Los receptores de CRF en el núcleo accumbens modulan la preferencia de pareja en los ratones de la pradera (2007)

Horma Behav. Manuscrito del autor; disponible en PMC Dic 10, 2007.

Publicado en forma final editada como:

Horma Behav. Abr 2007; 51 (4): 508 – 515.

Publicado en línea el 27 de enero de 2007. doi: 10.1016/j.yhbeh.2007.01.006

PMCID: PMC2128037

NIHMSID: NIHMS22254

La versión final editada de este artículo por la editorial está disponible en Horm Behav.

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Resumen

Evidencia reciente sugiere un papel para el factor liberador de corticotropina (CRF) en la regulación del vínculo de pareja en los topillos de pradera. Hemos demostrado previamente que las especies de topillos monógamas y no monógamas tienen distribuciones drásticamente diferentes del receptor de CRF tipo 1 (CRF 1 ) y del receptor de CRF tipo 2 (CRF 2 ) en el cerebro, y que las densidades de receptores CRF 1 y CRF 2 en el núcleo accumbens (NAcc) están correlacionadas con la organización social. Los topillos monógamos de pradera y pino tienen niveles significativamente más bajos de unión del receptor de CRF tipo 1 (CRF 1 ), y niveles significativamente más altos de unión del tipo 2 (CRF 2 ), en el NAcc que los topillos no monógamos de pradera y montaña. Aquí, informamos que las microinyecciones de CRF directamente en el NAcc aceleran la formación de la preferencia de pareja en los topillos de pradera machos. Las inyecciones de control de LCR en el NAcc, y de CRF en el núcleo caudado-putamen, no facilitaron la preferencia de pareja. Asimismo, las inyecciones de CRF en el núcleo accumbens (NAcc) de topillos de pradera no monógamos tampoco facilitaron la preferencia de pareja. En los topillos de pradera, este efecto de facilitación de CRF fue bloqueado por la coinyección de antagonistas de los receptores CRF 1 o CRF 2 en el NAcc. La tinción inmunocitoquímica para CRF y urocortina-1 (Ucn-1), dos ligandos endógenos para los receptores CRF 1 o CRF 2 en el cerebro, reveló que había fibras inmunorreactivas a CRF, pero no a Ucn-1, en el NAcc. Esto apoya la hipótesis de que la liberación local de CRF en el NAcc podría activar los receptores CRF 1 o CRF 2 en la región. En conjunto, nuestros resultados revelan una nueva función de los sistemas de CRF del núcleo accumbens en el comportamiento social.

Keywords: núcleo accumbens, unión, CRF1, CRF2, factor liberador de corticotropina, hormona liberadora de corticotropina, campañol, receptores neuropeptídicos, enlace de pares, comportamiento social, monogamia, diferencias de especies

El sistema del factor liberador de corticotropina (CRF) está involucrado en la neurobiología subyacente al estrés y la ansiedad, pero se sabe mucho menos sobre su papel en el comportamiento social. Los roedores microtinos exhiben diversas organizaciones sociales y, por lo tanto, ofrecen un excelente enfoque comparativo en el estudio de la neurobiología del comportamiento social ( Young y Wang, 2004 ). Los topillos de pradera ( Microtus ochrogaster ) y los topillos de pino ( Microtus pinetorum ) son monógamos; las parejas adultas forman vínculos de pareja selectivos y duraderos en el campo y en el laboratorio ( Getz, Carter y Gavish, 1981 ; Salo, Shapiro y Dewsbury, 1993 ). En contraste, los topillos de pradera ( Microtus pennsylvanicus ) y los topillos de montaña ( Microtus montanus ) , estrechamente relacionados, son promiscuos y solitarios ( Gruder-Adams y Getz, 1985 ; Shapiro y Dewsbury, 1990 ). Investigaciones anteriores han revelado que la distribución cerebral de los receptores de neuropéptidos para la oxitocina y la vasopresina parece ser responsable de las diferencias entre especies en la organización social ( Insel y Shapiro, 1992 ; Insel, Wang y Ferris, 1994 ; Lim, Wang, Olazabal, Ren, Terwilliger y Young, 2004b ). Sin embargo, evidencia más reciente sugiere que otro sistema de neuropéptidos, el CRF, también parece modular la formación de parejas en los topillos de la pradera ( DeVries, Guptaa, Cardillo, Cho y Carter, 2002 ).

Existen relativamente pocos estudios que examinen el papel de las hormonas del estrés en el comportamiento social. Un estudio halló que la administración de corticosterona exógena a topillos de la pradera machos facilitó la formación de vínculos de pareja con una hembra desconocida ( DeVries, DeVries, Taymans y Carter, 1996 ). Un estudio posterior halló que la administración intracerebroventricular (icv) de CRF facilitó la preferencia de pareja en topillos de la pradera machos, incluso a dosis extremadamente bajas que no parecieron afectar la actividad locomotora ni el comportamiento similar a la ansiedad ( DeVries et al., 2002 ). Además, la preferencia de pareja fue bloqueada por la administración icv de CRF alfa-helicoidal, que bloquea de forma no selectiva los receptores de CRF en el cerebro ( DeVries et al., 2002 ). Estos datos sugieren que el CRF puede desempeñar un papel en la formación de vínculos de pareja a través de mecanismos independientes de la ansiedad mediante la participación de receptores cerebrales de acción central. Sin embargo, la administración intracerebroventricular de CRF podría estar actuando sobre diversas regiones cerebrales para facilitar la preferencia de pareja, y actualmente se desconoce qué regiones cerebrales están implicadas específicamente.

