Nat Neurosci. Manuscrito del autor; disponible en PMC enero 1, 2014.
Publicado en forma final editada como:
Nat Neurosci. Jul 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Publicado en línea Jun 2, 2013. doi 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Wang,*,1,2,3 Florian Duclot,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Wang,2,3 y Mohamed Kabbaj1,2
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Resumen
En la pradera socialmente monógama (Microtus ochrogaster), el apareamiento induce enlaces de par duraderos iniciados por la formación de preferencias de pareja y regulados por una variedad de neurotransmisores que incluyen oxitocina, vasopresina y dopamina. Aquí examinamos los posibles mecanismos epigenéticos que median la regulación del enlace de pares. Mostramos que los inhibidores de la histona desacetilasa, el butirato de sodio y la TrichoStatin A (TSA) facilitan la formación de preferencias de pareja en parejas de la pradera en ausencia de apareamiento. Esto se asoció con una regulación al alza específica de los receptores de oxitocina (OTR) y vasopresina V1a (V1aR) en el núcleo accumbens, a través de un aumento en la acetilación de histonas en su promotor respectivo. Además, la preferencia de pareja facilitada por TSA se evitó mediante el bloqueo de OTR o V1aR en el núcleo accumbens. Es importante destacar que la preferencia de pareja inducida por el apareamiento activó la misma regulación epigenética de los promotores de los genes OTR y V1aR que la TSA. Estas observaciones indican que TSA y el apareamiento facilitan la preferencia de pareja a través de eventos epigenéticos, proporcionando la primera evidencia directa de una regulación epigenética de la unión de pares.
Introducción
La afiliación social es una característica esencial de los comportamientos sociales humanos y los déficits cognitivos sociales son características comunes en una multitud de trastornos neuropsiquiátricos, incluidos la esquizofrenia y los trastornos del espectro autista, así como la adicción y la depresión.1. Las princesas socialmente monógamas (Microtus ochrogaster) han surgido como un modelo muy interesante para la investigación de las bases neurobiológicas del apego social, ya que tanto los individuos de laboratorio como los de vida libre establecen vínculos de pareja a largo plazo2–4, que se inician por primera vez mediante la formación de conductas de afiliación selectiva hacia el socio, llamadas preferencia de socio5. Esta formación de preferencia de pareja implica una variedad de neurotransmisores y sistemas hormonales, incluidos los neuropéptidos oxitocina y vasopresina (AVP) y la dopamina mesolímbica5.
IEn general, la formación de la preferencia de pareja está mediada a través de la neurotransmisión AVP en el pálido ventral y el tabique lateral (LS) en los machos, y la neurotransmisión por oxitocina en el núcleo accumbens (NAcc) y la corteza prelímbica en praderas femeninas6–8.
Habitualmente involucrado en la recompensa natural como el apareamiento, la dopamina también actúa como un mediador crítico de la preferencia de la pareja en las praderas. La activación de los receptores de tipo D2 de dopamina (D2R) en el NAcc facilita, mientras que la activación de los receptores de tipo D1 de dopamina (D1R) inhibe la formación de preferencias de pareja en parejas de praderas masculinas y femeninas9–11.
Es importante destacar que las variaciones en la expresión génica de los receptores de oxitocina y AVP V1a, OTR y V1aR, respectivamente, pueden afectar drásticamente las preferencias de los compañeros. En los ratones de campo, por ejemplo, la sobreexpresión de OTR en la NAcc facilita la preferencia de la pareja en ausencia de apareamiento12–14.
Más allá de la regulación de la unión de pares, la oxitocina y el AVP también están implicados en una amplia gama de comportamientos sociales, incluidos el reconocimiento social, la agresión y la atención materna.15, 16. En particular, las alteraciones de este último comportamiento en roedores inducen neuroadaptaciones de larga duración a través de mecanismos epigenéticos, incluida la metilación del ADN del receptor de estrógeno alfa17 y genes AVP18, así como la acetilación de histonas del promotor del receptor de glucocorticoides19. Además, los inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) mejoran la expresión génica a través de un aumento de la acetilación de histonas en el cerebro de roedores.20, puede revertir estas alteraciones.19, e influir directamente en los comportamientos sociales como la receptividad sexual.21. Es importante destacar que, en una línea celular de cáncer de pulmón, el inhibidor de la HDAC tricostatina A (TSA) mejora directamente la transcripción de OTR al promover localmente la acetilación de histonas22.
Por lo tanto, se puede sugerir una base epigenética en la formación de la preferencia de pareja en las praderas. Para probar esta hipótesis, primero evaluamos los efectos de dos inhibidores de HDAC, butirato de sodio (NaB) y TSA, en la formación de preferencias de pareja en parejas de adultos de la pradera. A partir de entonces, investigamos los mecanismos moleculares que median los efectos de la TSA para inducir la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas. Finalmente, se buscó determinar si las alteraciones epigenéticas inducidas por la TSA durante la cohabitación también fueron provocadas por el apareamiento.
