思春期初期ラット（2011）の側坐核における急速なドーパミン放出事象

イントロダクション

ドーパミンニューロンのバースト発火とその結果生じるドーパミン放出イベント（別名ドーパミン過渡現象）は、脳内の重要な学習信号を構成すると考えられています（シュルツ、2007; Roeschら、2010）、外部の報酬とキューを食欲の振る舞いと結び付ける。 ドーパミンの過渡現象は、いくつかのドーパミン標的領域で自然発生します（Robinsonら、2002）および予期しない刺激の提示でより顕著です（Rebec et al。、1997; ロビンソンとワイトマン、2004）、 社会的相互作用 （Robinsonら、2001; Robinsonら、2002）および報酬（Roitmanら、2008）。 高速ドーパミン放出イベントの後には、多くの場合、別のラットに近づいたり、強化のためにレバーを押すなどの欲求行動が続きます（Robinsonら、2002; フィリップス他、2003; Roitmanら、2004）。 さらに、通常ドーパミントランジェントを引き起こさないニュートラルキューは、報酬と繰り返しペアになったときにそうすることができます（Stuberら、2005b; Stuberら、2005a; Day他、2007）、この神経信号が学習誘発可塑性を受けることを示しています。 重要なことに、ドーパミン過渡現象は体積伝達の結果であり、低親和性のシナプス外ドーパミン受容体を活性化できる高いシナプス外濃度を達成します（ワイトマンとロビンソン、2002）。 したがって、ドーパミン過渡現象は、注意を向け、その報酬の獲得を促進する可能性のある確立された報酬の脳信号として機能するように見えます。

ラットの中脳辺縁系ドーパミン系は、思春期に動的な変化を遂げる。例えば、腹側線条体におけるドーパミンD1およびD2受容体の発現は、思春期前期から思春期にかけて増加する（例：Andersen et al., 1997）。いくつかの研究では、思春期の結合は成体期よりも高いことが示唆されている（参考文献および議論については、Doremus-Fitzwater et al., 2010 ; Wahlstrom et al., 2010b を参照）。さらに、ドーパミンニューロンの発火率（McCutcheon and Marinelli, 2009）および基礎ドーパミン濃度（Badanich et al., 2006 ; Philpot et al., 2009）は、思春期にピークを迎える同様のU字型の曲線を示す。思春期ラットにおけるドーパミンの一過性変化はまだ測定されていないが、思春期ラットでは成体ラットに比べて、目新しいもの（Douglas et al., 2003 ; Stansfield and Kirstein, 2006 ; Philpot and Wecker, 2008）や社会的仲間（Varlinskaya and Spear, 2008）に対する行動反応が強化されることが報告されている。

本研究は、思春期ラットの側坐核（NAc）におけるドーパミン過渡現象を初めて測定し、成体ラットのドーパミン過渡現象と比較することを目的とした。我々は、ドーパミン過渡現象の検出に必要な空間的および時間的分解能を備えた電気化学的手法である高速スキャンサイクリックボルタンメトリーを使用した（Robinson et al., 2008 ）。ラットは思春期後期および成体期に比べてこの時期に仲間との社会的相互作用のレベルが上昇することから（ Varlinskaya and Spear, 2008 ） 、我々は思春期初期（生後29～30日）のドーパミン放出を調べた。したがって、我々は短い社会的相互作用中、ベースライン時、および成体ラットでドーパミン過渡現象を引き起こすことが報告されている予期せぬ新しい刺激の提示時にドーパミン過渡現象を測定した（Robinson and Wightman, 2004）。

実験手順

結果

この研究では、思春期のラット12匹と成体のラット10匹を使用しました。 手術時またはボルタンメトリー中に3匹の思春期ラットが含まれていなかったため、電極配置が正しくなかったため1匹の成体ラットが含まれていませんでした。 さらに、1人の青年からの社会的相互作用データは、他の刺激の提示に影響を与えないボルタンメトリーの困難のために破棄されました。 最後のnは、刺激提示のための9の青年と9の成人、および社会的相互作用のための8の青年と9の成人でした。

