPP-32 în extracte striatale de la șoareci de tip sălbatic și Tgp35. Nivelul de fosfo-Thr-75 DARPP-32 a fost mai mare la șoarecii Tgp35 (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-ori deasupra valorii șoarecilor de tip sălbatic). Apoi am evaluat efectele activității crescute a Cdk5 asupra semnalizării striatale a dopaminei. Am examinat activarea PKA indusă de cocaina la șoarecii Tgp35 prin analizarea stării de fosforilare a DARPP-32 la Thr-34. Nivelul de fosfo-Thr-34 DARPP-32 a fost crescut la șoareci de tip sălbatic 15 min după injectarea de cocaină (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-ori deasupra nivelului bazal). Cu toate acestea, efectul cocainei asupra fosforilării Thr-34 a DARPP-32 a fost atenuat la șoarecii Tgp35 (1.2 ± 0.3-ori peste nivelul bazal). Aceste rezultate au indicat că o creștere a activității Cdk5 a atenuat activarea PKA indusă de cocaină, probabil prin fosforilarea DARPP-32 la Thr-756, 12). Este, de asemenea, posibil ca o creștere a activității Cdk5 presinaptice să conducă la scăderea eliberării dopaminei și că aceasta contribuie la efectul redus al cocainei. În mod special, o singură injecție de cocaină nu a afectat nivelurile proteinei p35 și Cdk5, precum și activitatea kinazei (Fig. 3 C și D). Acest lucru este în contrast cu un studiu anterior, în care expunerea cronică la cocaină a demonstrat că up-regulază expresia p35 și Cdk5 (6).
Reglarea ulterioară a activității Cdk5 atenuează activarea indusă de cocaină a ERK1 / 2. Dovezi recente indică faptul că activarea receptorului dopaminic în striatum activează și alte cascade de semnalizare, incluzând calea ERK (21, 22), care are un rol important în răspunsul comportamental la cocaină (23). Prin urmare, am examinat dacă activitatea Cdk5 ar putea afecta activarea indusă de cocaină a căii ERK. Activarea căii ERK a fost observată după injectarea de cocaină în extracte striatale de la șoareci de tip sălbatic, așa cum reiese din creșterea fosforilării MEK1 / 2 la Ser-217 și Ser-221 (1.5 ± 0.2 deasupra nivelului bazal) și a ERK1 / 2 la Thr-202 și Tyr-204 (fosforylarea ERK2: 1.5 ± 0.2-ori deasupra nivelului bazal) (Fig. 4 A și B). Cu toate acestea, activarea indusă de cocaină a MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-ori deasupra nivelului bazal) și a ERK1 / 2 (fosforilarea ERK2: 1.2 ± 0.2-ori peste nivelul bazal) a fost atenuată la șoareci Tgp35Fig. 4 A și B). Mai mult, nivelele bazale ale fosfo-ERK1 / 2 au fost mai mici la șoarecii Tgp35 (0.8 ± 0.2-ori sub valoarea șoarecilor de tip sălbatic), în timp ce această tendință nu a fost statistic semnificativă. Acest ultim rezultat poate fi atribuit fosforilării dependente de Cdk5 a MEK1 la Thr-286, rezultând o scădere a activității catalitice (24). Pentru a evalua această posibilitate, am examinat starea de fosforilare a MEK1 la Thr-286 și am constatat că nivele mai ridicate de fosfo-Thr-286 MEK1 au fost prezente în extracte striatale de la șoareci Tgp35Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-ori deasupra valorii șoarecilor de tip sălbatic). Mai mult, starea de fosforilare a MEK1 la Thr-286 nu a fost modificată printr-o singură injecție de cocaină, în concordanță cu constatarea că activitatea Cdk5 nu a fost afectată de tratament (Fig. 3D).
