FACS identifikuje jedinečnou regulaci genu vyvolanou kokainem u selektivně aktivovaných dospělých striatálních neuronů (2011) - malé% striatálních neuronů

J Neurosci. Autorský rukopis; k dispozici v PMC Sep 16, 2011.
Publikováno v posledním editovaném formuláři:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Konečná upravená verze tohoto článku vydavatele je k dispozici zdarma na adrese J Neurosci
Viz další články v PMC to citovat publikovaný článek.

Abstraktní

Četné studie se značkou neurální aktivity Fos ukazují, že kokain aktivuje pouze malou část řídce distribuovaných striatálních neuronů. Až dosud nebyly dostupné účinné metody pro hodnocení neuroadaptací indukovaných specificky v těchto aktivovaných neuronech. Použili jsme fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS) k očištění striatálních neuronů aktivovaných během kokainem indukované lokomoce v naivní a kokainem senzibilizované cfos-lacZ transgenní krysy. Aktivované neurony byly značeny protilátkou proti p-galaktosidáze, proteinovému produktu genu lacZ. Cocaine indukoval jedinečný profil genové exprese selektivně v malém podílu aktivovaných neuronů, který nebyl pozorován u neaktivované většiny neuronů. Tyto geny zahrnovaly změněné hladiny okamžitých časných genů arc, fosB, a nr4a3, jakož i geny zapojené do signalizace p38 MAPK a specifičnosti buněčného typu. Navrhujeme, aby tato metoda FACS mohla být použita ke studiu molekulárních neuroadaptací ve specifických neuronech kódujících behaviorální účinky zneužívaných drog a dalších naučených chování.

Klíčová slova: senzibilizace kokainu, nucleus accumbens, neuronální soubory, fluorescenčně aktivované třídění buněk

ÚVOD

Hlavní hypotéza současného neurobiologického výzkumu závislosti na kokainu spočívá v tom, že chronická expozice kokainu způsobuje dlouhodobé neuroadaptace ve striatu a dalších složkách mezolimbického dopaminového odměnového okruhu, což vede k nutkavému užívání drog a dlouhodobé zranitelnosti relapsů (Nestler, 2001; Shaham a Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers a kol., 2010; Wolf a Ferrario, 2010). Tato hypotéza je však založena na četných studiích omezených na měření neuroadaptací v homogenátech mozkových oblastí nebo v neuronech vybraných nezávisle na jejich aktivačním stavu během chování.

Rozdíl mezi neuroadaptacemi u aktivovaných a neaktivovaných neuronů je důležitý, protože mohou hrát různé role ve fyziologických, behaviorálních a psychologických účincích kokainu. Četné studie se značkou neurální aktivity Fos ukazují, že kokain aktivuje ve striatu pouze malou část řídce distribuovaných neuronů. Po kontextově specifické lokomotorické senzibilizaci jsme prokázali, že Fos je indukován pouze tehdy, když byly krysy injikovány do prostředí spárovaného s léčivem a ne v nespárovaném prostředí (Mattson a kol., 2008; Koya a kol., 2009). A co je nejdůležitější, ukázali jsme, že tyto selektivně aktivované neurony hrají příčinnou úlohu ve naučeném spojení mezi kokainem a prostředím spárovaným s drogami, které zprostředkovává kontextově specifickou senzibilizaci (Koya a kol., 2009). Neuroadaptace uvnitř selektivně aktivovaných striatálních neuronů tedy mohou hrát jedinečné a důležité role při učení během kontextově specifické senzibilizace a dalších drogově indukovaných chování.

Až dosud technická omezení ztěžovala hodnocení molekulárních změn v malém počtu řídce distribuovaných neuronů selektivně aktivovaných během chování. Techniky, jako je mikrodisekce laseremKwon a Houpt, 2010) a imunohistochemie s dvojitým označením (Berretta a kol., 1992; Gerfen a kol., 1995; Peters et al., 1996) jsou schopné selektivně identifikovat molekulární změny v aktivovaných neuronech, ale tyto techniky mají velmi nízkou propustnost nebo nejsou kvantitativní. Fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS) může být účinným nástrojem pro purifikaci dospělých neuronálních populací pro molekulární analýzu (Liberles and Buck, 2006; Lobo a kol., 2006). FACS však nebyl použit k čištění neuronů na základě jejich aktivačního stavu. V této studii jsme použili FACS k očištění interprersovaných kokainem aktivovaných striatálních neuronů od transgenních cfos-lacZ krysy a porovnaly jejich jedinečné vzorce genové exprese s těmi v neaktivované většině neuronů.

METODY

Zvířata

Žena cfos-lacZ transgenní krysy (Kasof a kol., 1995; Koya a kol., 2009) a samice krys Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, NC, USA) byly umístěny jednotlivě ve standardních plastových klecích v místnosti s kontrolovanou teplotou a vlhkostí. Byly udržovány na reverzním světle 12: 12 h: tmavý cyklus (světla zapnutá na 20.00 h) a umožňoval volný přístup k potravě a vodě. Byli aklimatizováni na tyto podmínky bydlení po dobu minimálně 7 dní před léčbou drogami. Experimentální postupy byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití NIDA.

Léčebné procedury

Pro experimenty s akutním kokainem byly potkanům injikovány kokain (30 mg / kg, ip; n = 8) nebo solný roztok (1 ml / kg; n = 6) a umístěny do kulaté komory z plexiskla (průměr 38 cm). Krysy byly usmrceny 90 minut po injekcích, aby se získala mozková tkáň. Toto ošetření bylo opakováno třikrát v oddělených dnech, aby se získaly tři biologické replikáty pro mikročipovou analýzu. Kromě toho byly pro kvantitativní PCR (qPCR) podobně vyrobeny tři nezávislé biologické replikáty. Pro qPCR analýzy oblouk, pdyn, adora2a, byly použity pouze tyto tři nezávislé biologické replikace. Pro qPCR analýzy fosB, nr4a3, kcnc1 a map2k6, také jsme použili zbývající RNA z každého ze vzorků microarray.

