慢性コカインに対する（ヒト）行動的および構造的応答は側坐核殻（2013）におけるΔFosBおよびカルシウム/カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼIIを含むフィードフォワードループを必要とする

J Neurosci. 2013年3月6日;33(10):4295-4307.

ロビソン AJ、ヴィアル V、マゼイ・ロビソン M、フェン J、クールリッチ S、コリンズ M、ウィー S、クーブ G、トゥレッキ G、ネーヴ R、トーマス M、ネスラー EJ。

ソース

フィッシュバーグ神経科学・フリードマン脳研究所、マウントシナイ医学部、ニューヨーク、ニューヨーク、10029、神経科学・心理学、ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ55455、中毒性障害の神経生物学委員会カリフォルニア州ラホーヤのスクリップス研究所、カナダのケベック州モントリオールのダグラスメンタルヘルス大学研究所およびマギル大学、マサチューセッツ州ケンブリッジのケンブリッジにあるケンブリッジのニューハンプシャー州ケンブリッジにあるモントリオール。

抽象

転写因子ΔFosBと脳に豊富に存在するカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKIIα）は、コカインやその他の精神刺激薬乱用への慢性的な曝露によって側坐核（NAc）で誘導され、この2つのタンパク質は薬物反応の感作を媒介する。ΔFosBとCaMKIIαはどちらもNAcにおけるAMPAグルタミン酸受容体の発現と機能、NAc中型有棘ニューロン（MSN）の樹状突起スパイン形成、およびコカインに対する運動感作を調節するが、これらの分子間の直接的な関連性はこれまで検討されていない。本研究では、ΔFosBがタンパク質安定化Ser27でCaMKIIαによってリン酸化されること、およびラットNAcにおけるコカインを介したΔFosBの蓄積にはCaMKIIが必要であることを示す。

逆に、ΔFosBは生体内でのコカインによるCaMKIIα遺伝子発現誘導に必要かつ十分であり、NAcシェル領域のD1型MSNに選択的な効果であることを示した。

さらに、ＮＡｃ ＭＳＮ上の樹状突起棘の誘導およびΔＦｏｓＢのＮＡｃ過剰発現後のコカインに対する行動反応性の増加は両方ともＣａＭＫＩＩ依存性である。

重要なことに、我々はヒトのコカイン中毒者の側坐核においてΔFosBとCaMKIIの誘導を初めて実証し、将来の治療介入の標的となる可能性を示唆した。これらのデータは、ΔFosBとCaMKIIが細胞種および脳領域特異的な正のフィードフォワードループに関与し、慢性的なコカイン投与に対する脳の報酬回路の調節における重要なメカニズムであることを確立するものである。

導入

遺伝子発現の変化が薬物依存のメカニズムに寄与するという見解を裏付ける証拠が増えている（Robison and Nestler, 2011）。これらの変化の重要な媒介因子の1つは、Fosファミリー転写因子であるΔFosBである（Nestler, 2008）。事実上あらゆる乱用薬物の慢性投与は、報酬行動に不可欠な辺縁系領域である側坐核（NAc）におけるΔFosBの長期蓄積を誘発する。このような誘導は、D1ドーパミン受容体を発現するNAc中型有棘ニューロン（MSN）のクラスに特異的であると思われる。これらの D1 型 NAc MSN における ΔFosB の誘導過剰発現は、コカインおよびモルヒネに対する運動反応および報酬反応を増加させ( Kelz et al., 1999 ; Zachariou et al., 2006 )、コカインの自己投与の増加も含まれる ( Colby et al., 2003 )。さらに、ΔFosB 転写活性の遺伝的またはウイルス的阻害は、これらの薬物の報酬効果を減少させる ( Zachariou et al., 2006 ) ことから、この ΔFosB の持続的な誘導は、慢性的な薬物投与によって NAc に誘発される持続的な変化の重要な媒介因子であることが示唆される。

ΔFosBの異常な安定性（他のすべてのFosファミリータンパク質と比較して）は、全長FosBに存在するデグロンドメインの切断による分子固有の特性（Carle et al., 2007）と、制御されたプロセスの両方によるものである。ΔFosBはin vitroおよびin vivoでSer27でリン酸化され、この反応により細胞培養およびin vivoのNAcでΔFosBが約10倍安定化される（Ulery-Reynolds et al., 2009 ）。Ser27-ΔFosBはin vitroでカゼインキナーゼ-2の基質であることが示されているが（Ulery et al., 2006）、in vivoでのリン酸化のメカニズムは不明である。

カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）は、高発現セリン/スレオニンキナーゼであり、そのαおよびβアイソフォームは生体内で十二量体のホモおよびヘテロホロ酵素を形成し、複数の形態の神経可塑性に不可欠である（Lisman et al., 2002 ; Colbran and Brown, 2004）。 CaMKIIαは慢性アンフェタミンによってNAcシェルで選択的に誘導され（Loweth et al., 2010）、NAcシェルでのCaMKII活性の薬理学的遮断はアンフェタミン（Loweth et al., 2008）およびコカイン（Pierce et al., 1998）に対する行動感作を減少させる一方、このNAcサブ領域でのCaMKIIαのウイルス過剰発現はアンフェタミンに対する運動感作および自己投与を増強する（Loweth et al., 2010）。CaMKIIαはAMPAグルタミン酸受容体サブユニットの調節を介して報酬行動に影響を与える可能性があり（Pierce et al., 1998）、CaMKIIα活性は長年にわたり、いくつかの形態の神経可塑性におけるAMPA受容体機能およびシナプス標的化と関連付けられてきた（Malinow and Malenka, 2002）。

この文献は、ΔFosBとCaMKIIの間にいくつかの類似点があることを示している。両方とも乱用薬物の複数の行動効果に必要かつ十分であり、両方とも生体内のさまざまな神経細胞タイプの樹状突起スパインを上方制御し（Jourdain et al., 2003 ; Maze et al., 2010）、両方ともAMPA受容体の調節を介して少なくとも一部の行動効果を発揮する（Kelz et al., 1999 ; Malinow and Malenka, 2002 ; Vialou et al., 2010 ）。これらの類似点にもかかわらず、ΔFosBとCaMKIIの間の機能的なつながりは知られていない。本研究では、ΔFosBとCaMKIIの間の相互制御を確立し、2つのタンパク質がNAcシェルでD1型MSN特異的フィードフォワードループを形成し、それがコカインによって誘導され、生体内でのさまざまなコカイン反応を調節することを実証する。

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材料と方法

実験1：コカイン投与後のNAcシェルおよびコアのiTRAQプロテオミクス解析（図1A）

成体（8週齢）雄ラットに、20 mg/kgのコカインまたは生理食塩水を腹腔内投与し、7日間毎日1回投与した。最後の注射から24時間後、NAcの殻部と中心部をマイクロダイセクションし（図1A ）、急速凍結した。iTRAQ分析は、以前に記載された方法（ Ross et al., 2004 ; Davalos et al., 2010 ）に従って実施した。