Resultados
El tratamiento con TSA facilita la preferencia de la pareja
Los ratones de las praderas femeninas sexualmente ingenuos se inyectaron intracerebroventricularmente (icv.) con CSF o CSF que contiene 0.08, 0.4 o 4 ng de TSA inmediatamente antes de la cohabitación de 6-hora con un macho sin apareamiento, y luego se probó la preferencia de su pareja. Seis horas de cohabitación con un macho sin apareamiento no inducen la formación de preferencias de pareja en parejas de praderas femeninas4 y, por lo tanto, este paradigma de comportamiento se ha utilizado ampliamente para evaluar los efectos de varios fármacos para facilitar la formación de preferencias de la pareja.5.
Los animales tratados con CSF mostraron un contacto lado a lado no selectivo con la pareja o el extraño después de 6 horas de convivencia sin apareamiento (t15= 0.76, P = 0.46; Fig. 1a). Sin embargo, los animales tratados con TSA en todas las dosis probadas pasaron preferentemente más tiempo con el compañero que con el extraño (t8= 4.35, P = 0.002 para el TSA 0.08 ngrupo g; t15= 3.63, P = 0.002 para el TSA 0.4 ngrupo g; y t8= 2.58, P = 0.03 para el TSA 4 ngrupo g). Es importante destacar que no se encontraron diferencias de grupo en la actividad locomotora (F3,46 = 1.25, P= 0.30, Fig. 1b) y no se observó un comportamiento agresivo por parte de la prueba femenina hacia el extraño o la pareja, lo que demuestra que los efectos de la TSA eran específicos de una preferencia social, en lugar de ser secundarios a una alteración de la locomoción o aversión social hacia el extraño.
Para investigar si TSA mejora la acetilación de histonas en estructuras cerebrales involucradas en la formación de la preferencia de pareja, se inyectó un lote separado de hembras con la dosis media de TSA (0.4 ng) y convivieron con un macho en ausencia de apareamiento durante las horas mín. 30, 2 o 9. En particular, no se pudo detectar una variación significativa en los niveles de acetilación de la histona global H3 (Lys14) en ningún punto de tiempo, tanto en el putum NAcc como en el caudado (P > 0.05 para todos los grupos, Fig. 1c y d). Esto demuestra que la TSA facilita la formación de preferencias de pareja en ausencia de apareamiento, a pesar de no afectar la acetilación de la histona global H3 en el NAcc o el putamen caudado.
Es importante destacar que el butirato de sodio también facilitó la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas después de la cohabitación con un macho durante 6 horas sin apareamiento, asociado con un aumento en la acetilación de la histona H3 global (Lys14) en el NAcc (Figura suplementaria 1). Los efectos de la TSA en la formación de preferencias de la pareja podrían así reproducirse con otro inhibidor de la HDAC, lo que sugiere la participación de la inhibición de la HDAC, en lugar de un efecto no específico de la TSA en la facilitación de la preferencia de la pareja. Teniendo en cuenta que TSA es un inhibidor HDAC de clase I / II más específico y afín23, 24y, como los efectos conductuales de la TSA fueron más pronunciados que los de la NaB, optamos por utilizar la TSA sobre la NaB para investigar los correlatos moleculares específicos en las siguientes partes del estudio.
Correlaciones moleculares de la preferencia de pareja facilitada por TSA
Como las variaciones en los niveles de expresión génica en el vole, NAcc, se han asociado con diferentes estrategias de apareamiento entre los monos monógamos y no monógamos, y con la alteración de la formación de preferencias de pareja en los ratones de campo en particular.12, 13, 25, 26, evaluamos si la formación de preferencia de pareja facilitada por TSA se asoció con variaciones de la expresión génica en el NAcc.
Tratamiento TSA (0.4 ng, icv.) indujo un aumento en los niveles de ARNm de OTR en el NAcc después de 2 horas de cohabitación en comparación con los controles tratados con CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, Fig. 2a), que tendió a mantenerse después de 9 horas de convivencia (t9 = 2.17, P = 0.058, Fig. 2b). Aunque se pudo observar un ligero pero no significativo aumento en el ARNm de V1aR en las horas de NAcc 2 después de la inyección de TSA, no se detectaron otras diferencias grupales en ninguno de los otros ARNm medidos, incluidos D1R o D2R (P > 0.05, Fig. 2a, b). Es importante destacar que no se observaron diferencias grupales en el putamen caudado en ningún punto temporal y para cualquier ARNm medido (P > 0.05 para todos los grupos, Fig. 2c, d), lo que sugiere que el aumento en el ARNm de OTR observado en animales tratados con TSA fue específico para el NAcc. Además, dicha regulación ascendente solo estuvo presente después de la cohabitación con un hombre, ya que los niveles de ARNm de OTR y V1aR en el NAcc permanecieron sin cambios 2 horas después de la inyección de TSA sin cohabitación (OTR: 100.0% ± 11.70 para el grupo CSF, 86.7% ± 12.11 para TSA grupo, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 para el grupo CSF, 92.3% ± 13.75 para el grupo TSA, t9 = 0.27, P = 0.791).