予期しない刺激の提示でのドーパミン過渡現象

次に、思春期ラットにおいて、刺激の予期せぬ提示時にドーパミンの一過性変化がより起こりやすいかどうかを調べた。図1Aは、刺激の短い提示により、成体ラットのドーパミンの一過性変化の頻度がベースラインレベルより50%増加したことを示している（成体ベースラインと刺激のWald対比、p < 0.05）。これは以前の研究（Robinson and Wightman、2004）を再現するものである。対照的に、思春期ラットではドーパミン放出イベントの速度に有意な変化は見られなかった（思春期ベースラインと刺激のWald対比、p > 0.86）。グループ間で比較すると、ベースライン速度に差はなかった（思春期と成体のベースラインのWald対比、p > 0.19）が、刺激提示中の速度は成体ラットの方が高かった（思春期と成体の刺激のWald対比、p < 0.05）。成体ラットは刺激に同期したドーパミン放出を示す可能性が高かった。成体ラット9匹中8匹が少なくとも1回の刺激提示でドーパミン放出を示したのに対し、青年ラット9匹中6匹が同様の反応を示した。さらに、ドーパミン放出が時間的に同期した成体ラットは3.8 ± 0.4回の刺激（中央値4回）で放出を示したのに対し、青年ラットは2.3 ± 0.4回の刺激（中央値2回）で放出を示した。

図1

予期しない刺激の提示中の青年および成体ラットにおけるドーパミン放出イベント。 （A）思春期のラットでは、ドーパミン一過性頻度は刺激の提示中に基礎速度から変化しませんでした。 対照的に、ドーパミンの頻度 ...

次に、刺激提示中に発生する過渡現象がベースライン中の過渡現象よりも大きいかどうかを調べた。図 1B は、ドーパミン過渡現象の最大濃度の分布を示している。回帰分析により、振幅は青年期ラットと成体ラットで差がないことが明らかになった (Wald 対比、すべての p 値 > 0.05)。青年期ラットでは、刺激提示中の過渡現象の最大濃度は、ベースライン中の濃度と有意差がなかった。成体ラットでは、刺激提示中のドーパミン濃度はわずかに高く、右方向へのシフトは統計的に有意なレベルに近かった (成体ベースラインと刺激の Wald 対比、p < 0.06)。ドーパミン過渡現象の中央値と平均濃度は表 1に示されている。

テーブル1

思春期および成体ラットの側坐核コアにおけるドーパミン放出イベントの最大濃度。

グループデータでは、ドーパミン放出イベントは、思春期ラットよりも成体ラットの方が予期しない刺激提示時に発生しやすいことが示されましたが、個々のプロットでは、グループ内だけでなく刺激間の差異も示されています。図 1C は、刺激提示中のドーパミン過渡現象の頻度と、その刺激に先行する 4 分間のベースラインとの変化を示しています。成体では、刺激によってドーパミン過渡現象の発生率を高める効果が異なり、効果の高い順から低い順に次のようになります。ココナッツの匂いでは、ドーパミン過渡現象はベースラインの 208% で発生しました。トーンでは 184% で発生しました。レモンの匂いでは 161% で発生しました。ホワイトノイズでは 142% で発生しました。消灯では 91% で発生しました。思春期ラットでは、刺激によってドーパミン過渡現象が誘発される効果は全体的に低く、効果の高い順から低い順に次のようになります。トーンでは、ドーパミン過渡現象はベースラインの 158% で発生しました。レモンの匂いでは 127% で発生しました。ココナッツの香りで123%、ホワイトノイズで84%、消灯で23%。

しかしながら、図 1C は、各年齢群内で特定の刺激に対するドーパミン反応の放出に明確な個体差があることを示している。この神経化学的変動が行動的変動と関連しているかどうかを判断するために、表 2に示すように、各ラットの刺激提示に関連する動きをスコアした(ビデオ記録の一部が失われたため、1 匹の成体ラットはこの分析から除外した)。次に、スピアマンのノンパラメトリック相関を使用して、各年齢群内の刺激に対する行動的反応とドーパミン作動性反応を比較した。刺激を個別に分析したかグループとして分析したかに関わらず、ドーパミン過渡現象の頻度は、どの刺激においても、いずれの年齢群においても行動活性化と相関していないことがわかった (データは示していない、すべての p 値 > 0.05)。これは、刺激に対する行動的反応と神経化学的反応が直接関連していないことを示している。さらに、刺激提示に同期したドーパミン過渡反応を示さなかったラット（9匹中3匹の青年と9匹中1匹の成体）の行動スコアは、ドーパミン過渡反応を示したラットの行動スコアと完全に一致した。しかし、年齢群間の行動反応を比較すると、青年群は成体ラットに比べて、予期せぬ刺激提示時の動きが有意に少なかった（マン・ホイットニー検定、p < 0.05）。

