PLoS Unul. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Sursă
Laboratorul de Fiziologie Comportamentală, Școala Universitară de Științe ale Sănătății Umane, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japonia.
Abstract
Exercitiile fizice imbunatatesc multiple aspecte ale functiei hipocampale. În conformitate cu noțiunea că activitatea neuronală este esențială pentru promovarea funcțiilor neuronale, literatura anterioară a demonstrat în mod constant că perioadele acute de exerciții evocă activarea neuronală în hipocamp. Stimulentele de activare repetate duc la o acumulare a factorului de transcripție ΔFosB, care mediază plasticitatea neuronală pe termen lung.
În acest studiu, am testat ipoteza că rularea pe roți voluntare pe termen lung induce expresia ΔFosB în hipocamp și a examinat orice potențial specific regiunii în sub-câmpurile hipocampale de-a lungul axei dorso-ventrale. Șoarecii C57BL / 6 masculi au fost adăpostiți cu sau fără roată de alergare pentru săptămâni 4. Rularea pe termen lung a roților a crescut semnificativ imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în toate regiunile hipocampice măsurate (adică, în subcâmpurile DG, CA1 și CA3 ale hipocampului dorsal și ventral). Rezultatele au confirmat faptul că rularea a determinat o expresie specifică a regiunii specifice a imunoreactivității FosB / ΔFosB în cortex, sugerând că creșterea uniformă a FosB / ΔFosB în hipocampus nu este o consecință nespecifică a alergării. Date Western blot au arătat că imunoreactivitatea crescută a hipocampului FosB / ΔFosB sa datorat în principal creșterii ΔFosB. Aceste rezultate sugerează că exercițiul fizic pe termen lung este un declanșator puternic al inducției ΔFosB pe tot parcursul hipocampului, ceea ce ar explica de ce exercițiile fizice pot îmbunătăți funcțiile dorsale și hipocampice ventrale. Interesant, am constatat că exprimarea FosB / ΔFosB în DG a fost corelată pozitiv cu numărul de neuroni dublucortin-imunoreactivi (adică imaturi).
Deși mecanismele prin care ΔFosB mediază neurogenesa indusă de exerciții fizice sunt încă incerte, aceste date implică faptul că neurogenesa indusă de efort este cel puțin dependentă de activitate. Luate impreuna, rezultatele noastre actuale sugereaza ca ΔFosB este o noua tinta molecula implicata in reglarea exercitiilor induse de plasticitate hipocampa.
Introducere
Exercitarea conferă diverse beneficii aspectelor moleculare, structurale și funcționale ale hipocampului la rozătoare [1,2], dintre care unele au fost susținute de studii la om [3,4]. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza modificărilor induse de exercițiu în plasticitatea hipocampului nu sunt suficient de bine înțelese. Literatura anterioară a demonstrat în mod constant că exercițiul evocă activarea neuronală a hipocampului la rozătoare. Studiile imunohistochimice care utilizează c-Fos, un marker al activării neuronale tranzitorii, au demonstrat că atât rularea forțată, cât și cea voluntară a crescut expresia c-Fos în subdomeniile gyrus dentar (DG), CA1 și CA3 ale hipocampului rozătoarelor [5-7]. În plus, un studiu anterior care utilizează fluxmetria laser-Doppler (LDF) a demonstrat că o alergie ușoară a benzii de alergare a crescut fluxul sanguin cerebral regional (rCBF), un marker alternativ al activării neuronale, în subcâmpul CA1 la șobolan [8]. Studiile imunohistochimice permit analize detaliate specifice regiunii după ce exercițiile au încetat, în timp ce LDF permite monitorizarea în timp real a RBCF într-o zonă localizată în timpul exercițiilor. În ciuda avantajelor și limitărilor fiecărui studiu, aceste studii au demonstrat, în mod similar, efectul unor exerciții fizice acute asupra activității neuronale a hipocampului. Aceste rezultate sugerează un mecanism prin care exercițiile fizice pe termen lung promovează plasticitatea hipocampală prin declanșarea în mod repetat a activării neuronale [9].