En línea con los niveles más altos de ARNm de OTR, los animales tratados con TSA también mostraron niveles más altos de proteína OTR en ambos puntos de tiempo en la NAcc (horas 2: t10 = 2.34, P = 0.041; Horas 9: t10 = 3.16, P = 0.01, Fig. 2e, f), pero no caudado putamen (t10 = 0.41, P = 0.69, Fig. 2g, h). Curiosamente, si bien no se pudo detectar una alteración significativa de los niveles de ARNm de V1aR en el NAcc en 2 o 9 horas después de la inyección de TSA (Fig. 2a, b), los niveles de proteína V1aR aumentaron significativamente a las 9 horas, en comparación con los animales tratados con CSF, en el NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Fig. 2f) pero no caudado putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, Fig. 2h). Aunque con algunas variaciones, los niveles de proteína D1R y D2R en el NAcc y el putamen caudado no se vieron afectados significativamente por la administración de TSA (P > 0.05, Fig. 2e-h).
TSA facilita la acetilación de histonas de oxtr y avpr1a
El aumento tanto en el ARNm como en los niveles de proteína para la OTR después de la cohabitación después del tratamiento con TSA sugirió que la TSA probablemente incrementó la transcripción de oxtr, el gen que codifica para OTR, en lugar de alterar la traducción o recambio de la proteína. Además, los niveles de proteína V1aR fueron más altos en el NAcc, asociado con un ligero pero no significativo aumento en los niveles de ARNm después del tratamiento con TSA ( ). Teniendo en cuenta que TSA es un potente inhibidor de HDAC de clase I y II23, 24, 27, planteamos la hipótesis de que TSA aumentaba la acetilación de histonas en el oxtr y avpr1a Promotores en la NAcc, a partir de entonces mejorando su transcripción. Un nuevo lote de animales recibidos. icv. inyección de TSA (0.4) ng) e inmediatamente cohabitó con un macho sin apareamiento durante 30 minutos antes de ser sacrificado. La ventana de tiempo 30-min se eligió en base a un trabajo previo que informó un aumento máximo de la acetilación de histonas después de la inyección local de TSA en ratas y ratones28, 29. H3K14 acetilación en el oxtr y avpr1a Los promotores fueron luego analizados por inmunoprecipitación de cromatina.
En línea con el aumento en los niveles de ARNm y proteína de OTR observados previamente, los animales tratados con TSA mostraron un aumento muy alto (+ 460%) en la acetilación de histona H3 en el oxtr promotor génico, en comparación con los controles tratados con CSF, en el NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), pero no caudado putamen (t9= 0.31, P = 0.76, Fig. 3a). Por otra parte, la histona H3 acetilación en el avpr1a el promotor estaba significativamente elevado 30 min después de la administración de TSA (+ 196%) en el NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01) pero no caudado putamen (t9= 0.38, P = 0.71), en comparación con los controles tratados con CSF (Fig. 3b). Por lo tanto, TSA aumentó el sitio de acetilación de histonas específicamente en el NAcc tan pronto como 30 minutos después del inicio de la cohabitación con un hombre.
TSA facilita la preferencia de los socios a través de OTR y V1aR
Del conjunto anterior de experimentos, emerge un modelo molecular de acción, donde durante la cohabitación, la TSA potencia la acetilación de histonas en el oxtr y avpr1a los promotores, a partir de entonces mejoran su transcripción y dan como resultado mayores niveles de proteína OTR y V1aR hasta 9 horas después del comienzo del período de cohabitación. Es importante destacar que este efecto TSA es específico del sitio ya que el putamen caudado no se ve afectado. Aquí probamos si este aumento inducido por TSA en OTR y V1aR está relacionado con la facilitación de la formación de preferencias de pareja. Los ratones de campo femeninos recibieron una inyección intra-NAcc de TSA (0.04ng por lado) con o sin inyección previa (30minutes antes de la inyección TSA, 0.5ng por lado) de CSF o CSF que contiene uno de dos antagonistas de OTR diferentes, OTA (B) y OTA (T), o un antagonista de V1aR (V1aRA). Inmediatamente después de la inyección de TSA, las hembras cohabitaron con un macho durante 6 horas sin apareamiento, seguido de una prueba de preferencia de pareja.
