側坐核（2011）におけるオピオイドおよびカンナビノイド受容体を介したシグナル伝達に対するΔFosB過剰発現の影響

神経薬理学。 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

シム - セリーLJ, キャシディMP, スパルタA, Zachariou V, ネスラーEJ, Selley DE.

ソース

米国バージニア州リッチモンドのバージニアコモンウェルス大学医学部薬理・毒物学科および薬物アルコール研究所。

抽象

安定な転写因子ΔFosBは、側坐核（NAc）においていくつかの乱用薬物への長期曝露によって誘発され、線条体におけるΔFosBのトランスジェニック発現はモルヒネおよびコカインの価値のある特性を増強するe。ただし、これらの観測のメカニズムの基礎は不完全に理解されています。本発明者らは、ΔＦｏｓＢの誘導性発現を有する二形質転換マウスモデルを使用した。ドーパミンＮＡｃにおけるオピオイドおよびカンナビノイド受容体シグナル伝達に対するΔＦｏｓＢ発現の効果を決定するためのＤ（ＸＮＵＭＸ）受容体／ダイノルフィン含有線条体ニューロン。結果は、ミューオピオイド媒介Gタンパク質活性およびアデニリルシクラーゼの阻害が、ΔFosBを発現するマウスのNAcにおいて増強されたことを示した。 同様に、アデニリルシクラーゼのカッパオピオイド阻害は、ΔＦｏｓＢ発現マウスにおいて増強された。. 対照的に、カンナビノイド受容体媒介シグナル伝達は、ΔＦｏｓＢを過剰発現するマウスと対照マウスとの間で異ならなかった。 Tこれらの知見は、オピオイドおよびカンナビノイド受容体シグナル伝達がΔFosBの発現によって差次的に調節されることを示唆し、ΔFosB発現がNAcにおけるミューおよびカッパオピオイド受容体シグナル伝達の増強を介してその効果のいくつかをもたらし得ることを示す。

キーワード： Gタンパク質、アデニリルシクラーゼ、線条体

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はじめに

オピオイド受容体とカンナビノイドCB₁ 受容体（CB₁R）は、モルヒネ、ヘロイン、処方オピオイド、マリファナ（Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール（THC））。オピオイドとカンナビノイドの急性効果は、主にGを活性化するGタンパク質共役受容体によって媒介されます_{私は/ o} タンパク質を生成し、アデニリルシクラーゼの阻害などの下流エフェクター応答を生成します（Childers、1991, チルダーズら、1992, ハウレットら、2002）。 Δの運動、記憶障害および精神活性効果⁹-THCはCBによって生成されます₁R（Huestis、et al。、2001, Zimmerら、1999）、脳に広く分布し、大脳基底核、海馬、小脳に高レベルで存在します（Herkenham、et al。、1991）。最も臨床的に関連性が高く乱用されたオピオイド薬の鎮痛効果と報酬効果は、主にミューオピオイド受容体（MOR）によって媒介されます（Matthes、et al。、1996）、大脳辺縁系と脳幹が豊富です（マンスール他、1994）。腹側被蓋野（VTA）から側坐核（NAc）へのドーパミン作動性投射で構成される中脳辺縁系は、オピオイドとカンナビノイドの報酬効果に重要な役割を果たしています（BozarthとWise、1984, ヴァッカリーノ他、1985, ザンゲン他、2006）、およびその他の乱用薬物（Koob and Volkow、2010）。さらに、内因性オピオイドおよびカンナビノイドシステムは、複数のクラスの向精神薬の報酬効果に関与しています（マルドナド他、2006, Trigo、et al。、2010）。したがって、オピオイドとCBのメカニズムを解明することが重要です₁RシグナリングはNAcで規制されています。

薬物乱用分野の中心的な疑問は、向精神薬の急性から長期への移行を媒介するタンパク質を特定することでした。 AP-1転写因子ΔFosBは、特に興味深いものです。 フォス 乱用薬物または自然な報酬に繰り返しさらされると蓄積する遺伝子（McClung、et al。、2004, ネスラー、2008, ネスラー他、1999). 我々は、モルヒネに繰り返しさらされた後、ΔFosBが脳に誘導されることを発見しました。⁹-THC、コカインまたはエタノール、ΔFosB発現のユニークな局所パターンを生成する各薬物（ペロッティ他、2008）。薬物全体で一貫した所見は、線条体でΔFosBが高度に誘導されたことであり、4つの薬物すべてがNAcコアでΔFosBを誘導し、Δ⁹-THCは、NAcシェルおよび尾状核被殻における発現を有意に誘導した。