Dado que el sistema CRF ha sido implicado en la regulación de la formación de vínculos de pareja, predijimos que los circuitos neuronales para este sistema diferirían entre especies monógamas y no monógamas. Hemos demostrado previamente que, aunque las distribuciones de ARNm y péptido CRF parecen estar altamente conservadas entre las especies de topillos, las distribuciones de los receptores CRF tipos 1 y 2 (CRF 1 y CRF 2 ) difieren drásticamente en todo el cerebro en cuatro especies de topillos que exhiben organizaciones sociales variables ( Lim, Nair y Young, 2005 ; Lim, Tsivkovskaia, Bai, Young y Ryabinin, 2006 ). La unión del receptor pareció correlacionarse con la estructura social monógama en varias regiones del cerebro; sin embargo, solo el núcleo accumbens (NAcc) se segregó consistentemente con ambas especies de topillos monógamas y ambas especies de topillos no monógamas. Los topillos monógamos de pradera y pino tienen niveles significativamente más bajos del receptor CRF tipo 1 (CRF 1 ) y niveles significativamente más altos de unión del tipo 2 (CRF 2 ) en NAcc que los topillos no monógamos de pradera y montaña ( Lim et al., 2005 ).

Basándonos en nuestros estudios neuroanatómicos que demuestran diferencias entre especies en las densidades de CRF 1 y CRF 2 en el NAcc, planteamos la hipótesis de que la acción del CRF dentro del NAcc, en particular, era fundamental para el comportamiento social monógamo en los topillos de la pradera. Primero, determinamos si el CRF inyectado directamente en el NAcc puede facilitar la formación de la preferencia de pareja después de un breve período de cohabitación con la pareja. Luego, realizamos el mismo experimento en topillos de pradera no monógamos. Posteriormente, manipulamos el CRF 1 y el CRF 2 en el NAcc utilizando antagonistas farmacológicos para determinar sus contribuciones relativas a la formación de la preferencia de pareja facilitada por el CRF. Finalmente, mostramos evidencia de tinción inmunorreactiva de dos ligandos endógenos para los receptores CRF 1 y CRF 2 en el cerebro, CRF- y Urocortina-1 (Ucn-1), en el NAcc de los topillos de la pradera. Los resultados de estos estudios demuestran por primera vez que el CRF, actuando en el NAcc, puede promover el apego social y, además, que tanto los receptores CRF 1 como los CRF 2 están involucrados en este proceso.

FORMAS DE PAGO

Materias

Los animales eran adultos, sexualmente ingenuos, machos y hembras (70 – 100 días de edad) de una colonia de cría de laboratorio en la Universidad Estatal de Florida que originalmente se derivaron de campañoles capturados en el campo en Illinois, EE. UU. Los ratones de campo adultos sexualmente naïve procedían de la colonia de cría de laboratorio de la Universidad de Emory. Después del destete a los 21 días de edad, los sujetos se alojaron en parejas o tríos de hermanos del mismo sexo y agua y el alimento para conejos Purina se proporcionó a voluntad. Todas las jaulas se mantuvieron en un ciclo 14: 10 luz: oscuridad con la temperatura a 20 ° C. Se incluyeron datos de los ratones de la pradera masculina 87 en los experimentos de farmacología de CRF, junto con un número igual de pares de praderas femeninas de estímulo para el ensayo de unión de pares. También se utilizaron datos de los ratones de campo masculinos 10, junto con un número igual de ratones de campo hembra de estímulo. Se usaron ocho ratones de campo en los estudios de inmunocitoquímica CRF (n = 4 para cada sexo).

Facilitación CRF de la preferencia de pareja

Se canularon bilateralmente topillos de pradera machos adultos (n = 31) en el NAcc mediante métodos estereotáxicos, como se describió previamente ( Aragona, Liu, Curtis, Stephan y Wang, 2003a ; Liu y Wang, 2003 ). Los sujetos fueron anestesiados con pentobarbital sódico (2.5 mg por cada 40 g de peso corporal) y se implantaron estereotáxicamente cánulas guía bilaterales de calibre 26 (Plastics One, Roanoke, VA) dirigidas al NAcc (Anterior 1.7 mm, Bilateral ±1 mm, Ventral -4.0 mm al bregma). Las inyecciones de control (n = 6) se dirigieron al núcleo caudado-putamen (Anterior 1.7 mm, Bilateral ±1 mm, Ventral -2.5 mm al bregma). Tras 3-5 días de recuperación, los sujetos recibieron microinyecciones (200 nl por lado) de LCR artificial o del fármaco disuelto en LCR. Las inyecciones se realizaron con una aguja de calibre 33 que se extendía 1 mm por debajo de la cánula guía hasta la zona objetivo. La aguja se conectó a una jeringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) mediante un tubo de polietileno-20, a través del cual la solución se infundió lentamente mediante una bomba (MasterFlex L/S de accionamiento estándar, modelo 7016-21) a una velocidad de 200 nl/min por lado. El LCR humano/de rata se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO).