Pro opakované experimenty s kokainem byly samice potkanů ​​senzibilizovány čtyřmi injekcemi kokainu (15 mg / kg ip) podávanými jednou každý druhý den. Ve dnech injekce byla každá krysa umístěna do lokomotorické komory plexisklových lokomotorických aktivit plexiskla o velikosti 43 x 43 cm (Med Associates, St. Albans, VT, USA), aby byla navyklána na 30 minuty. Potkanům byl injikován kokain a lokomotorická aktivita byla zaznamenána jako vzdálenost ujetá po dobu 60 minut. Po čtvrté opakované injekci kokainu zůstaly krysy ve své domácí kleci po dobu 7 – 8 dní. V den testu byly krysy habituovány po dobu 30 min v komorách pohybové aktivity a poté injikovány kokainem (30 mg / kg ip) nebo solným vehikulem. Krysy byly dekapitovány a mozky byly extrahovány devadesát minut po injekcích. Celá senzibilizační léčba byla opakována třikrát během samostatných týdnů, aby se získaly tři biologické repliky z každé skupiny pro analýzu qPCR.

Buněčná disociace

Striatální tkáň byla disociována, aby se získala jednobuněčná suspenze. Krysy byly dekapitovány a jejich striata byla extrahována během dvou minut. Každý striatum se mlelo žiletkami na ledové skleněné desce a umístilo se do 1 ml Hibernate A (kat. Č. HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata byly enzymaticky štěpeny v 1 ml Accutase per striatum (kat. Č. SCR005; Chemicon, Billerica, MA) s promísením end-over-end po dobu 30 min při 4 ° C. Tkáň byla odstředěna po dobu dvou minut při 425 × g a resuspendována v 300 μl ledově studeného Hibernátu A. Všechny následné odstřeďovací kroky byly provedeny při 4 ° C.

Štěpená striatální tkáň byla mechanicky disociována triturací. Do jedné Eppendorfovy zkumavky byly spojeny čtyři striaty a desetkrát triturovány Pasteurovou pipetou s velkým průměrem (~ 1.3 mm). Zkumavky byly krátce umístěny na led, aby se velké kousky tkáně usadily; 600 μl zakalené suspenze obsahující disociované buňky byly přeneseny do zkumavky Falcon 15 ml na ledu. Do původní Eppendorfovy zkumavky bylo přidáno 600μL čerstvého Hibernátu A a potom byly kroky triturace opakovány jako výše s pipetami se středním a malým průměrem (~ 0.8mm a ~ 0.4mm). Každá zakalená suspenze obsahující disociované buňky byla spojena s předchozí suspenzí.

Zbývající buněčné klastry v sdružené buněčné suspenzi byly odstraněny filtrací přes předem navlhčené 100 μm a 40 μm buněčné síta (značka Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Malé buněčné zbytky v suspenzi byly redukovány odstředěním filtrátu po dobu 3 min při 430 × g pomocí třístupňového gradientu hustoty Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). Zakalená horní vrstva (přibližně 2 ml) obsahující zbytky byla odstraněna. Buňky ve zbývajících vrstvách byly resuspendovány ve zbývajícím roztoku Percoll a centrifugovány po dobu pěti minut při 550xg. Peleta byla resuspendována v 1 ml Hibernate A.

Imunoznačení a FACS

Disociované buňky byly fixovány a permeabilizovány přidáním stejného objemu ethanolu pro konečnou koncentraci 50% ethanolu a udržovány na ledu po dobu 15 minuty za občasného míchání. Buňky byly centrifugovány po dobu dvou minut při 425xg a resuspendovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty bez fosfázy (PBS). Buňky byly inkubovány s biotinylovanou primární protilátkou proti NeuN (1: 1000 ředění, Cat # MAB377B, Chemicon) a primární protilátkou proti p-galaktosidáze ((P-gal; 1: 10000 ředění, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole) Buňky byly rotovány end-over-end v primární protilátce po dobu 30 minut při 4 ° C a odstředěny po dobu tří minut při 425xg. Buňky byly promyty 800 μl PBS a resuspendovány v 700 μl PBS. s fluorescenčně značeným streptavidinem (Streptavidin-fykoerythrin, 1: 1000 ředění, kat. č. SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) a sekundární protilátkou (Alexa Fluor 488-značená anti-kozí IgG, 1: 1000 ředění, kat. č. A- 11055, Invitrogen) a rotační end-over-end po dobu 15 min. Buňky byly promyty 800 μl PBS, centrifugovány po dobu tří minut při 425 x g a resuspendovány v 1 ml PBS.

Imunooznačené buňky byly skenovány a tříděny v základním zařízení průtokové cytometrie Johns Hopkins Bayview Campus. Pro třídění buněk byla použita AAC FACS (BD, Franklin Lakes, NJ). Kontrolní vzorky byly analyzovány jako první pro stanovení optimálních kritérií pro třídění testovaných vzorků. Konkrétně byly fixované buňky bez ošetření protilátkou použity k nastavení brány rozptylu světla. Fixované buňky ošetřené fluorescenční sekundární protilátkou, ale žádnou primární protilátkou, byly poté použity k nastavení prahů pro fluorescenci endogenní tkáně a nespecifické vazby streptavidinem nebo sekundární protilátkou. Dále byly použity kontrolní vzorky, které byly jednotlivě označeny primární a sekundární protilátkou pro každý protein (NeuN nebo P-gal), aby se kompenzovalo fluorescenční překrytí v sousedních kanálech. Nakonec byly analyzovány a tříděny testované vzorky označené oběma fluorescenčními markery. Tříděné buňky byly shromážděny do zkumavek s nízkou vazbou (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) s 100 μl PBS v každé zkumavce.