図1

図1

コカインによるNAc中のCaMKIIの殻特異的誘導

実験2：コカイン投与後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（図1B～D）

成体（8週齢）の雄ラットに、運動記録チャンバー内で1日1回、10 mg/kgのコカインまたは生理食塩水ビヒクルを腹腔内投与し、7日間投与した。コカインを以前に投与した動物（「慢性」と呼ぶ）と生理食塩水を投与した動物の一部（「急性」と呼ぶ）では、コカイン（5 mg/kg 腹腔内）の単回注射に対する運動反応を記録し、残りの慢性生理食塩水投与動物（「生理食塩水」と呼ぶ）では、生理食塩水のみに対する運動反応を記録した。運動活性アッセイは、記載されているように実施した（Hiroi et al., 1997）。簡単に説明すると、成体雄ラットを18インチ×24インチのPASオープンフィールド記録ボックス（San Diego Instruments）に30分間入れて慣れさせ、生理食塩水を腹腔内注射し、さらに30分間観察し、5 mg/kgのコカインを腹腔内注射し、30分間観察した。

この最終注射から24時間後、麻酔薬が神経タンパク質レベルとリン酸化状態に及ぼす影響を避けるため、ラットは麻酔なしで断頭された。脳は1.2 mmマトリックス（Braintree Scientific）で連続的にスライスされ、標的組織は、NAcコアには14ゲージパンチ、残りの組織にはNAcシェル用に12ゲージパンチを使用して、プロテアーゼ（Roche）およびホスファターゼ（Sigma Aldrich）阻害剤を含むリン酸緩衝生理食塩水中で除去され（図1A参照）、直ちにドライアイスで凍結された。サンプルは、10 mMトリス塩基、150 mM塩化ナトリウム、1 mM EDTA、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1%トリトンX-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、pH 7.4、上記のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む改変RIPAバッファー中で軽い超音波処理により均質化された。 Laemmliバッファーを添加後、タンパク質を4～15%ポリアクリルアミド勾配ゲル（Criterion System、BioRad）で分離し、製造元のプロトコルに従ってOdysseyシステム（Li-Cor）を使用してウェスタンブロッティングを行った。

実験3：コカイン離脱後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（図1E）

成体（8週齢）の雄ラットに、10 mg/kgのコカインまたは生理食塩水を腹腔内投与で1日1回、7日間投与した。最終投与から14日後、生理食塩水投与群の動物にはさらに生理食塩水を投与し（「生理食塩水」と呼ぶ）、コカイン投与群の動物にはさらに生理食塩水を投与（「14日離脱」または「14d WD」と呼ぶ）するか、コカインを1回投与（「14d WD Chal」、チャレンジと呼ぶ）した。最終投与から1時間後、動物を断頭し、実験2と同様にウェスタンブロッティングを行った。

実験4：コカイン自己投与後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（図2A～C）

ラットは、固定比率の0.5スケジュールに従って1時間のセッションで9日間1 mg / kg /コカインの注入を自己投与するように訓練された。 9回のベースラインセッションの後、最後の2回のセッションでラットをコカイン摂取によってバランスのとれた2つのグループに分けた。 一方のラット群は1時間のセッションでコカインを自己投与することができ（0.5 mg / kg /注入）、他方のラットのグループは6時間のセッションで自己投与した（ロングアクセス、LgA）。 ）さらに10日間（エスカレーションセッション）。

脳切片は、記載されているように免疫組織化学用に処理された（Perrotti et al., 2004）。脳は、最後の薬物曝露から18～24時間後に灌流され、その結果、残存する全長FosBタンパク質が分解され、残りの免疫反応性はすべてΔFosBを反映するようになった。この分解は、ΔFosBを認識しない全長FosBのC末端に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって確認された（データは示していない）。35 µmの切片にスライスした後、各ラットのNAcを通る2つの切片で、盲検化された観察者によってΔFosB免疫陽性細胞の数が定量化され、その後、各動物の領域ごとに40倍視野あたりの平均値が計算された。各動物は、統計分析のための個々の観察として扱われた。関心領域は、Paxinos and Watson（Paxinos and Watson, 2007）を使用して特定された。

CaMKIIα免疫反応性の定量は、記載されているようにLicorシステムを使用して実施した（Covingtonら、2009 ）。CaMKIIおよびGAPDHの積分強度はOdysseyソフトウェアで測定した。結果は、1 mm 2あたりの積分強度値として示し、平均値±標準誤差（ n = 4～1​​0/グループ）として示す。GAPDHの値は、スライス厚および条件によるCaMKII強度の正規化の基準として使用した。

図2

図2

自己投与ラットおよびヒトコカイン中毒者のNAc殻におけるCaMKIIの誘導

実験5：コカイン依存症患者のタンパク質レベルの定量化（図2D）

手順

死後ヒト脳組織は、ケベック自殺脳バンク（ダグラス精神保健大学研究所、モントリオール、ケベック州、カナダ）から入手した。組織の保存は基本的に記載されている通りである（Quirion et al., 1987）。簡単に説明すると、摘出された脳は発泡スチロールの箱に入れられ、濡れた氷の上に置かれ、ケベック自殺脳バンクの施設に急いで運ばれる。脳、脳幹、小脳の中央で矢状切断により、すぐに半球が分離される。血管、松果体、脈絡叢、小脳の半分、脳幹の半分は通常、左半球から解剖され、その後、凍結前に冠状方向に1cm厚のスライスに切断される。後者の小脳の半分は、凍結前に矢状方向に1cm厚のスライスに切断される。組織は、-40℃の2-メチルブタン中で約60秒間急速凍結される。凍結組織はすべて、長期保存のため、-80℃のビニール袋に別々に保存する。特定の脳領域は、周囲をドライアイスで覆ったステンレス鋼板上で凍結冠状断スライスから解剖し、環境温度を制御する。ウェスタンブロッティングは、実験2で説明した方法で実施した。

コホート

このコホートは、15～66歳の男性37名と女性3名で構成されていました。すべての被験者は、長期にわたる瀕死状態や長期にわたる医学的疾患を経ずに突然死亡しました。各ケースにおいて、死因はケベック州検視局によって確認され、死亡時の投薬および違法薬物の使用に関する情報を得るために、組織サンプルを用いた毒物学的スクリーニングが実施されました。被験者グループは、コカイン依存症のSCID-I基準を満たした20名で構成されていました。対照グループは、コカイン依存症の既往歴がなく、主要な精神医学的診断もない20名で構成されていました。すべての被験者は、脳組織に直接影響を与えない原因で突然死亡しました。グループは、被験者の平均年齢、冷蔵遅延、およびpHでマッチングされました。すべての対象者について、以前に記載した方法（Dumais et al., 2005）に従って心理学的剖検を実施し、精神医学的および医学的病歴に関する詳細な症例情報、ならびにその他の関連する臨床データおよび社会人口統計学的データにアクセスできるようにしました。簡単に説明すると、訓練を受けた面接者が、故人の1人以上の情報提供者に対して、 DSM-IV精神障害のための構造化臨床面接（SCID-I）を実施しました。臨床医のパネルがSCID-I評価、症例報告、検死官のメモ、および医療記録を検討し、合意に基づく精神医学的診断を得ました。

