ソース
アルコール依存症ワゴナーセンター 中毒 米国テキサス州オースティンのテキサス大学テキサス大学神経科学研究所。 [メール保護].
抽象
抽象：
背景：
アルコール摂取量を減らしたり調整したりできないことは、アルコール使用障害の顕著な症状です。 飲酒の経験による変化の新しい行動モデルおよび遺伝モデルの研究は、アルコール使用障害に関する我々の知識をさらに深めるでしょう。 マウスの2つのF1雑種系統を比較した場合、以前とは異なるアルコール自己投与行動が観察された：C57BL / 6J×NZB / B1NJ （B×N） 高濃度のアルコールと禁断の期間を経験した後にアルコールの好みの減少を示す C57BL / 6J×FVB / NJ（ＢｘＦ）は持続的なアルコール嗜好性を示す。 これらの表現型は、これらの雑種が経験依存的な様式でエタノール摂取における遺伝的相加性（B×N）および過剰優性（B×F）の発生を示すので興味深い。
具体的には、高エタノール濃度での経験後、BxFは持続的なアルコール嗜好性を示し、BxNは低いアルコール嗜好性を示す。 しかし、低エタノール濃度での経験は、両方のハイブリッドに対して持続的なアルコール嗜好を生み出す.
本研究では、これらの表現型は報酬、嫌悪、およびストレス関連脳領域における誘導性転写因子、ΔFosBの示差的生産によって表されるという仮説を検証した。
結果：
神経可塑性の変化（ΔＦｏｓＢレベルで測定）は経験依存的であり、脳領域および遺伝子型特異的であり、神経回路がエタノール消費の動機づけ的側面の根底にあることをさらに裏付けている。.
アルコール嗜好性の低下を示すBxNマウスは、対照マウスと比較して、持続的なアルコール嗜好性を示すマウスよりもEdinger-Westphal核中のΔFosBレベルが低く、中内側扁桃体中のΔFosBレベルが高かった。
持続的なアルコール嗜好性を示すBxNマウスは、腹側被蓋野においてより高いΔFosBレベルを示した。 Edinger-Westphal核、および扁桃体（中央部と外側部）。
また、 Edinger-Westphal核および腹側被蓋領域におけるBxNマウスΔFosBレベルはエタノールの嗜好性および摂取量と有意に正の相関があった。 さらに、階層的クラスタリング分析は、全体的に低いΔＦｏｓＢレベルを有する多くのエタノールナイーブマウスが集団内にあるのに対し、全体的に高いΔＦｏｓＢレベルを有する持続的アルコール嗜好性を示す多くのマウスは一緒に集団内にあることを明らかにした。
結論：
2つのアルコール表現型を比較して対比することによって、この研究は報酬およびストレス関連回路（Edinger-Westphal核、腹側被蓋野、扁桃体を含む）がアルコール嗜好の低下として現れる顕著な可塑性を受けることを示している。
経歴
アルコール乱用やアルコール依存症に関連した、環境的および遺伝的な既知の感受性要因があります。 個人にほとんど影響を与えずに大量のアルコールを飲む能力は、多くのアルコール依存者の主な発症症状であり、アルコールに対する低レベルの反応がアルコール依存症の発症における主要な脆弱性因子であることを示している。1,2]。 アルコールの緩和に寄与する神経生物学的要因を定義することは、アルコールの使用と乱用の理解に役立ち、アルコール使用障害と診断された個人のための改善された治療法を開発するための効果的な戦略です。 げっ歯類モデルを使用してヒトの疾患を模倣することは、この疾患を理解し治療を改善する上で強力なツールとなっています。 アルコール乱用およびアルコール依存症の側面を研究するために適所にいくつかのげっ歯類モデルがあります、しかしどれも完全にモデルアルコール依存症. マウスが同様の環境条件下でエタノール溶液を経口で自己投与する程度は、その遺伝的背景に大きく依存します[3].
最近、我々はC57BL / 6JxFVB / NJ（BxF）およびFVB / NJxC57BL / 6J（FVBxB6）F1ハイブリッドマウスが2ボトルの嗜好試験中に異常に高レベルのアルコールを自己投与することを発見した（女性は20 – 35 / kg / kgを消費する）。そして、男性の7 – 25 g / kg /日、濃度とパラダイムに応じて）[4]。 この新しい遺伝的モデルは、過剰優位表現型の証拠および高血中アルコール濃度への飲酒を含む、既存の近交系と比較した場合、大きな利点があります。4]。 さらに、BxFマウスが示す高いエタノール消費量は、2つの追加のエタノール飲酒パラダイム（予定されている水分補給中の暗所での飲酒およびエタノール摂取）で見られます。4]。 その後、2つのF1ハイブリッド系統のマウスを比較すると、異なるアルコール自己投与行動が観察された。C57BL / 6J x NZB / B1NJ（BxN）は、高濃度アルコールでの経験後のアルコール嗜好性の低下を示す。5]. 一連の行動テストを使用して、我々はBxNがエタノールの嫌悪および鎮静作用に対してBxFマウスよりも感受性が高いことを示した。 [6].