Extrakce RNA

Po třídění byly vzorky obsahující buď Pgal-pozitivní nebo Pgal-negativní buňky z potkanů ​​s injekcí kokainu nebo všechny NeuN-pozitivní buňky z krys s injekcí fyziologického roztoku odstředěny po dobu 8 min při 2650 × g při 18 ° C. NeuN-negativní buňky z krys s injekcí fyziologického roztoku byly centrifugovány po dobu 8 min při 6000xg při 18 ° C. Pro experimenty s mikročipem byla RNA extrahována pomocí Trizol Reagent (kat. Č. 15596-026, Invitrogen) podle pokynů výrobce. Kvalita a množství RNA byly hodnoceny pomocí Bioanalyzer Picochip (kat. Č. 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Pro experimenty qPCR byla RNA extrahována pomocí soupravy RNEasy Micro (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) podle pokynů výrobce s ošetřením DNasou. Množství a čistota RNA byla hodnocena pomocí spektrofotometru Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Experimenty s mikročipem

Microarrays byly použity k analýze RNA z NeuN-pozitivních a NeuN-negativních buněk z krys injektovaných fyziologickým roztokem a Pgal-pozitivních a Pgal-negativních neuronů z potkanů ​​injikovaných kokainem. Jak je popsáno výše v části ošetření léčiv, mikročipy obsahovaly tři biologické repliky pro každý ze čtyř typů vzorků. Pět μl celkové RNA z každého vzorku bylo označeno pomocí soupravy pro amplifikaci RNA Illumina TotalPrep RNA (kat. Č. IL1791; Ambion, Austin, TX) ve dvoustupňovém procesu syntézy cDNA následované in vitro RNA transkripce s biotin-16-UTP. 0.75 μg biotinem značené cRNA bylo hybridizováno po dobu 16 k Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (kat. Č. BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Biotinylovaná cRNA hybridizovaná s čipem byla detekována streptavidinem značeným Cy3 a kvantifikována pomocí skeneru Illumina BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems. Veškeré značení a analýza byla provedena v jádru rodiny Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics.

Kvantitativní PCR v reálném čase

Kvantitativní PCR v reálném čase byla použita k ověření výsledků FACS a microarray. RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí soupravy RETROscript (Cat # AM1710, Ambion) s oligo (dT) primerem. Každá reakce 25 μl PCR zahrnovala 12.5 μl hlavní směsi pro expresi Taqman Gene (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl každého z 20 μM dopředných a reverzních primerů, 0.25 μl 100 μM FAM-značené sondy, 5 μl vody a 5 μl 1 ng / μl cDNA. Kombinace primerů a sond [Tabulka 1] byly navrženy s použitím Designového centra pro testování knihovny Roche Universal Probe Library Assay, aby byly intronové. PCR reakce byly monitorovány pomocí Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Program začal odečítáním destiček 20 při 50 ° C pro fotobělení, následoval 5 min při 95 ° C, a poté 40 cykly 20 sec při 94 ° C, 1 min při 60 ° C a odečetla se deska.

Tabulka 1 

Primery a sondy používané pro qPCR

Standardní křivky reakce byly nejprve provedeny pro každý gen pro stanovení účinnosti amplifikace [Tabulka 1]. Hladiny exprese pro každý amplifikovaný gen byly vypočteny pomocí účinnosti ^ ACq kde ΔCq = Cq(experimentální gen) - Cq(referenční gen) pro každý biologický replikát. Gorasp2 byl vybrán jako referenční gen, protože nebyl odlišně exprimován mezi neurony a gliemi v mikročipových analýzách. Byl dále validován jako referenční gen kvůli stejné amplifikaci qPCR ve všech vzorcích při nanášení stejného množství templátu. Technická zkouška trojnásobně Cq hodnoty byly zprůměrovány před výpočtem ACq pro každý gen ve vzorku. Pro každou mRNA měřenou v qPCR byly průměrné hodnoty genové exprese napříč biologickými replikáty. Poté, abychom odráželi hodnoty násobné změny, jsme tento průměr vydělili průměrnými hodnotami genové exprese NeuN-pozitivních buněk od krys s injekcí fyziologického roztoku. Tyto hodnoty jsou v grafech a tabulkách označeny jako střední hodnoty a standardní chyby.

Imunohistochemie

Mozková tkáň byla získána od samic potkanů ​​kmene Spraque-Dawley divokého typu po stejném akutním a opakovaném ošetření kokainem popsaným výše pro experimenty microarray a qPCR. Avšak 90 minuty po injekci v den testu byly krysy hluboce anestetizovány isofluranem a perfundovány 100 ml PBS následované 400 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Mozky byly fixovány v PFA po dobu 2 hodin a přeneseny do 30% roztoku sacharózy při 4 ° C po dobu 2 – 3 dnů. Mozky byly zmrazeny na práškovém suchém ledu a udržovány při -80 ° C až do dělení. Koronální řezy byly řezány o tloušťce 40 μm mezi Bregma 2.5 a −0.5 (Paxinos a Watson, 1998).

Řezy byly imunoznačeny pro Fos a Arc. Stručně, řezy byly promyty třikrát v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku (TBS) a permeabilizovány po dobu 30 min v TBS 0.2% Triton X-100. Řezy byly znovu promyty v TBS a inkubovány v primárních protilátkách zředěných v PBS s 0.3% Triton X-100 po dobu 24 po dobu třepačky při 4 ° C. Použili jsme králičí polyklonální protilátku proti c-Fos (1: 500 ředění, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a myší monoklonální Arc protilátku (1: 100 ředění, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Řezy byly promyty třikrát v TBS a inkubovány v sekundárních protilátkách zředěných v PBS po dobu 1.5 hodin na třepačce při pokojové teplotě. Použili jsme Alexa Fluor 488-značenou oslí anti-králičí protilátku (1: 200 ředění, Cat # A21206, Invitrogen) a Alexa Fluor 568-značená kozí anti-myší protilátka (1: 200 ředění, kat. Č. A11004, Invitrogen). Řezy byly promyty v TBS, namontovány na sklíčka potažená chromem a kryty sklíčeny tvrdým setem VectaShield.