薬理学的研究により、ドーパミンDの同時投与が示された₁ 受容体（D₁R）拮抗薬SCH 23390は、コカインまたはモルヒネを断続的に投与した後のNAcおよび尾状核被殻におけるΔFosB誘導をブロックし、Dの潜在的な重要性を示唆しました₁R発現ニューロン（ミュラーとウンターワルド、2005, ナイ他、1995）。薬物媒介行動に対するΔFosB誘導の影響は、NAcおよび背側線条体の特定のニューロン集団でΔFosBを発現する二重トランスジェニックマウスを使用して調査されています（チェン他、1998）。ダイノルフィン/ DでΔFosBを発現するマウス₁NAcおよび背側線条体（線11A）のR陽性ニューロンは、乱用薬物に対する反応の変化、特にコカインまたはモルヒネの報酬効果に対する感度の向上（コルビー他、2003, ケルツ他、1999, ザチャリウ他、2006）。これらの変化は、MORまたはさまざまなGタンパク質サブユニットのレベルに変化がない場合に発生しました。ただし、ダイノルフィンmRNAレベルは、ΔFosB発現マウスのNAcで減少しました（ザチャリウ他、2006）、ΔFosBの1つの標的が内因性オピオイドペプチドをコードする遺伝子であることを示唆しています。 ΔFosBの誘導は、NAcの受容体シグナル伝達を調節することで行動の変化を引き起こす可能性もありますが、この可能性は調査されていません。したがって、現在の研究では、ダイノルフィン/ DでのΔFosBの過剰発現の有無を判断するために、バイトランスジェニックマウスモデルを使用しました。₁Rを含む線条体ニューロンは、NAcでMORを介したGタンパク質活性とMORおよびKORを介したアデニリルシクラーゼ阻害を変化させます。 CBに対するΔFosBの影響₁R媒介Gタンパク質活性も評価された⁹-THC投与はNAcにΔFosBを誘導します（ペロッティ他、2008）そして、内因性カンナビノイドシステムは、脳の報酬回路を調節することが知られています（ガードナー、2005, マルドナド他、2006）、しかし、内因性カンナビノイド系に対するΔFosBの効果は調査されていません。

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2。材料および方法

2.1。試薬

[³⁵S]GTPγS（1250 Ci / mmol）、[α-³²P] ATP（800 Ci / mmol）および[³H] cAMP（26.4 Ci / mmol）はPerkinElmer（Shelton、CT）から購入しました。 ATP、GTP、GDP、cAMP、ウシ血清アルブミン、クレアチンホスホキナーゼ、パパベリン、イミダゾールおよびWIN-55212-2は、Sigma Aldrich（セントルイス、ミズーリ州）から購入しました。 GTPγSはRoche Diagnostic Corporation（シカゴ、イリノイ州）から購入しました。 DAMGOは、国立薬物乱用研究所（メリーランド州ロックビル）の薬物供給プログラムによって提供されました。 Econo-1シンチレーション液は、Fisher Scientific（ジョージア州ノークロス）から入手しました。 Ecoliteシンチレーション液は、ICN（Costa Mesa、CA）から入手しました。他のすべての化学物質は、Sigma AldrichまたはFisher Scientificから入手しました。

2.2。マウス

NSE-tTA（ラインA）×TetOp-ΔFosB（ライン11）に由来するオスのトランスジェニックマウスは、Kelz et al。（ケルツ他、1999）。導入遺伝子の発現を抑制するために、ドキシサイクリン（飲料水中の100 µg）で二遺伝子導入マウスを考案し、飼育しました。 8週齢では、トランスジーン発現を可能にするためにマウスの半分でドキシサイクリンを水から省き、残りのマウスはトランスジーンを抑制するためにドキシサイクリンで維持されました。脳は8週間後に収集され、ΔFosBの転写効果が最大になる時間（McClungとNestler、2003）。 c-JunのドミナントネガティブアンタゴニストであるΔc-JunがD₁R /ダイノルフィンとD₂線条体、海馬および頭頂皮質のR /エンケファリン細胞（ピークマンら、2003）。 C-Junおよび関連するJunファミリータンパク質はFosファミリータンパク質と二量体化し、標的遺伝子のAP-1部位に結合して転写を調節します。ただし、c-Jun（Δc-Jun）のN末端の切断により、複合体は転写的に不活性になり、活性なAP-1複合体のDNA結合を妨害することができます。 NSE-tTA（ラインA）×TetOp-FLAG-Δc-Jun（ラインE）に由来するオスのトランスジェニックマウスを、Peakman et al。（ピークマンら、2003）。導入遺伝子の発現を抑制するために、ドキシサイクリン（飲料水中の100 µg）で二遺伝子導入マウスを考案し、飼育しました。子犬を3週で離乳し、遺伝子型を調べ、グループに分けました。ドキシサイクリンを含む水で維持し、FLAG-Δc-Jun発現を誘導するために通常の飲料水で半分を維持しました。脳は6週間後に収集され、FLAG-Δc-Junの最大レベルが測定された時間（ピークマンら、2003）。すべての動物の手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。