飲酒の高アルコール消費と経験による変化の新規行動および遺伝モデルに関する基礎研究は、アルコール乱用およびアルコール依存症に関する我々の知識をさらに深めるでしょう。 ＢｘＮマウスは最初にエタノール溶液に対して高い嗜好性を示すので、アルコール嗜好性低下表現型は興味深い。 高エタノール濃度および禁断症状を経験した後のアルコール摂取量の減少の動機づけの側面は知られていないが、BxNマウスはエタノール溶液をまだ摂取しているがアルコール摂取量が減少しているという点でアルコール飲酒者を穏やかにすると考えられる。
BxFマウスは以前の経験に関係なく非常に高レベルのエタノールを安定的に消費するので、持続的アルコール嗜好モデルも興味深い。 持続的で減少したアルコール嗜好は、アルコール欠乏効果、すなわち強制的な禁酒期間の後に動物が著しく増加したアルコール消費を示す現象に関連し得る。e [7]。 アルコール欠乏効果は、飲酒行動の増加を研究するための有用な現象です。 アルコール欠乏効果を誘発することが知られている実験スケジュールはここで使用されるスケジュールとはかなり異なるが、持続的および減少したアルコール嗜好をアルコール欠乏効果と比較することはここで論じる異なる行動表現型をアルコール研究のげっ歯類モデルにおける重要な現象に関連付ける。 アルコール嗜好の減少はアルコール欠乏効果の反対であり、持続的アルコール嗜好はアルコール欠乏効果の欠如として説明され得る。 アルコール使用障害は遺伝学と環境の間の複雑な相互作用から生じると考えられているので、BxFおよびBxNのような多様な遺伝的動物モデルの使用はこの分野の進歩に大きく貢献する。 これらの雑種のための示差的即時遺伝子発現の同定は、エタノールのやりがいのあるそして嫌悪的な特性にとって重要な脳回路への洞察を提供する。
エタノールおよび他の薬物関与神経回路は、神経可塑性および/または活性の分子マーカーを用いて特定のげっ歯類モデルで研究されている。8–15]。 自己投与および実験者投与のエタノールは同等の脳代謝マップをもたらさず、特定の回路がエタノールの強化効果の根底にあることを示唆している。8,9].
アルコール研究ではまだ広範に調査されていないが、1つの重要な要素は、持続的で減少したアルコール嗜好行動の調査とこれらの行動の間に関与している神経回路の同定です。 この実験の目的は、持続的で減少したアルコール嗜好が関与している脳の領域を特定することでした。 慢性のアルコール投与（他の乱用薬物と一緒に）はΔFosBレベルの脳の地域差を引き起こすことが示されているので、我々はこれらの行動表現型が誘導転写因子ΔFosBの示差産生によって表されるという仮説を検証した。報酬、嫌悪、ストレスに関与する [10].
ΔFosBレベルの地域差を引き起こす慢性的な刺激には、乱用薬物（アルコール、コカイン、アンフェタミン、ニコチン、モルヒネ、および抗精神病薬）、慢性的なストレス（拘束ストレス、予測不可能なフットショック、電気けいれん発作）、および強迫観念11]。 脳における長期適応の潜在的なメディエータとして、慢性的なエタノール治療に反応してFosBの優性な変異体（FosBまたはΔFosB）を同定することは重要な違いです。
慢性刺激後にＦｏｓＢおよびΔＦｏｓＢを測定したいくつかの研究があり、それについてはΔＦｏｓＢが優勢なアイソフォームであることが確認されていない（以下に記載するものなど）。 しかし、FosBではなく、ΔFosBが慢性的な刺激後の優勢なアイソフォームであるという強い証拠があります。10–12]。 Ryabinin and Wang（1998）による研究では、低アルコール嗜好のDBA / 2Jマウスでは、4日間のエタノール反復注射により、次の脳領域でFosB発現が大幅に増加することが明らかになった：前側皮質扁桃核、外側中隔側腹部、中央扁桃、外側扁桃体、外側視床下部、側坐核殻、終末層のベッド核、および視床の傍室核13]。 彼らの結果はエタノール反応性神経回路を同定する。 FosB発現はまた、限られたアクセス条件下でのエタノール自己投与の獲得および維持の間に、高アルコールを好むC57BL / 6Jマウスにおいて測定された。 自己管理の習得中にFosBレベルに変化はなかった[14]. しかしながら、2週間のアクセス制限エタノール自己投与後、FosBレベルは扁桃体の中心内側核およびEdinger-Westphal核で増加した。15]. 全体として、報告は、エタノール自己投与に関与する新規領域を同定し、そして中皮コルチコリン経路および扁桃体拡大の役割を示唆している。16]。 しかし、ΔFosBレベルの変化は、エタノール投与経路、投与量、治療またはスケジュールにさらされる期間によって異なることに注意することが重要です。13–15].