Fluorescenční snímky imunoreaktivity Fos a Arc v kaudátovém putamenu a NAc (přibližně 2.0 mm před Bregma) byly zachyceny pomocí CCD kamery (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) připojené k mikroskopu Zeiss Axioskop 2. Obrázky pro počítání značených buněk byly pořízeny při zvětšení 200x; snímky pro stanovení kolokalizace Fos a Arc byly pořízeny při zvětšení 400x. Značené buňky ze čtyř hemisfér na krysu byly automaticky počítány pomocí softwaru IPLab pro Macintosh, verze 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Počty ze všech čtyř hemisfér byly zprůměrovány pro získání jediné hodnoty pro každou krysu.

Analýza dat

Data lokomoční senzibilizace byla analyzována pomocí jednosměrné ANOVA s opakovanými opatřeními pro hlavní účinek času po dobu 4 injekčních dnů. Statistická významnost byla stanovena na p <0.05. Data microarray byla analyzována pomocí programu DIANE 6.0, tabulkového procesoru microarray pro analýzu založeného na SAS JMP 7.0, jak bylo popsáno dříve (Garg a kol., 2009). Údaje o intenzitě fluorescence z mikročipů byly podrobeny filtraci detekcí p- hodnoty a Z normalizace. Kvalita vzorku byla analyzována pomocí rozptylu, analýzy hlavních složek a vzorku genu Z- hierarchické shlukování založené na skóre, aby se vyloučily možné odlehlé hodnoty. Poté byly použity testy ANOVA k eliminaci genů s většími odchylkami v každé srovnávací skupině. Geny byly identifikovány jako odlišně exprimované, pokud p <0.01, absolutní Z- poměr ≥ 1.5 a poměr falešných objevů (fdr) <0.07. U dat qPCR byla pro srovnání dat pro každý gen použita jednosměrná ANOVA. Statistická významnost byla stanovena na p <0.05. Pro imunohistochemii Fos a Arc byl pro výpočet statistické významnosti použit t-test za předpokladu nerovnoměrné odchylky, stanovený na p <0.05.

VÝSLEDKY

transgenní krysy cfos-lacZ

Projekt cfos-lacZ transgen u těchto krys je regulován a c-fos promotor podobný tomu v endogenním c-fos gen a je tak podobně aktivován v neuronech vysokou hladinou excitačního synaptického vstupu (Shin a kol., 1990; Labiner a kol., 1993; Sgambato a kol., 1997). Proteinový produkt cfos-lacZ transgen, β-galaktosidáza (βgal), je koexprimován s c-Fos ve silně aktivovaných neuronech (Koya a kol., 2009) a používá se k označení aktivovaných striatálních neuronů v následujícím postupu čištění FACS.

FACS purifikace aktivovaných striatálních neuronů po jednotlivých akutních injekcích kokainu

Celá striata byla získána z cfos-lacZ krysy 90 minut po akutních injekcích 30 mg / kg kokainu nebo solného roztoku mimo jejich domácí klec. Disociované striatální buňky z podobně ošetřených krys byly spojeny před purifikací FACS pro každou z biologických replikátů v následných analýzách microarray a kvantitativní PCR (qPCR). Disociované striatální buňky byly zpočátku analyzovány podle jejich dopředných a postranních charakteristik rozptylu světla [Obrázek 1a]. Většina neuronů označených NeuN byla nalezena v pruhu událostí podél spodní části grafu. Všechny následné analýzy byly tedy brány dopředu, aby zahrnovaly pouze události nalezené v tomto proužku.

Obrázek 1 

Fluorescenčně aktivované třídění βgal-značených neuronů z potkanů ​​ošetřených jednou injekcí kokainu

Buňky v této bráně byly separovány podle stupně imunoznačení neuronovým markerem NeuN a neurálním aktivačním markerem Pgal. V tkáni získané z potkanů ​​injektovaných kokainem mělo přibližně 15% neuronů značených NeuN vysoké hladiny βgal [Obrázek 1b], což odpovídalo přibližně 100,000 pgal-značeným neuronům na krysu. Všechny βgal-značené buňky ko-exprimovaly NeuN, což naznačuje, že βgal exprimovaly pouze neurony. Naproti tomu velmi málo neuronů značených NeuN získaných z krys injektovaných fyziologickým roztokem exprimovalo aktivační markery pgal nebo Fos, které podporují imunoreaktivitu pgal a Fos jako markery neurální aktivace u potkanů ​​injektovaných kokainem. Nízký počet βgal-exprimujících neuronů z krys injektovaných fyziologickým roztokem neposkytoval dostatek buněk pro následné molekulární analýzy. Použili jsme tedy pouze NeuN-značení k oddělení neuronálních buněk od neuronálních buněk ve všech následujících experimentech se striatální tkání získanou z krys injektovaných fyziologickým roztokem. Celkově bylo přibližně 30% všech striatálních buněčných těl NeuN pozitivních, což odpovídalo přibližně 600,000 striatálním neuronům na krysu. Když byly buňky purifikované FACS vyšetřeny fluorescenční mikroskopií, byly všechny buňky kulaté a postrádající procesy [Obrázek 2]. Mikroskopické pozorování potvrdilo, že FACS tříděné buňky byly vhodně značeny na NeuN- a βgal imunoreaktivitu. Zjistilo se, že vzorky buněk purifikovaných FACS jsou> 90% čisté, když byly hodnoceny pomocí druhého kola průtokové cytometrie (data nejsou uvedena).