2.3。膜の準備

脳は、アッセイの日まで-80℃で保存した。アッセイの前に、各脳を解凍し、NAcを氷上で解剖しました。各サンプルを50 mM Tris-HCl、3 mM MgClでホモジナイズしました₂、1 mM EGTA、pH 7.4（膜バッファー）、20°Cでのガラスホモジナイザーからの4ストローク。ホモジネートを48,000×で遠心分離しました g 4°Cで10分、膜バッファーに再懸濁、48,000で再度遠心分離× g 4°Cで10分、50 mM Tris-HCl、3 mM MgClに再懸濁₂、0.2 mM EGTA、100 mM NaCl、pH 7.4（アッセイバッファー）。タンパク質レベルは、ブラッドフォードの方法（ブラッドフォード、1976）ウシ血清アルブミン（BSA）を標準として使用。

2.4。アゴニスト刺激[³⁵S]GTPγSバインディング

膜は、アッセイバッファー中のアデノシンデアミナーゼ（10 mU / ml）を用いて30°Cで3分間プレインキュベートしました。次に、膜（5–10 µgタンパク質）を2％（w / v）BSA、30 nMを含むアッセイバッファーで0.1°Cで0.1時間インキュベートしました[³⁵S]GTPγS、30 µM GDP、およびアデノシンデアミナーゼ（3 mU / ml）、適切な濃度のDAMGOまたはWIN55,212-2の有無。 20 µMGTPγSを使用して非特異的結合を測定しました。インキュベーションは、GF / Bグラスファイバーフィルターでのろ過、3 ml氷冷3 mM Tris-HCl、pH 50での7.4洗浄により終了した。結合放射能は、Econo-1シンチレーション液でフィルターを一晩抽出した後、液体シンチレーション分光光度法で測定しました。

2.5。アデニリルシクラーゼアッセイ

メンブレン（5–25 µgタンパク質）を上記のようにアデノシンデアミナーゼとプレインキュベートした後、15µMフォルスコリンの存在下または非存在下で、DNUMO、U30HまたはWIN1-50,488を含むアッセイバッファーで55,212 2 µM ATP、[α-³²P] ATP（1.5 µCi）、0.2 mM DTT、0.1％（w / v）BSA、50 µMサイクリックAMP、50 µM GTP、0.2 mMパパベリン、5 mMホスホクレアチン、20単位/ mlクレアチンホスホキナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ（3 mU / ml）100 µlの最終ボリューム。これらの条件下で、合計[α-³²回収されたP] cAMPは一般に、添加された[α-³²P]各サンプルのATP。 3分煮沸することにより反応を終了し、[³²P] Cyclic AMPは、Salomonのデュアルカラム（Dowexとアルミナ）メソッド（サロモン、1979） [³H] cAMP（10,000 dpm）を内部標準としてカラムクロマトグラフィーの前に各チューブに加えました。放射能は液体シンチレーション分光光度法（45％効率 ³H）4.5 mlの溶出液を14.5 mlのEcoliteシンチレーション液に溶解した。

2.6 データ分析

特に指定のない限り、データは4–8の個別の実験の平均値±SEとして報告されます。各実験は3回実行されました。ネット刺激[³⁵S]GTPγS結合は、アゴニスト刺激結合から基底結合を引いたものとして計算されます。正味のフォルスコリン刺激アデニリルシクラーゼ活性は、フォルスコリン刺激活性-基礎活性（pmol / mg / min）として定義されます。フォルスコリン刺激アデニリルシクラーゼ活性の阻害率は、（アゴニスト非存在下での正味フォルスコリン刺激活性–アゴニスト存在下での正味フォルスコリン刺激活性/アゴニスト非存在下での正味フォルスコリン刺激活性）×100として定義されます。すべての曲線近似および統計分析は、Prism 4.0c（GraphPad Software、Inc.、サンディエゴ、CA）を使用して実行されました。濃度効果曲線を反復非線形回帰により分析して、ECを取得しました₅₀ とE_マックス値。濃度効果データの統計的有意性は、主要因としてアゴニスト用量と遺伝子誘導（オンまたはオフ）を使用して、二元配置分散分析（ANOVA）によって決定されました。カーブフィット値の統計的有意性（E_マックスまたはEC₅₀）ECの不等分散（F検定で検出）を修正するために必要な場合は、ウェルチの修正またはデータの平方根変換を使用して、対応のない両側スチューデントのt検定によって決定されました。₅₀ 値。

