Nat Neurosci. Manuscrito del autor; disponible en PMC enero 1, 2014.
Publicado en forma final editada como:
Nat Neurosci. Jul 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Publicado en línea el 2 de junio de 2013. doi: 10.1038/nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Wang,*,1,2,3 Florian Duclot,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Wang,2,3 y Mohamed Kabbaj1,2
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Resumen
En el topillo de la pradera ( Microtus ochrogaster ), una especie socialmente monógama, el apareamiento induce vínculos de pareja duraderos, iniciados por la formación de preferencias de pareja y regulados por diversos neurotransmisores, como la oxitocina, la vasopresina y la dopamina. En este estudio, examinamos los posibles mecanismos epigenéticos que median la regulación de estos vínculos. Demostramos que los inhibidores de la histona deacetilasa, butirato de sodio y TrichoStatin A (TSA), facilitan la formación de preferencias de pareja en las hembras de topillo de la pradera en ausencia de apareamiento. Esto se asoció con una regulación positiva específica de los receptores V1a de oxitocina (OTR) y vasopresina (V1aR) en el núcleo accumbens, mediante un aumento de la acetilación de histonas en sus respectivos promotores. Además, la preferencia de pareja facilitada por TSA se previno mediante el bloqueo de OTR o V1aR en el núcleo accumbens. Es importante destacar que la preferencia de pareja inducida por el apareamiento desencadenó la misma regulación epigenética de los promotores de los genes OTR y V1aR que la TSA. Estas observaciones indican, por lo tanto, que la TSA y el apareamiento facilitan la preferencia de pareja a través de eventos epigenéticos, proporcionando la primera evidencia directa de una regulación epigenética de la formación de vínculos de pareja.
Introducción
La afiliación social es una característica esencial de los comportamientos sociales humanos y los déficits cognitivos sociales son características comunes en multitud de trastornos neuropsiquiátricos, incluidos la esquizofrenia y los trastornos del espectro autista, así como la adicción y la depresión 1 . Los topillos de la pradera socialmente monógamos ( Microtus ochrogaster ) han surgido como un modelo muy interesante para la investigación de las bases neurobiológicas del apego social, ya que tanto los individuos de laboratorio como los que viven en libertad establecen vínculos de pareja a largo plazo 2 – 4 , que se inician primero con la formación de comportamientos de afiliación selectiva hacia la pareja, llamada preferencia de pareja 5 . Esta formación de preferencia de pareja involucra una variedad de neurotransmisores y sistemas hormonales, incluidos los neuropéptidos oxitocina y vasopresina (AVP) y la dopamina mesolímbica 5.
En general, la formación de preferencias de pareja está mediada por la neurotransmisión de AVP en el pálido ventral y el septo lateral (LS) en los machos, y la neurotransmisión de oxitocina en el núcleo accumbens (NAcc) y la corteza prelimbica en las hembras de topillo de la pradera 6 – 8.
La dopamina, que suele estar implicada en recompensas naturales como el apareamiento, también actúa como un mediador crítico de la preferencia de pareja en los topillos de la pradera. La activación de los receptores de dopamina de tipo D2 (D2R) en el NAcc facilita, mientras que la activación de los receptores de dopamina de tipo D1 (D1R) inhibe, la formación de la preferencia de pareja tanto en topillos de la pradera machos como hembras 9 – 11.
Es importante destacar que las variaciones en la expresión génica de los receptores V1a de oxitocina y AVP, OTR y V1aR respectivamente, pueden afectar drásticamente la preferencia de pareja. En las hembras de topillo de la pradera, por ejemplo, la sobreexpresión de OTR en el NAcc facilita la preferencia de pareja en ausencia de apareamiento 12 – 14.
Más allá de la regulación del vínculo de pareja, la oxitocina y la AVP también están implicadas en una amplia gama de comportamientos sociales, incluyendo el reconocimiento social, la agresión y el cuidado materno 15 , 16 . Cabe destacar que las alteraciones de este último comportamiento en roedores inducen neuroadaptaciones de larga duración a través de mecanismos epigenéticos, incluyendo la metilación del ADN del receptor de estrógeno alfa 17 y los genes de AVP 18 , así como la acetilación de histonas del promotor del receptor de glucocorticoides 19 . Además, los inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC), que mejoran la expresión génica a través de una mayor acetilación de histonas en el cerebro de roedores 20 , pueden revertir estas alteraciones 19 , e influir directamente en comportamientos sociales como la receptividad sexual 21 . Es importante señalar que, en una línea celular de cáncer de pulmón, el inhibidor de HDAC tricostatina A (TSA) mejora directamente la transcripción de OTR al promover localmente la acetilación de histonas 22.
Por lo tanto, se puede sugerir una base epigenética en la formación de la preferencia de pareja en las praderas. Para probar esta hipótesis, primero evaluamos los efectos de dos inhibidores de HDAC, butirato de sodio (NaB) y TSA, en la formación de preferencias de pareja en parejas de adultos de la pradera. A partir de entonces, investigamos los mecanismos moleculares que median los efectos de la TSA para inducir la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas. Finalmente, se buscó determinar si las alteraciones epigenéticas inducidas por la TSA durante la cohabitación también fueron provocadas por el apareamiento.