実験6：ラットNAcのクロマチン免疫沈降（図3A～C）

成体（8週）の雄ラットに10 mg / kgコカインまたは生理食塩水ビヒクルを1日1回7日間IP投与した。 最後の注射のＸ時間後に、ＮＡｃシェルおよびコアを顕微解剖した。 クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、全群ＸＮＵＭＸ（全ＸＮＵＭＸ動物、ＸＮＵＭＸコカインプール、ＸＮＵＭＸ生理食塩水プール）中の１群あたり７匹のラットからのシェルまたはコアの両側ＮＡｃパンチをプールすることで行った。 組織を架橋し、洗浄し、そして超音波処理によるクロマチン剪断まで−ＸＮＵＭＸ℃で保存した。 剪断したクロマチンを、予め磁性ビーズに結合した抗体（Dynabeads M-24、Invitrogen）と共に一晩インキュベートした。 非免疫IgGを対照として使用した。 逆架橋およびＤＮＡ精製後、ｑＰＣＲを使用してＣａＭＫＩＩαプロモーターＤＮＡのレベルを測定した。 転写開始部位の前の〜14 bpに位置するAP-98コンセンサス配列を含む領域を増幅するようにプライマーを設計した（Forward：ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse：TGTGCTCCTCAGAATCCACAA）。

図3

図3

CaMKIIαの細胞型および領域特異的なΔFosB誘導 インビボの

実験7：細胞型特異的なΔFosB過剰発現によるCaMKII転写産物およびタンパク質発現の測定（図3D）

NSE-tTA（系統A）× TetOp-ΔfosB（系統11）およびNSE-tTA（系統B）× TetOp-FLAG-ΔfosB（系統11）マウス（Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ; Zachariou et al., 2006）由来の雄の二重トランスジェニックマウスを、発生中にΔFosBの発現を抑制するために100 µg/mlのドキシサイクリンで受精および飼育した。離乳時に同腹仔を2つに分け、半分はドキシサイクリンを継続し、残りの半分は水に切り替え、ΔFosBの転写効果が最大となる8〜11週間後に動物を使用した（Kelz et al., 1999 ; McClung and Nestler, 2003）。転写解析のために、マウスを迅速に断頭し、脳を取り出して氷上に置いた。NAc の解剖は 14 ゲージの針パンチで行い、RNA を抽出するまでドライアイスで急速凍結した。RNA 分離、qPCR、およびデータ解析は、以前に記載したとおりに実行した ( LaPlant et al., 2009 )。簡単に説明すると、RNA は TriZol 試薬 (Invitrogen) で分離し、Qiagen の RNAeasy マイクロキットでさらに精製し、Agilent の Bioanalyzer で品質を確認した。逆転写は iScript (BioRad) を使用して実行した。qPCR は、Applied Biosystems 7900HT RT PCR システムで、次のサイクル パラメーターで実行した: 95 °C で 10 分; 95 °C で 1 分、60 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒の 40 サイクル; 95℃まで段階的に加熱して解離曲線を作成し、単一のPCR産物を確認した。ΔFosBおよびCaMKIIαタンパク質発現の免疫組織化学的解析は、実験4に記載されているように実施した。

実験8：NAc内D1およびD2ドーパミン受容体拮抗薬がコカイン誘発性タンパク質変化に及ぼす影響（図3H）

成体（8週齢）雄ラットに、10 mg/kgのコカインまたは生理食塩水（「ビヒクル」群）を7日間、1日1回腹腔内投与した。各コカイン注射の30分前に、ラットにD1受容体拮抗薬SCH 23390（0.5 mg/kg、「D1 Ant」群）、D2受容体拮抗薬エチクロプリド（0.5 mg/kg、「D2 Ant」群）、または生理食塩水対照注射（「コカイン」群）を腹腔内投与した。最終注射から24時間後、動物を断頭し、実験2に従ってウェスタンブロッティングによりタンパク質を定量した。

実験9：AAVを介したΔFosB過剰発現がタンパク質発現に及ぼす影響（図4 A～C）

成体雄ラット（8週齢）に定位脳手術を行い、AAV-GFP（緑色蛍光タンパク質）またはAAV-GFP-ΔFosB（Mazeら、2010）を注入した。すべての手術には33ゲージ針（Hamilton）を使用し、その間に精製高力価ウイルス0.5 µlを5分間かけて両側に注入し、その後さらに5分間の注入後休息期間を設けた。すべての距離はブレグマを基準として測定される：10°角度、AP = +1.7 mm、Lat = 2.5 mm、DV = −6.7 mm。手術後14日目に、動物に10 mg/kgのコカインを単回腹腔内注射し、運動モニタリングチャンバー内でΔFosB過剰発現の行動への影響を評価した。最終注射から24時間後、実験2に従ってラットを断頭し、蛍光顕微鏡下で組織マイクロダイセクションを行い、GFP陽性の側坐核組織を得た。その後、実験2に従ってウェスタンブロッティングを行った。

図4

図4

ΔFosBはNAc殻におけるコカイン媒介D1受容体依存性CaMKIIα誘導に必要かつ十分である

実験10：AAVを介したΔJunDの過剰発現がコカイン依存性タンパク質発現に及ぼす影響（図4 D～F）

実験8に従って、AAV-GFPまたはAAV-GFP-ΔJunDの定位的注入を行った。手術後14日目に、動物に10 mg/kgのコカインまたは生理食塩水を腹腔内投与し、7日間毎日投与した。コカイン（5 mg/kg、腹腔内投与）または生理食塩水を1回投与したときの運動反応を記録した。この最後の投与から24時間後にラットを断頭し、組織を採取し、実験9と同様にウェスタンブロットを行った。

実験11：試験管内プロテインキナーゼアッセイ（図5A～D）

組換えCaMKIIαおよびΔFosBは昆虫細胞から精製され（Brickeyら、1990；Jorissenら、2007）、タンパク質キナーゼアッセイは既述のとおりに実施された（Colbran、1993）。簡単に説明すると、CaMKIIは氷上で2.5 µM（または指定された濃度）のΔFosB、1 mM Ca 2+、40 mM Mg 2+ 、15 µMカルモジュリン、および200 mM HEPES pH 7.5とともにプレインキュベートされた。リン酸化は、[γ- 32 P]ATPの有無にかかわらず200 µM ATPの添加によって開始され、室温で10分間（図5A&B）、または氷上で2分間（図5C&D ）進行させた。生成物は、ウェスタンブロッティング（図5AおよびB）またはオートラジオグラムとシンチレーションカウンティング（図B～D）によって分離された。

図5

図5

ΔFosBはCaMKIIαの強力な基質です

実験12：Ser27 ΔFosBリン酸化の同定（図5E）

実験11に従ってin vitroキナーゼアッセイを実施し、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、ΔFosBに対応するバンドを切り出してタンデム質量分析に供した。すべてのパネルの対応するイオンフラグメントのm/z割り当ては、イオンピークの上にラベル付けされている。スペースの制限により、すべてのフラグメントイオンにラベルが付けられているわけではない。一般的に、フラグメントイオンラベルのテキストは黒色で表示されるが、目的のリン酸化部位の存在を直接確認または証拠を追加する場合は、赤色でマークされる。バックボーンフラグメント化生成物の証拠は、リン酸化ペプチドの配列読み取りで示され、検出されたリン酸化残基の部位は、単一のアミノ酸文字指定とともに赤色で示される。観測されたフラグメントイオンの数値記述も、ペプチド配列上にbイオンおよびyイオンとしてマークされる。強度の低いフラグメントイオンを表示するためのm/z軸のセクションのズーム係数は、各フラグメント質量スペクトルの上部にマークされる。パネルHに示されたフラグメントイオンは、Ser27リン酸化アイソフォームの存在を確認するものであるが、Ser28、Ser31、Ser34、およびThr37部位でリン酸化された他のアイソフォームの混合物の中に存在している。pa5、pa5-P、pb5、およびpb5-Pイオンの存在は、Ser27残基のリン酸化を明確に示している。