Obrázek 2 

Mikroskopické fotografie buněk a zbytků očištěných FACS

Selektivitu naší purifikační procedury FACS jsme stanovili pomocí mikročipu pro analýzu vzorů genové exprese buněk purifikovaných FACS. Srovnali jsme genovou expresi v pgal pozitivních a pgal negativních neuronech z potkanů ​​injikovaných kokainem, jakož i buněk NeuN pozitivních a NeuN negativních z potkanů ​​injektovaných fyziologickým roztokem. Hlavní složková a shluková analýza ukázala, že primárním diferenciačním faktorem bylo, zda byly buňky neurony nebo glia [Obrázek 3a]. Druhým rozlišovacím faktorem byla exprese βgal použitá k oddělení aktivovaných neuronů od neaktivovaných. Geny byly identifikovány jako odlišně exprimované, pokud p <0.01, absolutní Z- poměr ≥ 1.5 a poměr falešných objevů (fdr) <0.07. Zjistili jsme, že 125 genů bylo zvýšeno a 467 genů bylo sníženo v βgal-pozitivních neuronech ve srovnání s βgal-negativními neurony získanými ze stejné striatální tkáně potkanů ​​injikovaných kokainem [Obrázek 3b]. Když byly srovnávány stejné βgal pozitivní neurony potkanů ​​injikovaných kokainem s kontrolními vzorky všech neuronů značených NeuN od potkanů ​​injikovaných solným roztokem, bylo zvýšeno 133 genů a 890 genů bylo sníženo v βgal pozitivních neuronech. Zejména dvě kontrolní skupiny - βgal-negativní neurony od potkanů ​​injikovaných kokainem a všechny neurony značené NeuN od potkanů ​​injikovaných solným roztokem - produkovaly velmi podobné vzorce genové exprese; genová exprese se mezi těmito kontrolními skupinami významně nelišila [Obrázek 3b].

Obrázek 3 

Analýza mikročipů buněk vytříděných z krysí striaty po jedné injekci kokainu nebo fyziologického roztoku

Specifické geny nalezené v různých skupinách vzorků potvrdily separaci aktivovaných od neaktivovaných neuronů, jakož i neuronů od neuronálních buněk pomocí FACS [Tabulka 2]. Ne-pozitivní neurony z krys injektovaných kokainem exprimovaly vyšší hladiny mnoha markerů neurálních aktivačních markerových genů ve srovnání s pgal negativními neurony ze stejných krys injektovaných kokainem nebo všech neuronů značených NeuN z krys injektovaných fyziologickým roztokem [Obrázek 3c]. Tyto geny markerů aktivity zahrnuty c-fos, junB, oblouk, EGR rodina (1, 2, 4) a nr4a3 (Guzowski a kol., 2005). Je zajímavé, že tyto Pgal-pozitivní neurony také exprimovaly významně vyšší hladiny genu prodynorfinu specifického pro dopaminový receptor typu D1 a významně nižší hladiny genu pro dopaminový receptor D2.

Tabulka 2 

Shrnutí údajů z mikročipu a qPCR z experimentu s akutním kokainem.

Data exprese genů microarray byla validována pomocí qPCR. Geny markerů aktivity fosB, oblouk, a nr4a3 byly exprimovány ve vyšších hladinách v pgal pozitivních neuronech z potkanů ​​injikovaných kokainem relativně k pgal negativním neuronům ze stejných potkanů ​​injektovaných kokainu a ke všem neuronům z potkanů ​​injektovaných fyziologickým roztokem [Obrázek 4a; údaje a statistické informace v roce 2007 Tabulka 2]. βgal-pozitivní neurony také exprimovaly vyšší hladiny genu pro prodynorphin [Obrázek 4b]. Zatímco βgal-pozitivní neurony měly zjevně nižší hladiny exprese pro několik genů, včetně adenozinového receptoru A2A, draslíkového kanálu Kv3.1 a genů map2k6 / MEKK6, pouze úrovně exprese Kv3.1 a map2k6 / MEKK6 byly statisticky odlišné pomocí qPCR [Obrázek 4c]. Celkově byly změny genové exprese hodnocené pomocí qPCR téměř totožné se změnami genové exprese hodnocenými experimenty s mikročipem.

Obrázek 4 

Kvantitativní PCR ukazuje odlišný profil genové exprese pro pgal-pozitivní neurony po akutních injekcích kokainu, ve srovnání s pgal-negativními neurony ze stejných krys nebo se všemi neurony z krys s injekcí fyziologického roztoku

Ke stanovení, zda se změny mRNA v aktivovaných neuronech projevily na úrovni proteinu, jsme použili imunohistochemickou analýzu řezů mozkových koronů od samic potkanů ​​divokého typu injektovaných kokainem a fyziologickým roztokem [Obrázek 5]. Tyto řezy nepodstoupily disociaci nebo FACS, a proto imunohistochemická analýza nebyla ovlivněna disociací buněk nalezenou v postupu FACS. Ve ventrálním striatu potkanů ​​s injekcí kokainu [Obrázek 5a], byly markery nervové aktivity Fos a Arc koexprimovány ve stejných buňkách: 85 ± 4% všech Fos-pozitivních buněk bylo Arc-pozitivních, zatímco 82 ± 3% všech Arc-pozitivních buněk bylo Fos-pozitivních. Injekce kokainu způsobily 2.7-násobné zvýšení neuronů značených Fos a 2.7-násobné zvýšení neuronů značených Arc. V dorzálním striatu potkanů ​​injekčně užívajících kokain [Obrázek 5b], 80 ± 2% všech Fos pozitivních buněk bylo Arc pozitivních, zatímco 86 ± 3% všech Arc pozitivních buněk bylo Fos pozitivních. Injekce kokainu způsobily 4.4-násobné zvýšení neuronů značených Fos a 3.8-násobné zvýšení neuronů značených Arc.

Obrázek 5 

Fos a Arc jsou koexprimovány v (a) ventrálním striatu a (b) dorzálním striatu po jedné injekci kokainu

Purifikace aktivovaných striatálních neuronů FACS z kokainů senzibilizovaných na kokain

Ve druhém experimentu FACS byly všechny krysy senzibilizovány opakovanými injekcemi kokainu. Opakované podávání kokainu v lokomotorové krabici zlepšilo lokomoce vyvolanou kokainem: lokomoce v den 7 byla 180 ± 18% dne 1 lokomoce (hlavní účinek času v opakovaných injekcích 4, F3, 363 = 24.9, p <0.001), což naznačovalo významnou psychomotorickou senzibilizaci. O sedm dní později v testovací den byl krysám ve stejné lokomotorické krabici podán kokain nebo fyziologický roztok. O XNUMX minut později byla extrahována striatální tkáň včetně NAc a buňky byly purifikovány FACS pomocí postupu popsaného výše.