Propagarea semnalizării dopaminei la nucleu este atenuată de creșterea activității Cdk5. Activarea indusă de cocaină a cascadelor multiple de semnalizare care implică PKA și ERK conduce la activarea ulterioară a factorului de transcripție CREB în nucleu prin fosforilarea sa la Ser-13322, 25). Pentru a investiga dacă efectele inhibitoare mediate de Cdk5 asupra cascadelor de activare PKA și ERK pot converge la fosforilarea CREB în nucleu, am examinat starea de fosforilare a CREB la Ser-133 în extracte striatale de la șoareci de tip sălbatic și Tgp35. Nivelul bazal al fosfo-CREB a fost mai mic la șoarecii Tgp35 (0.7 ± 0.1-ori din valoarea șoarecilor de tip sălbatic) (Fig. 5). Ca răspuns la injectarea de cocaină, nivelul fosfo-CREB a fost crescut în striatum de șoareci de tip sălbatic (1.5 ± 0.1-ori peste nivelul bazal), dar acest răspuns la cocaină a fost atenuat la șoarecii Tgp35 (1.2 ± 0.1- ori peste nivelul bazal) (Fig. 5).
Fosforilarea CREB la Ser-133 sporește activitatea transcripțională prin intermediul unui element de răspuns cAMP în regiunea promotor a anumitor gene, incluzând gena c-fos (26). Prin urmare, am examinat inducerea c-fos în striatum de șoareci de tip sălbatic și de șoareci Tgp35 după injectarea de cocaină. La șoareci de tip sălbatic, nivelul ARNc-c-fos a crescut la valoarea maximă (1.8 ± 0.2-ori peste nivelul bazal) 30 min după injectarea de cocaină și apoi a revenit la nivelul bazal cu 120 min după injecție (Fig. 6 A și B). Cu toate acestea, nivelele de ARN c-fos au fost de ≈30% mai mici la șoarecii Tgp35 decât la șoareci de tip sălbatic până la 30 min după injectare (Fig. 6 A și B). Inducția mai mică a c-fos la șoareci Tgp35 a fost coroborată în continuare prin imunohistochimie (Fig. 6 C-F). Administrarea cocainei a crescut imunoreactivitatea c-fos, puternic în părțile dorsomedial-dorsocentrale ale striatumului și slab în părțile laterale, atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci Tgp35. Cu toate acestea, creșterea indusă de cocaină a numărului de celule c-fos-imunopozitive a fost în mod considerabil atenuată în striatum de șoareci Tgp35Fig. 6G). Împreună, aceste rezultate au arătat că îmbunătățirea mediată de cocaină a semnalizării dopaminei striate la nucleu a fost inhibată la șoarecii Tgp35, un rezultat probabil al creșterii activității Cdk5.
Discuție
Cdk5 și activatorul său p35 au fost identificate ca gene țintă care sunt sus-reglementate de expunerea cronică la cocaină (6). Reportim aici dovezi că creșterea activității Cdk5, ca urmare a suprapunerii p35 mai degrabă decât a reglajului Cdk5, conduce la atenuarea semnalizării dopaminei mediate de cocaină în neuronii striatali. Pentru a examina consecințele expresiei sus-reglementate fie a Cdk5, fie a p35 asupra semnalizării dopaminei striate, s-au analizat două linii de șoarece transgenice, șoareci TgCdk5 și Tgp35. Am constatat că activitatea Cdk5 a fost reglată în sus proporțional cu un nivel crescut al proteinei p35, dar nu a fost afectată de un nivel crescut al proteinei Cdk5. Raportul nostru anterior a demonstrat, de asemenea, că activitatea Cdk5 în creierul de șoarece TgCdk5 a fost mai mică decât în cazul creierului de șoarece de tip sălbatic atunci când activitatea a fost măsurată prin utilizarea imunoprecipitatelor Cdk517), sugerând că o supraexprimare Cdk5 are ca rezultat un nivel crescut de Cdk5 monomeric dacă nivelul p35 nu este crescut. Aceste rezultate au indicat faptul că nivelul proteinei p35 este un factor limitator de viteză pentru activitatea Cdk5.