Resultados
El tratamiento con TSA facilita la preferencia de la pareja
Se inyectó intracerebroventricularmente ( icv .) a hembras de topillo de la pradera sexualmente ingenuas con LCR o LCR que contenía 0.08, 0.4 o 4 ng de TSA inmediatamente antes de la cohabitación de 6 horas con un macho sin apareamiento, y luego se evaluó su preferencia de pareja. Seis horas de cohabitación con un macho sin apareamiento no inducen la formación de preferencia de pareja en las hembras de topillo de la pradera 4 y, por lo tanto, este paradigma conductual se ha utilizado ampliamente para evaluar los efectos de varios fármacos en la facilitación de la formación de preferencia de pareja 5.
Los animales tratados con CSF mostraron un contacto lado a lado no selectivo con la pareja o el extraño después de 6 horas de convivencia sin apareamiento (t15= 0.76, P = 0.46; Fig. 1a). Sin embargo, los animales tratados con TSA en todas las dosis probadas pasaron preferentemente más tiempo con el compañero que con el extraño (t8= 4.35, P = 0.002 para el TSA 0.08 ngrupo g; t15= 3.63, P = 0.002 para el TSA 0.4 ngrupo g; y t8= 2.58, P = 0.03 para el TSA 4 ngrupo g). Es importante destacar que no se encontraron diferencias de grupo en la actividad locomotora (F3,46 = 1.25, P= 0.30, Fig. 1b) y no se observó un comportamiento agresivo por parte de la prueba femenina hacia el extraño o la pareja, lo que demuestra que los efectos de la TSA eran específicos de una preferencia social, en lugar de ser secundarios a una alteración de la locomoción o aversión social hacia el extraño.
Para investigar si el TSA aumenta la acetilación de histonas en estructuras cerebrales implicadas en la formación de la preferencia de pareja, se inyectó a un grupo separado de hembras con la dosis media de TSA (0.4 ng ) y se las mantuvo con un macho en ausencia de apareamiento durante 30 min, 2 o 9 horas. Cabe destacar que no se detectó ninguna variación significativa en los niveles globales de acetilación de la histona H3 (Lys14) en ningún momento, tanto en el NAcc como en el putamen caudado ( P > 0.05 para todos los grupos, Fig. 1c y d ). Esto demuestra que el TSA facilita la formación de la preferencia de pareja en ausencia de apareamiento, a pesar de no afectar la acetilación global de la histona H3 en el NAcc o el putamen caudado.
Es importante destacar que el butirato de sodio también facilitó la preferencia de pareja en las hembras de topillo de la pradera después de la cohabitación con un macho durante 6 horas sin aparearse, asociado con un aumento en la acetilación global de la histona H3 (Lys14) en el NAcc ( Figura suplementaria 1 ). Los efectos del TSA en la formación de la preferencia de pareja pudieron reproducirse con otro inhibidor de HDAC, lo que sugiere la participación de la inhibición de HDAC, en lugar de un efecto no específico del TSA en la facilitación de la preferencia de pareja. Considerando que el TSA es un inhibidor de HDAC de clase I/II más específico y afín 23 , 24 , y que los efectos conductuales del TSA fueron más pronunciados que los del NaB, elegimos usar TSA en lugar de NaB para investigar las correlaciones moleculares específicas en las siguientes partes del estudio.
Correlaciones moleculares de la preferencia de pareja facilitada por TSA
Como las variaciones en los niveles de expresión genética en el NAcc del topillo se han asociado con diferentes estrategias de apareamiento entre topillos monógamos y no monógamos, y con la alteración de la formación de preferencias de pareja en los topillos de la pradera en particular 12 , 13 , 25 , 26 , evaluamos si la formación de preferencias de pareja facilitada por TSA estaba asociada con variaciones en la expresión genética en el NAcc.
Tratamiento TSA (0.4 ng, icv.) indujo un aumento en los niveles de ARNm de OTR en el NAcc después de 2 horas de cohabitación en comparación con los controles tratados con CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, Fig. 2a), que tendió a mantenerse después de 9 horas de convivencia (t9 = 2.17, P = 0.058, Fig. 2b). Aunque se pudo observar un ligero pero no significativo aumento en el ARNm de V1aR en las horas de NAcc 2 después de la inyección de TSA, no se detectaron otras diferencias grupales en ninguno de los otros ARNm medidos, incluidos D1R o D2R (P > 0.05, Fig. 2a, b). Es importante destacar que no se observaron diferencias grupales en el putamen caudado en ningún punto temporal y para cualquier ARNm medido (P > 0.05 para todos los grupos, Fig. 2c, d), lo que sugiere que el aumento en el ARNm de OTR observado en animales tratados con TSA fue específico para el NAcc. Además, dicha regulación ascendente solo estuvo presente después de la cohabitación con un hombre, ya que los niveles de ARNm de OTR y V1aR en el NAcc permanecieron sin cambios 2 horas después de la inyección de TSA sin cohabitación (OTR: 100.0% ± 11.70 para el grupo CSF, 86.7% ± 12.11 para TSA grupo, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 para el grupo CSF, 92.3% ± 13.75 para el grupo TSA, t9 = 0.27, P = 0.791).