この研究で使用されたマウス系統は、持続的および減少したアルコール嗜好と、これらの異なるアルコール反応の原因である根本的なメカニズムとを比較するための興味深いモデルを提供します。 この研究は、減少したアルコール嗜好性を示すマウスは、報酬およびストレス関連回路（Edinger-Westphal核、腹側被蓋野、扁桃体、側坐核、および帯状皮質を含む）においても有意な可塑性を示すことを実証している。
結果
BxFおよびBxNマウスにおける自己投与に対するアルコール濃度および禁断期間の影響
エタノール濃度や禁酒期間が変わるとその後のエタノール消費量が変化することを実証するために、エタノール消費量を測定する4つのスケジュール（グループ）を設計しました（図1）。 （図ＸＮＵＭＸａ、ｂ）。1ａ、ｂ）。 各ハイブリッドについて４つの実験群があった：高濃度、禁断期間を伴う高濃度、低濃度、および禁断期間を伴う低濃度。 エタノール選好に関する完全なデータ（図） （図2）2）と消費量（図） （図3）3（全てのグループおよび両方の遺伝子型についての）データは、参考のために提示されている。 持続および減少したアルコール嗜好の行動表現型を確立して説明するために、9％エタノール嗜好および消費データを図に示す。 フィギュア44 & and55。 これらの行動表現型は、9％エタノールの嗜好性と、高濃度グループでの1、2、3、および4回目の表示からの消費、および低濃度グループでの対応する実験日数の比較に基づいています。 ＸＮＵＭＸ％エタノール嗜好および消費の二元配置ＡＮＯＶＡ（遺伝子型×時間）を実施した。 高濃度グループでは、エタノールが優先されます（図 （図4a）4a）と消費量（図） （図5a）5a）BxFの方がBxNよりも大きく、BxFは持続的なアルコール嗜好と消費を示したが、BxNはアルコール嗜好と消費の減少を示した（エタノール嗜好–相互作用F（3,54）= 4.83、P <0、遺伝子型F（01、 1,54）= 24.10、P <0.001、時間F（3,54）= 9.92、P <0.0001;エタノール消費–相互作用N / S、遺伝子型F（1,54）= 50.73、P <0.0001、時間F（3,54、 11.68）= 0.0001、P <XNUMX）。 禁欲のある高濃度グループの場合、エタノールの好み（図 （図4b）4b）と消費量（図） （図5b）5b）BxFの方がBxNよりも大きく、BxFは持続的なアルコール嗜好と消費を示したが、BxNはアルコール嗜好と消費の減少を示した（エタノール優先–相互作用F（3,132）= 15.89、P <0.0001、遺伝子型F（1,132）= 250.43、P <0.0001、時間F（3,132）= 27.48、P <0.0001;エタノール消費–相互作用F（3,132）= 11.35、P <0.0001、遺伝子型F（1,132）= 510.88、P <0.0001、時間F（3,132）= 22.42、 P <0.0001）。 低濃度グループの場合、エタノールの好み（図 （図4c）4c）と消費量（図） （図5c）5c）BxNよりもBxFの方が大きく、両方の雑種が持続的なアルコール嗜好と消費を示した（エタノール優先–相互作用N / S、遺伝子型F（1,54）= 12.2、P <0.01、時間N / S;エタノール消費–相互作用N / S、遺伝子型F（1,54）= 74.83、P <0.0001、時間N / S）。 禁欲のある低濃度グループの場合、エタノールの好み（図 （図4d）4d）と消費量（図） （図5d）5d）BxNよりもBxFの方が大きく、両方の雑種がアルコールの好みと消費量の適度な減少を示しました（エタノール優先–相互作用N / S、遺伝子型F（1,132）= 166.58、P <0.0001、時間N / S;エタノール消費–相互作用F（3,132）= 3.61、P <0.05、遺伝子型F（1,132）= 480.64、P <0.0001、時間F（3,132）= 7.87、P <0.0001）。 要約すると、高濃度グループ（禁酒なし）では、BxFは持続的なアルコール嗜好を示し、BxNはアルコール嗜好の低下を示し、低濃度グループ（禁酒なし）では、BxFとB6xNの両方が持続的なアルコール嗜好を示しました。 関心のある表現型は、禁欲のないグループで最もよく捉えられるので、それらは研究の残りの部分の焦点です。
ΔFosBレベル
ΔFosB定量化および分析を使用して、持続的および低下したアルコール嗜好の間に慢性的に活性化された神経回路を同定した。 各ハイブリッドについて３つの実験群があった：高濃度、低濃度、および水（対照）。 ΔＦｏｓＢデータは、パーセントΔＦｏｓＢ陽性ニューロン［（ΔＦｏｓＢ陽性ニューロンの数）／（ΔＦｏｓＢ陽性ニューロンの数＋ニッスル陽性ニューロンの数）］として表される（表２）。 （Table1）1） 以前の研究は、エタノールの経験が神経変性を誘発する可能性があることを示しています。17]。 したがって、本研究では神経細胞数を調査し、本研究で定量化された脳領域の遺伝子型またはグループに基づいて有意差は報告されていません。 ΔＦｏｓＢデータの以下の３つの分析を行った：相関をマッピングするために、ＸＮＵＭＸ）三元配置ＡＮＯＶＡ（遺伝子型×群×脳領域）、ＸＮＵＭＸ）二元配置ＡＮＯＶＡ（脳領域×群）、およびＸＮＵＭＸ）相関行列を作成した。ネットワーク