テーブル2

予期しない刺激の提示時の思春期および成体ラットの行動スコア（0 =動きなし; 1 =嗅ぎ/頭の動き; 2 =向きの動き/驚;; 3 =歩行）。

社会的相互作用中のドーパミン過渡現象

次に、別の雄ラットとの 60 秒間の相互作用中のドーパミン放出を測定した。非社会的刺激の提示とは対照的に、回帰分析により、思春期ラットと成体ラットの両方で、別のラットとの最初の相互作用中にドーパミン過渡現象がベースラインから有意に増加したことが判明した。過渡現象の平均発生率は、思春期ラットではベースラインから 3 倍に増加し、1.0 ± 0.3 から 3.0 ± 0.9 過渡現象/分 (思春期ベースラインと相互作用の Wald 対比、p < 0.05)、成体では 2.0 ± 0.5 から 7.3 ± 1.3 (成体ベースラインと相互作用の Wald 対比、p < 0.001) となった。10 分後、同じラットとの 2 回目の相互作用中にドーパミン放出を測定した。成体では、ドーパミン過渡現象の発生率の増加はもはや有意ではなかった (p > 0.32)。過渡現象の平均発生率は 1.8 ± 0.5 から 3.7 ± 1.3 過渡現象/分に増加したが、この変化はラット間でばらつきが大きかった。対照的に、青年期ラットでは、2 回目の提示時にも 1 回目と同様にドーパミン過渡現象が増加し、0.8 ± 0.2 から 3.1 ± 0.9 過渡現象/分となった (p < 0.01)。グループ別およびエピソード別の個々のラットのデータは図 2Aに示されている。

図2

サイズが一致したラットとの短い相互作用中の思春期および成体ラットにおけるドーパミン放出イベント。 （A）ドーパミントランジェントは、他のラット（「ラット」）との最初の相互作用中に思春期および成体ラットの両方でより頻繁でした ...

我々は、最初の相互作用と2回目の相互作用のエピソード中の行動の違いが、2回目の相互作用中の成体ラットのドーパミン放出の増加の欠如を説明できるかどうかを調査した。表3は、スコア化された相互作用期間の45秒間の社会的探索と移動に費やされた時間を示している。この実験チャンバー（21 × 21 cmの床面積）では、青年ラットは成体ラットよりも活発な社会的相互作用に費やす時間が少なく（2要因反復測定ANOVA：グループの主効果、p < 0.05）、移動に費やす時間が長かった（2要因反復測定ANOVA：グループの主効果、p < 0.05）。しかし、青年ラットは互いに離れて移動するためのスペースがより多く、より大きな成体ラットは物理的に近接している可能性が高いことが観察された。したがって、重要な比較は、最初の相互作用期間と2回目の相互作用期間のグループ内行動を比較するための対応のあるt検定であった。これらの分析により、いずれの年齢層においても、最初の相互作用期間と2回目の相互作用期間の間に行動上の違いは見られなかった（すべてのp値 > 0.05）。さらに、ドーパミン過渡現象の絶対頻度も、ベースラインからの増加頻度も、相互作用期間中の社会的相互作用や運動量とは相関しなかった（データは示していないが、すべてのp値 > 0.05）。