En línea con los niveles más altos de ARNm de OTR, los animales tratados con TSA también mostraron niveles más altos de proteína OTR en ambos puntos de tiempo en la NAcc (horas 2: t10 = 2.34, P = 0.041; Horas 9: t10 = 3.16, P = 0.01, Fig. 2e, f), pero no caudado putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, Fig. 2g, h). Curiosamente, si bien no se pudo detectar una alteración significativa de los niveles de ARNm de V1aR en el NAcc en 2 o 9 horas después de la inyección de TSA (Fig. 2a, b), los niveles de proteína V1aR aumentaron significativamente a las 9 horas, en comparación con los animales tratados con CSF, en el NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Fig. 2f) pero no caudado putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, Fig. 2h). Aunque con algunas variaciones, los niveles de proteína D1R y D2R en el NAcc y el putamen caudado no se vieron afectados significativamente por la administración de TSA (P > 0.05, Fig. 2e-h).
TSA facilita la acetilación de histonas de oxtr y avpr1a
El aumento tanto en los niveles de ARNm como de proteína para OTR después de la cohabitación después del tratamiento con TSA sugirió que TSA probablemente aumentó la transcripción de oxtr , el gen que codifica para OTR, en lugar de alterar la traducción o el recambio de la proteína. Además, los niveles de proteína V1aR fueron más altos en el NAcc, asociados con un ligero pero no significativo aumento en los niveles de ARNm después del tratamiento con TSA ( Fig. 2 ). Considerando que TSA es un potente inhibidor de HDAC de clase I y II 23 , 24 , 27 , planteamos la hipótesis de que TSA aumentó la acetilación de histonas en los promotores de oxtr y avpr1a en el NAcc, luego mejorando su transcripción. Un nuevo lote de animales recibió una inyección icv . de TSA (0.4 n g) e inmediatamente cohabitó con un macho sin aparearse durante 30 minutos antes de ser sacrificado. Se eligió el intervalo de tiempo de 30 minutos basándose en trabajos previos que informaban de un aumento máximo de la acetilación de histonas después de la inyección local de TSA en ratas y ratones 28 , 29. Posteriormente, se analizó la acetilación de H3K14 en los promotores de oxtr y avpr1a mediante inmunoprecipitación de cromatina.
En línea con el aumento en los niveles de ARNm y proteína de OTR observados previamente, los animales tratados con TSA mostraron un aumento muy alto (+ 460%) en la acetilación de histona H3 en el oxtr promotor génico, en comparación con los controles tratados con CSF, en el NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), pero no caudado putamen (t9= 0.31, P = 0.76, Fig. 3a). Por otra parte, la histona H3 acetilación en el avpr1a el promotor estaba significativamente elevado 30 min después de la administración de TSA (+ 196%) en el NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01) pero no caudado putamen (t9= 0.38, P = 0.71), en comparación con los controles tratados con CSF (Fig. 3b). Por lo tanto, TSA aumentó el sitio de acetilación de histonas específicamente en el NAcc tan pronto como 30 minutos después del inicio de la cohabitación con un hombre.
TSA facilita la preferencia de los socios a través de OTR y V1aR
A partir del conjunto de experimentos anterior, emerge un modelo molecular de acción, donde durante la cohabitación, TSA potencia la acetilación de histonas en los promotores oxtr y avpr1a , lo que posteriormente mejora su transcripción y resulta en niveles más altos de proteína OTR y V1aR hasta 9 horas después del inicio del período de cohabitación. Es importante destacar que este efecto de TSA es específico del sitio, ya que el núcleo caudado-putamen permanece inalterado. Aquí probamos si este aumento de OTR y V1aR inducido por TSA está relacionado con la facilitación de la formación de preferencia de pareja. Las hembras de topillo de la pradera recibieron una inyección intra-NAcc de TSA (0.04 n g por lado) con o sin inyección previa (30 minutos antes de la inyección de TSA, 0.5 n g por lado) de CSF o CSF que contenía uno de dos antagonistas de OTR diferentes, OTA(B) y OTA(T), o un antagonista de V1aR (V1aRA). Inmediatamente después de la inyección de TSA, las hembras convivieron con un macho durante 6 horas sin aparearse, seguidas de una prueba de preferencia de pareja.