Los animales tratados con LCR no mostraron una preferencia de pareja (t5 = 0.17, P = 0.87, Fig. 4a). Sin embargo, los animales tratados con TSA pasaron significativamente más tiempo en contactos lado a lado con el "compañero" que con el "extraño", lo que sugiere que una sola inyección de TSA directamente en el NAcc es suficiente para facilitar la formación de preferencias del compañero sin apareamiento (t5 = 7.04, P = 0.0009). Curiosamente, el bloqueo de OTR o V1aR mediante el tratamiento previo con OTA (B), OTA (T) o V1aRA previno los efectos de la TSA (P > 0.05 para todos los grupos). Como no se encontraron diferencias grupales en la actividad locomotora (F4,32 = 1.89, P = 0.14, Fig. 4b), estos datos sugieren que la TSA en el NAcc facilita la formación de preferencias de los socios a través de los mecanismos mediados por OTR y V1aR de una manera específica del comportamiento.
El apareamiento induce neuroadaptaciones similares a TSA
Siguiendo nuestras observaciones previas, establecimos que la potenciación epigenética de la neurotransmisión de la oxitocina y la vasopresina en la NAcc femenina era suficiente para facilitar la formación de preferencias de la pareja en ausencia de apareamiento. Para investigar si estas neuroadaptaciones también se producen durante la formación natural de la preferencia de pareja, las parejas de praderas femeninas cohabitaron con un hombre durante las horas 24 en presencia de apareamiento, lo que induce la preferencia de pareja4, y sacrificado. Observamos un aumento en los niveles de ARNm y proteína OTR y V1aR en el NAcc, en comparación con las mujeres sexualmente ingenuas (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 para ARNm, y + 58%, t8 = 3.05, P = 0.01 para proteína; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 para ARNm, y + 26%, t20 = 2.23, P = 0.037 para proteína, Fig. 5a, b).
Como los niveles de ARNm y proteína para OTR y V1aR aumentaron por la cohabitación con el apareamiento, a continuación investigamos si esta regulación al alza se asoció con un aumento epigenético de oxtr y avpr1a Transcripción de genes. De este modo, se cohabitó un nuevo lote de hembras con un macho durante 6 horas con el apareamiento y la acetilación H3K14 en el oxtr y avpr1a Promotores medidos por inmunoprecipitación de cromatina. En línea con los niveles de ARNm y proteína OTR y V1aR, los ratones de las praderas femeninas exhiben una mayor acetilación de H3K14 en el oxtr y avpr1a promotores en la NAcc, en comparación con las mujeres sexualmente ingenuas (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Fig. 5c, d). Estos datos sugieren que los paradigmas de cohabitación que inducen de manera confiable la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas desencadenan una regulación al alza de la expresión de OTR y V1aR en el NAcc a través de mecanismos epigenéticos, como se observa después del tratamiento con TSA.
Discusión
En el presente estudio, reportamos por primera vez una regulación epigenética de la formación de preferencias de pareja. Primero, demostramos que el aumento de la acetilación de histonas en el NAcc mediante la administración de un inhibidor de HDAC facilita la formación de preferencias de la pareja en parejas de adultos de la pradera en ausencia de apareamiento. TLuego, descubrimos evidencia directa de que la formación de preferencias de pareja en las hembras es impulsada epigenéticamente, a medida que aumenta la cohabitación y el apareamiento con un macho oxtr y avpr1a Expresión de genes a través de la acetilación de histonas mejorada en el NAcc. La administración de TSA en la NAcc indujo la preferencia de la pareja y condujo a niveles más altos de ARNm y proteínas OTR en la NAcc. Además, aunque la acetilación global de histonas H3 no se vio afectada en las hembras tratadas con TSA, un marcado enriquecimiento de la acetilación de histonas en el oxtr El promotor en el NAcc se observó tan pronto como 30 minutos después de la administración de TSA. Finalmente, el bloqueo de OTR en el NAcc fue suficiente para evitar la preferencia de los socios facilitada por la TSA. Dado que se detectaron modificaciones epigenéticas similares después de la cohabitación con el apareamiento, en procedimientos que se sabe que inducen la preferencia de pareja, nuestros datos presentan un modelo para una regulación epigenética del comportamiento social. DDurante la convivencia con un macho, TSA o apareamiento, se induce rápidamente una acetilación específica de histona H3 en el oxtr promotor en el NAcc que mejora su transcripción, lo que resulta en niveles más altos de ARNm y proteína OTR, que posteriormente facilitan la formación de preferencias de pareja.
En ratones de campo femeninos, las horas de convivencia 6 con un macho sin apareamiento no inducen la formación de preferencias de pareja4, y este paradigma de comportamiento se ha utilizado para examinar los efectos de las manipulaciones farmacológicas en la inducción de la preferencia de pareja5. En nuestro estudio, mientras que los controles tratados con solución salina o CSF no desarrollaron la preferencia de pareja, los ratones de la pradera tratados con NaB o TSA sí lo hicieron. Como ni NaB ni TSA afectaron la locomoción general, sus efectos en la preferencia de pareja parecían ser de comportamiento específico en lugar de efectos secundarios en la locomoción. Este efecto específico de la TSA fue confirmado por nuestras observaciones moleculares. De hecho, aunque se administra icv., pudimos detectar una alteración específica de la expresión génica en el NAcc pero no en una estructura adyacente, el putamen caudado. Además, incluso dentro de los niveles de ARNm y proteína NAcc, D1R y D2R no se vieron afectados. Dicha especificidad parece ser sorprendente para un inhibidor de HDAC amplio como TSA que afecta a los HDAC de clase I y II. Sin embargo, se ha informado que la TSA afecta la expresión de solo un pequeño subconjunto de genes en el genoma de los mamíferos30–32, incluso en ratones20.
