DeltaFosBは慢性アンフェタミン曝露後のc-fos遺伝子のエピジェネティックな脱感作を仲介する（2008）

ウィリアム・レンタル,¹ ティファニー・L・カール,¹ イアン迷路,¹ ハーバートE.コヴィントン、III,¹ ホアントラン・チュオン,¹ イムラン・アリバイ,¹ アーヴィンド・クマール,¹ ラスティ・L・モンゴメリー,² エリック・N・オルソン,² (NAIST) と エリックJ.ネストラー^1,*

レクリエーション用薬物の使用から慢性中毒への移行の根底にある分子メカニズムはよくわかっていません。 このプロセスに関与している分子の1つはΔFosBです。これは、薬物曝露を繰り返すと線条体に蓄積し、精神刺激薬や他の乱用薬物に対する感作行動反応を媒介する転写因子です。 ΔFosBが薬物誘発行動を調節する下流の転写メカニズムは完全には理解されていません。 ΔFosBが特定の遺伝子の発現を活性化するクロマチンリモデリングメカニズムを以前に報告しましたが、ΔFosBを介した遺伝子抑制のメカニズムは不明のままです。 ここでは、識別します c-fos、ΔFosBによって抑制される新規の下流標的として、精神刺激薬曝露後に線条体で急速に誘導される初期初期遺伝子。 慢性アンフェタミン治療後の線条体におけるΔFosBの蓄積が脱感作することを示す c-fos 後続の薬物用量へのmRNA誘導。 ΔFosBの脱感作 c-fos ヒストンデアセチラーゼ1（HDAC1）をリクルートすることによる発現 c-fos 遺伝子プロモーターは、周囲のヒストンを脱アセチル化し、遺伝子活性を減衰させます。 したがって、線条体のHDAC1の局所ノックアウトは、アンフェタミン誘発性の脱感作を無効にします c-fos 遺伝子。 コンサートでは、慢性のアンフェタミンはヒストンH3のメチル化を高めます c-fos プロモーター、H3ヒストンメチルトランスフェラーゼ、KMT1A / SUV39H1の発現レベルと同様に、遺伝子活性を抑制することで知られるクロマチン修飾。 この研究は、ΔFosBが明確な転写プログラムを媒介し、最終的に慢性アンフェタミン暴露に対する行動の可塑性を媒介する新規のエピジェネティックな経路を明らかにしています。

キーワード： 中毒、アンフェタミン、線条体、クロマチン、ヒストン修飾、遺伝子調節

RNAの分離と定量

凍結脳組織をTriZol（Invitrogen、Carlsbad、CA）で解凍し、製造業者のプロトコルに従って処理した。 RNAesy Microカラム（Qiagen、バレンシア、CA）でRNAを精製しました。 Superscript III（Invitrogen）を使用して、トータルRNAを逆転写しました。 次に、SYBR Green（ABI、フォスターシティ、CA）を使用してリアルタイムPCRを実行し、ΔΔCtメソッドを使用して定量しました。 見る 補足表 プライマーの完全なリストについては。

クロマチン免疫沈降（ChIP）

クロマチンを超音波処理してから免疫沈降させました（ 補足方法）Abcam（Cambridge、UK）のアセチル化ヒストン抗体（Millipore、Billerica、MA）、anti-HDAC1、またはanti-H3K9me2を使用し、anti-FosB（C-terminal）（Kumarら、2005）、抗FosB（N末端）（サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、カリフォルニア州、州）、またはウサギIgGコントロール（ミリポア）。 IPは、MilliporeのProtein Aビーズを使用して収集しました。 洗浄後、クロマチンをビーズから溶出し、プロテイナーゼKの存在下で逆架橋しました。その後、リアルタイムPCRを使用してDNAを精製および定量しました。

免疫沈降

PC12セルにV5タグ付きHDAC1（Montgomery et al。、2007）、FosB、または前述のΔFosB（Carle et al。、2007）。 細胞溶解物を分割し、非免疫IgG（Sigma）または抗FosB抗体（sc-48、Santa Cruz）のいずれかとともに4℃で一晩インキュベートしました。 プロテインGビーズ（Sigma）を使用して免疫沈降を行いました。 免疫沈降タンパク質をSDS-PAGEで分析し、カスタムポリクローナル抗FosB（N末端）抗体（Carle et al。、2007）および抗V5抗体（Abcam）。 HDAC1とΔFosBが結合パートナーであるかどうかを判断するには インビボの、繰り返しの電気けいれん発作を使用して、高レベルのΔFosBタンパク質（Hopeら、1994）。 皮質組織を慢性（7毎日）発作または偽処理ラットから解剖し、溶解し、抗HDAC1抗体（Abcam）を用いて上記のように免疫沈降させた。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