反復測定三元配置ANOVA（遺伝子型xグループx脳領域）は、遺伝子型x脳領域の相互作用[F（15,375）= 2.01、P <.05]、グループx脳領域の相互作用[F（15.375）= 1.99、P <0.01]、および脳領域の主な効果[F（15,375）= 43.36、P <.000]。 各遺伝子型の反復測定二元配置分散分析（脳領域xグループ）は、BxFとBxNの両方にグループと脳領域の主効果があることを示しました[BxF – F（2,374）= 11.79、P <.0001、主効果グループ; F（15,374）= 25.64、P <.0001、脳領域の主な効果; BxN – F（2,360）= 43.38、P <.0001、グループの主な効果。 F（15,360）= 23.73、P <.0001、遺伝子型の主な効果]。 事後分析により、BxNのXNUMXつの重要なグループの違いが明らかになりました（図 （図ＸＮＵＭＸａ〜ｃ）。6交流）。 Ｌａ、ＣｅＣ ／ ＣｅＬ、ＥＷ、およびＶＴＡにおいて、ΔＦｏｓＢレベルの割合は、低濃度グループでは水グループよりも高かった。 CeMPVでは、ΔFosBの割合が高濃度グループのほうが水グループよりも高かった。 EWにおけるΔFosBの割合は、高濃度グループよりも低濃度グループの方が高かった。 定量された他の全ての脳領域についてのΔFosBデータを表に示す。 Table11。 ピアソンのr相関分析を使用して、特定の脳領域のΔFosB陽性ニューロンの％がエタノールの消費または好みと相関しているかどうかを判断しました。 エタノール消費量と嗜好性は、BxNマウスのEWおよびVTAで％ΔFosBと有意な正の相関を示しました（エタノール消費量– EW r = 0.85; VTA r = 0.85;エタノール優先度– EW r = 0.83、VTA r = 0.88; p <0.05すべてのために）。
ΔFosB発現、遺伝子型、脳領域、およびエタノール消費の間の複雑な関係を主成分分析および階層的クラスタリングを用いてさらに調べた。 主成分分析により、データ内の大部分の変動性（〜80％）が5成分によって表されることが明らかになった。 次に、教師なしの階層的クラスタリング（個人および脳領域によってクラスタ化された）が実行され、最初の主成分を使用して順序付けされました（図2） （図7）。7） 個々のクラスタリングにより、遺伝子型に関係なく、エタノール消費量に基づいて、強力ではあるが完全ではないグループ分けパターンが明らかになった。 エタノールナイーブマウスの多くは、平均よりクラスタ化して全体のΔＦｏｓＢが低いことを示し、持続アルコール嗜好性を示したマウスの多くは一緒にクラスタ化して平均よりも全体的なΔＦｏｓＢを示した。 これら2つのクラスターは最も発散していました。 その間の３つのクラスターは、ΔＦｏｓＢ値およびエタノール飲用表現型のより大きい、より小さい、および平均の混合を表した。
議論
マウスの2つのF1ハイブリッド系統を比較すると、異なるアルコール自己投与行動が観察された。 BxFは持続的なアルコール嗜好を示すのに対し、BxNは高濃度のアルコールおよび禁断期間を経験した後のアルコール嗜好性の低下を示す. BxFモデルは安定、高消費（持続的アルコール嗜好）およびBxNモデルは中程度の飲酒（減少したアルコール嗜好）。 神経可塑性（またはΔＦｏｓＢレベルによって測定される活性）はエタノールの経験に応じて異なり、これはさらに持続および減少したアルコール嗜好における特定の神経回路の根底にある役割を裏付けている。
高アルコール消費株、C57BL / 6、エタノールの好みおよび消費は、初期エタノール濃度、禁酒期間、および亜株（C57BL / 6CrまたはC57BL / 6J）に大きく依存します。7,18]。 我々は、試験した４つの異なるスケジュールにおいて、ＢｘＦマウスで見られたエタノール嗜好性および消費が一貫してより高い（そしてＢｘＮよりも安定している）ことを見出した。 ＢｘＮにおける中程度に高いエタノールの嗜好性および消費は、１つのスケジュールの慢性的な飲酒（禁断のない低濃度）でしか持続されなかったが、試験された他のすべての慢性の飲酒スケジュールでは嗜好および消費の減少が観察された。 BxNアルコール依存性の減少は、経験（複数の高エタノール濃度および／または数回の短期間の禁酒を経験した後のエタノールの反復提示）が以前の非常に好ましいエタノール濃度に対する反応を劇的に減少させる新規動物モデルを提供する。
自己投与および実験者投与のエタノールは異なる脳代謝地図を生成し、特定の回路がエタノールの強化効果の根底にあることを示唆する [8,9]。 我々は、持続的および減少したアルコール嗜好行動表現型が、報酬、嫌悪、およびストレスに関与することが知られている脳領域における誘導性転写因子ΔFosBの示差的産生によって表されるという仮説を検証した。 ΔＦｏｓＢは、独特の長期安定性を有する転写因子であり、そしてｃ − Ｆｏｓがそうであるように刺激に対して減感するのではなく、むしろそれは慢性治療中に蓄積する。 ΔFosBの増加は神経活動の増加によるものであり、長期にわたる神経可塑性を反映していると考えられている。 脳領域におけるΔＦｏｓＢ陽性ニューロンの割合は、遺伝子型（ＢｘＦおよびＢｘＮ）および群（水分制御、低濃度、および高濃度）に依存することを我々は見出した。