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3。結果

3.1。オピオイドおよびカンナビノイド受容体を介したGタンパク質活性化に対するΔFosB発現の影響

MOR-またはCBを判断するには₁R媒介Gタンパク質活性化は、アゴニストで刺激されたNAcのΔFosBの誘導性トランスジェニック発現により変化した[³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、ΔＦｏｓＢ導入遺伝子を条件付きで発現する（ΔＦｏｓＢオン）または発現しない（ΔＦｏｓＢオフ）二重トランスジェニックマウスのこの領域から調製した単離膜で調べた。 MOR選択的エンケファリンアナログDAMGOを使用してMORを活性化し、カンナビノイドアミノアルキルインドールWIN55,212-2を使用してCBを活性化した₁R.これらのリガンドは、MORおよびCBで完全なアゴニストであることが以前に示されました。₁R、それぞれ（ブレイボゲル他、1998, セリー他、1997）。げっ歯類の脳ではシグナルが低すぎるため、KORを介したGタンパク質活性を調べることはできませんでした（チルダーズら、1998）。結果は、マウスのΔFosBoffおよびΔFosBからのNAcのDAMGOおよびWIN55,122-2によるGタンパク質活性の濃度依存性刺激を示しました（図1）。 DAMGOで刺激されたアクティビティ（図1A）、濃度効果データの双方向ANOVAは、ΔFosBステータス（p <0.0001、F = 22.12、df = 1）およびDAMGO濃度（p <0.0001、F = 29.65、df = 5）の有意な主効果を明らかにしました。有意な相互作用（p = 0.857、F = 0.387、df = 5）。濃度効果曲線の非線形回帰分析により、大幅に大きいDAMGOEが明らかになりました。_マックスマウスのΔFosBの値（E_マックス = 73±5.2％刺激）ΔFosBoffマウス（E_マックス = 56±4.1％の刺激; スチューデントのt検定によるマウスのΔFosBとはp <0.05異なる）。 DAMGO EC₅₀ ΔFosBonマウスとΔFosBoffマウスの間で値は異ならなかった（それぞれ302±72 nM対212±56 nM、p = 0.346）。

アゴニスト刺激に対するΔFosB発現の影響[³⁵NAcにおけるS]GTPγS結合。 ΔFosB発現（ΔFosBオン）またはコントロール（ΔFosBオフ）マウスの膜を、さまざまな濃度を使用する方法で説明したようにアッセイしました ...

MORアゴニストDAMGOで得られた結果とは対照的に、カンナビノイドアゴニストWIN55,212-2（図1B）。 WIN55,212-2濃度効果データの双方向ANOVAは、WIN55,212-2濃度の有意な主効果（p <0.0001、F = 112.4、df = 7）を明らかにしましたが、ΔFosBステータス（p = 0.172）ではありませんでした。、F = 1.90、df = 1）、相互作用はありませんでした（p = 0.930、F = 0.346、df = 7）。同様に、WIN55,212-2Eに対するΔFosBステータスの影響はありませんでした。_マックス値（103±6％対108±8％刺激のΔFosBオンおよびオフマウス、それぞれ、p = Studentのt検定による0.813）またはEC₅₀ 値（103±20 nM対170±23 nM、それぞれΔFosBオンおよびオフマウス、p = 0.123）。

曲線の形状と、以前の研究で脳内の二相性WIN55,212-2濃度効果曲線が示されているという事実に基づいて（ブレイボゲル他、1999, ブレイボゲル他、1998）、WIN55,212-2曲線も2サイトモデルを使用して分析されました。平均化されたデータの分析により、2サイトモデルを使用した適合度のわずかな改善が示されました（R² = 0.933および0.914、二乗和=シングルサイトモデル（RでのΔFosBオンおよびオフマウスの3644および5463）² = 0.891と0.879、平方和=それぞれΔFosBのオンとオフのマウスの6561と6628）。しかし、どちらのEでもΔFosBのオンとオフのマウスの間に有意差は見られません_マックスまたはEC₅₀ 高または低効力サイトの値（補足表1）、ECが低下する傾向がありましたが₅₀ ΔFosBをオンにしたマウスの高効力部位の値（EC₅₀高いです = 28.0±10.6 nM）とΔFosBオフ（EC₅₀高いです = 71.5±20.2 nM; p = 0.094）。さらに、ΔFosBステータスが基底に及ぼす影響はなかった[³⁵NAc膜におけるS]GTPγSの結合（253±14対226±14 fmol / mgのΔFosBオンおよびオフマウス、それぞれp = 0.188）。これらのデータは、マウスのNAcにおけるΔFosBの誘導性トランスジェニック発現が、CBに有意な影響を及ぼすことなくMOR媒介Gタンパク質活性化を増加させたことを示しています₁R媒介または基礎Gタンパク質活性。