定位手術を使用して、マウスの腹側線条体に、示された遺伝子またはGFPを脳の反対側に発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）を感染させた。 アンフェタミン処理後、凍結脳を8 µm厚の冠状切片に加工し、膜スライド（Lieca、Wetzlar、Germany）にマウントしました。 AAVに感染した領域をレーザーで切開して（ライカ）非感染細胞を除外し、PicoPure RNA抽出キット（MDS、カリフォルニア州サニーベール）で処理しました。 RNAをRiboAmp HSキット（MDS）で増幅し、上記のように逆転写しました。 見る 補足方法 完全な詳細については。

ΔFosBの脱感作 c-fos 慢性アンフェタミン曝露後の線条体におけるmRNA誘導

脱感作かどうかを調べる c-fos mRNA発現はΔFosBによって制御される細胞適応です。ラットを生理食塩水または急性または慢性のアンフェタミンで処理し、1から10日間、ホームケージに引き込みます。 次に、生理食塩水またはアンフェタミンのチャレンジ投与後、ラットを1時間で分析しました。 前に示したように（参照 イントロダクション), c-fos mRNAは、急性アンフェタミン投与により線条体で4-foldを誘導した。 ただし、以前に慢性アンフェタミンに暴露したラットでは、 c-fos 5日間の薬物中止の間、薬物チャレンジに応じて大幅に減衰しました（図1A）、この脳領域でΔFosBが上昇し続けるポイント（Hopeら、1994）。 さらに、5日間にわたって慢性アンフェタミンから離脱したラットでは、基底 c-fos mRNAの発現は、生理食塩水で処理したコントロールで見られるレベルを下回りました（図1A）。 重要なのは、 c-fos アンフェタミンチャレンジへの誘導は、生理食塩水で処理された動物と比較して、離脱の1日目に著しく減衰した。 一緒に、これらの発見は、基礎と誘導の両方に対する慢性アンフェタミンの効果を示しています c-fos mRNAレベル。ただし、2つの効果は複雑な時間経過で発生します。

慢性アンフェタミン投与後のΔFosB蓄積が脱感作に直接寄与するかどうかを判断する c-fos 式、我々は最初にΔFosBのChIPを実行しました c-fos 線条体の遺伝子プロモーター。 に示すように 図1B c-fos プロモーターは、慢性アンフェタミン暴露後に結合したΔFosBが有意に多くなります。これは、少なくとも5日間の薬物中止で見られます。 これらのデータは、ΔFosB占有率を相関させます。 c-fos 速度が低下したプロモーター c-fos 遺伝子活性。 次に、ΔFosBが減少を引き起こすかどうかを直接テストする c-fos アンフェタミンチャレンジに応答した誘導では、線条体でAAVベクターを使用してΔFosBまたはコントロールとしてGFPを過剰発現させました。 次に、レーザー顕微解剖により感染した線条体を分離しました（図1C）およびqRT-PCRを実行しました c-fos mRNA。 かなり少ない c-fos AAV-GFPに感染した反対側と比較して、AAV-ΔFosBに感染した線条体組織にアンフェタミンの急性投与後に誘導されたmRNA β-チューブリン mRNAは変化しません（図1D） これらのデータは、 c-fos 脱感作は、慢性アンフェタミン暴露後のプロモーターへのΔFosBの蓄積によって媒介されます。

ΔFosBはHDAC1を c-fos 仲介するプロモーター c-fos 遺伝子抑制

ΔFosBが仲介するメカニズムを調べる c-fos 脱感作、我々はその時点に焦点を当てた c-fos 最も強く抑制された：慢性アンフェタミンからの離脱の5日間。 に関与する重要なメカニズム c-fos コカインを含むさまざまな刺激に反応した活性化（Kumarら、2005）、ヒストンのアセチル化です。 したがって、ヒストンのアセチル化が c-fos 遺伝子プロモーターは、急性アンフェタミンによっても誘発され、薬物への反復曝露がこの反応を減衰させたかどうか。 実際、急性アンフェタミンは、ヒストンH4アセチル化を増加させました c-fos プロモーター、および慢性アンフェタミン治療後、この誘導はもはや観察されなかった（図2A）。 H4の影響は観察されなかったため、H3のアセチル化は特異的でした（表示なし）。 これらのデータは、よりコンパクトで不活性なクロマチン構造に関連するヒストンのアセチル化の減少を示唆しています（コザリデス、2007）、の脱​​感作に貢献 c-fos 慢性アンフェタミン暴露後の遺伝子。 この仮説を直接テストするために、ラットを慢性アンフェタミンで治療し、5日間の離脱後、HDAC阻害剤、酪酸ナトリウムまたはそのビヒクルを投与しました。 酪酸ナトリウムはアンフェタミン誘発性の抑制を逆転させることがわかった c-fos 式（図2B）、低アセチル化という考えを直接支持する c-fos プロモーターは、遺伝子の脱感作の根底にある重要なメカニズムです。