Tgp35 au prezentat o inducție mai mică atât a fosforilării CREB cât și a c-fos în striatum după injectarea acută de cocaină, sugerând că răspunsul striatal la cocaină a fost inhibat de creșterea activității Cdk5. Atenuarea semnalizării dopaminei mediate de cocaină la șoarecii Tgp35 a fost posibil realizată prin inhibarea mediată de Cdk5 a cascadelor multiple de semnalizare care implică DARPP-32, PKA și ERK. Administrarea de cocaină a crescut fosforilarea PKA a DARPP-32 la Thr-34 la șoareci de tip sălbatic, în timp ce acest răspuns a fost atenuat la șoarecii Tgp35. S-a arătat că fosfurarea PKA a DARPP-32 la Thr-34 inhibă activitatea proteinei fosfatazei 1 (PP1), enzima responsabilă de defosforilarea Ser-133 a CREB27). Astfel, activitatea PP1 nu ar fi antagonizat prin calea DARPP-32 / PP1 la șoareci Tgp35.
Activarea indusă de cocaină a ERK1 / 2 a fost, de asemenea, atenuată la șoarecii Tgp35. Există mai multe mecanisme distincte prin care Cdk5 ar putea inhiba activarea indusă de cocaină a ERK1 / 2. Mai întâi, fosforilarea dependentă de Cdk5 a DARPP-32 la Thr-75 ar putea inhiba PKA, ducând la inhibarea ulterioară a oricărei activări MEK1 / 2 mediată de PKA care este necesară pentru activarea ERK1 / 2. Un studiu recent a constatat că fosforilarea DARPP-32 la Thr-34 este necesară pentru activarea mediată de cocaină a ERK1 / 2 prin multiple căi care implică reglarea indirectă a activării MEK, precum și implicarea reglării fosfatazei îmbogățite cu striat, a tirozinei fosfatază care acționează direct asupra ERK1 / 2 (28). Susținerea acestei posibilități este sugerată de constatarea că fosforilarea indusă de cocaină a MEK1 / 2 la Ser-217 și Ser-221 a fost eliminată la șoarecii Tgp35. O altă cale probabilă este prin fosforilarea dependentă de Cdk5 a MEK1 la Thr-286, ceea ce ar conduce la scăderea activității catalitice și la inhibarea activității ERK1 / 2 (24).
Inhibarea activității Cdk5 în striatum a demonstrat că potențează efectele comportamentale ale tratamentului cronic al cocainei la animale (6). În concordanță cu ipoteza că o reglare în sus a activității Cdk5 poate contribui la adaptarea neuronală pentru contracararea efectelor administrației repetate de cocaină (6), am constatat că fosforilarea mediată de Cdk5 a DARPP-32 și MEK1 a contribuit la atenuarea activării induse de cocaină a ERK1 / 2, rezultând inducerea mai mică a fosforilării CREB și a c-fos în striatum. Constatarile noastre sustin ideea ca activitatea Cdk5 crescuta, ca urmare a up-regulation-ului p35, poate altera expresia genei in striatum dupa expunerea cronica la cocaina. Acest lucru poate apărea prin modificări ale activităților factorilor de transcripție cum ar fi CREB și c-fos. Astfel, activatorul Cdk5 p35, în virtutea efectelor sale limită de viteză asupra activității Cdk5, poate contribui la schimbările de lungă durată ale funcției neuronale care stau la baza dependenței de cocaină.
recunoasteri
Mulțumim doctorilor. Mary Jo Danton, Philip Grant și Sashi Kesavapany pentru citirea critică a manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de Granturile Z01DE00664-05 din cadrul instituțiilor naționale de sănătate Z10044DEXNUMX-XNUMX (de la ABK), din subvenția DAXNUMX din cadrul Serviciului Public de Sănătate al SUA și de finanțările Fundației Simons, Fundației Peter J. Sharp și Fundației Picower (către PG).
notițe
Abrevieri: Cdk5, kinaza dependentă de ciclină 5; ERK, kinază reglată de semnal extracelular; DARPP-32, fosfoproteină reglementată de dopamină și cAMP, masa moleculară 32 kDa; PKA, kinaza dependentă de cAMP; MEK, ERK kinaza; CREB, proteina de legare a elementului de răspuns cAMP.
Referinte
;