Buňky ve stejném pruhu událostí rozptylovaných světlem jako v předchozím experimentu byly separovány podle stupně imunoznačení neuronovým markerem NeuN a neurálním aktivačním markerem Pgal. V tkáni získané z potkanů ​​injektovaných kokainem mělo přibližně 10% neuronů značených NeuN vysoké hladiny βgal [Obrázek 6], což odpovídalo přibližně 60,000 pgal-značeným neuronům na krysu. Všechny βgal-značené buňky ko-exprimovaly NeuN, což naznačuje, že βgal exprimovaly pouze neurony. Tkáň získaná z potkanů ​​injikovaných fyziologickým roztokem v testovací den produkovala velmi málo neuronů exprimujících βgal nebo Fos, a tedy nedostatek buněk pro následnou molekulární analýzu. Proto jsme použili pouze NeuN-značení k oddělení neuronálních buněk od neuronálních buněk získaných od krys injektovaných fyziologickým roztokem. Přibližně 30% všech buněčných těl u krys injektovaných fyziologickým roztokem bylo NeuN pozitivních, což v tomto experimentu odpovídalo přibližně 400,000 striatálním neuronům na krysu.

Obrázek 6 

Fluorescenčně aktivované třídění βgal značených neuronů od senzibilizovaných krys vystavených kokainu 7 dní po opakovaném ošetření kokainem

Použili jsme qPCR k porovnání genové exprese v βgal-pozitivních a βgal-negativních neuronech od potkanů ​​injikovaných kokainem, stejně jako ve všech NeuN-pozitivních neuronech od potkanů ​​injikovaných solným roztokem po senzibilizaci kokainem. βgal pozitivní neurony potkanů ​​injikovaných kokainem exprimovaly vyšší hladiny tří markerových genů neurální aktivity - fosB, oblouk, a nr4a3–Vztah k βgal negativním neuronům od stejných potkanů ​​injikovaných kokainem a ke všem neuronům potkanů ​​injikovaných solným roztokem [Obrázek 7a; údaje a statistické informace v roce 2007 Tabulka 3]. βgal-pozitivní neurony také exprimovaly vyšší hladinu genu pro prodynorphin podobnou té v experimentu s injekcí jednoho kokainu [Obrázek 7b]. Naproti tomu βgal-pozitivní neurony měly nižší hladiny exprese pro několik genů [Obrázek 7c], počítaje v to Drd2 kódující dopaminový receptor D2 a Map2k6 kódující kinázu, která aktivuje p38 MAPK, podobná experimentu s akutním kokainem. Konečně, Pgal-pozitivní neurony zvýšily expresi dusp1, také známý jako mkp1 [Obrázek 7c], který kóduje fosfatázu, která inaktivuje p38 MAPK (Sgambato a kol., 1998).

Obrázek 7 

Kvantitativní PCR demonstruje odlišný profil genové exprese v pgal pozitivních neuronech od senzitizovaných kokainem infikovaných potkanů, ve srovnání s pgal negativními neurony stejných potkanů ​​nebo všech neuronů potkanů ​​infikovaných fyziologickým roztokem
Tabulka 3 

Shrnutí údajů qPCR z opakovaného experimentu s kokainem.

K určení, zda se změny mRNA v aktivovaných neuronech odrážejí na proteinové úrovni, jsme použili imunohistochemickou analýzu řezů koronálního mozku z divokých samic potkanů ​​senzibilizovaných na kokain po injekcích kokainu nebo fyziologického roztoku v den testu. U ventrálního striata potkanů ​​s injekcí kokainu byly markery nervové aktivity Fos a Arc koexprimovány ve stejných buňkách: 90 ± 2% všech Fos pozitivních buněk bylo Arc pozitivních a 83 ± 2% všech Arc pozitivních buňky byly Fos-pozitivní. Injekční injekce kokainu způsobily 2.3-násobné zvýšení neuronů značených Fos a 2.2-násobné zvýšení neuronů značených Arc. U hřbetního striata u potkanů ​​injektovaných kokainem bylo 93 ± 2% všech Fos-pozitivních buněk Arc-pozitivních a 90 ± 3% všech Arc-pozitivních buněk bylo Fos-pozitivních. Injekční injekce kokainu způsobily 4.4-násobné zvýšení neuronů značených Fos a 4.5-násobné zvýšení neuronů značených Arc. Tak jen velmi málo ne-Fos-značených buněk exprimovalo Arc a velmi málo ne-Arc-značených buněk exprimovalo Fos, což podporuje naše zjištění ze tříděných buněk.

DISKUSE

Vyvinuli jsme postup pro čištění a hodnocení molekulárních změn v neuronech definovaných pouze jejich předchozím aktivačním stavem během lokomotorické aktivity vyvolané kokainem. Data z experimentů microarray, qPCR a imunohistochemie nezávisle potvrdila, že náš postup FACS identifikoval jedinečné molekulární alterace v aktivovaných neuronech, jak je definováno c-fos indukce indukce pgal exprese. Hlavním biologickým nálezem používajícím tento postup bylo to, že okamžité časné geny (IEG) jsou indukovány pouze u aktivovaných neuronů, zatímco exprese IEG je nezměněna nebo dokonce snížena u neaktivované většiny neuronů. Protože mnoho z těchto markerů neurální aktivity IEG jsou také transkripční faktory, je pravděpodobné, že v těchto aktivovaných neuronech jsou následně indukovány velmi odlišné vzorce genové exprese, které mohou přispívat k fyziologickým a behaviorálním účinkům kokainu (viz například (Curran a Franza, 1988; Nestler a kol., 1993; McClung a kol., 2004; Loebrich a Nedivi, 2009).

Diferenciální indukce IEG mezi aktivovanými a neaktivovanými neurony podporuje hypotézu, že během lokomoce vyvolané kokainem je silně aktivována pouze menšina neuronů, zatímco většina neuronů je aktivována v mnohem menší míře nebo vůbec ne. Elektrofyziologické experimenty u potkanů ​​divokého typu ukazují, že exprese Fos proteinu koreluje s vysokými hladinami excitačního synaptického vstupu (Shin a kol., 1990; Labiner a kol., 1993; Sgambato a kol., 1997). Víme, že exprese Fos a βgal jsou podobně regulovány ve stejných neuronech v cfos-lacZ krysy (Koya a kol., 2009). Z toho usuzujeme, že zvýšená exprese βgal a IEG pouze u malého počtu striatálních neuronů naznačuje, že pouze menšina striatálních neuronů přijímá vysoké hladiny excitačního synaptického vstupu v reakci na podávání kokainu.