Aquí demostramos que la acetilación de la histona H3 en Lys14 en el oxtr promotor, una modificación asociada con la transcripción de genes mejorada, incluso durante la plasticidad cerebral33, 34, subraya niveles más altos de ARNm y proteína OTR. En respuesta a la TSA, la acetilación de histonas en el oxtr El promotor aumenta y facilita la activación de su transcripción en la línea celular humana.22, apoyando nuestro hallazgo de que oxtr Puede ser regulado epigenéticamente. Dado que un bloqueo local de OTR en la NAcc fue suficiente para prevenir los efectos de comportamiento de la TSA, nuestros datos sugieren que la expresión de la OTR inducida por la TSA en la NAcc durante la cohabitación mediaba la facilitación de la formación de preferencias de los compañeros. Además, 24 horas de convivencia con el apareamiento, un procedimiento conocido por inducir de manera confiable la preferencia de pareja en parejas de praderas femeninas, indujo un aumento similar en la expresión de OTR en la NAcc femenina. Esto está completamente de acuerdo con la participación conocida de la oxitocina y su receptor en la neurobiología de la formación de preferencias de pareja en ratones de campo. El apareamiento induce un aumento en los niveles de oxitocina extracelular en el NAcc25, y la infusión local de oxitocina en el NAcc facilita la formación de preferencias del compañero en ausencia de apareamiento8. Además, los antagonistas de OTR bloquean la formación de preferencia de pareja inducida por la administración de oxitocina o el apareamiento8, 35. Es importante destacar que la sobreexpresión viral de OTR en la NAcc femenina es suficiente para facilitar la formación de preferencias de la pareja12, 13.
Además de fortalecer el papel de la OTR, nuestros resultados también proporcionan evidencia de una activación de la expresión del gen OTR a través de mecanismos epigenéticos durante la cohabitación con un macho en ausencia de apareamiento. De hecho, aunque es insuficiente para inducir la preferencia de pareja, dicha cohabitación sin aparearse durante cortos períodos de tiempo activa los procesos neurobiológicos que subyacen en la formación de preferencias de pareja. Por ejemplo, dos horas de exposición libre a un hombre inducen aumentos leves pero no significativos en la liberación de oxitocina en la hembra NAcc25. Por lo tanto, se puede proponer que TSA o NaB potencien las neuroadaptaciones inducidas por la cohabitación con un hombre, facilitando el desarrollo de la preferencia de pareja. Curiosamente, tal potenciación ya se ha informado en roedores en los que los inhibidores de HDAC de clase I y II, incluidos NaB y TSA, facilitan la consolidación de un evento de aprendizaje que no da lugar a la formación de memoria a largo plazo en animales de control.36, 37. En apoyo de esta noción, períodos más largos de cohabitación (e.g.., 48hours) puede inducir la preferencia de la pareja incluso en ausencia de apareamiento4. También es importante tener en cuenta que la cohabitación con el apareamiento se desencadenó en la NAcc femenina y una regulación positiva de la expresión de OTR y V1aR a través de los mismos mecanismos epigenéticos que los observados después de la cohabitación con el tratamiento con TSA, lo que demuestra que la TSA y el apareamiento afectan las mismas vías para promover formación de preferencia de pareja. Es importante destacar que TSA no induce una regulación al alza de OTR y V1aR en la NAcc femenina en ausencia de cohabitación con un hombre. En total, esto apoya la hipótesis de que la TSA facilita la formación de la preferencia de pareja a través de la potenciación de las neuroadaptaciones endógenas provocadas naturalmente por la cohabitación con un hombre, en lugar de activar por sí mismas estas o diferentes neuroadaptaciones.