Los animales se dividieron en uno de cuatro grupos: control de LCR (n = 7), 0.01 pg de CRF en NAcc (n = 9), 0.1 pg de CRF en NAcc (n = 15) y 0.1 pg de CRF en núcleo caudado-putamen (n = 6). El núcleo caudado-putamen (CP) es una región cerebral justo dorsal al NAcc y también contiene receptores CRF 2 , sirviendo así como una región de control anatómico para los efectos del CRF. Cada animal recibió inyecciones bilaterales de 200 nl de volumen antes de una cohabitación abreviada de 6 horas con una hembra nueva. La concentración de 0.01 pg de CRF en 200 nl es de 10 nM, mientras que la concentración de 0.1 pg de CRF en 200 nl es de 100 nM. El K i calculado para CRF 1 es 11 nM, mientras que el Ki calculado para CRF 2 es 25 nM en relación con 125 I-sauvagina ( Primus, Yevich, Baltazar y Gallager, 1997 ). La cohabitación durante 6 horas sin apareamiento no induce de forma consistente preferencia de pareja, como se demostró en estudios previos ( Aragona et al., 2003a ; Aragona, Liu, Yu, Curtis, Detwiler, Insel y Wang, 2006 ). Inmediatamente después de la cohabitación, se evaluó la preferencia de pareja de los sujetos.

Las pruebas de preferencia de pareja consistieron en colocar al macho en un aparato de tres cámaras en el que la hembra estaba atada en una jaula, y una hembra desconocida ("extraña") de la misma edad y experiencia sociosexual estaba atada en una segunda jaula, como se describió previamente ( Carter, DeVries y Getz, 1995 ). Cada hembra estímulo se utilizó en dos pruebas de preferencia de pareja separadas, una vez como pareja y otra como desconocida de otro sujeto, por lo que cada hembra tuvo una exposición social y sexual equivalente durante las 20 horas de cohabitación. Se permitió a los sujetos moverse libremente por el aparato, y se cuantificó el tiempo que pasaron en contacto con la pareja y la desconocida durante el transcurso de la prueba de 3 horas.

Se midió la actividad locomotora durante la prueba de preferencia de pareja para determinar si las dosis elegidas de tratamiento con CRF afectaban la actividad locomotora general o el comportamiento similar a la ansiedad, como se describió previamente ( Hotta, Shibasaki, Arai y Demura, 1999 ). El número de cruces de jaula a través de ambos túneles del aparato de preferencia de pareja se evaluó utilizando detectores infrarrojos. Hay cuatro haces infrarrojos a través de las tres jaulas del aparato de preferencia de pareja, con dos haces flanqueando cada túnel que conecta dos jaulas. El número total de interrupciones del haz de luz se sumó para cada animal durante el período de tres horas. Después de las pruebas de comportamiento, los sujetos fueron sacrificados y los sitios de inyección se verificaron histológicamente.

También se evaluó la facilitación de la preferencia de pareja por CRF en topillos de pradera machos adultos (n=10). Los animales fueron canulados bilateralmente en el NAcc como se describió anteriormente y asignados aleatoriamente a uno de dos grupos: control de CSF (n=4) o CRF 0.1 pg (n=6). Las pruebas de cohabitación y preferencia de pareja se realizaron exactamente como se describió anteriormente para los topillos de pradera. Los topillos de pradera machos adultos de nuestra colonia generalmente no forman preferencias de pareja cuando cohabitan con una hembra ( Lim et al., 2004b ).

CRF1- y CRF2- Farmacología selectiva y preferencia de pareja.

Se canularon bilateralmente topillos de pradera adultos en el NAcc como se describió anteriormente y se dividieron en tres grupos: 0.1 pg de CRF (n = 10), 0.1 pg de CRF más 10 pg de antagonista de CRF 1 (CP-154,526) (n = 25) y 0.1 pg de CRF más 10 pg de antagonista de CRF 2 (anti-sauvagina-30) (n = 15). El anti-sauvagina-30 se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO) y el CP-154,526 de Michael Owens, Ph.D. (Universidad de Emory, Atlanta, GA). La concentración de 10 pg del antagonista CRF 1 (CP-154,526) en 200 nL de solución es de 100 nM, mientras que la concentración de 10 pg del antagonista CRF 2 (anti-sauvagina-30) en 200 nL de solución es de 10 nM. Cada animal recibió inyecciones bilaterales de 200 nL de volumen directamente en el NAcc antes de una cohabitación abreviada de 6 horas con una hembra nueva. Inmediatamente después de la cohabitación, se evaluó la preferencia de pareja de los sujetos como se describió anteriormente. Después de las pruebas de comportamiento, los sujetos fueron sacrificados y los sitios de inyección se verificaron histológicamente. Los animales cuyos sitios de canulación se colocaron fuera del NAcc fueron excluidos del análisis de datos y no se reflejaron en el número total de animales utilizados.

Análisis de Datos

Los datos de la prueba de preferencia de pareja para cada experimento se analizaron utilizando un método ANOVA de 2 en el que el estímulo (pareja o extraño) y el tratamiento fueron factores. Además, se utilizaron las pruebas t de Student para comparar el tiempo en contacto con la pareja y el extraño dentro de cada grupo de tratamiento. Se realizaron correcciones de Bonferroni para el nivel de importancia para cada experimento con el fin de minimizar el riesgo de error de tipo I debido a comparaciones múltiples. Los varones se clasificaron como habiendo desarrollado una preferencia de pareja si pasaron más del doble de tiempo en contacto con la pareja que con el extraño.

Los datos recopilados para la actividad locomotora se totalizaron como el número de roturas del haz infrarrojo para cada animal y se promediaron dentro de cada grupo de tratamiento. Los resultados se analizaron utilizando un ANOVA de una vía con tratamiento como factor independiente.