Factorul de transcripție ΔFosB, o izoformă trunchiată de îmbinare a FosB cu lungime întreagă, este indusă de diferite tipuri de stimuli repetate în regiuni specifice ale creierului, unde se acumulează treptat datorită stabilității unice (timp de înjumătățire de săptămâni) [10-12]. Un număr crescând de dovezi demonstrează că nivelurile crescute de ΔFosB mediază plasticitatea neuronală și comportamentală de lungă durată asociată cu stimuli particulari [11,13]. De exemplu, administrarea cronică a medicamentelor de abuz cum ar fi cocaina și morfina crește frecvent expresia ΔFosB în nucleul accumbens, reprezentând unul din mecanismele moleculare care stă la baza sensibilității crescute la aceste medicamente [11,14,15]. Similar la alți stimuli de recompensă, inclusiv dieta bogată în grăsimi și experiență sexuală [16,17], long-on-run pe rotile voluntare pe roți a crescut, de asemenea, imunoreactivitatea FosB / ΔFosB la nucleul accumbens de șobolan, sugerând că alergarea voluntară este o răsplată naturală pentru rozătoare [18,19]. Cu toate acestea, din cele mai bune cunoștințe, nici o literatură nu a examinat dacă expunerea repetată la exerciții fizice induce expresia ΔFosB în hipocampus. Deoarece exercițiul declanșează activarea neuronală în hipocampus, am emis ipoteza că rularea pe roată voluntară pe termen lung ar induce expresia ΔFosB în hipocampus. În timp ce mecanismele exacte prin care ΔFosB reglementează plasticitatea hipocampului rămân incerte, studiile au demonstrat că șoarecii care nu au fosB genele prezintă neurogeneză hipocampală afectată și un comportament similar depresiei [20,21]. euexercițiul este cunoscut pentru a spori neurogenesis și au proprietăți antidepresive [22-25]. eudacă ipoteza noastră este corectă, ΔFosB ar fi o nouă țintă moleculară potențială care să mediceze plasticitatea hipocampală indusă de exercițiu.
Hipocampul are un gradient anatomic și funcțional de-a lungul axei longitudinale (dorso-ventrale)26]. Hipocampul dorsal joacă un rol-cheie în învățarea și memoria spațială [27,28], în timp ce hipocampul ventral este implicat preferențial în reglarea comportamentelor emoționale [29,30]. Mai mult, studiile au demonstrat că stimulii fiziologici induc diferite modele de expresie c-Fos în porțiunile dorsale și ventrale ale hipocampului [31-33]. Deoarece exercițiul îmbunătățește ambele dorsale [34-37] și funcțiile dependente de hipocampul ventral [24,25,38], este important să se examineze dacă funcționarea voluntară pe termen lung determină expresia specifică a ΔFosB în hipocamp.
Ipoteza principală a acestui studiu a fost că o alergare pe termen lung pe roți voluntare ar induce expresia ΔFosB în hipocampul șoarecelor. Această ipoteză a fost investigată prin imunohistochimia FosB / ΔFosB în subdomeniile dorsale și ventrale hipocampice, DG, CA1 și CA3, cu un accent deosebit pe identificarea inducției specifice regiunii. Rezultatele au fost confirmate prin western blotting, care a fost utilizat pentru a identifica izoforma lui fosB produse genetice induse în hipocampus. Am examinat, de asemenea, cortexul pentru inducerea FosB / ΔFosB specifică regiunii pentru a exclude posibilitatea ca exercitarea pe termen lung să nu mărească imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în creier. În cele din urmă, asocierea corelativă dintre expresia FosB / ΔFosB și neurogenesis a fost investigată ca prim pas în căutarea implicațiilor funcționale ale inducției ΔFosB induse de efort în reglarea plasticității hipocampale.
Materiale și metode
1: Declarația privind animalele și etica
Douăzeci de șoareci masculi C57BL / 6 (8 săptămâni de vârstă) au fost achiziționați de la un crescător comercial (SLC, Shizuoka, Japonia). Zece șoareci au fost utilizați pentru experimentul 1, iar ceilalți zece pentru experimentul 2. Șoarecii au fost adăpostiți în condiții controlate de temperatură (22-24 ° C) și lumină (ciclul 12 / 12-h lumină / întuneric, lumină la 0500) și s-au furnizat alimente și apă ad libitum. Toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comisia de etică experimentală pe animale a Universității Metropolitane din Tokyo.
În fiecare experiment, la sosire, șoarecii au fost repartizați aleatoriu fie la un grup de control (Control, n = 5), fie la un grup de alergători (Runner, n = 5). În prima săptămână, toți șoarecii au fost adăpostiți în cuști standard din plastic în grupuri (șoareci 5 / colivie) pentru aclimatizarea inițială. Apoi, soarecii Runner au fost transferați într-o cușcă echipată cu o roată de rulare (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, SUA). Deoarece se știe că izolarea socială suprimă neurogenesa indusă de exerciții în hipocampus [39], Șoarecii Runner au fost adăpostiți ca grup (șoareci 5 / colivie) pentru alte săptămâni 4. Numărul de rotații ale roților a fost înregistrat în fiecare dimineață, iar greutatea corporală (g) a fost măsurată săptămânal.