ONuestro estudio también destaca el papel crítico de NAcc V1aR en la formación de preferencias de la pareja femenina, ya que los animales tratados con TSA exhiben niveles más altos de V1aR, cuyo bloqueo impidió la formación de preferencias facilitada por la TSA. Además, estos efectos se asociaron con una mayor acetilación de histonas en el avpr1a promotor, a pesar de no haber una elevación significativa del ARNm de V1aR probablemente debido a un punto temporal no óptimo. Aunque no podemos descartar una regulación de la estabilidad de la proteína por TSA mediante la acetilación de proteínas no histonas38, este hallazgo sugiere que, similar a la oxtr promotor, TSA podría promover avpr1a Transcripción a través de la acetilación de histonas locales. Si bien se ha descrito la contribución de AVP en la unión de pareja masculina5, su papel en el comportamiento de la mujer sigue siendo controvertido. Por un lado, una icv. La inyección de AVP facilita la formación de preferencias del compañero tanto en el macho como en el femenino, lo que se evita mediante el bloqueo de V1aR o OTR39. Por otro lado, una icv. La inyección del antagonista V1aR bloquea la preferencia de la pareja inducida por el apareamiento en el macho, pero no en la hembra.40. Sin embargo, todos estos estudios utilizaron icv. inyecciones, evitando cualquier conocimiento adicional de las estructuras involucradas. Aquí, proporcionamos la primera evidencia de que la neurotransmisión AVP dentro de la NAcc puede estar involucrada en la formación de preferencias de pareja en los ratones de campo, mientras que la mayor parte de la literatura describe su participación en diferentes áreas como el pálido ventral, el tabique lateral, el núcleo del lecho del Stria terminalis, y amígdala en machos.5. Por lo tanto, resulta interesante observar que el bloqueo de OTR o V1aR en el NAcc de la hembra fue suficiente para prevenir la formación de preferencias de la pareja después del tratamiento con TSA, lo que sugiere que la formación de preferencias de la pareja requiere la activación de V1aR y OTR. Tsu hallazgo está en línea con, y apoya, una observación anterior en parejas de praderas masculinas de que un acceso simultáneo a OTR y V1aR en el LS es esencial para la preferencia de pareja inducida por AVP6. Además, la observación de un aumento específico en los niveles de OTR y V1aR en animales tratados con TSA respalda aún más el requisito de una activación simultánea de las neurotransmisiones de AVP y oxitocina para la unión de pares.
En combinación con la oxitocina y la AVP, la neurotransmisión de la dopamina en el NAcc modula la formación de preferencias de la pareja en el ratón femenino.9. Aunque el apareamiento induce la liberación de dopamina en el NAcc9, las variaciones en los niveles de los receptores se observan solo después de un período prolongado (más largo que 24h) de convivencia con el apareamiento, importante para el mantenimiento de la unión de pares10. En línea con estas observaciones, los ratones hembra de pradera tratados con TSA mostraron preferencia de pareja sin una variación significativa en los receptores de dopamina D1R y D2R. Por lo tanto, esta ausencia de regulación del receptor de dopamina proporciona otra prueba de la especificidad de la TSA.
Nuestros datos informan por primera vez de un componente epigenético en la neurobiología de la unión por pares, y sugerimos que la TSA induce un "estado permisivo" en las praderas femeninas, potenciando la respuesta molecular natural a la cohabitación y promoviendo la formación de interacciones sociales más fuertes. llevando a la preferencia de pareja. Por lo tanto, es tentador suponer que una preferencia de pareja facilitada por la TSA podría fortalecerse aún más y conducir a un vínculo persistente. Si bien aún no se han identificado las HDAC específicas involucradas, sería interesante investigar más a fondo los efectos de la TSA en otros comportamientos asociados con la estrategia de vida monógama en las praderas, como la agresión selectiva y el cuidado biparental. Teniendo en cuenta la relevancia de los ratones de la pradera en el modelado de los mecanismos neurobiológicos de la unión de pares en humanos5, y los prometedores inhibidores de HDAC que ya están en ensayos clínicos.24, 41, 42, nuestros datos allanan el camino para nuevas posibilidades farmacológicas para influir en los comportamientos sociales.
Métodos
Materias
Voles de la pradera femenina sexualmente naïve (Microtus ochrogaster) de una colonia de cría de laboratorio se destetaron a los 21 días de edad y se alojaron en parejas de hermanos del mismo sexo en jaulas de plástico (12 × 28 × 16 cm) con agua y alimentos proporcionados ad libitum. Todas las jaulas se mantuvieron bajo un ciclo 14: 10 h claro-oscuro, y la temperatura fue aproximadamente 20 ° C. Todos los animales se asignaron al azar en grupos experimentales cuando alcanzaron 70 – 90 días de edad. El número de animales utilizados se basó en estudios previos en el campo realizados por nuestro grupo y otros, combinados con un análisis de poder. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad Estatal de Florida.