テーブル3

社会調査と他のラットとの相互作用中の移動に費やされた時間。

他のラットとの相互作用中のドーパミン過渡現象の最大濃度を、ベースライン時の濃度と比較した。この分析では、統計的検出力を高めるために、両方の相互作用エピソードのデータをプールした。図2Bは、同種相互作用中の青年ラットと成体ラットの両方で、ドーパミン過渡現象の振幅分布がより大きな放出イベントの方にシフトしたことを示している。平均振幅と中央値振幅は表1に示されている。社会的相互作用はボルタンメトリー信号に運動関連ノイズを発生させる可能性があるため、ノイズレベルも調査し、成体ラットと青年ラットの両方で相互作用エピソード中にノイズレベルが実際に高いことを発見した（ベースラインと相互作用のWald対比、各グループでp < 0.05）。しかしながら、信号対雑音比はグループ間で差がなかった（表1：Wald対比、すべてのp値 > 0.05）ため、ノイズの問題は青年ラットと成体ラットの間の差異の原因ではないと考えられる。

図3に示すように、すべての記録はNAcの中心部で行われた。

図3

思春期および成体ラットの側坐核コア内のドーパミン作動性記録部位、ブレグマの前の1.2および1.6 mmの代表的な冠状スライスに示される（ パキシノスとワトソン、1986).

議論

ドーパミンの神経伝達は、刺激の顕著性、報酬の予測、行動の促進など、やる気のある行動の多くの側面の鍵です。 動機づけられた行動が青年と成人の間で異なるので、本研究は、成人と比較して初期の青年期ラットでの高速ドーパミン放出イベントを調査しました。 ドーパミントランジェントの基礎レートは2つの年齢グループ間で有意差はありませんが、予期せぬ刺激に反応するトランジェントは、成人と比較して思春期のラットでは少ないことを報告します。 対照的に、ドーパミン過渡現象の頻度と振幅の両方は、別のラットとの相互作用で両方の年齢層で増加します。 ただし、周波数の変化は、パートナーラットの2回目の提示では、成人では慣れていますが、青年では慣れていません。 したがって、刺激の提示での高速ドーパミン放出イベントは、青少年ラットと成人で異なり、この生理学的差異は、社会的および非社会的刺激の処理における年齢依存性の差異と関連している可能性があります。

NAc コアにおけるドーパミン過渡現象の周波数と振幅は、思春期初期 (生後 29 ～ 30 日) と成体 (生後 71 ～ 72 日) の雄ラットで類似していた。これらの所見は、麻酔下のラットのドーパミンニューロンの電気生理学的記録と一致している。ドーパミンニューロンの発火率は、出生から思春期中期から後期にかけて増加し、その後成体期にかけて減少する ( Pitts et al., 1990 ; Tepper et al., 1990 ; Lavin and Drucker-Colin, 1991 ; Marinelli et al., 2006 ; McCutcheon and Marinelli, 2009 )。活動のピークは思春期中期から後期に発生する。実際、McCutcheonとMarinelli（2009）は、基礎発火率は本研究の対象である思春期初期と成体期で類似していると報告しており、本研究のデータは、ドーパミン過渡現象がドーパミンニューロンのバースト発火から生じるため、ニューロンのバースト発火率も同様であることを示唆している（Suaud-Chagnyら、1992；Sombersら、2009）。注目すべきは、思春期ラットでは、ドーパミン過渡現象の基礎頻度にばらつきがあり、自発的な過渡現象がほとんどない部位から、1分間に数回発生する部位まで様々であったことである。この発見は、成体で報告されている「ホット」および「コールド」記録部位（Robinson et al., 2009 ; Robinson and Wightman, 2007 ; Wightman et al., 2007）と同様であり、ドーパミンニューロンのバースト率の変動を反映している可能性がある（Hyland et al., 2002）。発達期の発火率と一致して、マイクロダイアリシス研究では、思春期後期（生後45日）のドーパミンレベルが思春期前期または成体期と比較して増加していることが報告されている（Badanich et al., 2006 ; Philpot et al., 2009）。したがって、我々の発見は思春期ラットと成体ラットの間のドーパミン過渡現象の基礎率の最初の評価を提供するが、ドーパミン過渡現象は思春期中期から後期にかけてより顕著になる可能性があるため、この動的な発達期にはより多くの時点が必要である。