実験13：Ser27リン酸化の定量（図5F）

標準ペプチドは、Ser27ΔFosBのホスホ型および非ホスホ型を模して設計された。 合成および精製後、各「重い」イディオタイプペプチドを50 / 50アセトニトリル/水緩衝液に溶解し、アミノ酸分析に送って合成ペプチドストック溶液上の絶対濃度を決定した。 次に、各「重い」ペプチドを4000 QTRAP質量分析計（MS）に直接注入して、MS / MSフラグメンテーションおよび2から4回のMRM遷移に最適な衝突エネルギーを決定しました。 次に、ペプチドの分離を確実にするために、純粋な「重い」ペプチドを4000 QTRAPでLCMSにかけた。 Q1を特定の前駆体m / z値に設定し（Q1はスキャンしていない）、Q3をそのペプチドの特定のフラグメントに対応する特定のm / z値に設定して、機器をトリプル四重極モードで実行した。 MRMモードでは、一連の単一反応（衝突エネルギーを調整して目的のフラグメントイオンの強度を最適化するプリカーサ/フラグメントイオン遷移）を連続して測定し、サイクル（通常は1〜2秒）をループスルーしました。 ＨＰＬＣ分離の全時間。 既存のペプチドのＭＳ ／ ＭＳスペクトルからＭＲＭ遷移を決定した。 次いで、高強度フラグメントイオンに対応するペプチドあたり２つの遷移を選択し、自動化ソフトウェアを用いてＭＲＭ遷移の信号強度を最大にするように衝突エネルギーを最適化した。 次いで、ＣａＭＫＩＩまたは対照に曝露された標準ペプチドおよびΔＦｏｓＢサンプルから生じるピークを比較して、反応中の各ペプチド形態の絶対存在量を決定した。 LC-MRMデータのデータ解析は、AB Multiquant 1.1ソフトウェアを使用して行われます。

実験14：CaMKII過剰発現マウスにおけるΔFosBの誘導（図5GおよびH）

T286D CaMKIIを過剰発現するトランスジェニックマウス（Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012）と野生型同腹仔を、トランスジーンの発現を可能にするためにドキシサイクリン非存在下で飼育した。成体マウスに、14日間、1日1回、20 mg/kgのコカインまたは生理食塩水を腹腔内投与した。最終投与から24時間後、動物を断頭し、実験4と同様にΔFosB発現の免疫組織化学と定量を行った。

実験15：HSVを介したΔFosBの過剰発現とCaMKII阻害がNAc樹状突起スパインに及ぼす影響（図6A～E）

成体雄マウス（8週齢）のNAcにHSV-GFP、HSV-GFP-ΔFosB（Olaussonら、2006）、HSV-GFPAC3I、またはHSV-GFPAC3I-ΔFosBを定位的に注入した。これらの構築物では、CaMKII活性のペプチドベースの阻害剤であるAC3IがGFPのC末端に融合されている。GFPAC3Iは、GFPAC3Iを含むpMM400ベクターをテンプレートとして、以下のプライマーを用いてPCRによりクローニングした：GFP-AC3I-F：5' CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3'（clampNheIKozakmet）；GFP-AC3I-R：5' CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3'（clampBspEIstop）。得られたPCR産物をNheIおよびBspEI部位を用いてp1005+およびp1005+-Δ FosBベクターに挿入した。構築物はシーケンスにより検証した。定位座標は、10°角度、AP = +1.6 mm、Lat = +1.5 mm、DV = −4.4 mmであった（Barrot et al., 2002）。灌流および脳切片作製は実験4に従って行った。

樹状突起スパイン解析は、記載されている方法（ Christoffel et al., 2011 ）に従って実施した。簡単に説明すると、GFPを発現するHSV感染細胞から、細胞体から50～150 µm離れた樹状突起セグメントをランダムに選択した。形態学的解析には、共焦点LSM 710（Carl Zeiss）で画像を取得し、NeuronStudioのrayburstアルゴリズムを使用した。NeuronStudioは、(1)アスペクト比、(2)頭部と頸部の比率、(3)頭部の直径に基づいて、スパインを細い、キノコ型、またはずんぐり型に分類する。頸部を持つスパインは、細いまたはキノコ型に分類され、顕著な頸部を持たないスパインはずんぐり型に分類される。頸部を持つスパインは、頭部の直径に基づいて、細いまたはキノコ型に分類される。

図6

図6

CaMKII活性の遮断はNAcにおけるΔFosBの形態学的および行動的影響を防止する

実験16：HSVを介したΔFosBの過剰発現とCaMKII阻害がコカイン反応に及ぼす影響（図6F）

実験15に従って成体雄マウスにウイルスを注射し、実験9に従って5mg/kgのコカインを1回注射した後の運動反応を測定した。運動データは、コカイン注射後30分間のビーム遮断回数の合計として表される。

追加情報

アニマルハウジング

オスのスプラーグ・ドーリーラット（体重250～275g、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ社製）を2匹ずつ飼育した。8週齢のオスのC57BL/6Jマウス（ジャクソン研究所製）を、1ケージあたり最大5匹のグループで飼育した。すべての動物は、実験操作の前に1週間以上動物飼育施設に慣らし、温度管理された部屋（23～25℃）で12時間明暗サイクル（午前7時に点灯）で飼育し、餌と水は自由に摂取できるようにした。実験は、神経科学学会およびマウントサイナイ病院の動物実験倫理委員会（IACUC）のガイドラインに従って実施した。

薬物

薬物を腹腔内投与し、コカイン（5-20 mg / kg /マウス、10 ml /ラット、NIDA）およびSCH 1または塩酸エチクロプリド（23390 mg / kg / 0.5 ml、Tocris）を含む滅菌食塩水に溶解した。 定位外科手術のために、滅菌生理食塩水中のケタミン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）およびキシラジン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅａｉｎ）の「カクテル」でマウスを麻酔した。

抗体

CaMKIIα（合計）：アップステート05〜532、1：5,000

ＣａＭＫＩＩホスホ−ＴｈｒＸＮＵＭＸ：プロメガＶＸＮＵＭＸＡ、ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ

ΔFosB（合計）：セルシグナリング5G4、1：250

ΔFosBホスホ-Ser27：リン酸溶液、1：500

GluA1（合計）：Abcam、Ab31232、1：1,000

GluA1ホスホ-Ser831：ミリポアN453、1：1,000

GluA1ホスホ-Ser845：ケミコンAb5849、1：2,000

GluA2：ミリポア07 – 598、1：2,000

NR2A：シグマHPA004692、1：2,500

NR2B：ミリポアAb1557P、1：1,000

統計分析

全ての統計分析は、Prism 6ソフトウェアパッケージ（GraphPad）を用いて行った。 スチューデントのt検定はすべてのペアワイズ比較に使用され（t値が与えられる結果に示される）、そして一元配置分散分析はすべての多重比較に使用された（F値が与えられる結果のセクションに示される）。