Inmunohistoquímica CRF y Urocortin-1

Los topillos de pradera adultos fueron anestesiados profundamente entre las 10:00 y las 14:00 horas con isoflurano y perfundidos con solución salina seguida de paraformaldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 10 mM (pH 7.4). Los cerebros disecados fueron postfijados durante la noche en la solución de paraformaldehído al 2%/PBS y crioprotegidos en sacarosa al 30%/PBS. Se cortaron secciones coronales flotantes de 30 μm de espesor en un criostato y se procesaron para inmunohistoquímica de acuerdo con protocolos estándar ( Ryabinin, Criado, Henriksen, Bloom y Wilson, 1997 ; Weitemier, Tsivkovskaia y Ryabinin, 2005 ) con ajustes para tejido de topillo realizados en experimentos anteriores ( Lim et al., 2006 ). Brevemente, la actividad de la peroxidasa endógena se inactivó mediante una incubación de 15 minutos con peróxido de hidrógeno al 0.3 %. Para el anticuerpo específico de urocortina-1, el bloqueo se realizó mediante una incubación de cinco horas con albúmina de suero bovino al 2 %, heparina al 0.1 %, Triton X-100 al 0.01 % en PBS. Para el anticuerpo específico de CRF, el bloqueo se realizó mediante una incubación de cinco horas con suero de cabra al 4.5 %, Triton X-100 al 0.3 % en PBS. Los anticuerpos primarios de conejo que reconocen la urocortina-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se utilizaron en una dilución de 1:5,000. Los anticuerpos primarios que reconocen la CRF (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) se utilizaron en una dilución de 1:15,000. Se utilizaron anticuerpos secundarios anti-conejo biotinilados (Vector Laboratory Inc., Burlingame, CA) para detectar los anticuerpos primarios. La detección de los anticuerpos secundarios se realizó con el kit Vectastain ABC (Vector), y el desarrollo enzimático se llevó a cabo con el kit Metal Enhanced DAB (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). La especificidad de la inmunotinción se evaluó mediante la ausencia total de inmunorreactividad en áreas que no se sabe que expresen CRF o Urocortina-1. Además, se realizaron previamente experimentos de preabsorción de control para estos anticuerpos ( Bachtell, Weitemier, Galvan-Rosas, Tsivkovskaia, Risinger, Phillips, Grahame y Ryabinin, 2003 ).

El análisis cualitativo de la imagen se realizó utilizando un sistema que consiste en un microscopio Olympus BX40 y una cámara de video digital de alta resolución (Olympus Qcolor3) interconectada a una computadora personal Macintosh que ejecuta OS-X. Las imágenes de una sección única mejor combinadas entre los animales para cada región del cerebro se recolectaron digitalmente con la misma intensidad de iluminación. Dado que no se observó tinción inmunopositiva en cuerpos celulares en NAcc, el número de neuronas inmunorreactivas no se contabilizó cuantitativamente.

MAS FUERTES

Manipulación farmacológica de los receptores de CRF en NAcc.

Se había demostrado previamente que la infusión de CRF icv facilita la preferencia de pareja en los topillos de la pradera ( DeVries et al., 2002 ). Basándonos en nuestros datos neuroanatómicos que demuestran diferencias entre especies en CRF 1 y CRF 2 en el NAcc, planteamos la hipótesis de que el NAcc era el sitio de acción para la facilitación de la preferencia de pareja por parte del CRF. El estudio anterior mostró que la administración icv de CRF dependiente de la dosis podía facilitar las preferencias de pareja en los topillos de la pradera machos después de una breve cohabitación con una hembra ( DeVries et al., 2002 ). Basándonos en este estudio, diseñamos dosis de CRF para inyecciones específicas en el NAcc. Las dosis que utilizamos, 0.1 pg y 0.01 pg de CRF disueltos en 200 nL de solución isotónica (o 100 nM y 10 nM, respectivamente), estaban muy por debajo de las dosis icv efectivas mínimas de 0.1 ng y 1 ng de CRF disueltos en 1 μL (o 210 nM y 2.1 μM, respectivamente) ( DeVries et al., 2002 ). Aunque se ha demostrado que el CRF se une preferentemente al CRF 1 , también se une al CRF 2 con una afinidad sustancial (K i igual a 11 y 25, respectivamente) ( Primus et al., 1997 ).

El análisis del conjunto de datos general mediante un ANOVA de dos vías reveló un efecto principal significativo del animal estímulo (F(1,66) = 6.77, p<0.05), pero no se detectaron otros efectos principales ni interacciones. Para determinar qué grupos pasaron preferentemente tiempo en contacto con los compañeros en lugar de con los extraños, se realizaron pruebas t de Student con correcciones de Bonferroni del valor p. Los topillos de pradera de control con inyecciones bilaterales de LCR artificial en el polo septal del NAcc, o 0.1 pg de CRF en el núcleo caudado-putamen, no pasaron significativamente más tiempo en contacto con el compañero que con el animal estímulo extraño (p>0.3, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.01) ( Figura 1A ). Los topillos de pradera inyectados con la dosis más baja de CRF, 0.01 pg, tendieron a pasar más tiempo en contacto con la pareja que con el extraño (p>0.08, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.01). Por el contrario, los topillos de pradera que recibieron inyecciones bilaterales de la dosis 10 veces mayor de CRF, 0.1 pg en el polo septal del NAcc, pasaron significativamente más tiempo en contacto con la pareja que con el extraño (p<0.01, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.01) ( Figura 1A ). Además, mientras que solo 6 de los 13 animales de control mostraron una preferencia por la pareja, definida como pasar el doble de tiempo en contacto con la pareja en comparación con el extraño, 12 de los 15 animales que recibieron 0.1 pg de CRF mostraron una preferencia por la pareja ( Figura 1B ). Los tres animales que no mostraron preferencia por una pareja presentaron una fuerte preferencia por animales desconocidos, lo que probablemente contribuyó a la ausencia de un efecto principal del tratamiento o de un efecto de interacción en el ANOVA de dos vías. Por lo tanto, si bien las infusiones de CRF en el NAcc aumentaron significativamente el tiempo de contacto con la pareja en relación con el animal desconocido, no resultaron en un aumento general del tiempo de contacto con la pareja.