ΔFosBがどのようにヒストンのアセチル化を阻害するかを理解する c-fos プロモーター、我々はΔFosBがヒストンのアセチル化を低下させる酵素、すなわちHDACと相互作用するかどうかを調査しました。 HDAC1とHDAC2は、これらの酵素がさまざまな転写因子と複合体を形成して遺伝子発現を抑制するため、最初に調査しました（グロジンガーとシュライバー、2002）。 予備的なChIP研究により、 c-fos プロモーター（以下を参照）、ただし検出可能なHDAC2はありません（表示なし）、免疫共沈降実験を実行して、ΔFosBがHDAC1と物理的に相互作用するかどうかを確認しました。 実際、ΔFosBの免疫沈降により、PC1細胞のHDAC12も引き下げられることがわかりました（図2D）。 重要なことに、この相互作用はΔFosBに特異的であり、全長FosBであり、慢性精神刺激薬の投与後に蓄積しません（Hopeら、1994）、HDAC1と対話しませんでした。 逆の実験を行いました インビボの 電気けいれん発作で大量のΔFosBを誘発することにより。 細胞培養データと一致して、HDAC1に対する抗体による免疫沈降は、脳組織からΔFosBを引き下げました（図2E).

ΔFosBとHDAC1が物理的に相互作用するというこれらの発見に基づいて ビトロ (NAIST) と インビボの、我々は、慢性アンフェタミンの後、ΔFosBがHDAC1を c-fos 遺伝子プロモーター。 確かに、線条体溶解物のChIPは、非常に高いレベルのHDAC1を c-fos 慢性アンフェタミン暴露後のプロモーター（図2C）、アンフェタミンはHDAC1の結合を変えませんでした β-アクチン 遺伝子プロモーター。 HDAC1が減衰に十分かどうかを直接判断するには c-fos 誘導、HEK293T細胞にHDAC1またはGFPをトランスフェクトし、5％血清で刺激しました（参照 補足方法）。 血清誘発性 c-fos HDAC1を過剰発現する細胞では発現が著しく鈍化した（図2F）。 これらの研究は延長されました インビボの 線条体の片側にAAV-GFPとAAV-CreGFPに感染したfloxed HDAC1マウスを使用して、 hdac1 対側線条体の遺伝子。 AAV-CreGFPが減少 Hdac1 感染組織（レーザーマイクロダイセクションによって分離）でのmRNA発現は、AAV-GFPを注入したコントロールと比較して75％以上 Hdac2 式は変更されませんでした（図2G）。 その後、マウスを慢性アンフェタミンで治療し、その後5日間薬物を中止しました。 マウスをアンフェタミン攻撃の30分後に分析し、感染した線条体領域を顕微解剖しました。 アンフェタミンが有意に多く誘発することがわかりました c-fos AAV-GFPと比較したAAV-CreGFPに感染した線条体組織のmRNA（図2G）、HDAC1が慢性アンフェタミン誘発性の抑制に必要であることを実証 c-fos 表現。 これらのデータは、慢性アンフェタミン治療後のラットにおけるΔFosBの蓄積により、より多くのΔFosBが c-fos プロモーター、HDAC1の補充、ヒストンのアセチル化の減少、最終的には遺伝子の活性の低下。

ヒストンのメチル化は c-fos 慢性アンフェタミン暴露後のプロモーター

遺伝子活性の抑制には、多くの場合、並行して発生するいくつかのエピジェネティックな修飾が含まれます（コザリデス、2007; Tsankovaら、2007）。 遺伝子活性の低下に関連する最も特徴的なヒストン修飾の1つは、リジン3でのヒストンH9のメチル化（H3K9）です。 このヒストン修飾は、プロモーター領域で見つかった場合、HP1（ヘテロクロマチンタンパク質1）などのコレプレッサーをリクルートすることにより、転写抑制に関連付けられています（コザリデス、2007）。 したがって、我々は c-fos 慢性アンフェタミン投与後に見られる遺伝子は、H3K9メチル化の変化とも関連しています。 この仮説と一致して、慢性アンフェタミンで治療されたラットの線条体組織で実行されたChIPは、ジメチル化されたH3K9（H3K9me2）が c-fos プロモーター（図3A）、で観察されない効果 β-アクチン 遺伝子プロモーター。 H3K9のメチル化を媒介する重要な酵素の1つはKMT1A / SUV39H1であり、この酵素の発現が慢性アンフェタミン暴露によって調節されているかどうかという問題を提起しました。 慢性アンフェタミンで治療したラットの線条体に対してqRT-PCRを実行し、 Kmt1a / Suv39h1 mRNA、異なるクロマチン修飾酵素、 Hdac5、影響を受けないまま（図3B）。 ただし、HDAC1とは異なり、共免疫沈降実験では、ΔFosBとKMT1A / SUV39H1の検出可能な相互作用は明らかにならず、メチルトランスフェラーゼの有意な濃縮も特定できませんでした c-fos ChIPによるプロモーター（図示せず）。 とにかく、これらの発見は、KMT1A / SUV39H1のアップレギュレーションがH3を過剰メチル化する可​​能性があることを示唆しています。 c-fos 削減メカニズムに貢献します c-fos 慢性アンフェタミン暴露後の遺伝子活性。

Supp1

この作業は、NIDAからの助成金によって支援されました

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