3.2。オデオイドおよびカンナビノイド受容体を介したアデニリルシクラーゼの阻害に対するΔFosBの効果

MORおよびCBによる下流エフェクター活性の調節に対するΔFosBの誘導性トランスジェニック発現の効果を評価する₁R、1 µMフォルスコリン刺激アデニリルシクラーゼ活性の阻害をNAc膜で調べました。 MOR-およびCBに加えて₁アデニリルシクラーゼ活性のR媒介阻害、KOR活性の効果も、KOR選択的完全アゴニストU50,488（朱ら、1997）、以前の結果はダイノルフィンmRNAがバイトランスジェニックモデルのΔFosBの標的であることを示したため（ザチャリウ他、2006）。結果は、DAMGO、U50,488、およびWIN55,212-2がそれぞれ、マウスのΔFosBoffおよびΔFosBの両方でアデニリルシクラーゼ活性の濃度依存性阻害を生成することを示しました（図2）。 DAMGO濃度効果データの二元配置分散分析（図2A）ΔFosBステータス（p = 0.0012、F = 11.34、df = 1）およびDAMGO濃度（p <0.0001、F = 29.61、df = 6）の有意な主効果を明らかにしましたが、有意な相互作用はありません（p = 0.441、F = 0.986 、df = 6）。 DAMGO濃度効果曲線の非線形回帰分析により、大幅に低いDAMGOECが明らかになりました。₅₀ ΔFosBオフマウス（101±11 nM、スチューデントのt検定によるp <510）と比較したマウスのΔFosB（182±0.05 nM）の値。ただし、DAMGOEには有意差はありませんでした。_マックス値（20.9±1.26％対ΔNUMos±19.8％のΔFosBオンおよびオフマウスの阻害、それぞれp = 1.27）。

NAcにおけるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に対するΔFosB発現の効果。 1 µMの存在下での方法に記載されているように、ΔFosB発現（ΔFosBオン）またはコントロール（ΔFosBオフ）マウスの膜をアッセイしました。 ...

KORを介したアデニリルシクラーゼ阻害は、ΔFosBの誘導性トランスジェニック発現の関数としても異なっていた（図2B）。 U50,488濃度効果データの双方向ANOVAは、ΔFosBステータス（p = 0.0006、F = 14.53、df = 1）およびU50,488濃度（p <0.0001、F = 26.48、df = 3）の有意な主効果を示しました。、有意な交互作用なし（p = 0.833、F = 0.289、df = 3）。濃度効果曲線の非線形回帰分析により、U50,488Eが大きいことが明らかになりました。_マックス ΔFosBオフマウス（18.3±1.14％阻害;スチューデントのt検定によるΔFosBオンとはp <12.5異なる）と比較したマウスのΔFosBの値（2.03±0.05％阻害）、U50,488ECに有意差なし₅₀ 値（310±172 nM対225±48 nM、それぞれΔFosBオンおよびオフマウス、p = 0.324）。

MORおよびKORで観察された効果とは対照的に、カンナビノイドアゴニストWIN55212-2によるアデニリルシクラーゼの阻害に対する誘導性トランスジェニックΔFosB発現の有意な効果はありませんでした（図2C）。 WIN55,212-2濃度効果データの二元配置分散分析は、薬物濃度の有意な効果（p <0.0001、F = 23.6、df = 2）を示しましたが、ΔFosBステータス（p = 0.735、F = 0.118、df）ではありませんでした。 = 1）有意な相互作用もありませんでした（p = 0.714、F = 0.343、df = 2）。さらに、アゴニストの非存在下では、基底またはフォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼ活性に対するΔFosB状態の影響はありませんでした。基礎アデニル酸シクラーゼ活性は、マウスのΔFosBで491±35 pmol / mg / minであったのに対し、ΔFosBオフマウスでは546±44でした（スチューデントのt検定によるp = 0.346）。同様に、1 µMフォルスコリンの存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性は、マウスのΔFosBでは2244±163 pmol / mg / minでしたが、ΔFosBオフマウスでは2372±138 pmol / mg / minでした（p = 0.555）。