2: Experiment 1. Examinarea imunohistochimică a expresiei FosB / ΔFosB și a neurogenezei hipocampale
2.1: perfuzie și prelucrarea țesuturilor
În dimineața (0900-1100) după ultima zi a perioadei de rulare, șoarecii au fost profund anesteziați cu pentobarbital de sodiu și perfuzați transcardial cu soluție salină rece. Creierul a fost îndepărtat rapid și post-fixat în paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat 0.1 M (PBS, pH 7.4) peste noapte. Creierul a fost apoi crioprotezat în 30% zaharoză în PBS și înghețat până la prelucrarea ulterioară. Secțiunile creierului coronar (40 μm) dintr-o emisferă au fost obținute utilizând un microtome de congelare și colectate în PBS cu 0.01% azidă de sodiu.
2.2: Imunohistochimie
O serie de secțiuni dintr-o șesă a fost aleasă în mod aleator pentru imunizarea FosB / ΔFosB. O serie adiacentă a fost utilizată pentru etichetarea dubcortinei (DCX), un marker al neuronilor imaturi validați pentru evaluarea neurogenezei [40,41]. După stingerea activității peroxidazei endogene cu 1% H2O2 în PBS, secțiuni plutitoare libere au fost preincubate cu soluție de blocare conținând 10% ser normal de cal în PBS pentru 2 h. După spălări în PBS, secțiunile au fost incubate cu anticorp pan-FosB de iepure policlonală (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SUA) diluat în PBS cu 0.5% Triton X-100 și 0.5% BSA -BSA) pentru 24 h la 4 ° C. O altă serie de secțiuni au fost incubate cu anticorp policlonal anti-DCX de capră (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) în PBST-BSA pentru 48 h la 4 ° C. Secțiunile au fost incubate suplimentar cu un anticorp secundar biotinilat corespunzător (IgG anti-iepure, 1: 1000, AP182B, IgG anti-capră, 1: 1000, AP180B, ambii anticorpi de la EMD Millipore, Billerica, MA, SUA) pentru 2 h la temperatura camerei. Secțiunile au fost apoi tratate cu complex de avidin-biotină-peroxidază (kit de peroxidază Vectastain ABC, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, SUA) pentru 90 min urmând instrucțiunile producătorului. Antigenii au fost în final vizualizați cu 0.02% 3,3-diaminobenzidină (DAB) în 0.1 M Tris-HCI (pH 7.6) conținând 0.01% H2O2. Pentru imunostabilizarea FosB / ΔFosB, reacția a fost intensificată cu sulfat de nichel-amoniu. Pentru colorarea DCX, nucleele celulare s-au contracarat cu colorare Nissl. Secțiunile au fost montate pe diapozitive acoperite cu gelatină și au fost plasate plafoane.
2.3: Cuantificarea imunoreactivității FosB / ΔFosB utilizând pragul de imagine
Anticorpul pan-FosB utilizat în acest studiu a fost ridicat împotriva unei regiuni interne împărtășite de regiunea FosB și ΔFosB N-terminală, astfel încât să nu se poată face diferența între cele două izoforme. Prin urmare, structurile imunocomponate au fost descrise ca nuclei FosB / ΔFosB imunoreactive (FosB / ΔFosB-ir). Pentru o cuantificare oarbă imparțială, diapozitivele au fost codificate înainte de analiză. Atlasul creierului mouse-ului [42] a fost utilizat pentru a identifica localizarea următoarelor regiuni de interes: stratul celular de granule (GCL) din DG (secțiunile 3), stratul de celule piramidale de CA1 (secțiuni 3) și CA3 (secțiunile 2-3) în hipocampul dorsal (închis la -2.2 mm de la bregma); DG (segmente 2), CA1 (secțiuni 2) și CA3 (secțiuni 2) în hipocampul ventral (închis la -3.4 mm de la bregma) (Figura 4, stânga). Secțiunile caudale conțin atât porțiunile dorsale cât și ventrale ale hipocampului, dar partea orientată a fost orientată. În DG, lamele superpiramidale (DGsp) și infrapiramidale (DGip) au fost analizate separat. Cortexul vizual (secțiunile 2-3, închis la -0.6 mm de la bregma), cortexul somatosensor al barilului (secțiunile 2-3 închise la -0.6 mm din bregma), cortexul vizual (secțiunile 3 închise la -2.9 mm bregma), cortexul auditiv (secțiuni 3, închis la -2.9 mm de la bregma) și bolul olfactiv (secțiunile 3, închise la + 4.3 mm de la bregma) au fost de asemenea analizateFigura 6, stânga).