Los animales tratados con LCR no mostraron preferencia de pareja ( t 5 = 0.17, P = 0.87, Fig. 4a ). Sin embargo, los animales tratados con TSA pasaron significativamente más tiempo en contacto lado a lado con la "pareja" que con el "extraño", lo que sugiere que una sola inyección de TSA directamente en el NAcc es suficiente para facilitar la formación de la preferencia de pareja sin apareamiento ( t 5 = 7.04, P = 0.0009). Curiosamente, el bloqueo de OTR o V1aR mediante el pretratamiento con OTA(B), OTA(T) o V1aRA impidió los efectos de TSA ( P > 0.05 para todos los grupos). Como no se encontraron diferencias entre grupos en la actividad locomotora ( F 4,32 = 1.89, P = 0.14, Fig. 4b ), estos datos sugieren que TSA en el NAcc facilita la formación de la preferencia de pareja a través de mecanismos mediados por OTR y V1aR de una manera específica del comportamiento.
El apareamiento induce neuroadaptaciones similares a TSA
Siguiendo nuestras observaciones previas, establecimos que la potenciación epigenética de la neurotransmisión de oxitocina y vasopresina en el NAcc de las hembras era suficiente para facilitar la formación de la preferencia de pareja en ausencia de apareamiento. Para investigar si estas neuroadaptaciones también ocurren durante la formación natural de la preferencia de pareja, se convivió a topillos de la pradera hembra con un macho durante 24 horas en presencia de apareamiento, que induce la preferencia de pareja⁴ , y se sacrificaron. Observamos un aumento en los niveles de ARNm y proteína de OTR y V1aR en el NAcc, en comparación con las hembras sexualmente vírgenes (OTR: +38%, t 10 = 2.68, P = 0.02 para el ARNm, y +58%, t 8 = 3.05, P = 0.01 para la proteína; V1aR: +89%, t 14 =2.53, P = 0.02 para el ARNm, y +26%, t 20 = 2.23, P = 0.037 para la proteína, Fig. 5a,b ).
Como los niveles de ARNm y proteína para OTR y V1aR aumentaron por la cohabitación con el apareamiento, a continuación investigamos si esta regulación al alza se asoció con un aumento epigenético de oxtr y avpr1a Transcripción de genes. De este modo, se cohabitó un nuevo lote de hembras con un macho durante 6 horas con el apareamiento y la acetilación H3K14 en el oxtr y avpr1a Promotores medidos por inmunoprecipitación de cromatina. En línea con los niveles de ARNm y proteína OTR y V1aR, los ratones de las praderas femeninas exhiben una mayor acetilación de H3K14 en el oxtr y avpr1a promotores en la NAcc, en comparación con las mujeres sexualmente ingenuas (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Fig. 5c, d). Estos datos sugieren que los paradigmas de cohabitación que inducen de manera confiable la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas desencadenan una regulación al alza de la expresión de OTR y V1aR en el NAcc a través de mecanismos epigenéticos, como se observa después del tratamiento con TSA.
Discusión
En el presente estudio, informamos por primera vez sobre una regulación epigenética de la formación de la preferencia de pareja. Primero, demostramos que el aumento de la acetilación de histonas en el NAcc mediante la administración de un inhibidor de HDAC facilita la formación de la preferencia de pareja en topillos de pradera hembra adultas en ausencia de apareamiento. Luego , revelamos evidencia directa de que la formación de la preferencia de pareja en las hembras está impulsada epigenéticamente, ya que la cohabitación y el apareamiento con un macho aumentaron la expresión de los genes oxtr y avpr1a a través de una mayor acetilación de histonas en el NAcc . La administración de TSA en el NAcc indujo la preferencia de pareja y condujo a niveles más altos de ARNm y proteínas de OTR en el NAcc. Además, aunque la acetilación global de la histona H3 no se vio afectada en las hembras tratadas con TSA, se observó un marcado enriquecimiento de la acetilación de histonas en el promotor de oxtr en el NAcc tan pronto como 30 minutos después de la administración de TSA. Finalmente, el bloqueo de OTR en el NAcc fue suficiente para prevenir la preferencia de pareja facilitada por TSA . Dado que se detectaron modificaciones epigenéticas similares tras la cohabitación con apareamiento, bajo procedimientos conocidos por inducir preferencia de pareja, nuestros datos proponen un modelo de regulación epigenética del comportamiento social. Durante la cohabitación con un macho, el TSA o el apareamiento induce rápidamente una acetilación específica de la histona H3 en el promotor oxtr en el NAcc que potencia su transcripción, lo que resulta en niveles más altos de ARNm y proteína OTR, que posteriormente facilitan la formación de la preferencia de pareja.