3.3。アデニリルシクラーゼのオピオイドおよびカンナビノイド受容体媒介阻害に対するΔcJunの効果

ΔFosBの誘導性トランスジェニック発現は、NAcのMORおよびKORからアデニリルシクラーゼへの阻害シグナル伝達を増強したため、ΔFosBを介した転写のドミナントネガティブ阻害剤がオピオイド受容体シグナル伝達を逆の方法で調節するかどうかを判断することが重要でした。この疑問に対処するために、DAMGOおよびU50,488によるフォルスコリン刺激アデニリルシクラーゼ活性の阻害を、ΔcJunを条件付きで発現する二重導入マウスのNAcから調製した膜で調べました。結果は、MORまたはKORによるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に対するΔcJun発現の有意な効果を示さなかった（図3）。 DAMGO濃度-効果曲線の双方向ANOVAは、DAMGO濃度の有意な主効果を示しました（p <0.0001、F = 20.26、df = 6）が、ΔcJunステータスではありません（p = 0.840、F = 0.041、df = 1）有意な相互作用はありませんでした（p = 0.982、F = 0.176、df = 6）。同様に、Eに有意差はありませんでした_マックスまたはEC₅₀ ΔcJunがオンのマウス間の値（E_マックス = 23.6±2.6％; EC₅₀ = 304±43 nM）またはΔcJunoff（E_マックス = 26.1±2.5％、p = 0.508; EC₅₀ = 611±176nM、p = 0.129）。同様の結果がU50,488でも見られ、濃度効果曲線の二元配置分散分析は濃度の有意な効果を示しました（p <0.0001、F = 11.94、df = 6）が、ΔcJunステータスの効果は示しませんでした（p = 0.127 、F = 2.391、df = 1）、有意な相互作用はありませんでした（p = 0.978、F = 0.190、df = 6）。同様に、Eに有意差はありませんでした_マックスまたはEC₅₀ ΔcJunがオンのマウス間の値（E_マックス = 14.8±2.9％; EC₅₀ = 211±81 nM）またはオフ（E_マックス = 16.7±1.8％、p = 0.597; EC₅₀ = 360±151 nM、p = 0.411）。

NAcにおけるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に対するΔcJun発現の効果。 ΔcJun発現（ΔcJunon）またはコントロール（ΔcJunoff）マウスの膜をDAMGO（A）、U50,488H（B）またはWIN55,212-2の存在下でインキュベートしました ...

ΔcJunの発現は、カンナビノイドアゴニストによるNAcのアデニル酸シクラーゼの阻害にも有意な影響を与えませんでした。 WIN55,212-2濃度効果曲線の双方向ANOVAは、WIN55,212-2濃度の有意な主効果を示しましたが（p <0.0001、F = 15.53、df = 6）、遺伝子型ではありません（p = 0.066、F = 3.472、df = 1）、有意な相互作用はありませんでした（p = 0.973、F = 0.208、df = 6）。同様に、WIN55,212-2Eには有意差はありませんでした。_マックス値（それぞれ、マウスのΔcJunオンとオフの13.0±2.3％および13.6±0.9％阻害、p = 0.821）およびEC₅₀ 値（それぞれ、ΔcJunオンマウスとオフマウスの208±120 nMおよび417±130 nM、p = 0.270）。したがって、ΔcJunを発現するマウスではWIN55,212-2の効力が低下する傾向がわずかにありましたが、導入遺伝子はアデニリルシクラーゼのカンナビノイド阻害を有意に変更しませんでした。さらに、基礎またはフォルスコリンで刺激されたアデニリルシクラーゼ活性に対するΔcJun状態の影響はなかった。基礎アデニリルシクラーゼ活性は、それぞれΔcJunがオンまたはオフのマウスで1095±71 pmol / mg / minおよび1007±77 pmol / mg / min（p = 0.403）でした。 1 µMフォルスコリンによって刺激されたアデニリルシクラーゼ活性は、それぞれΔcJunがオンまたはオフのマウスで、4185±293 pmol / mg / min対4032±273 pmol / mg / min（p = 0.706）でした。