Imaginile digitale (2070 × 1548 pixeli) ale fiecărei ROI au fost realizate utilizând un microscop optic (BX-51, Olympus, Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră CCD (DP-73, Olympus) și software pentru imagini (cellSens, Olympus). obiectivul de mărire obiectiv a fost 10 × pentru ROI hippocamp și 4 × pentru ROI-urile corticale. Pentru a identifica imunoreactivitatea FosB / ΔFosB moderată-până la puternică (Figura 1D-G), utilizând mai multe secțiuni în avans, ambele setări de achiziție a imaginii (intensitatea luminii, dimensiunea opririi câmpului, timpul de expunere și echilibrul de alb) și nivelurile de prag pentru fiecare dintre componentele RGB au fost optimizate pentru ROI hipocamp și cortic. Următoarea analiză a fost apoi efectuată în condiții optimizate (1). ROI au fost selectate de un poligon în formă neregulată (Figura 1A, B) (2). Imaginea a fost prafuită, care a transformat nucleele FosB / ΔFosB-ir la o culoare roșie (Figura 1C-G) (3). ROI-ul% a fost apoi calculat automat după cum urmează:% ROI = (suprafață convertită (în roșu) / suprafață totală ROI) × 100.
Pentru a valida această analiză a pragurilor de imagine, regiunile 20 au fost alese aleatoriu din diferite zone ale creierului cu dimensiuni diferite ale regiunilor. În plus față de cuantificarea pragului de imagine, numărul de nuclee FosB / ΔFosB-ir în regiunile selectate a fost numărat manual și densitatea nucleilor FosB / ΔFosB-ir a fost obținută prin împărțirea numărului de nuclee FosB / ΔFosB-ir prin măsurarea zona (mm2).
2.4: Cuantificarea neuronilor imaturi DCX-ir în girusul dentar
Neuronii DCX-ir imaturi din DG șoarecilor Runner au fost abundenți și suprapuși, ceea ce a făcut dificilă numărarea precisă a numărului discret de soma DCX-ir folosind un microscop optic. Cu toate acestea, într-un studiu anterior, analiza Sholl pentru evaluarea morfologică a arătat că fiecare neuron DCX-ir are, în medie, un singur dendrit atunci când este măsurat în cadrul 40 μm al soma [43]. Prin urmare, următoarea analiză originală a fost dezvoltată pentru a permite cuantificarea specifică regiunii neuronilor DCX-ir.
- (1) O imagine a GCL a fost proiectată pe ecranul unui computer utilizând un software de vizualizare și un obiectiv 40 × obiectiv (2). Pe imaginea live, un segment de linie (150 ± 0.1 μm) a fost desenat de-a lungul mijlocului GCL (Figura 2) (3). Schimbarea adâncimii focale, de câte ori segmentul de linie traversat dendritele DCX-ir au fost numărate (4). ROI-urile (dspal DGsp, dDGsp, dorsal DGip, dDGip, ventral DGsp, vDGsp, ventral DGip, vDGip) corespundeu regiunilor în care a fost analizată imunoreactivitatea FosB / ΔFosB (5). La fiecare ROI, segmente de linie 2-3 au fost desenate pe secțiune, iar numărul de puncte de trecere a fost calculat în medie pe secțiunile 2-3 pe șoarece. Deoarece grosimea GCL este de aproximativ 60-80 μm, numărul de încrucișări ar trebui să reflecte numărul de neuroni DCX-ir din regiunea restricționată analizată.
O imagine reprezentativă a neuronilor imaturi DCX-ir și a unui segment de linie (150 ± 0.1 μm) suprapusă pentru numărarea numărului de puncte de trecere cu dendritele DCX-ir.
3. Experiment 2. Identificarea izoformei FosB / ΔFosB indusă de rularea roții
3.1: perfuzie și prelucrarea țesuturilor
O altă cohortă de șoareci a fost tratată ca mai sus în Experimentul 1. După săptămâni de intervenție 4, șoarecii au fost perfecționați transcardial cu soluție salină rece sub anestezie profundă. Hipocampul a fost rapid disecat și înghețat cu azot lichid și depozitat la -80 ° C. Hipocampii fiecărui șoarece au fost omogenizați în tampon RIPA (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI pH 7.6, 1% NP-40, 1% deoxicolat de sodiu, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) inhibitori (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Germania). Lizatele au fost centrifugate timp de 15 min la 5000 rpm la 4 ° C și s-au colectat supernatantele. Concentrațiile de proteine au fost măsurate cu un kit de determinare a proteinei BCA (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Cantități egale de proteine (30 pg / bandă) au fost electroporate pe un gel de poliacrilamidă 10%, apoi transferate într-o membrană PVDF (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, SUA). Legarea nespecifică a fost blocată prin preincubarea membranei pentru 1 h în TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI pH 7.5, 0.1% Tween-20) conținând 3% BSA. Membrana a fost incubată cu anticorp pan-FosB (1: 1000) care a fost utilizat mai sus pentru imunohistochimie, dizolvat în TBST conținând 3% BSA. După spălările cu TBST, membrana a fost incubată cu anticorp IgG anti-iepure conjugat cu HRP (1: 5000 în TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) pentru 1 h la temperatura camerei. După spălările cu TBST, benzile de proteine au fost vizualizate prin incubare cu Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, SUA) și capturate folosind un Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membrana a fost reprobată cu un anticorp anti-gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) (#2275, 1: 5000 în TBS-T, Trevigen, MD, SUA) ca un control al încărcării. Densitatea optică a benzilor de proteine a fost cuantificată utilizând Image-J și normalizată la nivelul GAPDH.