F事後分析により、自発的なエタノール消費は、ＥＷ核、ＶＴＡ、および扁桃体におけるΔＦｏｓＢの増加をもたらすことが明らかにされた。エタノール、報酬、およびストレス応答に関与することが知られている脳領域におけるニューロン可塑性の増加を示す。 高濃度グループのBxNマウス（アルコール嗜好性の低下）は、EWにおけるニューロンの可塑性が低下しており、これらのニューロンがアルコール摂取に経験依存性の可塑性で反応することを示唆している。 低濃度群（持続的なアルコール嗜好性を示した）では、EWにおける神経可塑性は高濃度群および水分コントロール群よりも大きい。 異なるエタノール飲用パラダイムおよび遺伝的マウスモデルを用いて実施されたが、BxNマウスのEWにおける我々の発見は以前のエタノール消費研究と一致する。14,15]。 非節前性EWは、最近、眼球周囲運動症のウロコルチン（Ucn）含有ニューロンを含むと特徴付けられています。19]。 ＵｃｎＸＮＵＭＸは、ＣＲＦＸＮＵＭＸおよびＣＲＦＸＮＵＭＸ受容体に結合するコルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）様ペプチドである。 遺伝的、薬理学的、および病変のアプローチを用いた以前の研究は、Ucn1がアルコール摂取の調節に関与していることを示しています。19–22]。 Tこれは、げっ歯類における高アルコール摂取の既知の遺伝的素因であり、EWおよびLSiにおけるUcn1のより高い基礎レベルと相関する [23]。 したがって、高アルコール摂取を好むBxFマウスを摂取することに関してEWで観察された事後的意義の欠如は予想外であった。 おそらくこれは、B×N水群と比較してB×F水群のΔFosBレベルがわずかに上昇したためです。 実際、持続的なアルコール嗜好性を示すすべてのマウス（BxF高濃度グループ、BxF低濃度グループ、およびBxN低濃度グループ）のパーセントΔFosBレベルは非常に類似していた。
BxNについては、低濃度グループでのエタノール消費はVTAにおけるニューロンの可塑性を増加させた（高濃度グループおよび水コントロールグループよりも大きい）。 低濃度グループの方がエタノールの好みと消費量も大きかった。 我々が高アルコールを好みそして消費するＢｘＦマウスについてＶＴＡにおいて観察した事後有意性の欠如は予想外であり、そして水対照群におけるΔＦｏｓＢのわずかに高い基礎レベルのためであるかもしれない。 パーセントΔＦｏｓＢレベルは、Ｂ×Ｎ水グループと比較してＢ×Ｆ水グループにおいてわずかに上昇したが、パーセントΔＦｏｓＢレベルは、持続的なアルコール嗜好性を示す全てのマウスについて全く同様であった（ＢｘＦ高濃度グループ、ＢｘＦ低濃度グループ、およびＢｘＮ低濃度グループ）。 。 VTAドーパミン系はエタノールの強化効果を仲介することにおいて主要な役割を果たし、そしてエタノールおよび報酬に関連した行動にとって重要な多くの相互関係に参加する。24–26]。 さらに、VTAは扁桃核とEW核に射影します。 ラットはエタノールを直接VTAに自己投与することが示されています。27]. また、エタノール曝露はVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの発火率を増加させます[28,29]。 発火速度の増加は、我々がBxNにおける長期の自発的エタノール投与後に観察したVTAにおけるΔFosB誘導に関連している可能性がある。
アルコール依存は長期の神経適応を誘発し、その結果負の感情状態がもたらされます。 負の強化における重要なメカニズムは、扁桃体内の副腎皮質刺激ホルモン放出因子（CRF）シグナル伝達です。 [30]。 CeAにおけるニューロンの薬理学的操作は、GABA、CRF、オピオイド、セロトニン、ダイノルフィン、およびノルエピネフリン受容体を標的としています。25,31–34]。 GABA拮抗薬およびCRF拮抗薬はエタノール消費量を減少させる [32,33,35]. CeAの病変は連続アクセス自発的エタノール消費を減少させる [36]. 我々の調査結果はさらに規制アルコール飲酒行動におけるCeAの役割をサポートしています。 中心扁桃体のGABA作動性ニューロンは、その結合がそれらのペプチド含有量に関連しているように見える異種集団を形成する。 これらのGABA作動性ニューロンはCeAの出力活性を統合しています。 [でレビューされたとおりWee and Koob（2010]）、sいくつかの研究は、エタノールの摂取と維持におけるダイノルフィンとカッパオピオイド受容体の役割を特定しましたe [37]。 最近になって、Walkerらは、拡大扁桃体内のκ-オピオイド受容体拮抗薬、ノル - ビナルトルフィミンが依存性動物におけるエタノールの自己投与を選択的に減少させることを実証した。38]。 カッパオピオイド受容体シグナル伝達は、ストレス、報酬、および嫌悪の交差点における研究の重要な関心事であり続けている。 ストレス誘発性エタノール自己投与はカッパオピオイド受容体シグナル伝達によって媒介されることもまた証明されている。 [39]。 中心のCeAは、後嚢（CeL / CeC）と内側後腹部に細分することができます。 CeL / CeCのGABA作動性ニューロンはVTAからドーパミン作動性神経支配を受ける。 前述のように、これらのニューロンは急性エタノール投与後に活性化され、持続的なアルコール選択性を示すΔＦｏｓＢマウスの増加を示す。 また、Mc [花嫁（2002]）CeAとアルコールの効果に関する優れたレビュー40]。 我々の研究では、持続性アルコール嗜好性（低濃度群）のＢｘＮマウスはＣｅＣ ／ ＣｅＬにおいて増大したニューロン可塑性を示し、低アルコール嗜好性（高濃度群）のＬａおよびＢｘＮマウスはＣｅＭＰＶにおいて増大したニューロン可塑性を示す。 これらの結果は、特定のエタノール経験が扁桃体のGABA作動性ニューロンにおける可塑性を含むことを示唆している。 このデータを用いて、ＶＴＡおよびＥＷにおけるニューロン可塑性の対応する変化と共に、我々はこの回路が持続的アルコール嗜好条件下で有意な可塑性を受けることを提案する。