3.4。討論

この研究の結果は、ダイノルフィン/ DにおけるΔFosBの誘導性トランスジェニック発現を有するマウスのNAcにおけるMOR媒介Gタンパク質活性化の増強とアデニリルシクラーゼの阻害を明らかにしました。₁Rを含むニューロン。アデニリルシクラーゼ活性のKOR媒介阻害は、ΔFosB発現マウスのNAcでも増強されており、ΔFosBがNAcの内因性オピオイド系を調節することを示唆している。ダンゴE_マックス MOR刺激の値は大きかった[³⁵S]GTPγS結合、およびそのEC₅₀ ΔFosB過剰発現マウスでは、コントロールマウスと比較して、アデニリルシクラーゼ阻害の値が低かった。これらの発見は、検討されたアッセイ条件下でのGタンパク質活性化ではなく、エフェクター調節のための受容体予備の可能性を示唆している。 KORアゴニストによるアデニリルシクラーゼの最大阻害がΔFosB発現の影響を受けるという発見は、マウス脳の低レベルのKOR結合部位と一致する、KORを介した応答に対する受容体の低い予備を示唆しています（ウンターワルド他、1991）。対照的に、CB₁R媒介Gタンパク質活性およびアデニリルシクラーゼの阻害は、ΔFosB発現の影響を受けませんでした。 オピオイド系とカンナビノイド系は、これらのNAcニューロンのΔFosBに対する応答が異なることを示唆しています。

オピオイド受容体を介したシグナル伝達に対するΔFosBの効果は、線条体におけるΔFosB発現がモルヒネの急性および慢性効果を変化させたという以前の報告と一致していますザチャリウ他、2006）。その研究の1つの発見は、ダイノルフィン/ DでΔFosBのトランスジェニック発現を持つマウス₁R線条体ニューロンは、コントロールよりも場所の条件付けにおいてモルヒネに対してより感受性が高かった。さらに、この効果は、NAcへの部位特異的注射によるΔFosBのウイルス媒介発現により模倣された。これらの観察結果は、NAcで強化されたMORシグナル伝達を示す現在の結果と一致しています。

以前にコードする遺伝子を特定しました ΔFosBのターゲットとしてのダイノルフィン、およびダイノルフィンの減少は、ΔFosB二重トランスジェニックマウスにおけるモルヒネの報酬特性の向上と一致することを提案しました (ザチャリウ他、2006）。現在の結果は、NAcにおけるアデニリルシクラーゼのKOR媒介阻害がΔFosB発現マウスで増強されていることを示しており、これはダイノルフィンの減少後のKOR感度の代償的増加を反映している可能性がある。これまでの研究では、NAcを含むプロジノルフィンノックアウトマウスの特定の脳領域でKORが上方制御されていることが示されています（クラーク他、2003).

ΔFosBとは対照的に、ΔFosB結合パートナーcJunのドミナントネガティブトランケート変異体であるΔcJunの誘導性トランスジェニック発現は、MORまたはKORアゴニストによるアデニリルシクラーゼ阻害を変化させなかった。これらの結果は、比較的低いΔFosB発現の基礎レベルは、NAcにおけるこのレベルのシグナル伝達でオピオイド受容体シグナル伝達を維持するのに重要な役割を果たさないことを示唆しています。モルヒネの条件付けされた報酬効果が、以前の研究でΔcJun発現によって減少したという事実（ザチャリウ他、2006）コンディショニング手順中のΔFosBのモルヒネ誘導は、薬物に対する行動反応の調節に重要であること、またはオピオイド受容体による近位シグナル伝達に影響を与えるもの以外のΔFosBの転写効果がオピオイド報酬に影響する可能性があることを示唆しているいずれにせよ、本研究の結果は明らかに、線条体ダイノルフィン/ DのΔFosB発現が基底レベルを超えて上昇した場合₁R発現ニューロン、MORとKORのNAcにおけるアデニリルシクラーゼの阻害へのカップリングの堅牢な増加があります。

MORおよびKORを介したシグナル伝達がΔFosBの過剰発現によって増強されるメカニズムは不明ですが、我々は以前に[³H]ナロキソンの結合は、ΔFosBオンマウスとオフマウスのNAcに違いはありません（ザチャリウ他、2006）。同じ研究により、Gα_i1および2タンパク質レベルは、ΔFosB発現によるこの領域の影響を受けませんでした。しかし、以前の遺伝子発現アレイ解析では、Gα_o mRNAはマウスのΔFosBのNAcで上方制御された（McClungとNestler、2003）。タンパク質レベルでのGタンパク質サブユニット発現および多くのGタンパク質調節タンパク質の発現に対するトランスジェニックΔFosB発現の効果を包括的に調べることは、今後の研究で興味深いでしょう。