Diskrétní aktivace striatálních neuronů je v souladu s hypotézou upstate-downstate, která popisuje protichůdné účinky dopaminu na striatální neuronální aktivitu. Předpokládá se, že dopamin způsobený kokainem zvyšuje rozdíly mezi neurony s vysokou aktivitou a nízkou aktivitou tím, že zvyšuje probíhající elektrofyziologickou aktivitu neuronů, které jsou již ve stavu vysoké aktivity, zatímco zeslabuje probíhající aktivitu většiny neuronů s nižší aktivitou (Wilson a Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez a kol., 1997; Nicola a kol., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola a kol., 2004). Výsledné zvýšení poměru signál k šumu nejen zvyšuje selektivitu během akutní signalizace, ale, jak se navrhuje v naší studii, může také přispět k indukci jedinečných molekulárních neuroadaptací pouze u neuronů s vysokou aktivitou. Mezitím se genová exprese v pgal-negativních neuronech, které tvoří většinu striatálních neuronů z potkanů ​​injikovaných kokainem, zdála, že se neliší od genové exprese ve striatálních neuronech od krys injektovaných fyziologickým roztokem; to podporuje hypotézu, že většina striatálních neuronů zůstává v expozici kokainu ve spodní poloze.

Složky signální dráhy kinázy p38 MAP kinasy byly také odlišně změněny mezi aktivovanými a neaktivovanými neurony. Genová exprese Map2k6 / MEKK6, kinázy, která aktivuje p38, byla snížena, zatímco genová exprese Mkp1 / Dusp1, fosfatázy, která inaktivuje p38 (Sgambato a kol., 1998), byl zvýšen u aktivovaných neuronů, ale ne u neaktivovaných neuronů. Takže celková signalizace p38 MAPK hraje roli v synaptické plasticitě (Bolshakov a kol., 2000; Izumi a kol., 2008), může být atenuován v aktivovaných neuronech vzhledem k neaktivované většině neuronů.

FACS může také pomoci identifikovat neuronální typy, které jsou aktivovány po akutní nebo opakované expozici kokainu. V aktivovaných neuronech jsme našli vyšší expresi prodynorfinu genu neuronového markeru D1 a nižší expresi dopaminového receptoru D2 a receptoru adenosinu A2A v aktivovaných neuronech. To naznačuje, že Fos byl indukován primárně v D2 striatálních neuronech. I když to souhlasí s mnoha imunohistochemickými studiemi, které uvádějí indukci Fos primárně v neuronech D1 po injekcích psychostimulancií do domácí klec (Berretta a kol., 1992; Cenci et al., 1992), je v rozporu se stejnou aktivací neuronů D1 a D2 nalezených po injekcích psychostimulancií v relativně nové prostředí mimo krysí domácí klec (Jaber et al., 1995; Badiani a kol., 1999; Hope a kol., 2006).

Protože jsme použili stejný βgal marker k identifikaci aktivovaných neuronů během FACS, jako jsme použili pro náš dříve popsaný postup inaktivace Daun02 (Koya a kol., 2009), je pravděpodobné, že pozorujeme jedinečné molekulární změny v neuronálních souborech, které jsou nezbytné pro naučenou složku kontextově specifické senzibilizace lokomoce vyvolané kokainem. Dříve jsme zjistili, že inaktivace pouze malého počtu řídce distribuovaných neuronů v domnělém souboru postačuje k narušení kontextově specifické psychomotorické senzibilizace kokainu (Koya a kol., 2009). Toto zjištění bylo replikováno pomocí stejné samice cfos-lacZ krysy a režim senzibilizace použitý v této studii [http://irp.drugabuse.gov]. Tyto neurony nejsou inherentně citlivější na všechny podněty, protože změna prostředí nebo kontextu, ve kterém bylo léčivo podáváno, aktivovala po injekcích kokainu jinou sadu striatálních neuronů (Mattson a kol., 2008; Koya a kol., 2009). Výběr specifického striatálního neuronálního souboru se zdá být primárně závislý na modelu aktivity kortikálních a subkortikálních glutamatergických aferentů (Pennartz a kol., 1994; O'Donnell, 2003) a tyto vstupy jsou samy určovány specifickými environmentálními a interoceptivními podněty přítomnými během chování. Z této předchozí práce spolu s našimi současnými údaji předpokládáme, že opakované párování kokainu s environmentálními stimuly během našeho senzibilizačního režimu vede k jedinečným molekulárním změnám v opakovaně aktivovaných neuronových souborech, což může přispět k naučeným asociacím, které jsou základem kontextově specifické senzibilizace.

Celkově jsme demonstrovali novou aplikaci FACS k izolaci dospělých neuronů selektivně aktivovaných během akutní lokomotorické aktivity vyvolané kokainem a opakované lokomotorické senzibilizace indukované kokainem. Navrhujeme, aby tento přístup mohl být také použit k identifikaci jedinečných molekulárních neuroadaptací v neuronálních souborech kódujících behaviorální účinky zneužívaných drog a dalších naučených chování. Příčinné role těchto jedinečných molekulárních neuroadaptací v nervové plasticitě a chování musí být nakonec zkoumány manipulací genové exprese pouze v aktivovaných neuronech; tato technika však musí být ještě vyvinuta.

Poděkování

Tento výzkum byl podpořen programem intramurálního výzkumu Národního institutu pro zneužívání drog. D. Guez-Barber byl podporován NIH MSTP TG 5T32GM07205, číslem ocenění F30DA024931 od Národního institutu pro zneužívání drog a Charlesem BG Murphym v psychiatrii na Yale University. Děkujeme Joe Chrestovi za vynikající technickou pomoc s FACS a Chris Cheadle, Tonya Watkins a Alan Berger za jejich práci na microarray. Děkujeme Yavin Shahamovi za užitečné komentáře k rukopisu.