4: analiză statistică
Modificările în greutatea corporală a șoarecilor au fost analizate prin măsurători repetate cu două sensuri ANOVA (grup × timp). Pentru determinarea diferențelor statistice între grupuri (Control vs Runner) sa folosit un t-test ne-corelat. Analiza de corelație a lui Pearson a fost utilizată pentru a valida analiza imunoreactivității FosB / ΔFosB (numărătoarea manuală vs. pragul de imagine) și pentru a examina asocierea dintre nivelul exprimării FosB / ΔFosB și numărul de puncte de trecere DCX din DG. Datele au fost prezentate ca medie ± SEM. Pragul pentru semnificația statistică a fost stabilit la P <0.05.
REZULTATE
1: Greutatea corporală și distanța de rulare în Experimentele 1 și 2
Schimbările în greutatea corporală a șoarecilor Control și Runner în Experimentele 1 și 2 sunt reunite și prezentate în Figura 3. Măsurile repetate cu două sensuri ANOVA au indicat o interacțiune semnificativă (grup × timp, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) și efectul principal al grupului F(1, 18) = 6.07, P <0.05), indicând o greutate corporală semnificativ mai mică la șoarecii Runner. Distanța de rulare pe cușcă este indicată în Tabelul 1. Deși distanța de rulare exactă a fiecărui șoarece a fost nesigură, deoarece șoarecii au fost adăpostiți împreună, observația obișnuită a confirmat că toate șoarecii au efectuat frecvent roata. Șoarecii Runner din experimentul 2 au alergat mai mult decât cei din Experimentul 1, dar distanța medie de funcționare (m / zi / cușcă) a fost consecventă în timpul fiecărui experiment.
2: Validarea cuantificării imunoreactivității FosB / ΔFosB utilizând pragul de imagine
A existat o corelație semnificativă între zona FosB / ΔFosB-ir obținută prin pragul imaginii și densitatea nucleelor FosB / ΔFosB-ir obținute prin numărarea manuală (r = 0.941, P <00001, Figura 4).
3: imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în hipocampus
Imaginile reprezentative ale imunostimulării FosB / ΔFosB în subdomenii hipocampale dorsale și ventrale au fost prezentate în Figura 5. În toate ROI-urile analizate, imunoreactivitatea FosB / ΔFosB la șoareci Runner (Figura 5, dreapta) a fost calitativ mai mare decât la șoarecii de control (Figura 5, centru). La șoarecii Runner, analiza cantitativă a indicat o creștere semnificativă a zonei FosB / ΔFosB-ir în ambele dorsale (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) și subcâmpurile ventrale hipocampice (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figura 6).
4: imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în cortex
Imaginile reprezentative ale imunostimulării FosB / ΔFosB în ROI-urile corticale sunt prezentate în Figura 7. Analiza cantitativă a evidențiat modificările dependente de regiune în imunoreactivitatea FosB / ΔFosB pe termen lung (Figura 8). La șoareci Runner, zona FosB / ΔFosB-ir a fost semnificativ mai mare în cortexul motor (P <0.05) și cortexul somatosenzorial al barilului (P <0.05), dar nu în cortexul vizual (P = 0.662) sau cu bulbul olfactiv (P = 0.523). În cortexul auditiv, zona FosB / ΔFosB-ir a avut tendința de creștere a șoarecilor Runner (P = 0.105).
5: neurogenesis
Imaginile reprezentative ale imunofluziunii DCX sunt prezentate în Figura 9. În hipocampusul dorsal, imunoreactivitatea DCX la șoareci Runner (Figura 9, dreapta) a fost calitativ mai mare comparativ cu șoarecii de control (Figura 9, stânga). Comparativ cu hipocampusul dorsal, imunoreactivitatea DCX în hipocampul ventral a fost mai slabă la șoarecii Control și Runner. La șoarecii Runner, numărul de încrucișări a fost semnificativ mai mare în dDGsp (P <0.01) și dDGip (P <0.01; Figura 10). În hipocampul ventral, numărul de încrucișări la șoareci Runner a avut tendința de a crește, dar nu au existat diferențe semnificative între grupuri (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figura 10).
6: Corelație între expresia FosB / ΔFosB și neurogenesis
A fost efectuată o analiză de corelație între zona FosB / ΔFosB-ir și numărul de treceri DCX (Figura 11). Deoarece fiecare set de date (de ex. DGsp dorsal la șoarecii de control) constă doar din perechi 5, analiza a fost efectuată mai întâi cu toate perechile 40. Intrigant, a existat o corelație semnificativă între zona FosB / ΔFosB-ir și numărul de treceri DCX (r = 0.885, P <0.0001). În plus, a fost identificată și o corelație semnificativă atunci când DG dorsal (r = 0.762, P <0.05) și DG ventral (r = 0.816, P <0.01) au fost analizate separat.