以前の報告（Robinson and Wightman, 2004）と一致して、成体雄ラットでは、刺激の予期せぬ提示時にドーパミン過渡現象の頻度が増加し、多くの場合、刺激の最初の提示と時間的に同期していることがわかりました。以前の研究では、本研究で使用したのと同様の匂い刺激と聴覚刺激を提示しました。どちらの研究でも、これらの刺激はNAcにおけるドーパミン過渡現象の頻度を基礎値以上に増加させ、これは刺激が動物にとって潜在的に顕著であるという神経化学的シグナルとして解釈されました。しかし、成体で観察された刺激の予期せぬ提示に対するドーパミン過渡現象の頻度の増加は、思春期初期のラットのNAcコアでは確実には見られず、思春期のラットは全体として成体よりも刺激に対する行動反応が少なかったです。ドーパミン作動性ニューロンの位相性活性化は特定の運動とは相関しないが、バースト発火やドーパミン過渡現象を促進するタイプの刺激は、しばしば行動活性化を引き起こす（Nishino et al., 1987 ; Romo and Schultz, 1990 ; Robinson et al., 2002）。したがって、今回の研究結果は、この種の新しい刺激提示に対するドーパミン作動性および行動反応の発達上の違いを示しており、これはどちらも、これらの刺激が思春期ラットにとって顕著性に欠けていることに起因する可能性がある。重要なことに、刺激に対する行動反応の低下は、単に運動能力の低下（おそらくテザーやボルタンメトリーヘッドステージによるもの）によるものではなく、思春期ラットは社会的相互作用中に移動と社会的指向行動の両方を示した。さらに、各年齢群内の個々のラットを分析したところ、行動反応と刺激に対するドーパミン過渡現象の頻度との間に関連性は見られなかった。本研究で見られた予期せぬ新規刺激に対する相対的な鈍感さは、思春期のラットは成体よりも新規環境や新規物体の探索レベルが高いという以前の研究結果（例：Douglas et al., 2003 ; Stansfield and Kirstein, 2006 ; Philpot and Wecker, 2008）とは対照的であり、新規物体の探索は思春期中期（生後35～36日、Spear et al., 1980）にラットでピークに達すると報告されている。本研究で使用した短時間の刺激提示によって誘発される行動活性化と同時ドーパミン放出イベントと、以前の研究で使用したような、見慣れた環境に置かれた新規環境や静的な新規物体に対する反応との間の発生学的差異を明らかにするには、追加の研究が必要となるだろう。

NAcコアにおけるドーパミン過渡現象の頻度と振幅は、青年期群と成体群の両方において、他のラットとの短い相互作用中に確実に増加した。我々の以前の報告（Robinson et al., 2002）と一致して、ドーパミン反応は、同種のラットの2回目の提示で成体ラットで慣れた。対照的に、青年期ラットではドーパミン過渡現象の頻度の増加が持続した。この慣れの欠如は、青年期ラットと成体ラットで見られる社会的相互作用に関連する報酬の増加を反映している可能性がある（例：Douglas et al, 2004）。実際、社会的活動は青年期後期および成体期と比較して青年期初期にピークに達することが示されており、この効果は、本研究で行ったように、ラットをテスト前の数日間隔離飼育すると増幅される（Varlinskaya & Spear, 2008）。興味深いことに、2つの年齢群は、社会的活動の総量と一般的な運動量で異なっていた。これまでの報告では、隔離飼育された思春期ラットは、個別の社会的相互作用試験において成体よりも社会的行動や運動量が多く、特に思春期初期のラットでその効果が顕著であることが示されているが（Varlinskaya & Spear, 2008）、本研究では、テストした思春期初期のラットは成体ラットと比較して運動量が多く、社会的行動が少ないことがわかった。これは、実験装置のサイズが原因と考えられる。21 × 21 cm の装置では、成体ラットの方が小型の思春期ラットよりも同種のパートナーに接近しやすく、成体ラットにとって社会的接触はほぼ避けられない。さらに、テストラットのみを繋いでいたことが、社会的相互作用中の行動レパートリーに影響を与えた可能性もある。最後に、ここで使用した短い相互作用期間（60秒）は、初期の相互作用のみを捉えており、げっ歯類の社会的相互作用に関して一般的に使用されるより長い相互作用期間（270～600秒）と比較すると、年齢に関連した社会的行動の異なるパターンを生み出す可能性があります（例：Varlinskaya & Spear、2008年；Glenn et al、2003年）。