Figura 1 y XNUMX 

Las micro-inyecciones bilaterales de CRF en NAcc facilitan la preferencia de pareja en ratones de campo masculinos. (A) Los animales de control que recibieron LCR artificial en el NAcc, o 0.1 pg CRF en el caudato-putamen (CP), no preferían significativamente a la pareja sobre ...

Debido a las marcadas diferencias entre especies en las densidades de CRF 1 y CRF 2 en el NAcc, planteamos la hipótesis de que la acción de CRF dentro del NAcc solo facilitaría la formación de preferencias de pareja en los topillos de pradera, y no en los topillos de pradera no monógamos. De hecho, los topillos de pradera a los que se les inyectó CSF, o la dosis alta de 0.1 pg de CRF, no pasaron significativamente más tiempo en contacto con la pareja que con el extraño (p>0.5, prueba t de Student) ( Figura 2 ).

Figura 2 y XNUMX 

Las micro-inyecciones bilaterales de CRF en NAcc no facilitan la preferencia de la pareja en ratones de campo masculinos no monógamos. Los ratones de campo adultos inyectados con CSF artificial, o 0.1 pg de CRF en NAcc, no pasaron más tiempo en contacto con el compañero que ...

Basándonos en las diferencias de especies en la distribución de CRF 1 y CRF 2 en NAcc, planteamos la hipótesis de que tanto CRF 1 como CRF 2 modularían el comportamiento de preferencia de pareja, tal vez en direcciones opuestas. El análisis del conjunto de datos general mediante un ANOVA de 2 vías reveló un efecto principal significativo del animal estímulo (F(1,94) = 7.52, p<0.05), pero no se detectaron otros efectos principales ni interacciones. Los topillos de las praderas inyectados con un cóctel de 0.1 pg de CRF, más 10 pg del antagonista selectivo de CRF 2 anti-sauvagina-30, no pasaron significativamente más tiempo con la pareja o el extraño (p>0.3, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.016) ( Figura 3A ). Curiosamente, los topillos de pradera inyectados con un cóctel de 0.1 pg de CRF, más 10 pg del antagonista selectivo de CRF 1 CP-154,526-1, también mostraron un bloqueo de la preferencia de pareja (p>0.5, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.016) ( Figura 3A ). Los topillos de pradera de control inyectados con 0.1 pg de CRF en el NAcc fueron probados simultáneamente, y se encontró que replicaron los resultados originales de facilitación de la preferencia de pareja (p<0.01, prueba t de Student, nivel de Bonferroni establecido en p<0.016) ( Figura 3A ). Además, mientras que 8 de los 10 topillos de pradera tratados con CRF mostraron una preferencia de pareja, solo 11 de los 25 animales que recibieron el antagonista de CRF 1 , y 6 de los 15 animales que recibieron el antagonista de CRF 2 , mostraron una preferencia de pareja ( Figura 3B ). Nuestros resultados sugieren que la activación de los receptores CRF 1 y CRF 2 en el NAcc es necesaria para la facilitación de la preferencia de pareja inducida por CRF en los topillos de la pradera.

Figura 3 y XNUMX 

Ambos CRF1 y CRF2 Los receptores en el NAcc son necesarios para la formación de preferencias de pareja facilitada por CRF en ratones de campo de la pradera. (A) Los animales inyectados con 0.1 pg de CRF en NAcc pasaron más tiempo en contacto con la pareja que con el extraño (p <0.01, Student's ...

La actividad locomotora no difirió significativamente entre los grupos de tratamiento (F(1,80) = 1.37, p>0.05, ANOVA unidireccional), aunque la actividad locomotora tendió a ser menor en los animales que recibieron CRF en el NAcc. Los resultados se muestran en la Tabla 1. En la Figura 4 se muestra una sección histológica representativa que muestra el sitio de canulación para el NAcc.

Figura 4 y XNUMX 

Verificación histológica de la colocación de la cánula. (a) El autorradiograma del receptor en la mitad izquierda representa la ubicación de CRF2 en pradera de campana ncc. (b) Fotomicrografía representativa de la sección del cerebro teñida con Nissl que muestra la colocación de la cánula que termina dentro de ...
Tabla 1 

Actividad locomotora representada por el número total de roturas de rayos infrarrojos o cruces de jaulas, promediado dentro de cada grupo de tratamiento. No hay diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (F = 1.37, p> 0.05, ANOVA de una vía).