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結果

慢性コカインはNAc殻にCaMKIIを誘導する

多くの研究は、NAc シェルとコアの MSN が乱用薬物への慢性的な曝露に対して異なる生化学的および生理学的反応を示し ( Kourrich and Thomas, 2009 ; Loweth et al., 2010 )、2 つのサブ領域が薬物探索行動を異なって制御することを示している( Ito et al., 2004 )。NAc シェルとコアのタンパク質成分に対するコカインの異なる影響を決定するために、多重アイソバリック タギング (iTRAQ) とタンデム質量分析法 (MS/MS) を使用した。成体雄ラットにコカイン (20 mg/kg) または生理食塩水を 7 日間毎日腹腔内注射した。最後の注射から 24 時間後に、NAc シェルとコアをマイクロダイセクションし (図 1A )、急速凍結した。これらのサンプル中のタンパク質は、iTRAQ を使用して定量した。 4つのCaMKIIアイソフォームすべてにおいて、コカイン投与後に発現量が大幅に増加したが、これはNAcコアと比較してシェルに特異的であった。PP1触媒サブユニット、調節サブユニット、PP2Aなど、他のシステムで様々なCaMKII基質と関連付けられてきたいくつかのタンパク質ホスファターゼ（Colbran, 2004）も同様のパターンを示した。これらの知見は、CaMKIIシグナル伝達経路がNAcにおいてシェル特異的な様式でコカインによって顕著に調節されていることを示す、新規かつ偏りのない証拠を提供するものである。

この知見をより定量的に検証するために、上記と同様にラットにコカイン（様々な用量）または生理食塩水を投与し、コカイン（5 mg/kg）または生理食塩水の投与に対する運動反応を測定した。10 mg/kgのコカインを繰り返し投与すると、典型的な運動感作パターンが見られた（図1B）。この投与レジメンを用いたさらなる研究では、ウェスタンブロッティングにより、コカインの最終投与から24時間後に、コカインの繰り返し投与がNAcシェルでCaMKIIαを選択的に誘導することが明らかになった（図1CおよびD；p=0.0019；F=7.943；df=29）。さらに、AMPA受容体のGluA1サブユニットの標準的なCaMKII基質Ser831のリン酸化は、NAcシェルで有意に増加したが、コアでは増加しなかった（p=0.0261; F=4.208; df=28）。一方、CaMKIIα Thr286の自己リン酸化は、シェルでのみ強いが有意ではない誘導傾向を示した（図1D）。他のいくつかのグルタミン酸受容体は影響を受けなかった。これらのCaMKIIの測定値とは対照的に、同じ組織サンプルでは、​​以前の知見（Perrotti et al., 2008）と一致して、NAcのシェル（p=0.0260; F=4.189; df=29）とコア（p=0.0350; F=3.807; df=29）の両方でΔFosBの誘導が示された（図1CおよびD ）。

AMPA受容体のコカイン調節に関するこれまでのいくつかの研究では、慢性コカイン投与中止後約14日経過した動物を分析していたため（考察を参照）、我々はこの時点でこれらの生化学的分析を繰り返した。コカインの最終投与から14日後、NAcではΔFosBが上昇したままであった（p=0.0288; F=4.258; df=22）が、CaMKIIもGluA1 Ser831のリン酸化も上昇したままではなかった（図1E）。しかし、10 mg/kgのコカイン単回投与から1時間後、総CaMKII（p=0.0330; F=3.947; df=26）とGluA1 Ser831（p=0.0213; F=4.509; df=27）のリン酸化レベルは、いずれも最初の慢性コカイン曝露後に見られる程度まで上昇していた（図1E）。これらのデータは、NAcシェルニューロンが長期間の禁断期間中にCaMKII誘導の準備状態にあることを示しており、おそらくCaMKII遺伝子プロモーターの直接的なプライミングを介していると考えられる（考察を参照）。さらに、ΔFosB誘導がCaMKII誘導よりも持続的であるという事実は、クロマチンベースか否かを問わず、CaMKII制御に「ブレーキ」をかける追加的なメカニズムが存在することを示唆しており、これについては考察で述べた。

これらの観察をさらに強化するために、自発的な薬物摂取を伴うコカイン自己投与モデルを検討した。成体雄ラットにコカインへの短いアクセスまたは長いアクセスを与えた。予想どおり（Ahmed and Koob、1998）、長いアクセス条件のみが薬物の自己投与の増加につながった（図2A ）。ΔFosBは、NAcシェル（p=0.0011; F=11.12; df=17）とコア（p=0.0004; F=13.86; df=17）の両方で、コカインへの長いアクセスによって短いアクセスよりも大きく誘導された。対照的に、CaMKIIαは、NAcシェルでのみコカインへの長いアクセスによって誘導された（図2BおよびC ; p=0.0236; F=4.957; df=16）。短期投与動物（約12 mg/kg IV）、長期投与動物（約70 mg/kg IV）、および実験者投与動物（10 mg/kg）における1日平均コカイン摂取量を比較し、後者がΔFosBおよびCaMKIIの強力な誘導を引き起こすのに対し、短期投与では誘導を引き起こさない理由を問うことは興味深い。この不一致は、コカインのピーク濃度の違い（実験者投与コカインは単回腹腔内ボーラス投与であるのに対し、自己投与コカインは複数回のIV投与によって投与される）または薬物曝露期間の違い（実験者投与は7日間、自己投与は19日間）によるものと考えられる。

コカインの作用におけるΔFosBとCaMKIIに関する文献は多数存在するものの、ヒトのコカイン使用者におけるこれらのタンパク質の研究はこれまで行われていませんでした。本研究では、コカイン依存症のヒトの側坐核において、ΔFosB（p=0.0316; t=1.921; df=34）とCaMKII（p=0.0444; t=1.755; df=32）の両方のレベルが増加していることを示す最初の証拠を提示します（図2D、表1）。これらのデータは、げっ歯類の側坐核におけるコカインによるΔFosBとCaMKIIの誘導に関する我々の研究が、ヒトのコカイン依存症に臨床的に関連していることを示しています。

テーブル1

テーブル1

ヒトコカイン常用者および対応対照群からの試料の特性化

ΔFosBはNAcシェルのD1型MSNにおいてCaMKII転写を選択的に調節する

齧歯類のNAcにおいてCaMKIIとΔFosBの両方がコカインによって上方制御されるという発見から、ΔFosBがCaMKII遺伝子の転写を調節する可能性があるかどうかを調べることにした。我々は以前、NAcのバイアスのかからないマイクロアレイ解析においてCaMKIIαがΔFosBの標的候補であることを報告していたが（McClung and Nestler, 2003）、この発見はその研究ではさらに検証されていなかった。我々はまず定量的ChIP（qChIP—ChIPに続いて定量的PCR）を用いて、ΔFosBが成体雄ラットのNAcのCaMKIIα遺伝子プロモーターに結合するかどうかを調べたところ、驚くべきことに、慢性的なコカイン投与により、この結合はシェル領域では有意に増加するが（p=0.0133; t=2.901; df=12）、コア領域では増加しないことがわかった（図3A）。 ΔFosB の CaMKIIα プロモーターへの結合におけるこのサブ領域特異的な差異に関連するメカニズムをさらに理解するために、qChIP を使用してこのゲノム領域のヒストン修飾の状態を特徴付けました。以前の研究では、マウス NAc 全体でコカインが CaMKIIα プロモーターの H3 アセチル化を誘導することが示されました ( Wang et al., 2010 )。対照的に、コカインは NAc コアで選択的に CaMKIIα プロモーターの H3 アセチル化を減少させ (図 3B ; p=0.0213; t=2.726; df=10)、シェルでは変化が見られず、ΔFosB 結合を超えたサブ領域特異的なクロマチン変化と一致していることがわかりました。抑制マークであるジメチル化 H3 リジン 9 (H3K9me2) の qChIP では、シェルとコアの両方のサブ領域で減少傾向が明らかになりました (図 3C )。