7: Identificarea izoformei FosB / ΔFosB indusă de funcționarea pe termen lung
În cele din urmă, pentru a identifica izoforma lui fosB produse genetice induse în hipocampus ca răspuns la alergarea pe termen lung, hipocampii dintr-o cohorta suplimentară de șoareci au fost supuși la Western blot cu utilizarea aceluiași anticorp pan-FosB. Fluxuri multiple de 35-37 kDa, reprezentând izoforme modificate ale ΔFosB [44], au fost semnificativ crescute în șoarecii Runner versus Control (Figura 12, P <0.01). Pe de altă parte, izoforma FosB de 48 kDa a fost nedetectabilă în ambele grupuri. O altă bandă ușor vizibilă peste 25 kDa reprezintă probabil izoforma Δ2ΔFosB (27 kDa). Au existat alte două benzi, peste 50 kDa și 37 kDa, care au fost cel mai probabil din cauza legării nespecifice. Când au fost cuantificate, nu s-au găsit diferențe în aceste benzi non-osFosB între grupuri (datele nu sunt prezentate).
Discuție
În concluzie, studiul prezent a efectuat mai întâi o analiză imunohistochimică pentru a examina 1), indiferent dacă rularea pe roată voluntară pe termen lung induce expresia FosB / ΔFosB în hipocamp; și 2) dacă există un răspuns specific regiunii de-a lungul axei sale dorso-ventrale.
Patru săptămâni de alergare pe roată voluntară au determinat o creștere semnificativă a imunoreactivității FosB / ΔFosB în toate regiunile hipocampice analizate (de exemplu, subdomeniile DG, CA1 și CA3 ale ambelor porțiuni dorsale și ventrale ale hipocampului). Am confirmat că izoforma 35-37kDa ΔFosB a fost cea mai importantă fosB produsul gena se acumulează ca răspuns la funcționarea pe termen lung. Aceste rezultate susțin în mod clar ipoteza că exercițiul fizic pe termen lung este un declanșator puternic al inducerii ΔFosB în întregul hipocamp și că inducerea acestuia poate fi un mecanism molecular nou prin care exercițiile afectează diferite tipuri de funcții dorsale și / sau ventrale hipocampus-dependente.
1: Validarea și limitările de cuantificare a imunoreactivității FosB / ΔFosB utilizând pragul de imagine
O tehnică de limitare a imaginii, utilizată pe scară largă în studiile imunohistochimice pentru numărarea numărului de celule țintă și pentru evaluarea morfologiei celulare, a fost adoptată în acest studiu pentru cuantificarea specifică a regiunii pentru imunoreactivitatea FosB / ΔFosB [15,45,46]. A fost demonstrată o corelație semnificativă între nivelele de imunoreactivitate FosB / ΔFosB cuantificate prin pragul de imagine și prin numărarea manuală (Figura 4). Cu toate acestea, deoarece densitatea și suprapunerea au împiedicat numărarea numărului de nuclei FosB / ΔFosB-ir în zone foarte dense, corelația demonstrată implică doar precizia metodei de pragare a imaginii atunci când zonele FosB / ΔFosB-ir reprezintă <~ 40% din totalul rentabilității investiției zonă. Prin urmare, este necesară o interpretare atentă pentru zonele FosB / ΔFosB-ir> 40% din aria totală a ROI.
În particular, în DG de șoareci Runner (Figura 4), Expresia FosB / ΔFosB a fost indusă de circulația roții și majoritatea nucleelor FosB / ΔFosB-ir s-au suprapus. În aceste domenii, creșterea inducerii expresiei FosB / ΔFosB conduce la o subestimare mai mare a nivelului de exprimare, indiferent de metoda de cuantificare utilizată (pragul de imagine sau numărarea manuală). Cu toate acestea, în ciuda riscului de subestimare, este important de reținut faptul că studiul prezent a demonstrat cu succes creșteri semnificative ale zonei FosB / ΔFosB-ir în DG șoarecilor Runner. Acest lucru sugerează că limitările metodologice nu compromit constatările noastre. În schimb, potențiala subestimare sporește fiabilitatea constatării că o alergare pe termen lung a crescut imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în hipocampus.