以前の研究では、C57BL / 6Jマウスは2本のボトルを飲むことで高い血中アルコール濃度を達成できることが示されていますが、これらの血中アルコール濃度は持続せず、飲酒はDole and Gentry（1984）によって示される薬理学的動機の基準を満たさないことが多い41,42]。 アルコール嗜好性の低下を示すBxNマウスは、典型的なC57BL / 6Jマウスから予想されるよりも少ない量を消費した。1]。 したがって、我々は血中アルコールサンプルを採取しなかったが、アルコール嗜好性の低下を示すBxNマウスが薬理学的に適切な血中アルコールレベルを達成したことはありそうもない。 BxF脳領域の事後結果（多重比較用に補正）が慢性エタノール摂取後のいかなる領域についてもΔFosB陽性ニューロンの割合に有意な変化を示さなかったとしても、群の非常に有意な効果がBxFにも存在することに留意することは重要である。これらの異なるスケジュールで。
変数間の潜在的な関係を視覚化するために、階層的クラスタリングを実施した。 得られた分析のヒートマップは、遺伝子型に関係なく、ΔFosBレベルとエタノール消費量の間の一般的な傾向を示しています。 より高いΔＦｏｓＢレベルは大量飲酒と関連し、より低いΔＦｏｓＢレベルは対照動物と関連した。 しかし、関係の強さは、ΔFosBレベルのみに基づいて飲酒表現型を正確に予測するのに十分ではなかった。
結論
2種類のF1ハイブリッド系統のマウスで、明確なアルコール自己投与行動が観察された：高濃度のアルコールでの経験後、BxNはアルコール嗜好性の低下を示し、BxFは持続的なアルコール嗜好性を示す。 BxFモデルは安定、高消費（持続的アルコール嗜好）およびBxNモデルは中程度の飲酒（減少したアルコール嗜好）。 神経可塑性の変化（ΔＦｏｓＢレベルによって測定される）は、脳領域特異的および遺伝子型特異的と同様に経験依存的であり、さらに神経回路を定義することはエタノール消費の動機付けの側面の根底にある。 これらの結果は、ハイブリッドマウスにおける1つの親系統の変化がアルコール消費のパターンの変化およびΔFosB発現のパターンの顕著な変化をもたらすことを示し、これは異なる脳ネットワークがこれらの異なるハイブリッドマウスに関与していることを示唆する。
メソッド
倫理
この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用のための指針の勧告に従って厳密に行われた。 このプロトコルは、テキサス大学オースティン校の施設内動物管理使用委員会（AUP 2010-00028）によって承認された。 全ての手術はペントバルビタールナトリウム麻酔下で行われ、そして全ての努力は苦痛を最小にするためになされた。
動物
ＣＸＮＵＭＸＢＬ ／ ＸＮＵＭＸＪおよびＦＶＢ ／ ＮＪまたはＮＺＢ ／ ＢＸＮＵＭＸＮＪマウス（ＢｘＦ ＦＸＮＵＭＸおよびＢｘＮ ＦＸＮＵＭＸ、母系株×父系株）のいずれかに由来する交雑雌性ＦＸＮＵＭＸハイブリッドマウスを用いて研究を行った。 C1BL / 57J、FVB / NJ、およびNZB / B6NJブリーダーは、The Jackson Laboratory（メイン州バーハーバー）から購入し、1-1週で交配した。 子孫は、各遺伝子型（B×F FXNUM X、B×N FX NUM X）の同性グループに引き離された。 以前に収集したデータとの比較を容易にするために、雌マウスのみをテストしました。1,5,6]。 マウスは、与えられた食物および水と共に標準ケージに収容された。 アドリブで。 コロニー室および試験室は、ＸＮＵＭＸ ｈ光：ＸＮＵＭＸ ｈ暗サイクル（ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸに点灯）であった。
二瓶選択エタノール選好試験
2ボトル選択法を用いて、雌BxFおよびBxNマウスにおける自発的エタノール自己投与パターンを決定した。1,6]。 ＦＸＮＵＭＸハイブリッド雌性マウス（年齢ＸＮＵＭＸ日）を、エタノール溶液の導入前に水を入れたシッパーチューブを有するボトルに１週間慣れさせながら、標準ケージに個別に収容した。 馴化後、マウスは２つの同一の瓶にアクセスした：１つは水を含み、もう１つはエタノール溶液を含む。 チューブの位置は、位置の好みを制御するために毎日変更されました。 潜在的な漏出および蒸発を説明するために、マウスを含まないコントロールケージ内のチューブから枯渇した平均重量を毎日個々の飲酒値から差し引いた。 実験を通して、マウスを1日ごとに体重測定した。 実験を通して、すべての水分消費量を毎日測定した。 消費されたエタノールの量およびエタノールの好みを各マウスについて計算し、これらの値をエタノールの濃度ごとに平均した。 BxFおよびBxNマウスの自己投与に対するアルコール濃度および禁断期間の影響は、高濃度へのアクセスを伴う実験群を指定することによって実証された（63-4％エタノール溶液へのアクセスの増加、続いて3、35の繰り返しサイクル）。 3％エタノール、および9％エタノールの最終発表で終わり、低濃度の別のグループ（18-27％エタノールへのアクセスの拡大、残りの実験は9％エタノールへのアクセスで実施）。 これらの各グループには、1週間に3週間の禁酒期間を経験した、または経験しなかったサブグループがありました。 対照マウスは実験用マウスと同時に同様の状態を経験したが、1本の水しか与えられなかった。