Inmunorreactividad de CRF y Ucn-1 en NAcc

Para mostrar las fotomicrografías de los ligandos endógenos del receptor CRF presentes en el NAcc, realizamos inmunorreactividad de CRF y Urocortina-1 (Ucn-1) en topillos de pradera adultos. En la Figura 5 se muestran secciones cerebrales representativas procesadas para inmunocitoquímica de CRF . Se observaron fibras inmunorreactivas a CRF en el NAcc en ambos sexos sin diferencias evidentes en la distribución o densidad de las fibras ( Figura 5b ). No se detectaron fibras de Ucn-1 en el NAcc ni en los topillos de pradera machos ni en las hembras ( Figura 5c ). Por lo tanto, es posible que el CRF sea uno de los ligandos endógenos que podrían unirse fisiológicamente a los receptores CRF 1 y CRF 2 en el NAcc del topillo para facilitar la preferencia de pareja. Cabe destacar que se ha demostrado que el CRF se une tanto al CRF 1 como al CRF 2 , con una afinidad aproximadamente de dos a diez veces mayor por el CRF 1 ( Primus et al., 1997 ). Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que otros ligandos endógenos, como la urocortina-2 o la urocortina-3, también contribuyan al control neuronal de la formación de enlaces de pares.

Figura 5 y XNUMX 

Inmunorreactividad de CRF y Ucn-1 en matrices de pradera. (a) Esquema del atlas de rata que muestra el área de ampliación 10x de NAcc (ver rectángulo) (Paxinos y Watson, 1998). (b) Sección de ratones de la pradera que muestra fibras inmunoreactivas a CRF en NAcc (ver flechas). (c) pradera ...

DISCUSIÓN

En estudios previos, identificamos diferencias entre especies en la expresión de CRF 1 y CRF 2 en el núcleo accumbens que se correlacionaban con la organización social en cuatro especies de topillos. Los topillos monógamos de pradera y pino tenían niveles más altos de CRF 2 en el NAcc y niveles más bajos de CRF 1 en el NAcc, en comparación con las especies no monógamas de topillos de pradera y montaña ( Lim et al., 2005 ). Con base en estos datos, planteamos la hipótesis de que la acción de CRF dentro del NAcc era fundamental para el comportamiento social monógamo en los topillos de pradera. En el presente estudio, mostramos por primera vez que las microinyecciones de CRF directamente en el NAcc facilitan la preferencia de pareja en los topillos de pradera machos. El análisis ANOVA de dos vías detectó un efecto principal del animal estímulo, es decir, en general se pasó más tiempo en contacto con la pareja que con el extraño, pero no se detectó ningún efecto principal del tratamiento ni de la interacción. Las fuertes preferencias por el extraño en 3 animales del grupo de 0.1 pg de CRF en el NAcc inflaron la varianza, impidiendo la detección de un efecto de interacción. Sin embargo, comparaciones separadas del tiempo dedicado a la pareja frente al tiempo dedicado a un extraño revelaron preferencias significativas por la pareja en el grupo NAcc de 0.1 pg de CRF. Este efecto se replicó en el estudio con antagonistas, lo que demuestra la robustez del efecto. Este cambio en las preferencias de pareja no se asoció con un aumento estadísticamente significativo del tiempo dedicado a la pareja ni con una disminución del tiempo dedicado al extraño, sino que fue el resultado de una mayor preferencia general por la pareja en relación con el extraño. Por el contrario, el CRF no tiene efecto sobre la preferencia de pareja en los topillos de pradera no monógamos. Además, mostramos que este efecto de facilitación está modulado por la acción del CRF en los receptores CRF 1 y CRF 2. Por último, mostramos evidencia de microfotografías de que hay fibras inmunorreactivas al CRF en el NAcc del topillo de pradera, lo que indica que el CRF podría ser uno de los ligandos endógenos que actúan sobre los receptores CRF 1 y CRF 2 en el NAcc durante la formación de la preferencia de pareja. En conjunto, estos datos demuestran una nueva función de los sistemas de CRF que actúan en el NAcc en el comportamiento social.

Nuestros datos que muestran que el CRF en el NAcc facilita la preferencia de pareja respaldan nuestra hipótesis inicial de que los sistemas de CRF del núcleo accumbens participan en la formación de vínculos de pareja en los topillos de las praderas. Además, habíamos planteado la hipótesis de que los receptores CRF 2 , en particular, eran cruciales dada la abundancia de receptores CRF 2 en las dos especies de topillos monógamas, pero no en las dos especies de topillos no monógamas ( Lim et al., 2005 ). Los resultados del experimento con topillos de pradera respaldan esta hipótesis, ya que la infusión de CRF no tiene efecto sobre la preferencia de pareja en una especie que carece prácticamente de receptores CRF 2 en el NAcc. Además, encontramos que la coadministración de un antagonista selectivo de CRF 2 bloquea la preferencia de pareja en los topillos de las praderas. Estos datos revelan un papel potencialmente crítico de los receptores CRF 2 en la formación de vínculos de pareja.

Sin embargo, también encontramos que la coadministración de un antagonista selectivo de CRF1 bloqueó la preferencia de pareja en los topillos de la pradera. Este resultado fue más sorprendente, dado que los receptores CRF1 se expresan en el NAcc tanto en especies no monógamas como monógamas. En conjunto, estos datos subrayan la importancia de ambos subtipos de receptores para la expresión de la preferencia de pareja e indican la posibilidad de que la especificidad del receptor sea un tema complejo que podría beneficiarse de una mayor exploración. Es posible que exista una interacción dinámica entre los dos subtipos de receptores en el NAcc durante el comportamiento de formación de parejas, y podría ser interesante explorar más a fondo los fenotipos celulares de las neuronas que expresan CRF1 y CRF2 , o incluso determinar si los receptores CRF1 y CRF2 podrían incluso colocalizarse en las mismas neuronas. También es posible que otros agentes, como la proteína de unión a CRF, que puede actuar como reservorio de CRF endógeno, estén involucrados ( Jahn, Eckart, Brauns, Tezval y Spiess, 2002 ).