2: Inducerea uniformă a ΔFosB în hipocampus prin alergare pe termen lung
Hipocampul prezintă gradienți anatomici și funcționali de-a lungul axei sale longitudinale [26], astfel încât pentru prezentul studiu imunoreactivitatea FosB / ΔFosB în porțiunile dorsale și ventrale ale hipocampului a fost analizată separat. Datele au demonstrat că funcționarea pe termen lung a crescut expresia FosB / ΔFosB în toate valorile de interes ale hipocampului măsurate. Această inducere uniformă a imunoreactivității FosB / ΔFosB ar putea să nu fie cauzată în mod specific de modificările sistemice metabolice asociate cu alergarea pe termen lung. Cu toate acestea, este important de observat că au existat creșteri specifice ale regiunii imunoreactivității FosB / ΔFosB în cortex. Acest rezultat este susținut de concluziile recente care arată că o intervenție acută de alergare a alergat a crescut fluxul sanguin cerebral regional în hipocampus, dar nu în bulbul olfactiv [8]. În plus, Rhodes și colab. (2003) a demonstrat că zilele 7 ale ciclului voluntar au fost induse de expresia c-Fos în DG și CA2 / 3 ale hipocampului (CA1 nu a fost măsurată) și în cortexul senzorial, dar nu în cortexul vizual [47]. Luate împreună, aceste studii sugerează că inducerea uniformă a expresiei FosB / ΔFosB în hipocampus nu este o consecință nespecifică a funcționării pe termen lung. Interesant, Hawley și colab. a raportat recent că stresul cronologic imprevizibil a mărit expresia FosB / ΔFosB la nivelul dorsal, dar nu în ventralul DG al hipocampului de șobolan [48]. Cu o investigație ulterioară, modelele distincte de inducție FosB / ΔFosB, cum ar fi cele provocate de exerciții fizice sau de stres, vor oferi o perspectivă continuă asupra impacturilor dependente de stimuli asupra hipocampului.
Anticorpul primar pan-FosB utilizat în acest studiu este cunoscut că recunoaște toate izoformele proteinelor FosB. La analiza western blotting, am constatat că singurele izoforme care au crescut în hipocampus după o perioadă lungă de timp au fost izoformele modificate ale ΔFosB (35-37 kDa), singurele izoforme stabile dintre proteinele familiei Fos [11]. Această constatare este în concordanță cu lucrarea anterioară utilizându-se anticorpul pan-Fos pentru a demonstra că 35-37 kDa ΔFosB este proteina predominantă a familiei Fos indusă în cortexul frontal prin stres cronic [44]. Prin urmare, creșterea imunoreactivității FosB / ΔFosB hipocampală indusă aici prin rularea pe termen lung cel mai probabil reflectă nivelul ΔFosB.
Se știe mai puțin despre efectele specifice ale regiunii asupra exercițiilor fizice asupra aspectelor moleculare și structurale ale hipocampului. Cu toate acestea, numeroase studii comportamentale indică un mare potențial pentru ameliorările induse de exerciții fizice atât în funcțiile hipocampale dorsale cât și în cele ventrale. Exercitarea a fost demonstrată pentru a îmbunătăți învățarea spațială și memoria [34-38] și prelucrarea spațială și contextuală depinde în principal de hipocampul dorsal [27,28]. Dimpotrivă, este cunoscut, de asemenea, că exercitarea exercită proprietăți anxiolitice și antidepresive [24,25,38] și aceste răspunsuri emoționale sunt predominant reglate de hipocampul ventral [29,30]. Inducția uniformă a ΔFosB prin rularea pe termen lung observată în acest studiu sugerează că o anumită formă de modificări neuroplastice au apărut pe tot parcursul hipocampului. Acest lucru ar explica de ce exercițiile fizice pot afecta atât funcțiile dorsale cât și cele hipocampice ventrale.
3: Analiza specifică regiunii privind neurogenesa indusă de efort
O disociere funcțională a neurogenesisului între hipocampul dorsal și ventral a primit de asemenea o atenție sporită [49]. În acest studiu, profitând de caracteristicile morfologice ale neuronilor DCX-ir imaturi [43], am numărat numărul de intersecții dintre dendritele DCX-ir și un segment de linie tras de-a lungul mijlocului GCL. Această măsurare nu a furnizat numărul total de neuroni DCX-ir în DG, dar a permis cuantificarea specifică regiunii necesară efectuării unei analize de corelare cu datele de expresie FosB / ΔFosB (a se vedea mai jos). După o perioadă lungă de timp, numărul neuronilor DCX-ir a crescut semnificativ în DG dorsal, dar nu ventral. Acest lucru sugerează că exercițiul ar putea stimula neurogenesisul mai izbitor în dorsal comparativ cu partea ventrală a DG. Cu toate acestea, studiile anterioare au raportat rezultate contradictorii în care rularea alergată a crescut neurogenesis atât la nivelul dorsal, cât și al ventralului DG [50,51]. În studiul de față, numărul trecerilor DCX-ir în DG ventral a avut tendința de a crește cu rularea, deși mărimea mică a eșantionului (șoareci 5 per grup) ar fi limitat capacitatea de a detecta o diferență statistic semnificativă între grupuri. Prin urmare, este probabil prematur să excludem posibilitatea ca alergarea voluntară pe roți să poată stimula neurogeneza ventriculară a hipocampului. Studiile detaliate detaliate sunt necesare pentru a înțelege specificitatea regiunii neurogenesiei induse de efort în ceea ce privește procesul său multistrat (proliferarea celulară, diferențierea, migrația și supraviețuirea).