各ハイブリッドについて合計で５つのグループがあった：水（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ − ＸＮＵＭＸ）、高濃度（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、禁断期間を伴う高濃度（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、低濃度（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、および低濃度。禁断期間あり（n = 14） 図を参照 Figure11 詳細な2つの瓶選択グループスケジュールのために。
免疫組織化学および定量
ΔFosB免疫組織化学（IHC）は、水（コントロール）または水とアルコール[高濃度および低濃度]のいずれかに16日間連続してアクセスしたマウスの72の脳領域で測定されました。 エタノールの好みと消費に対する高濃度の影響は、禁欲の影響よりもはるかに大きかった。 したがって、禁欲期間を経験したグループは、ΔFosBIHC測定に含まれていませんでした。 さらに、実験は、持続的または減少したアルコール嗜好の最初の出現を超えて行われ、行動表現型がエタノール濃度変化の繰り返しサイクルで安定していることを示し、慢性的なエタノール消費の影響を調べた。 実験73日目にアルコールを除去してから175〜20時間後、マウスを深く麻酔し（0.01 mg / kgペントバルビタールナトリウム）、100mlの4Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、続いて4 mlの4％を心臓内に灌流しました。 PBS中のパラホルムアルデヒド。 脳を取り出し、3°Cで50％パラホルムアルデヒドで後固定し、30％アガロースに包埋し、ビブラトームで切片化し（30 um、冠状）、凍結防止剤（0.1％スクロース、4％エチレングリコール、20％ポリビニル）に入れました。 PBS中のピロリドン）を0.3°Cで一晩、IHC用に処理するまで-2°Cで保存しました。 解凍した切片をPBSで洗浄し、2％H3O4で処理し、3％正常ヤギ血清中で48時間インキュベートして、非特異的標識を最小限に抑えました。 次に、組織切片を、1％正常ヤギ血清および抗FosB（SC-5000、1：200希釈、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）中で1℃で一晩インキュベートした。 切片を洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギIg（200：0.05希釈、Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）で0.015時間インキュベートし、洗浄し、アビジン-ビオチン複合体（XNUMX：XNUMX希釈、Eliteキット-Vector Laboratories）でインキュベートしました。 。 ペルオキシダーゼ活性は、XNUMX％ジアミノベンジジン（XNUMX％Hを含む）との反応によって視覚化されました。2O2） 組織切片をニッスル対比染色した（メチレンブルー／アズールIIを使用）。 スライドを盲検計数用にコード化した。 ΔFosB-IRニューロンを、光学分画法およびStereoIn Investigatorコンピューターソフトウェアを使用して50X（油）倍率で計数した。 サンプリングパラメータ情報：計数枠（ＸＮＵＭＸｕｍ×ＸＮＵＭＸｕｍ×ＸＮＵＭＸｕｍ）は、定量化された全ての領域について同じであった。 ただし、50未満の変動係数を達成するために、両側の総細胞数が50〜10になるように、各脳領域のグリッドサイズを決定しました。 各領域について、ΔＦｏｓＢ陽性核の百分率（ΔＦｏｓＢ陽性核の数／ニューロン数）としてデータを計算した。
この研究で使用されたＦｏｓＢ抗体（ＳＣ − ＸＮＵＭＸ、サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、カリフォルニア）は、ＦｏｓＢの内部領域に対して惹起され、そしてＦｏｓＢおよびΔＦｏｓＢの両方を認識する。 この抗体はＦｏｓＢとΔＦｏｓＢの両方を認識するが、アルコールを含む乱用薬物はニューロンにおいてＦｏｓＢではなくΔＦｏｓＢを特異的に誘導することが示されているので、この研究で定量化された免疫陽性ニューロンはΔＦｏｓＢ陽性ニューロンと呼ばれる。 Ｐｅｒｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ。 （[[2008] FosBとΔFosBを認識する抗体（SC-48）とΔFosBに選択的な抗体（市販されていない）の2種類の抗体を使用して、（アルコールを含む乱用薬物の慢性投与に応じて）ΔFosB誘導を測定した。研究したところ、FosB抗体（SC-48）を用いて観察された免疫反応性は、完全長FosBに対して選択的な抗体を用いて免疫反応性ニューロンを検出しなかったため、ΔFosBによるものである［10]。 さらに、ΔFosBは、様々な慢性的な治療によって脳領域および細胞型に特異的な方法で誘導されることが知られており、このトピックに関する優れたレビューが利用可能です。11,43,44].