Las dosis efectivas de CRF para inyecciones específicas en el NAcc que facilitaron la preferencia de pareja no tuvieron un efecto significativo del tratamiento farmacológico en la actividad locomotora, que comúnmente se interpreta como un comportamiento similar a la ansiedad. DeVries y Carter (2002) encontraron dosis efectivas de CRF icv para la preferencia de pareja en 0.1 y 1.0 ng (210 nM y 2.1 μM, respectivamente), y no detectaron diferencias en la actividad locomotora entre los grupos de tratamiento ( DeVries et al., 2002 ). Sus dosis fueron de 1000 a 10 000 veces mayores y al menos dos a veinte veces más altas en concentración que las dosis que usamos específicamente en el NAcc (10 nM y 100 nM). En nuestro estudio, aunque no detectamos diferencias significativas en la actividad locomotora entre los grupos de tratamiento, hubo, sin embargo, una ligera tendencia hacia menos cruces de jaula en los animales que recibieron CRF solo en el NAcc. Si bien es posible que el CRF ejerza efectos sutiles sobre el comportamiento similar a la ansiedad y, por lo tanto, sobre la locomoción, lo que a su vez podría afectar la formación de preferencias de pareja, creemos que la explicación más plausible es que la disminución de los cruces de jaula en el grupo tratado solo con CRF es un subproducto de una mayor preferencia de pareja, es decir, un mayor tiempo de permanencia dentro de la jaula de la pareja. Esto respalda la hipótesis de que el CRF podría tener una función novedosa e independiente en la regulación del comportamiento social, posiblemente independiente de los efectos del eje HPA sobre la ansiedad.

También mostramos evidencia de fotomicrografía de inmunorreactividad de CRF en NAcc en la misma región que los receptores CRF 2 en topillos de pradera monógamos. Esto sugiere que CRF podría ser uno de los ligandos endógenos que actúa sobre los receptores CRF 1 y CRF 2 en NAcc. Aunque se ha demostrado que CRF se une preferentemente a CRF 1 , también se une a CRF 2 con afinidad sustancial ( Primus et al., 1997 ). No se observaron fibras inmunorreactivas a Ucn-1 en NAcc, pero se observaron en otras regiones del cerebro como el núcleo de Edinger-Westphal ( Lim et al., 2006 ). No pudimos mapear fibras de Urocortina-2 o Urocortina-3 en el cerebro del topillo debido a la falta de inmunotinción específica; Sin embargo, sería interesante determinar si estos ligandos potenciales, que también se unen a los receptores CRF 2 con alta afinidad, también están presentes en el NAcc junto con los receptores CRF 2.

El prosencéfalo ventral, y en particular el NAcc, ha sido identificado repetidamente como la región cerebral crítica para la formación de vínculos de pareja en los topillos de la pradera. Dado el papel del NAcc en la vía de recompensa dopaminérgica mesolímbica, se ha hipotetizado que los mecanismos naturales de recompensa y refuerzo subyacen a la formación de vínculos de pareja, de modo que la pareja se asocia selectivamente con la recompensa ( Aragona et al., 2003a ; Lim, Murphy y Young, 2004a ). Hemos demostrado previamente mediante manipulaciones farmacológicas y genéticas que los receptores V1a de vasopresina del prosencéfalo ventral son necesarios para la formación de vínculos de pareja en machos, incluso cuando se sobreexpresan en especies de topillos no monógamas ( Lim et al., 2004b ; Lim y Young, 2004 ). Los receptores de oxitocina en el NAcc son necesarios para la preferencia de pareja en las hembras de topillos de la pradera ( Young, Lim, Gingrich e Insel, 2001 ). También se ha demostrado que los receptores de dopamina D1 y D2 del núcleo accumbens modulan la formación y el mantenimiento de la preferencia de pareja tanto en machos como en hembras, y de hecho la dopamina interactúa con la oxitocina durante este proceso conductual ( Aragona et al., 2003a ; Aragona et al., 2006 ; Aragona, Liu, Yu, Damron, Perlman y Wang, 2003b ; Liu y Wang, 2003 ). Por lo tanto, es probable que la activación del receptor CRF contribuya a un circuito más amplio que converge en el NAcc para producir este complejo comportamiento social. En consonancia con esta hipótesis, existe evidencia de que los receptores CRF en el NAcc pueden modular la liberación de dopamina en el estriado ( Lu, Liu, Huang y Zhang, 2003 ), y evidencia preliminar reciente sugiere que la activación del receptor CRF del NAcc puede estimular la presión de la palanca para obtener refuerzo natural ( Berridge, Pecine y Schulkin, 2004 ). Otro estudio ha demostrado que los receptores CRF 2 en el área tegmental ventral, que envía proyecciones dopaminérgicas al NAcc, pueden inducir potenciación a largo plazo, un correlato fisiológico del aprendizaje conductual y la asociación de recompensa ( Ungless, Singh, Crowder, Yaka, Ron y Bonci, 2003 ). Dado que se postula que la preferencia de pareja es una forma de aprendizaje de recompensa natural, los receptores CRF en el NAcc podrían desempeñar un papel similar en la potenciación sináptica subyacente durante la formación de vínculos de pareja en los topillos de la pradera.