4: implicațiile funcționale ale inducerii induse de exerciții ΔFosB pentru reglarea plasticității hipocampului
În cele din urmă, ca prim pas în recunoașterea implicațiilor funcționale ale inducerii induse de exerciții în hipocampus, am examinat relația dintre imunoreactivitatea FosB / ΔFosB și punctele de trecere DCX-ir atât în DG dorsal cât și în ventrală și am găsit o corelație semnificativă pozitivă între cele două variabile. Deși mecanismele exacte prin care ΔFosB reglează neurogenesa indusă de exerciții fizice rămân incerte, un studiu recent a demonstrat acest lucru fosBșoareci null, care nu au FosB, ΔFosB și Δ2ΔFosB (toate fosB ), prezintă deficite în neurogenesisul hipocampal bazal, incluzând proliferarea proliferării celulelor progenitoare neuronale, migrația ectopică crescută a neuronilor nou-născuți și structurile DG anormale [20]. Cu toate acestea, aceste modificări nu au fost observate în fosB(d / d), care nu au FosB, dar nu ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interesant, în fosB- șoareci null, expresia unor gene legate de neurogenesis, inclusiv VGF (Factor de creștere a nervului VGF inductibil) și poate (Prepropeptidă de galanină)20]. Deoarece VGF și GAL sunt molecule secretoare, o propunere care promite promisiunea consideră că neuronii care exprimă ΔFosB pot regla neurogenesis prin activitatea autocrină / paracrină [20].
În plus, trebuie remarcat faptul că regiunea în care ΔFosB este indusă prin rularea spațială se suprapune cu regiunea în care activitatea neurogenică este ridicată. Această constatare sugerează că neurogeneza indusă de efort este dependentă de activitate minimă. Activarea neuronală este cheia pentru menținerea și îmbunătățirea funcției sistemului nervos central [9], prin mecanisme care includ expresia și eliberarea factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) [52,53], absorbția factorului de creștere asemănător insulinei 1 (IGF-1) prin bariera hemato-encefalică [54,55], supresia apoptozei [56] și reglarea motilității mitocondriale [57]. Prin urmare, studiul prezent sugerează că exercitarea pe termen lung a declanșat activarea neuronală repetată, evidentă în expresia crescută a ΔFosB, care contribuie la creșterea plasticității hipocampului, potențial prin intermediul acestor mecanisme multiple descrise mai sus.
Studiul de față a evaluat numai neurogenesa indusă de efort și asocierea acesteia cu expresia FosB / ΔFosB în DG. Cu toate acestea, imunoreactivitatea FosB / ΔFosB a fost de asemenea indusă în subcâmpurile CA1 și CA3. În timp ce sunt necesare studii suplimentare pentru a obține o mai bună înțelegere a rolurilor funcționale ale expresiei ΔFosB induse de exerciții fizice în aceste subcâmpuri, literatura anterioară oferă o posibilitate promițătoare. Guan și colab. (2011) a demonstrat că ablația specifică a kinazei dependente de ciclină 5 (Cdk5) în neuronii piramidali CA1 sau CA3 a diminuat consolidarea sau recuperarea memoriei, respectiv [58]. Interesant, Cdk5 este ținta din aval a ΔFosB [59] și este implicat în reglarea plasticității sinaptice [60]. Prin urmare, expresia ΔFosB indusă de exercițiu ar putea fi implicată în reglarea plasticității sinaptice prin activarea Cdk5 în subcâmpurile CA1 și CA3.
Concluzie
În timp ce perioadele acute de exerciții fizice erau cunoscute pentru a induce expresia proteinelor genetice imediate în hipocampus, studiul prezent oferă prima dovadă că exercițiul fizic pe termen lung induce expresia ΔFosB în întregul hipocamp. Theste inducerea uniformă a ΔFosB susține înțelegerea actuală că exercițiul este o intervenție eficientă non-farmacologică capabilă să îmbunătățească mai multe funcții hipocampale. Împreună cu corelația semnificativă dintre expresia FosB / ΔFosB și neurogenesis, aceste date sunt provocatoare și indică necesitatea unor studii suplimentare care să delimiteze rolul ΔFosB în medierea efectelor exercițiilor asupra funcției hipocampale, inclusiv a neurogenezei.
Declarație de finanțare
Referinte
;