ΔFosBがin vivoでCaMKIIαの転写を調節するかどうかを調べるために、飲用水にドキシサイクリンを投与することで制御される方法で、 D1型MSNとD2型MSNで特異的にΔFosBを誘導的に過剰発現する2つの二重トランスジェニックマウス系統を使用した（ Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002）。D1型MSNのみでΔFosBを過剰発現する成体雄マウスでは、NAcのCaMKIIα mRNAレベルが有意に増加した（p=0.0337; t=1.996; df=13）が、ΔFosBを主にD2型MSNで過剰発現するマウスではこの効果は見られなかった（図3D）。 D1型MSNにおけるΔFosB発現によって誘導されたCaMKIIα mRNAの増加は、NAcシェル（p=0.0030; t=3.578; df=14）とコア（p=0.0392; t=2.275; df=14;図3EおよびF）の両方でCaMKIIαタンパク質の同時増加を伴った。これらのデータは、ΔFosBが両方のサブ領域のD1型MSNでCaMKIIα遺伝子発現を駆動できることを示しているが、図3Bは、コカインによるCaMKIIαプロモーターでのクロマチン変化（例えば、アセチル化の減少）が、コカイン投与後のコアサブ領域でのΔFosBによるCaMKIIのアップレギュレーションを妨げていることを示唆している。

遺伝子組み換えマウスのデータから、ΔFosBによるCaMKII遺伝子発現の誘導はNAcのD1型MSNに特異的であることが示されたため、次に、コカイン依存性のCaMKIIのアップレギュレーションにD1ドーパミン受容体の活性化が必要かどうかを調べた。成体雄ラットに以前と同様に慢性的にコカインまたは生理食塩水を投与したが、各注射の30分前に、コカイン群のラットには生理食塩水、D1拮抗薬SCH 23390（0.5 mg/kg）、またはD2受容体拮抗薬エチクロプリド（0.5 mg/kg）を腹腔内注射した。動物は最後のコカイン注射から24時間後に解析した。ウェスタンブロッティングにより、D1受容体拮抗薬は、D2受容体拮抗薬とは異なり、コカインによるΔFosBの増加を完全に阻害することが明らかになった（p<0.0001; F=18.96; df=18）。これは以前の報告（Nye et al., 1995）と同様である。また、CaMKIIの増加も阻害した（p=0.0005; F=10.99; df=18;図3GおよびH）。これらのデータは、コカインが、特にNAcシェルのD1型MSNにおいて、ΔFosBを介したCaMKII遺伝子発現の増加を引き起こすという仮説を支持する。今後の研究では、この脳領域におけるコカインのCaMKII発現に対する細胞型特異的な効果を直接実証することが重要となるだろう。

ΔＦｏｓＢは、ＮＡｃシェルにおけるＣａＭＫＩＩのコカイン誘導に必要かつ十分である。

二重トランスジェニックマウスの使用を補完するために、次にラットにおけるウイルス媒介遺伝子導入を用いて、コカインによるCaMKIIα誘導におけるΔFosBの役割を研究した。我々は、ΔFosBとGFP、またはGFPのみを過剰発現させるために、成体雄ラットのNAcシェル（シェルを選択的に標的とすることができる）にアデノ随伴ウイルス（AAV）粒子を両側性に注入した。その後、動物に10 mg/kgのコカインを1回腹腔内注射した。ΔFosB/GFPを過剰発現した動物は、GFPのみを過剰発現した動物と比較して、運動反応が増加した（図4A）。コカインの1回注射から24時間後、蛍光灯の下で解剖することにより、これらの動物からGFP陽性NAc組織を摘出した。この組織のウェスタンブロッティング（図4BおよびC）では、ΔFosBの強い過剰発現と、GFP動物と比較して総CaMKIIαタンパク質の有意な増加（p=0.0070、t=2.894、df=30）が明らかになり、慢性コカイン投与で見られる誘導と同様であった。さらに、ΔFosBの過剰発現により、Thr286におけるCaMKIIαの自己リン酸化（酵素活性化の指標）が増加し（p=0.0330、t=2.243、df=28）、CaMKII基質であるGluA1のSer831のリン酸化も増加した（p=0.0540、t=2.012、df=28）。これもまた、慢性コカインの作用を模倣している（図1CおよびD）。これらのデータを総合すると、NAcシェルにおけるΔFosBの発現は、コカインに対する運動感受性の亢進、およびこの領域におけるCaMKIIの誘導と活性化に十分であるというさらなる証拠が得られる。

我々は同様のアプローチを用いて、ΔFosBがNAcシェルにおけるコカインによるCaMKIIαの誘導にも必要かどうかを調べた。AAVを用いて、ΔFosB転写活性化の負の調節因子であるΔJunDと呼ばれる切断型JunDタンパク質（Winstanley et al., 2007）とGFP、またはGFPのみを過剰発現させた。2週間後、トランスジーンの発現が最大になった時点で、動物にコカイン（10 mg/kg）または生理食塩水を7日間毎日投与し、最後の慢性注射から24時間後にコカインチャレンジ（5 mg/kg）に対する運動反応を検査した（図4D）。 ΔJunDの過剰発現は、コカインに対する運動亢進感作を阻害し、NAcシェルにおけるCaMKIIαの誘導と活性化も阻害した（図4EおよびF；p=0.0437；F=2.997；総自由度=38）。これは、この領域におけるコカインによるCaMKIIαの誘導にはΔFosBの転写活性が必要であることを示している。興味深いことに、ΔJunDは生理食塩水およびコカイン処理条件の両方でΔFosBのレベルを低下させた（p=0.0004；F=8.110；自由度=35）ことがわかり、ΔFosBが自身の発現レベルをAP-1活性に依存しているという新たな可能性が示唆された。

CaMKIIはSer27でΔFosBをリン酸化する

使い方 ビトロ プロテインキナーゼアッセイにより、本発明者らは、精製ΔＦｏｓＢがＣａＭＫＩＩαに対する頑健な基質であることを確認した。 彼のインキュベーション6ＣａＭＫＩＩαおよびＡＴＰを用いた－ΔＦｏｓＢは、ΔＦｏｓＢの電気泳動移動度において上方へのシフトを引き起こした。イチジク5A; 得られたいくつかのバンドは複数のリン酸化部位を示唆した。 似ている ビトロ [γ-を用いたキナーゼアッセイ32P 1 ATPは、シフトしたΔFosBバンドへの放射能標識リン酸の取り込みを示した（イチジク5B）、タンパク質の直接リン酸化を示す。 我々は、以前に特徴付けられたΔFosBのSer27に対するリン酸特異的抗体を作製した。Ulery et al。、2006） この抗体はSer27リン酸化されたΔFosBを含む脳抽出物に対するシグナルを生成しませんが（データは示されていません）、我々は細胞内でSer27リン酸化を検出することができました。 ビトロ CaMKIIを用いたキナーゼアッセイイチジク5B） ΔFosBのCaMKIIリン酸化の速度論的分析は、それがキナーゼの強力な基質であることを示している（イチジク5C見かけのKM 5.7±2.0µMとKの関係CAT 2.3±0.3minの値-1。 これらの結果は、よく特徴付けられている多くのものと同等です。 インビボの CaMKIIの基質（コルブランアンドブラウン、2004） さらに、我々は、ＣａＭＫＩＩがＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ ｍｏｌ ／ ｍｏｌの化学量論でΔＦｏｓＢをリン酸化することを決定した。図5D）、Ｈｉｓ内に少なくとも３つのＣａＭＫＩＩリン酸化部位があることを示す。6と一致する-ΔFosBタンパク質 イチジク5A.