神経解剖学的構造の略語および位置
Il –辺縁下皮質（+1.70 mm）; Cg1 –帯状皮質1（+1.1 mm）; Cg2 –帯状皮質1（+1.10 mm）; NAccコア–側坐核コア（+1.10 mm）; NAccシェル–側坐核シェル（+1.10 mm）; LSi –外側中隔中間（+1.10 mm）; La –外側扁桃体（-1.22 mm）; Bla –基底外側扁桃体（-1.22 mm）; CeC / CeL –中央被膜および中央外側扁桃体（-1.22 mm）; CeMPV –扁桃体の中心核の内側後腹側部分（-1.22mm）。 PAG –赤道周囲の灰色（-3.64 mm）; EW –エディンガーウェストファル核（-3.64 mm）; VTA –腹側被蓋野（-3.64 mm）; DR –背側縫線核（− 4.60 mm）; PBN –傍小脳脚核（-5.2 mm）; NTS –孤束核（-6.96mm）。 定位座標におけるマウスの脳[45各脳領域の定量化のために、主観的に1〜3つのセクションを一致させるために使用した。
統計的手順
特記しない限り、データは平均±ＳＥＭとして報告されている。 データは正規分布でした。 統計は、Statisticaバージョン6（StatSoft、Tulsa、OK、USA）およびGraphPad Prismバージョン4.00（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）を用いて行った。 グループ間の差異を評価するために、エタノール消費量および選好データについて反復測定二元配置分散分析を行った。 グループ（高濃度、低濃度、および水）、脳領域、および遺伝子型についての相互作用および主な影響を評価するために、ΔFosBデータについて二元配置および三元配置の分散分析を行った。 多重比較のためのBonferroniの訂正およびBonferroniの事後分析は適切なときに行われた。 具体的には、ストレスと報酬の回路がマウスのFosBを増加させ、アルコール嗜好性の低下を示すと仮定した。 雑種交配ごとに、ピアソンのrを使用して、エタノール経験マウスにおけるΔFosBレベルとエタノール嗜好性および消費との間の有意な相関関係の存在を同定した。
データがどのように共変動するかを視覚化し、データがどのようにグループ化されるかを評価するために、階層的クラスタリングを実行しました。 代入された中央値は、欠けているパーセントΔFosBデータを置き換えたが、それはデータの15％を超えなかった。 帰属値が実際に観察された場合よりも不確実性の度合いは高いですが、階層的クラスタリング分析では、ケースごとの比較のために完全なメンバーシップまたは完全な削除が必要です。 階層的クラスタリングをWardの方法を用いて行い、得られたクラスターを主成分分析の第一主成分（JMP（登録商標）、バージョン8、SAS Institute Inc.、ノースカロライナ州ケアリー）によって順序付けした。 水およびエタノールを経験した群については、各脳領域のΔFosBデータをzスコア変換し、主成分分析を行ってクラスター数を決定した。 次に、教師付き階層的クラスタリング分析を使用して、データを脳の領域および個人ごとにまとめた。
著者の貢献
ARO、YAB、RAH、TAJは研究のデザインに貢献しました。 AROはデータを取得しました。 ARO、IP、RDMがデータを分析しました。 ARO、RDM、IP、TAJ、YAB、RAHが原稿の作成と修正に関わった。 著者全員が最終原稿を読み、承認しました。
謝辞
ありがとうございます。 Jody Mayfield氏とColleen McClung氏が有益な議論をし、Marni Martinez氏、Jennifer Stokes氏、Michelle Foshat氏、Jose Cienfuegos氏、Jamie Seymour氏、そしてDarshan Pandya氏が技術支援を受けています。 この研究は、アルコール依存症コンソーシアム助成金AA13520に関する統合神経科学イニシアチブ、ならびにアルコール乱用およびアルコール依存症助成金協会AA06399-SおよびAA16424によって支持された。
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