En las hembras de topillo de la pradera, 6 horas de cohabitación con un macho sin apareamiento no inducen la formación de preferencia de pareja 4 , y este paradigma conductual se ha utilizado para examinar los efectos de las manipulaciones farmacológicas en la inducción de la preferencia de pareja 5. En nuestro estudio, mientras que los controles tratados con solución salina o LCR no desarrollaron preferencia de pareja, las hembras de topillo de la pradera tratadas con NaB o TSA sí lo hicieron. Como ni NaB ni TSA afectaron la locomoción general, sus efectos sobre la preferencia de pareja parecieron ser específicos del comportamiento en lugar de efectos secundarios sobre la locomoción. Este efecto específico de TSA fue confirmado además por nuestras observaciones moleculares. De hecho, aunque se administró icv ., pudimos detectar una alteración específica de la expresión génica en el NAcc pero no en una estructura adyacente, el caudado-putamen. Además, incluso dentro del NAcc, los niveles de ARNm y proteína de D1R y D2R permanecieron inalterados. Tal especificidad parece ser sorprendente para un inhibidor de HDAC amplio como TSA, que afecta tanto a las HDAC de clase I como a las de clase II. Sin embargo, se ha informado que la TSA afecta la expresión de solo un pequeño subconjunto de genes en el genoma de los mamíferos 30 – 32 , incluidos los ratones 20.
Aquí demostramos que la acetilación de la histona H3 en Lys14 en el promotor de oxtr , una modificación asociada con una transcripción génica mejorada, incluso durante la plasticidad cerebral 33 , 34 , subyace a niveles más altos de ARNm y proteína de OTR. En respuesta a TSA, la acetilación de la histona en el promotor de oxtr aumenta y facilita la activación de su transcripción en la línea celular humana 22 , lo que respalda nuestro hallazgo de que oxtr puede ser regulado epigenéticamente. Dado que un bloqueo local de OTR en el NAcc fue suficiente para prevenir los efectos conductuales de TSA, nuestros datos sugieren que la expresión de OTR inducida por TSA en el NAcc durante la cohabitación medió la facilitación de la formación de preferencia de pareja. Además, 24 horas de cohabitación con apareamiento, un procedimiento conocido por inducir de manera confiable la preferencia de pareja en topillos de pradera hembra, indujeron un aumento similar en la expresión de OTR en el NAcc de la hembra. Esto está completamente de acuerdo con la participación conocida de la oxitocina y su receptor en la neurobiología de la formación de preferencia de pareja en topillos hembra. El apareamiento induce un aumento en los niveles extracelulares de oxitocina en el NAcc 25 , y la infusión local de oxitocina en el NAcc facilita la formación de la preferencia de pareja en ausencia de apareamiento 8. Además, los antagonistas de OTR bloquean la formación de la preferencia de pareja inducida por la administración de oxitocina o el apareamiento 8 , 35. Es importante destacar que la sobreexpresión mediada por virus de OTR en el NAcc femenino es suficiente para facilitar la formación de la preferencia de pareja 12 , 13.
Además de reforzar el papel de OTR, nuestros resultados también proporcionan evidencia de una activación de la expresión del gen OTR a través de mecanismos epigenéticos durante la cohabitación con un macho en ausencia de apareamiento. De hecho, aunque insuficiente para inducir preferencia de pareja, dicha cohabitación sin apareamiento durante cortos períodos de tiempo activa los procesos neurobiológicos subyacentes a la formación de la preferencia de pareja . Por ejemplo, dos horas de exposición libre a un macho inducen elevaciones leves pero no significativas en la liberación de oxitocina en el NAcc de la hembra 25. Por lo tanto, se puede proponer que TSA o NaB potencian las neuroadaptaciones inducidas por la cohabitación con un macho, facilitando el desarrollo de la preferencia de pareja. Curiosamente, dicha potenciación ya se ha informado en roedores donde los inhibidores de HDAC de clase I y II, incluidos NaB y TSA, facilitan la consolidación de un evento de aprendizaje que no resulta en la formación de memoria a largo plazo en animales de control 36 , 37 . En apoyo de esta noción, períodos más largos de cohabitación ( p. ej ., 48 horas) pueden inducir preferencia de pareja incluso en ausencia de apareamiento⁴ . También es importante señalar que la cohabitación con apareamiento desencadenó en el NAcc femenino una regulación positiva de la expresión de OTR y V1aR a través de los mismos mecanismos epigenéticos que los observados después de la cohabitación con tratamiento con TSA, lo que demuestra que el TSA y el apareamiento afectan las mismas vías para promover la formación de la preferencia de pareja. Es importante destacar que el TSA no induce una regulación positiva de OTR y V1aR en el NAcc femenino en ausencia de cohabitación con un macho. En conjunto, esto apoya la hipótesis de que el TSA facilita la formación de la preferencia de pareja a través de la potenciación de neuroadaptaciones endógenas desencadenadas naturalmente por la cohabitación con un macho, en lugar de activar por sí mismo estas u otras neuroadaptaciones.