リン酸化の個々の部位を調べるために、in vitroキナーゼアッセイのサンプルの MS 分析を用いました。図 5E は、以前に特徴付けられた Ser27 およびいくつかの追加部位 (データは示していません) での ΔFosB のリン酸化を示しています。Ser27 の以前の機能的特徴付けを考慮して、Ser27 のリン酸化状態と非リン酸化状態を模倣する標識合成ペプチドを作成し、これらのペプチドの既知量を標準として使用して、 CaMKII によるin vitroリン酸化の前後の ΔFosB の MRM 分析を行いました。その後の定量 (図 5F ) により、Ser27 が CaMKII の強力な基質であることが確認されました。これらの結果は、ΔFosB 内の複数のリン酸化残基の中で、Ser27 が CaMKII の特に効果的な基質であることを示しています。

CaMKIIはNAcシェルにおけるΔFosBのコカイン蓄積を仲介する

CaMKIIは、 in vitroでΔFosBをリン酸化し、in vitroおよびin vivoでの安定性を劇的に高めることができるため（Ulery et al., 2006 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ）、CaMKII活性がin vivoでNAcのΔFosBレベルを制御するかどうかを調べた。この疑問に対処するために、まず、NAcを含む複数の脳領域でCaMKIIαのカルシウム非依存性変異体（T286D）を過剰発現するマウス系統を使用した（Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012）。年齢を合わせた成体雄の変異体と野生型の同腹仔に、14日間毎日1回20 mg/kgのコカインまたは生理食塩水を注射し、最終注射の1日後に動物を分析した。変異動物では、NAcシェルではΔFosBの基礎レベルが増加していたが（p=0.0001、F=9.207、df=37）、コアでは増加していなかった（図5GおよびH）。驚くべきことに、変異動物ではシェルとコアの両方でコカイン依存性のΔFosB誘導が阻害されていたことから、CaMKIIはNAcシェルでΔFosBの安定性を直接制御している可能性があるが、NAcの2つのサブ領域におけるコカイン活性化経路のΔFosBの上流にも位置している可能性があることが示唆される。

CaMKII活性はΔFosB仲介構造および行動可塑性に必要である

NAc MSNにおけるコカインによる樹状突起スパインの誘導は、この脳領域における薬物誘発適応として最もよく確立されているものの1つであり、このようなスパインの誘導は薬物に対する行動反応の感作と相関しており（Robinson and Kolb, 2004 ; Russo et al., 2010）、D1型MSNに選択的であることが報告されている（Lee et al., 2006）。我々は最近、NAcにおけるコカインによる樹状突起スパインの誘導はΔFosBとその下流の転写プログラムに依存することを実証した（Maze et al., 2010）。他の脳領域や実験系における樹状突起スパインの形態形成や誘導におけるCaMKIIの関与については多くの文献があるものの（Jourdain et al., 2003 ; Penzes et al., 2008 ; Okamoto et al., 2009）、NAc MSNスパイン形成におけるその役割は研究されていない。そこで我々は、CaMKII阻害ペプチドAC3IをGFPに融合させたHSVを介した過剰発現を利用して、ΔFosBによるMSN樹状突起スパインの誘導にCaMKII活性が必要かどうかを調べた。この構築物は、以前に生体内でCaMKII活性を阻害することが示されている（Zhang et al., 2005 ; Klug et al., 2012）。成体マウスのNAcシェルにおけるΔFosBのウイルス過剰発現は、以前に報告されたように（Mazeら、2010 ）、MSN樹状突起スパイン密度の有意な増加を誘導し（p<0.0001; F=8.558; df=59;図6AおよびB ） 、この増加は主に細い（p=0.0027; F=5.319; df=59）およびずんぐりした（p=0.0378; F=2.988; df=59）スパインタイプ（どちらも未成熟スパインと考えられている）によって引き起こされた（図6C～E）。より成熟したキノコ型のスパインには影響は見られなかった。しかし、GFP-AC3Iを共発現させた場合、ΔFosBによるスパインの誘導は完全に阻害された（図6A～E）。これは、NAcシェルにおける樹状突起スパインのΔFosB誘導にはCaMKII活性が必要であることを示している。

次に、同じウイルスツールを用いて、ΔFosBのコカインに対する行動感受性への影響にCaMKII活性が必要かどうかを調べた。NAcシェルへのウイルス注入から72時間後、動物に5 mg/kgのコカインを1回注射し、運動活動を記録した。ΔFosBのより広範囲なAAV過剰発現で以前に示されたように（図4A）、HSVを介したΔFosBの過剰発現は、コカインに対する運動感受性を増加させた（p=0.0002、F=8.823、df=37、図6F）。樹状突起スパインの誘導と同様に、GFP-AC3Iの共発現によるCaMKII活性の阻害は、ΔFosBを介したコカイン感受性の増加を完全に阻害し、コカインの行動効果におけるΔFosB誘導性の変化にはCaMKII活性が必要であることを示した。

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議論

本研究では、コカインがNAcでΔFosBを誘導し、それがNAcシェルで選択的にCaMKIIα遺伝子の転写を上方制御するという新しいフィードフォワード機構を明らかにしました。CaMKIIαはその後ΔFosBをリン酸化して安定化させ、ΔFosBの蓄積量を増加させ、CaMKIIαの誘導をさらに促進します（図6G）。コカインへの慢性的な曝露中に2つのタンパク質のレベルが同時に上昇することで、薬物に対する行動反応の感作に重要な形で寄与します。ΔFosBとCaMKIIの両方がコカインに対する行動反応の増加に必要であることが以前に実証されているため（Pierce et al., 1998 ; Peakman et al., 2003）、これは特に魅力的な仮説です。我々はウイルスアプローチを用いて、特にNAcシェルにおけるΔFosBについてこの知見を再現しました（図4および図66）。