Drogas
El butirato de sodio (NaB), disuelto en solución salina, y la Tricostatina A (TSA), disuelto en el portador de líquido cefalorraquídeo artificial (CSF, BioFluids, Rockville, MD) se compraron a Sigma-Aldrich (St Louis, MO). NaB se inyectó por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 600 mg / kg, que se sabe que induce la acetilación de histonas en varias estructuras cerebrales en ratones43, 44. De manera similar, el rango de dosis utilizado para la TSA se basó en trabajos previos que determinaron su efectividad en la inducción de eventos de acetilación de histonas locales y variaciones en la expresión de genes en roedores.19, 20. El antagonista selectivo del receptor V1aR V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP, y el antagonista de OTR OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (yo)2, Thr4, Tyr-NH29] -OVT), se obtuvieron de Bachem (Torrance, CA). Un segundo antagonista de OTR más selectivo, OTA (T), dGly-NH2–d(CH2)5 [Tyr (Me)2, Thr4] OVT45, fue proporcionado amablemente por el Dr. Maurice Manning (Universidad de Toledo, OH). Estos antagonistas y dosis utilizadas se han elegido en base a estudios previos que demuestran su selectividad para V1aR u OTR, respectivamente35, 39, 46–49.
Canulación estereotáxica y microinyección.
Las hembras fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (1mg / 10g de peso corporal), y las cánulas de guía de acero inoxidable de calibre 26 (Plastics One, Roanoke, VA) se implantaron estereotáxicamente, dirigidas al ventrículo lateral (unilateralmente; barra nasal en −2.5 mm, 0.6 mm rostral, 1.0 mm lateral, y 2.6 mm ventral a bregma) o específicamente al sitio del NAcc (bilateralmente; barra nasal a −2.5 mm, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm bilateral, y 4.5 mm ventral a bregma). Después de 3 días de recuperación, los sujetos recibieron microinyecciones de CSF o CSF que contenían diferentes concentraciones de TSA. Cuando se utilizaron antagonistas selectivos para OTR o V1aR, se inyectaron 30 minutos antes de la TSA. Las inyecciones se realizaron con una aguja de calibre 33 que extendió 1 mm por debajo de la cánula guía hacia el área objetivo, en un volumen de inyección de 500 nL en el ventrículo lateral (icv.) o 200 nL por lado en el NAcc. La aguja se conectó a una jeringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) a través de un tubo de polietileno-20 y la depresión del émbolo se realizó lentamente, requiriendo 1 minuto por inyección. Al final del experimento, todos los sujetos fueron sacrificados por decapitación rápida y los cerebros extraídos para verificar la colocación de las cánulas por un observador ciego a las condiciones experimentales. Los sujetos con cánulas fuera de lugar fueron excluidos del análisis de datos.
Test de convivencia y preferencia de pareja.
Siguiendo inmediatamente ip., icv., o inyecciones de drogas intra-NAcc, las hembras fueron cohabitadas con un macho durante 6 horas sin apareamiento. La ausencia de apareamiento se verificó al examinar el comportamiento grabado en video. Para la investigación de las neuroadaptaciones provocadas por la cohabitación con hembras apareadas y preparadas con estrógenos (2µg por día, ip., durante los días 3) se cohabitaron con un macho durante las horas 6 o 24, y se verificó la presencia de apareamiento posteriormente en cinta de video (que va de 6 a 11 durante las primeras horas de convivencia de 6).
La prueba de preferencia de pareja se realizó inmediatamente después de la cohabitación de 6-hora, como se describió anteriormente11. Brevemente, el aparato de prueba de tres cámaras consistía en una jaula neutra conectada a dos jaulas idénticas paralelas, cada una con un animal de estímulo: un "extraño" macho desconocido o un "compañero" macho familiar utilizado durante el período de convivencia. Las mujeres pudieron moverse libremente por el aparato durante la prueba de 3 horas, y los machos de estímulo fueron atados dentro de sus jaulas, sin permitir el contacto directo entre sí. Toda la sesión fue grabada en video y la duración del contacto lado a lado del sujeto con la pareja o el extraño fue cuantificada más tarde por un experimentador capacitado que no conocía los grupos biológicos. Una preferencia de pareja se definió como los sujetos que pasan significativamente más tiempo en contacto corporal con la pareja que con un extraño, según lo determinado por un par, de dos colas t-prueba. Además, el aparato de tres cámaras estaba equipado con sensores de fotobeam, lo que permite la determinación de la actividad locomotora indicada por el número de entradas de la hembra en las cámaras de estímulo. Por lo tanto, este puntaje locomotor nos permite controlar los posibles efectos secundarios de los medicamentos en el comportamiento de las hembras, como la actividad general, la ansiedad o la exploración alterada de un entorno novedoso, como es comúnmente usado por nuestro grupo y otros.12.
Extracción de ARN y proteínas.
Las hembras se sacrificaron por decapitación rápida, y los cerebros se extrajeron inmediatamente y se congelaron en hielo seco. Se cortaron secciones coronales (200 µm) en un criostato y se montó la escarcha en portaobjetos de microscopio. Se tomaron punzones bilaterales de tejido con un diámetro de 1 mm de todo el NAcc y el putamen caudado, siendo este último un área de control, y se almacenaron a -80 ° C hasta el procesamiento. El ARN total y las proteínas se extrajeron utilizando el protocolo TRI-Reagent según las instrucciones del fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
Análisis de la expresión de proteínas por Western-blot.