ONuestro estudio también destaca el papel crítico de NAcc V1aR en la formación de preferencias de la pareja femenina, ya que los animales tratados con TSA exhiben niveles más altos de V1aR, cuyo bloqueo impidió la formación de preferencias facilitada por la TSA. Además, estos efectos se asociaron con una mayor acetilación de histonas en el avpr1a promotor, a pesar de no haber una elevación significativa del ARNm de V1aR probablemente debido a un punto temporal no óptimo. Aunque no podemos descartar una regulación de la estabilidad de la proteína por TSA mediante la acetilación de proteínas no histonas38, este hallazgo sugiere que, similar a la oxtr promotor, TSA podría promover avpr1a Transcripción a través de la acetilación de histonas locales. Si bien se ha descrito la contribución de AVP en la unión de pareja masculina5, su papel en el comportamiento de la mujer sigue siendo controvertido. Por un lado, una icv. La inyección de AVP facilita la formación de preferencias del compañero tanto en el macho como en el femenino, lo que se evita mediante el bloqueo de V1aR o OTR39. Por otro lado, una icv. La inyección del antagonista V1aR bloquea la preferencia de la pareja inducida por el apareamiento en el macho, pero no en la hembra.40. Sin embargo, todos estos estudios utilizaron icv. inyecciones, evitando cualquier conocimiento adicional de las estructuras involucradas. Aquí, proporcionamos la primera evidencia de que la neurotransmisión AVP dentro de la NAcc puede estar involucrada en la formación de preferencias de pareja en los ratones de campo, mientras que la mayor parte de la literatura describe su participación en diferentes áreas como el pálido ventral, el tabique lateral, el núcleo del lecho del Stria terminalis, y amígdala en machos.5. Por lo tanto, resulta interesante observar que el bloqueo de OTR o V1aR en el NAcc de la hembra fue suficiente para prevenir la formación de preferencias de la pareja después del tratamiento con TSA, lo que sugiere que la formación de preferencias de la pareja requiere la activación de V1aR y OTR. Tsu hallazgo está en línea con, y apoya, una observación anterior en parejas de praderas masculinas de que un acceso simultáneo a OTR y V1aR en el LS es esencial para la preferencia de pareja inducida por AVP6. Además, la observación de un aumento específico en los niveles de OTR y V1aR en animales tratados con TSA respalda aún más el requisito de una activación simultánea de las neurotransmisiones de AVP y oxitocina para la unión de pares.
En combinación con la oxitocina y la AVP, la neurotransmisión dopaminérgica en el NAcc modula la formación de la preferencia de pareja en las hembras de topillo 9. Aunque el apareamiento induce la liberación de dopamina en el NAcc 9 , las variaciones en los niveles de receptores se observan solo después de un período prolongado (más de 24 h) de cohabitación con el apareamiento, lo cual es importante para el mantenimiento del vínculo de pareja 10. En consonancia con estas observaciones, las hembras de topillo de la pradera tratadas con TSA sí mostraron preferencia de pareja sin variación significativa en los receptores de dopamina D1R y D2R. Por lo tanto, esta ausencia de regulación de los receptores de dopamina proporciona otra prueba de la especificidad del TSA.
Nuestros datos informan por primera vez un componente epigenético en la neurobiología del vínculo de pareja, y sugieren que el TSA induce un “estado permisivo” en las hembras de topillo de la pradera, potenciando la respuesta molecular natural a la cohabitación y promoviendo la formación de interacciones sociales más fuertes que conducen a la preferencia de pareja . Por lo tanto, es tentador hipotetizar que una preferencia de pareja facilitada por el TSA podría fortalecerse aún más y conducir a un vínculo persistente. Aunque aún no se han identificado las HDAC específicas involucradas, sería interesante investigar más a fondo los efectos del TSA en otros comportamientos asociados con la estrategia de vida monógama en los topillos de la pradera, como la agresión selectiva y el cuidado biparental. Considerando la relevancia de los topillos de la pradera para modelar los mecanismos neurobiológicos del vínculo de pareja en humanos 5 , y los prometedores inhibidores de HDAC que ya se encuentran en ensayos clínicos 24 , 41 , 42 , nuestros datos abren el camino a nuevas posibilidades farmacológicas para influir en los comportamientos sociales.
Métodos
Materias
Se destetaron hembras de topillo de la pradera ( Microtus ochrogaster ) sin experiencia sexual, procedentes de una colonia de cría de laboratorio, a los 21 días de edad. Se alojaron en parejas del mismo sexo en jaulas de plástico (12 × 28 × 16 cm) con agua y alimento a libre disposición . Todas las jaulas se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 14:10 h y a una temperatura aproximada de 20 °C. Todos los animales se asignaron aleatoriamente a grupos experimentales al alcanzar los 70-90 días de edad. El número de animales utilizados se basó en estudios previos de campo realizados por nuestro grupo y otros, junto con un análisis de potencia. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Florida.
Drogas
El butirato de sodio (NaB), disuelto en solución salina, y la Tricostatina A (TSA), disuelto en el portador de líquido cefalorraquídeo artificial (CSF, BioFluids, Rockville, MD) se compraron a Sigma-Aldrich (St Louis, MO). NaB se inyectó por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 600 mg / kg, que se sabe que induce la acetilación de histonas en varias estructuras cerebrales en ratones43, 44. De manera similar, el rango de dosis utilizado para la TSA se basó en trabajos previos que determinaron su efectividad en la inducción de eventos de acetilación de histonas locales y variaciones en la expresión de genes en roedores.19, 20. El antagonista selectivo del receptor V1aR V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP, y el antagonista de OTR OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (yo)2, Thr4, Tyr-NH29] -OVT), se obtuvieron de Bachem (Torrance, CA). Un segundo antagonista de OTR más selectivo, OTA (T), dGly-NH2–d(CH2)5 [Tyr (Me)2, Thr4] OVT45, fue proporcionado amablemente por el Dr. Maurice Manning (Universidad de Toledo, OH). Estos antagonistas y dosis utilizadas se han elegido en base a estudios previos que demuestran su selectividad para V1aR u OTR, respectivamente35, 39, 46–49.