La formación de vínculos de pareja en la naturaleza es un proceso cognitivo complejo que requiere la integración de numerosos estímulos externos y estados internos. Esta formación resulta de la síntesis de varios procesos conductuales, como el reconocimiento social, la aproximación y la motivación social, e implica aprendizaje y memoria. La oxitocina y la vasopresina participan de forma integral en el procesamiento neuronal de los estímulos sociales y en la formación de recuerdos sociales ( Bielsky, Hu, Szegda, Westphal y Young, 2004 ; Ferguson, Young, Hearn, Matzuk, Insel y Winslow, 2000 ). La dopamina podría estar implicada en el estado motivacional elevado que impulsa la interacción social con la pareja y en el refuerzo necesario para establecer una preferencia por dicha pareja. El CRF podría proporcionar un mecanismo mediante el cual el estado de estrés interno modula la preferencia por la pareja. La señalización del CRF también podría permitir los cambios a largo plazo en la plasticidad neuronal durante la formación de vínculos de pareja. Cada sistema de neurotransmisores desempeña un papel diferente pero crucial en el complejo comportamiento de la formación de vínculos de pareja, y el bloqueo de cualquiera de ellos interrumpiría dicha formación.

El papel del CRF en la regulación del comportamiento social ha sido mínimamente estudiado, a pesar de la abundancia de estudios que relacionan el CRF con comportamientos de estrés y ansiedad. Existe una fuerte evidencia de que la activación del receptor CRF 2 funciona para disminuir la ansiedad y comportamientos similares a la depresión en ratones ( Bale, Contarino, Smith, Chan, Gold, Sawchenko, Koob, Vale y Lee, 2000 ; Bale y Vale, 2003 ). El comportamiento social, el estrés y la ansiedad están fuertemente interrelacionados, especialmente en comportamientos que implican apoyo social o afrontamiento del aislamiento social. Los topillos de las praderas que han formado vínculos de pareja muestran niveles elevados de corticosterona plasmática durante la separación social de la pareja, y la reunión con la pareja hace que estos niveles vuelvan a la línea de base ( Carter, DeVries, Taymans, Roberts, Williams y Getz, 1997 ). Los topillos de las praderas machos sometidos a natación forzada, un factor de estrés psicológico, muestran una facilitación de la formación de vínculos de pareja después de una cohabitación abreviada con la pareja ( DeVries et al., 1996 ). Finalmente, los machos emparejados que se separan de sus parejas muestran estrategias de afrontamiento más pasivas en la prueba de natación forzada que sus contrapartes separadas de sus hermanos, y tales cambios de comportamiento van acompañados de un aumento en el ARNm de CRF en el NAcc ( Bosch, Nair, Neumann y Young, 2005 ).

Estos datos sugieren que los comportamientos sociales y de estrés tienen una relación recíproca y, además, las mismas moléculas implicadas en el estrés y la ansiedad también juegan un papel importante en el comportamiento social. De hecho, hay evidencia de que los neuropéptidos “sociales” vasopresina y oxitocina pueden modular el comportamiento de estrés y ansiedad ( Bielsky et al., 2004 ; Landgraf, Gerstberger, Montkowski, Probst, Wotjak, Holsboer y Engelmann, 1995 ; Liebsch, Wotjak, Landgraf y Engelmann, 1996 ; Mantella, Vollmer, Li y Amico, 2003 ; Ring, Malberg, Potestio, Ping, Boikess, Luo, Schechter, Rizzo, Rahman y Rosenzweig-Lipson, 2006 ; Windle, Shanks, Lightman e Ingram, 1997 ). De este modo, las mismas moléculas que modulan el estado de estrés interno pueden contribuir a la regulación de comportamientos sociales como la formación de vínculos de pareja, y las moléculas y los circuitos que evolucionaron para un comportamiento pueden, de hecho, controlar dinámicamente el otro.

AGRADECIMIENTOS

En la Universidad de Emory, nos gustaría agradecer al Dr. Michael J. Owens por brindarnos amablemente el compuesto CP-154,526. También nos gustaría agradecer a Lorra Miller y Meera Modi por su asistencia con el experimento de pradera de pradera. Por último, nos gustaría agradecer a los Dres. A. Courtney DeVries en la Universidad Estatal de Ohio y C. Sue Carter en la Universidad de Illinois, Chicago por su trabajo pionero sobre la CRF en praderas y la correspondencia del Dr. DeVries sobre los experimentos farmacológicos.

Apoyo de becas: esta investigación fue apoyada por NIH otorga MH65050 a MML, AA13738 a AER, MH58616 a ZXW, MH64692 a LJY y NSF STC IBN-9876754 y el Yerkes Center Grant RR00165.

Notas a pie de página

Aviso legal del editor: Este es un archivo PDF de un manuscrito sin editar que ha sido aceptado para su publicación. Como servicio a nuestros lectores, proporcionamos esta versión preliminar del manuscrito. El manuscrito se someterá a corrección de estilo, maquetación y revisión de pruebas antes de su publicación en su versión final citable. Tenga en cuenta que durante el proceso de producción pueden detectarse errores que podrían afectar al contenido, y se aplican todas las exenciones de responsabilidad legales de la revista.

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