Después de la separación en un gel 10% de poliacrilamida (15% para histonas), las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR (sc-18096, 1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -actina (A2066, 1: XUMOXUM St Louis, MO), o anti-acetil histona H1000 (Lys3, # 14 – 06, 911: 1) y H1000 total (# 3 – 05, 928: 1, Millipore, Temecula, CA). Todos los anticuerpos están validados para su uso en humanos, ratas y ratones, con los cuales los ratones de campo comparten altos porcentajes de homología (desde 1000 hasta 81%). Después de la hibridación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP, las membranas se revelaron con ECL (ECL SuperSignal West Dura substrato, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) y se expusieron en una película Fuji XAR (Fuji Film, Tokio, Japón). La cuantificación se realizó con el software AIS 96 Image (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Canadá), y todas las señales se normalizaron dentro de la misma membrana que la actina, excepto la señal acetil-H6.0 que se normalizó a la señal total de histona H3. Los datos normalizados se expresan como porcentaje de animales tratados con CSF.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real semicuantitativa (RT-PCR)
0.5 µg de ARN total se procesó para la síntesis complementaria de ADN y luego se analizó como se describió anteriormente50 con la normalización del gen nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa (NADH). Todas las reacciones se realizaron por triplicado y su especificidad se verificó mediante análisis de la curva de fusión y separación en un gel de Agarosa 2%. Las secuencias de los cebadores utilizadas fueron las siguientes: (Rev) para el uso de los botones en el teclado de la GVCG ) para D5R, y 3'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5 '(For) y 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-5' (Rev) para NADH. Los datos normalizados se expresan como un porcentaje de animales tratados con CSF.
Inmunoprecipitación de cromatina
Se analizó la acetilación de histona H3 (Lys14) en punzones tisulares con putum caudado y caudato utilizando el kit de tejido de proteína G Magna ChIP (Millipore, Temecula, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de la reticulación con 1% de formaldehído, la cromatina se cortó utilizando un Misonix XL-2000 en fragmentos de 200-600 pb. La inmunoprecipitación de la histona acetilada H3 (Lys14) se realizó con 10 µg de anticuerpo anti acetil-H3 (Lys14) (Millipore) durante la noche a 4 ° C. Después de los lavados, la elución de las perlas y la reversión de la reticulación, el ADN inmunoprecipitado se purificó y se analizó por triplicado mediante RT-PCR en una plataforma iCycler (ver arriba) con una curva estándar interna hecha de muestras combinadas de INPUT. Los cebadores se diseñaron para amplificar 236 bp-long region ubicada 128 bp en sentido ascendente de la primera codificación del exón para el OTR de la pradera (oxtr, Genbank número de accesoAF079980), o 192 bp-long region localizada 141 bp en sentido ascendente de la primera codificación de exones para el vole de la pradera V1aR (avpr1a, Genbank número de accesoAF069304). Las secuencias fueron las siguientes: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) y 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTATAGGG-3' (Rev) para oxtr, y 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) y 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) para avpr1a. Cada muestra se normalizó mediante el respectivo valor de ENTRADA, y los datos se expresaron como porcentaje de los animales tratados con LCR.
Análisis estadísticos y procesamiento de datos.
Para los análisis de la preferencia de pareja, se excluyeron los animales que mostraron comportamientos de apareamiento durante el período de cohabitación o con cánulas fuera de lugar. Para todos los demás análisis moleculares, se excluyó un máximo de un punto de datos por grupo biológico cuando se identificó como un valor atípico. La mayoría de los experimentos se replicaron, excepto cuando los resultados fueron muy claros. El tiempo pasado en contacto lado a lado con cualquiera de los animales de estímulo durante la prueba de preferencia de pareja se analizó con un par de dos colas t-prueba. Los puntajes de locomoción fueron analizados utilizando un sistema de dos colas. t-test (para dos grupos) o un ANOVA de una vía (para más de dos grupos), y cuando sea apropiado, la PLSD de Fischer post-hoc pruebas se llevaron a cabo con un umbral de significación P <0.05. Después de la verificación de la normalidad, todos los demás datos se analizaron con una escala de dos colas. t-prueba suponiendo varianzas iguales o desiguales probadas de antemano. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software StatView (SAS Institute). Cuando los datos se estandarizaron a sus controles respectivos (% de CSF, salino o grupos de apareamiento), los análisis estadísticos se realizaron en los datos sin procesar.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH) que otorga MHR21-083128 a MK y ZW, y MHR01-058616 a ZW También agradecemos al Dr. Maurice Manning por el generoso regalo del antagonista OTR (T).
Notas a pie de página
Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Contribuciones de autor
HW, FD y YL realizaron los experimentos. HW y FD analizaron los datos. HW, FD, ZW y MK diseñaron el estudio. FD, ZW y MK escribieron el artículo. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron sobre el manuscrito.
Referencias
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