Canulación estereotáxica y microinyección.
Las hembras fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (1 mg/10 g de peso corporal), y se implantaron estereotáxicamente cánulas guía de acero inoxidable de calibre 26 (Plastics One, Roanoke, VA), dirigidas al ventrículo lateral (unilateralmente; barra nasal a -2.5 mm, 0.6 mm rostral, 1.0 mm lateral y 2.6 mm ventral al bregma) o específicamente al NAcc (bilateralmente; barra nasal a -2.5 mm, 1.7 mm rostral, ±1.0 mm bilateral y 4.5 mm ventral al bregma). Después de 3 días de recuperación, los sujetos recibieron microinyecciones de LCR o LCR que contenía diferentes concentraciones de TSA. Cuando se utilizaron antagonistas selectivos para OTR o V1aR, se inyectaron 30 minutos antes del TSA. Las inyecciones se realizaron con una aguja de calibre 33 que se extendía 1 mm por debajo de la cánula guía hacia el área objetivo, con un volumen de inyección de 500 nL en el ventrículo lateral ( ICV ) o 200 nL por lado en el núcleo accumbens (NAcc). La aguja se conectó a una jeringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) mediante un tubo de polietileno-20 y la presión del émbolo se realizó lentamente, requiriendo 1 minuto por inyección. Al final del experimento, todos los sujetos fueron sacrificados por decapitación rápida y se extrajeron los cerebros para verificar la colocación de las cánulas por un observador ciego a las condiciones experimentales. Los sujetos con cánulas mal colocadas fueron excluidos del análisis de datos.
Test de convivencia y preferencia de pareja.
Inmediatamente después de las inyecciones intraperitoneales (ip .), intracerebroventriculares (icv .) o intranucleares (NAcc.) de fármacos, las hembras convivieron con un macho durante 6 horas sin aparearse. La ausencia de apareamiento se verificó examinando el comportamiento grabado en vídeo. Para investigar las neuroadaptaciones desencadenadas por la convivencia con apareamiento, las hembras tratadas con estrógenos (2 µg al día, ip ., durante 3 días) convivieron con un macho durante 6 o 24 horas, y la presencia de apareamiento se verificó a posteriori en vídeo (entre 6 y 11 episodios durante las primeras 6 horas de convivencia).
La prueba de preferencia de pareja se realizó inmediatamente después de la cohabitación de 6 horas, como se describió previamente 11. En resumen, el aparato de prueba de tres cámaras consistía en una jaula neutral conectada a dos jaulas idénticas paralelas, cada una con un animal estímulo: un macho desconocido ("extraño") o un macho conocido ("pareja") utilizado durante el período de cohabitación. Las hembras podían moverse libremente por el aparato durante las 3 horas de prueba, y los machos estímulo estaban atados dentro de sus jaulas, sin permitir contacto directo entre ellos. Toda la sesión se grabó en vídeo y la duración del contacto lateral de la hembra con la pareja o el extraño fue cuantificada posteriormente por un experimentador capacitado que desconocía los grupos biológicos. Se definió la preferencia de pareja como el tiempo significativamente mayor que los sujetos pasaron en contacto físico con la pareja en comparación con el extraño, según lo determinado por una prueba t pareada de dos colas . Además, el aparato de tres cámaras estaba equipado con sensores de haz de luz, lo que permitió determinar la actividad locomotora indicada por el número de entradas de la hembra en las cámaras de estímulo. Esta puntuación locomotora nos permite controlar los posibles efectos secundarios de los fármacos en el comportamiento de las hembras, como la actividad general, la ansiedad o la exploración alterada de un entorno nuevo, como lo utilizan comúnmente nuestro grupo y otros 12.
Extracción de ARN y proteínas.
Las hembras se sacrificaron por decapitación rápida, y los cerebros se extrajeron inmediatamente y se congelaron en hielo seco. Se cortaron secciones coronales (200 µm) en un criostato y se montó la escarcha en portaobjetos de microscopio. Se tomaron punzones bilaterales de tejido con un diámetro de 1 mm de todo el NAcc y el putamen caudado, siendo este último un área de control, y se almacenaron a -80 ° C hasta el procesamiento. El ARN total y las proteínas se extrajeron utilizando el protocolo TRI-Reagent según las instrucciones del fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
Análisis de la expresión de proteínas por Western-blot.