社会的相互作用は、ヘッドステージアセンブリがチャンバーの壁や他のラットに接触することで、動きに関連した電気的ノイズを誘発する可能性があり、社会的相互作用中のドーパミン過渡頻度の過小評価につながる可能性があります。重要なことに、信号対雑音比は年齢群間または最初の相互作用期間と2番目の相互作用期間間で差がなく、2番目の相互作用期間中に思春期ラットで観察されたドーパミン過渡頻度の持続的な増加はノイズ関連のアーティファクトではないことを示しています。同様に、探索行動と運動行動は、各年齢群内の両方の相互作用で基本的に同じであったため、行動の違いも思春期ラットと成体ラット間のドーパミン作動性反応の慣れの違いを説明するものではありません。実際、以前の研究（Robinson et al., 2002）では、成体ラットはパートナーラットとの2回目の相互作用中に、ドーパミン過渡の放出が少ないにもかかわらず、より強い社会的指向行動を示したことが観察されており、ドーパミン過渡はパートナー指向行動を促進するために必要ではないことを示唆しています。ドーパミンの一過性変化が報酬予測のシグナルとして解釈される場合（Schultz and Dickinson, 2000 ; Schultz, 2007 ; Roesch et al., 2010）、成体におけるパートナーの繰り返し提示に対するドーパミン放出イベントの慣れは、報酬の減少または2回目の提示の予測可能性の向上を反映している可能性があり、思春期ラットにおけるドーパミン放出の持続は、パートナーとの繰り返しの相互作用に対する報酬の増強または驚きを反映している可能性がある。

中脳辺縁系ドーパミン系は、食欲行動や報酬獲得に関与している（総説については、Depue and Iacono, 1989 ; Panksepp, 1998 ; Depue and Collins, 1999 ; Ikemoto and Panksepp, 1999 ; Schultz and Dickinson, 2000 ; Schultz, 2007 を参照）。このドーパミン経路のいくつかの側面は思春期に動的な変化を受けるため、報酬や報酬を予測する可能性のある新しい刺激に対する行動的および神経化学的反応も動的であることは驚くべきことではない（総説については、Chambers et al., 2003 ; Ernst et al., 2009 ; Wahlstrom et al., 2010b ; Wahlstrom et al., 2010a を参照）。思春期初期のラットでは社会的相互作用に対するドーパミン反応が慣れを起こさないという我々の発見は、社会的報酬や薬物報酬を含む思春期における報酬への感受性の高まりを記録した多くの研究と一致している（レビューと参考文献については、Doremus-Fitzwater et al, 2010 ; Spear and Varlinskaya, 2010 を参照）。同様に、新しい刺激は顕著であり、報酬または脅威を予測できるため、ドーパミン放出と行動促進を引き起こす可能性がある。しかし、思春期初期のラットでは、新しい刺激を短時間提示してもドーパミン放出の増加は観察されなかった。したがって、本研究は、社会的報酬への感受性は最適であるが、新規性への反応は最適ではない発達段階（思春期初期）におけるドーパミン放出をサンプリングした可能性がある。この解釈は、思春期のより多くの時点における新しい刺激および社会的刺激に対するドーパミン放出の検討など、いくつかの今後の研究の方向性につながる。また、明示的な手がかりと報酬の学習（例えば、パブロフ式条件付け）中のドーパミン放出を調査し、光や匂いなどの刺激提示の種類が、報酬を予測する際に思春期のラットでドーパミン反応を引き起こすかどうかを判断する予定です（Day et al, 2007 ; Roesch et al., 2007）。

要約すると、高速ドーパミン放出イベント、またはドーパミン過渡現象は、青年期と成人期で異なって発現されます。 トランジェントの割合と濃度はベースラインで類似していましたが、成人と比較して思春期のラットでは、予期しない非社会的刺激によるドーパミン放出の活性化が少なく、社会的刺激による持続的な活性化が観察されました。 ドーパミン放出イベントのこれらの違いは、手がかりと報酬、特に社会的報酬に対する感受性の発達の違いに寄与する可能性が高い。 思春期のより多くの時点を評価し、明示的な報酬関連学習中のドーパミン放出を監視することにより、これらの発見に基づいて構築することは価値があるでしょう。

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