Poznámky pod čarou

 

Pro autory tohoto rukopisu neexistují žádné střety zájmů.

Reference

  1. Badiani A, Oates MM, den HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Environmentální modulace amfetaminem indukované exprese c-fos v D1 versus D2 striatálních neuronech. Behav Brain Res. 1999; 103: 203 – 209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Agonisté dopaminu a glutamátu stimulují neuronově specifickou expresi Fos-like proteinu ve striatu. J Neurophysiol. 1992; 68: 767 – 777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dual MAP kinázové dráhy zprostředkovávají opačné formy dlouhodobé plasticity na synapsích CA3-CA1. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107 – 1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. Synaptická plasticita receptoru AMPA indukovaná psychostimulanty: minulost, přítomnost a terapeutická budoucnost. Neuron. 2010; 67: 11 – 24. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Striatální indukce c-fos kokainem nebo apomorfinem se vyskytuje přednostně u výstupních neuronů promítajících se do Substantia Nigra u krysy. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376 – 380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos a Jun: připojení AP-1. Buňka. 1988; 55: 395 – 397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 exprese buňkami rezidentními v CNS je klíčová pro vyvolání ochranné imunity v mozkových abscesech. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. Funkce dopaminového receptoru D1 a D2 ve striatu: koaktivace D1- a D2-dopaminových receptorů na oddělených populacích neuronů vede k zesílené okamžité včasné genové odpovědi v neuronech obsahujících D1. J Neurosci. 1995; 15: 8167 – 8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Mapování behaviorálních nervových obvodů s okamžitou expresí genu. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599 – 606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. Aktivace receptoru D1 zvyšuje evokovaný výboj v neurostriálních středně ostnatých neuronech modulací vodivosti Ca2 + typu L. J Neurosci. 1997; 17: 3334 – 3342. [PubMed]
  11. Naděje B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Kokainem indukovaná lokomotorická aktivita a exprese Fos v nucleus accumbens jsou senzitizovány po 6 měsíců po opakovaném podávání kokainu mimo domácí klec. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867 – 875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Dlouhodobá inhibice potenciace nízkoúrovňovou aktivací N-methyl-D-aspartátového receptoru zahrnuje kalcineurin, oxid dusnatý a p38 mitogenem aktivovanou proteinovou kinázu. Hippocampus. 2008; 18: 258 – 265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Akutní a chronické amfetaminové ošetření různě regulují hladiny RNA neuropeptidových messengerů a Fos imunoreaktivitu v striatálních neuronech potkanů. NEUROSCIENCE. 1995; 65: 1041 – 1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Glutamátová homeostatická hypotéza závislosti. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontánní a evokovaná glutamátová signalizace ovlivňuje expresi Fos-lacZ a pyramidální buněčnou smrt v kulturách hippocampálních řezů z transgenních potkanů. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197 – 208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Cílené přerušení kokainem aktivované jádro accumbens neurony zabraňuje kontextově specifické senzibilizaci. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069 – U1152. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. Kombinovaná metoda mikrodisekce laserového záchytu a histologie X-Gal pro analýzu genové exprese v neuronech specifických pro c-Fos. J Neurosciho metody. 2010; 186: 155 – 164. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Indukce c-fos mRNA zapálenými záchvaty: komplexní vztah s vypalováním neuronových dávek. J Neurosci. 1993; 13: 744 – 751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Druhá třída chemosenzorických receptorů v čichovém epitelu. Příroda. 2006; 442: 645 – 650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, šedá M, Geschwind DH, Yang XW. Profilování FACS pole subtypů neuronů striatální projekce v mozku mladistvých a dospělých myší. Nat Neurosci. 2006; 9: 443 – 452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Funkce aktivně regulovaných genů v nervovém systému. Physiol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [PMC bezplatný článek] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Kontextově specifická senzibilizace lokomotorické aktivity vyvolané kokainem a přidružené neuronové soubory v jádrech krysy accumbens. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202 – 212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulární přepínač pro dlouhodobou adaptaci v mozku. Brain Res Mol Brain Res. 2004: 132: 146 – 154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Drogová závislost - model pro molekulární základ neurální plasticity. Neuron. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Molekulární podstata závislosti na dlouhodobé plasticitě. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119 – 128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminergní modulace neuronální excitability ve striatu a nucleus accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185 – 215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Zvýšení kontrastu: fyziologický účinek striatálního dopaminu? Cell Tissue Res. 2004; 318: 93 – 106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Dopamin gating předních mozkových souborů. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429 – 435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. Mozek krysy ve stereotaxických souřadnicích. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Jádro nucleus accumbens jako komplex funkčně odlišných neuronálních souborů: integrace behaviorálních, elektrofyziologických a anatomických dat. Prog Neurobiol. 1994: 42: 719 – 761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. Exprese c-Fos v potkanově intergenním letáku: photická regulace, ko-lokalizace s Fos-B a buněčná identifikace. Brain Res. 1996; 728: 231 – 241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Vliv elektrické stimulace mozkové kůry na expresi proteinu Fos v bazálních gangliích. Neurosci. 1997; 81: 93 – 112. [PubMed]
  33. Sgambato V, strany C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracelulární signálem regulovaná kináza (ERK) kontroluje okamžitou časnou indukci genu po kortikostiatální stimulaci. J Neurosci. 1998; 18: 8814 – 8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. Role neuroadaptací při relapsu při hledání drog. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437 – 1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Indukce exprese c-fos mRNA následným výbojem v hippocampu naivních a zapálených krys. J Neurochem. 1990; 55: 1050 – 1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Počátky dvoustupňových spontánních membránových potenciálních fluktuací neostriatálních ostnatých neuronů. J Neurosci. 1996; 16: 2397 – 2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. Plastičnost AMPA receptoru v jádru se opakuje po opakované expozici kokainu. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC bezplatný článek] [PubMed]