Después de la separación en un gel 10% de poliacrilamida (15% para histonas), las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -actina (A2066, 1: XUMOXUM St Louis, MO), o anti-acetil histona H1000 (Lys3, # 14 – 06, 911: 1) y H1000 total (# 3 – 05, 928: 1, Millipore, Temecula, CA). Todos los anticuerpos están validados para su uso en humanos, ratas y ratones, con los cuales los ratones de campo comparten altos porcentajes de homología (desde 1000 hasta 81%). Después de la hibridación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP, las membranas se revelaron con ECL (ECL SuperSignal West Dura substrato, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) y se expusieron en una película Fuji XAR (Fuji Film, Tokio, Japón). La cuantificación se realizó con el software AIS 96 Image (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Canadá), y todas las señales se normalizaron dentro de la misma membrana que la actina, excepto la señal acetil-H6.0 que se normalizó a la señal total de histona H3. Los datos normalizados se expresan como porcentaje de animales tratados con CSF.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real semicuantitativa (RT-PCR)
Se procesaron 0.5 µg de ARN total para la síntesis de ADN complementario y, posteriormente, se analizaron según lo descrito previamente, <sup>50</sup> con normalización respecto al gen de la nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa (NADH). Todas las reacciones se realizaron por triplicado y su especificidad se verificó mediante análisis de curva de fusión y separación en gel de agarosa al 2 %. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron las siguientes: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3' (Fwd) y 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3' (Rev) para OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3' (For) y 5'-CCAGATGTGGTAGCAGATGAAGC-3' (Rev) para AVP1aR, 5'- TTAACAACAATGGGGCTGTG-3' (For) y 5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3' (Rev) para D1R, 5'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-3' (For) y 5'-CGGTGTGTTCATCATCTGCT-3' (Rev) para D2R, y 5'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-3' (For) y 5'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-3' (Rev) para NADH. Los datos normalizados se expresan como un porcentaje de los animales tratados con LCR.
Inmunoprecipitación de cromatina
La acetilación de la histona H3 (Lys14) en muestras de tejido del núcleo accumbens y del núcleo caudado-putamen se analizó utilizando el kit Magna ChIP protein G Tissue (Millipore, Temecula, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de la reticulación con formaldehído al 1%, la cromatina se cortó utilizando un Misonix XL-2000 en fragmentos de 200–600 pb. A continuación, se realizó la inmunoprecipitación de la histona H3 acetilada (Lys14) con 10 µg de anticuerpo anti-acetil-H3(Lys14) (Millipore) durante la noche a 4 °C. Después de los lavados, la elución de las perlas y la reversión de la reticulación, el ADN inmunoprecipitado se purificó y analizó por triplicado mediante RT-PCR en una plataforma iCycler (véase más arriba) con una curva estándar interna hecha a partir de muestras INPUT agrupadas. Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región de 236 pb de longitud ubicada 128 pb aguas arriba del primer exón que codifica para el OTR del topillo de la pradera ( oxtr , acceso de Genbank # AF079980 ), o una región de 192 pb de longitud ubicada 141 pb aguas arriba del primer exón que codifica para el V1aR del topillo de la pradera ( avpr1a , acceso de Genbank # AF069304 ). Las secuencias fueron las siguientes: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3' (Fwd) y 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) para oxtr , y 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3' (Fwd) y 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) para avpr1a . Cada muestra se normalizó con respecto al valor de ENTRADA correspondiente, y los datos se expresan como un porcentaje de los animales tratados con LCR.
Análisis estadísticos y procesamiento de datos.
Para los análisis de preferencia de pareja, se excluyeron los animales que mostraron comportamientos de apareamiento durante el período de cohabitación o con cánulas mal colocadas. Para todos los demás análisis moleculares, se excluyó un máximo de un punto de datos por grupo biológico cuando se identificó como valor atípico. La mayoría de los experimentos se replicaron, excepto cuando los resultados fueron muy claros. El tiempo que pasó en contacto lado a lado con cualquiera de los animales estímulo durante la prueba de preferencia de pareja se analizó con una prueba t pareada de dos colas . Las puntuaciones de locomoción se analizaron utilizando una prueba t de dos colas (para dos grupos) o un ANOVA unidireccional (para más de dos grupos), y cuando fue apropiado, se realizaron pruebas post-hoc PLSD de Fischer con un umbral de significancia de P < 0.05. Después de verificar la normalidad, todos los demás datos se analizaron con una prueba t de dos colas asumiendo varianzas iguales o desiguales probadas previamente. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software StatView (SAS Institute). Una vez estandarizados los datos con respecto a sus respectivos controles (% de los grupos de LCR, solución salina o apareamiento), los análisis estadísticos se realizaron sobre los datos brutos.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH) que otorga MHR21-083128 a MK y ZW, y MHR01-058616 a ZW También agradecemos al Dr. Maurice Manning por el generoso regalo del antagonista OTR (T).
Notas a pie de página
Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Contribuciones de autor
HW, FD y YL realizaron los experimentos. HW y FD analizaron los datos. HW, FD, ZW y MK diseñaron el estudio. FD, ZW y MK escribieron el artículo. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron sobre el manuscrito.
Referencias