ΔFosB発現がCBを増強しなかったことは興味深い₁NAcのR媒介シグナル伝達。 CBの変更が可能です₁Rシグナル伝達は、NAc準備全体では不明瞭なニューロンの離散集団で発生します。例えば、Δの投与⁹– THCは、NAcのシェルではなくコアにΔFosBを有意に誘導しました（ペロッティ他、2008）私確かに、Δでの挑戦が示されています⁹-Δの繰り返し投与後のTHC⁹-THCはNAcコアのドーパミン放出を増加させましたが、シェルの放出を減少させました (カドニら、2008）。また、バイトランスジェニックマウスの11A系統は、ダイノルフィン/ DでのみΔFosBを発現することに注意することも重要です₁線条体のR陽性中型有棘ニューロン、ただしCB₁Rはダイノルフィン/ Dの両方で表されます₁Rおよびエンケファリン/ D₂R陽性線条体ニューロン（ホーマンとヘルケンハム、2000）、および皮質求心性神経の末端（ロベ他、2001）。 ΔFosBを介した転写のドミナントネガティブレギュレーターであるΔcJunの発現も、カンナビノイド受容体シグナル伝達に有意な影響を与えませんでしたが、ΔcJunは両方のD₁ とD₂-これらのマウスにおける中型有棘ニューロンの集団（ピークマンら、2003）。しかし、MORとKORの結果が示唆するように、ΔcJunが受容体シグナル伝達に影響を与えないように、ΔFosBの基礎発現が十分に低い可能性があります。また、CB₁Rシグナル伝達は基底ΔFosB発現によって適度に増強されるため、ΔFosB発現をさらに増加させるか、ΔcJunでその作用をブロックすると、統計的有意性のレベルに達しないわずかな効果しかありません。この解釈の間接的なサポートは、WIN55,212-2 ECを比較することで確認できます₅₀ ΔcJun対ΔFosBを発現するマウス間の値。 WIN55,212-2 ECの比率₅₀ ECにΔcJunの発現を誘発したマウスにおけるアデニリルシクラーゼ阻害の値₅₀ ΔFosBの発現が誘導されたマウスでのGタンパク質活性化の値は4.0でしたが、どちらの導入遺伝子も誘導されていないマウスでの同じ比率は1.2でした。

あるいは、カンナビノイドは、CBに直接影響することなくΔFosB発現を誘導する₁Rシグナリング。このシナリオでは、カンナビノイドは、ΔFosBを介した転写制御を介して、他の薬物の向精神作用に対する反応性を調節できます。私実際、Δの管理⁹-THCは、オピオイドとアンフェタミンに対する交差感作を引き起こします（カドニら、2001, ラマーク他、2001）、この仮説と一致します。さらに、本研究でΔFosBを誘導的に発現するマウスと同様に、カンナビノイドアゴニストCP55,940を繰り返し投与すると、NAcでMORを介したGタンパク質活性化が増加することが報告されました（Vigano、et al。、2005）。 Δに対するΔFosB発現の影響⁹-THCを介した行動は評価されていませんが、現在の結果は相互作用を排除していません。この結果と以前の調査（ザチャリウ他、2006）線条体におけるMORおよびKOR /ダイノルフィンのΔFosB誘発変化を示します。 Δの報酬効果⁹-THCは、場所の嗜好によって測定されるように、MORヌルマウスでは廃止されますが、KORの削除はΔ⁹-THCの嫌悪感と明らかなΔ⁹-THC場所設定（ゴーズランドら、2002）。同様に、Δに対する条件付き場所嫌悪⁹-THCは、野生型マウスと比較してプロダイノルフィンノックアウトでは存在しません（Zimmerら、2001）。これらのデータは、Δ⁹-THCは、ΔFosB誘導と、それに続くダイノルフィン発現の減少を伴うMORシグナル伝達の誘導後に、より価値のあるものになる可能性があります。

まとめでy、この研究の結果は、DにおけるΔFosBの発現₁R /ダイノルフィン陽性線条体ニューロンは、NAcのアデニリルシクラーゼ活性のGタンパク質媒介阻害のレベルでMORおよびKOR媒介シグナル伝達を強化しました。この発見は、報酬における内因性オピオイド系の役割を実証した研究と一致しています（Trigo、et al。、2010）、および報酬に対するΔFosB媒介効果の潜在的なメカニズムを提供する。対照的に、CB₁NAcのRを介したシグナル伝達は、調べた条件下で線条体のΔFosB発現による有意な影響を受けませんでしたが、内在性カンナビノイドシステムに対するΔFosB誘導の効果を決定するにはさらなる研究が必要です。

研究ハイライト

MORシグナル伝達はΔFosBを発現するマウスの側坐核で増強される
アデニリルシクラーゼのKOR阻害は、ΔFosBを発現するマウスでも強化されます
ΔFosBの発現はCBを変化させません₁側坐核におけるRシグナル伝達

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補足資料

01

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謝辞

著者は、Hengjun He、Jordan Cox、およびAaron Tomarchioの[³⁵S]GTPγS結合アッセイ。この調査は、USPHS GrantsのDA014277（LJS）、DA10770（DES）、およびP01 DA08227（EJN）によってサポートされました。

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脚注

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