D1型MSNにおける遺伝子導入によるΔFosBの過剰発現は、コカイン未投与動物のNAcシェルとコアの両方でCaMKII誘導を引き起こす可能性があるが、コカイン投与下では、両領域で発生する内因性ΔFosBの蓄積が、特にNAcシェルでCaMKII誘導を引き起こす。この違いは、我々の二重遺伝子導入モデルで誘導されるΔFosBのレベルが高いことに関連している可能性があるが、コカインがシェルMSNとコアMSNでCaMKIIαプロモーターを異なる形で変化させ、前者ではΔFosB結合を促進し、後者では排除する能力を反映している可能性もある。実際、NAcコアのみでCaMKIIα遺伝子プロモーターのヒストンのコカインによる脱アセチル化を明らかにした我々のChIPデータは、クロマチン機構の関与の可能性を裏付けている。この仮説に沿って、D1型MSNにおけるΔFosBの過剰発現は、コカインが存在しない状況下でNAcコアにおけるCaMKIIαの誘導を促進することができた（図3F）。これは、慢性的なコカイン曝露中にこの誘導を阻害するCaMKIIαプロモーターの活性修飾が存在することを示唆している。CaMKIIプロモーターにおけるクロマチンランドスケープの調節は、慢性的にコカインを離脱したラットのNAcシェルではコカインのチャレンジ用量によってCaMKIIが誘導されるが（図1E）、薬物未投与の動物では誘導されない理由も説明できるかもしれない（図1D）。これは、ΔFosBのエピジェネティックな「遺伝子プライミング」効果を表している可能性があり（Robison and Nestler、2011）、したがって、コカイン渇望の潜伏の分子メカニズムの1つである可能性がある（Pickens et al.、2011）。しかし、このクロマチン変化が渇望の潜伏期間と因果関係にあるためには、時間とともに増加する必要がある。これが事実かどうか、また他の遺伝子がコカインによるΔFosB依存的なサブ領域特異的な調節を示すかどうかを研究することは興味深いだろう。また、我々が記述したフィードフォワードループがCaMKIIまたはΔFosBの際限のない蓄積につながるわけではないことにも注意する必要がある（図1E）。これを引き起こす分子的な「ブレーキ」を解明することは、今後の研究の重要な目標である。

いくつかの実験系および脳領域におけるΔFosBおよびCaMKIIの既知の機能は多くのレベルで収束する (イチジク6F） どちらの分子も樹状突起棘の成長と密接に関係しています：CaMKIIはアクチン細胞骨格と相互作用します（岡本ら、2009）、背骨の頭の大きさを調節する（松崎他、2004また、海馬器官型スライス培養における糸状仮足およびシナプス数の可塑性誘発性増加に必要かつ十分である（Jourdain et al。、2003）、wΔＦｏｓＢは、ＮＡｃ ＭＳＮにおけるコカイン誘発樹状突起棘形成に必要かつ十分である。Mazeら、2010） さらに、両方の分子はAMPAグルタメート受容体の調節に関連している。 CaMKIIはAMPA受容体サブユニットの全レベルを調節しないが、培養中の海馬錐体ニューロンにおいてSer1でGluA831をリン酸化することによりAMPA受容体のシナプスへの挿入を促進し、AMPAチャンネルコンダクタンスを増加させる。 インビボの （（でレビューマリノウとマレンカ、2002; コルブランアンドブラウン、2004））。 シナプスへのGluA1のそのような増加した輸送は同様に慢性的なコカイン作用にも関係していました（ボドローとオオカミ、2005） さらに、NAcにおけるAMPA受容体活性化に対する行動反応は、D1ドーパミン受容体依存的にCaMKIIαの過剰発現によって増強される（シンガーら、2010） ΔFosBの長期D1特異的過剰発現は、NAcにおいてGluA2転写を誘導することが示されている（Kelzら、1999これは、GluA1を介したAMPA応答を抑制しますが、ここでは短期間のΔFosBの過剰発現と短期間のコカイン曝露がこのサブユニットに影響を及ぼさないことを示します（図1） それにもかかわらず、我々は最近、短期間のΔＦｏｓＢ過剰発現がそれにもかかわらずＮＡｃ中のＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮ中のＡＭＰＡ応答を減少させることを見出した。Grueterら、2013） これらのデータは、まだよく理解されていない中毒進行の異なる側面の根底にあるコカインへの時間依存的な一連の神経適応を構成するかもしれない時間的に異なるメカニズムを示唆している。 行動レベルでは、CaMKIIとΔFosBの両方がコカインに対する自発運動感作に必要であり（上記参照）、両方ともげっ歯類のコカイン自己投与の持続に必要である（Colbyら、2003; Wangら、20102つのタンパク質は、部分的に異なる根本的なメカニズムを介してではあるが、薬物曝露に対する短期および長期の行動適応に重要であることを示唆している。 おそらく、ΔFosBおよびCaMKIIは、NAcシナプス機能の変化を介してそのような複雑な行動適応を調節するが、シナプス現象を行動変化に直接関連づけるためにはさらに多くの作業が必要である。

CaMKIIホロ酵素は、シナプス後密度（PSD）への標的化を調節すると考えられるさまざまなシナプス関連タンパク質と同時に相互作用し（Robison et al., 2005）、この現象はシナプス可塑性にとって重要であると考えられている。特に、CaMKIIとNMDA型グルタミン酸受容体のGluN2Bサブユニットとの相互作用は、シナプス可塑性と学習の両方を調節することが最近示された（Halt et al., 2012）。AC3IペプチドはCaMKIIの自己阻害ドメインを模倣し、酵素の触媒活性を阻害する一方で、複数のタンパク質間相互作用も阻害する（Strack et al., 2000 ; Robison et al., 2005）。したがって、ここで報告されたHSV-GFP-AC3Iの行動および形態学的効果は、CaMKII標的タンパク質のリン酸化の減少、CaMKII標的化の変化、またはシナプスにおけるCaMKIIの構造的役割の変化によって生じる可能性がある（Lisman et al., 2002）。

提案されたΔFosB-CaMKIIループがNAcシェルに限定されていることは特に注目に値する。最近の研究では、コカイン投与に対するNAcシェルとコアの反応にいくつかの生理学的差異があることが示されており、この考えは我々のバイアスのかからないiTRAQ（表S1）データによって確認されている。NAcシェルのMSNは、慢性コカイン投与後に数週間持続する発火能力の低下を示す一方、同じ動物のコアMSNは、2週間以内に基礎レベルに戻る一時的な（1～3日間）発火能力の増加を示す（Kourrich and Thomas、2009）。さらに、慢性コカインに曝露された動物のNAcシェルとコアでは、 GluA2を含む多数のシナプス蛋白質が異なって調節されている（Knackstedt et al.、2010）。慢性的なアンフェタミン投与は、特にNAcシェルにおいてCaMKIIαを誘導するため（Loweth et al., 2010）、コカインでも同様の効果が見られることは驚くべきことではありません。しかし、慢性的なコカイン投与はNAcシェルとコアの両方でΔFosBを誘導するため（Perrotti et al., 2008）、シェルにおけるCaMKIIα誘導がΔFosB依存性であることを示したことから、今回の研究結果は、シェルにおけるCaMKIIαの選択的誘導に関与する、これら2つのサブ領域間のCaMKIIαプロモーターにおける異なる転写メカニズムに関する新たな証拠を提供するものです。

近年の研究の多くは、D1型およびD2型のNAc MSNの違いを明らかにすることに焦点を当てている。D1受容体とD2受容体の両方がコカインの報酬効果に関与しているが（Self, 2010 ） 、近年の研究では、D1型MSNの光遺伝学的活性化はコカインに対する行動反応を増加させる一方、D2型MSNの活性化は逆の効果をもたらすことが示されている（Lobo et al., 2010）。これらの知見と一致して、D1受容体ノックアウトマウスはコカイン自己投与の獲得に欠陥があるが（Caine et al., 2007）、D2ノックアウトマウスは欠陥がない（Caine et al., 2002）。NAcへのD1アゴニストの直接投与は、再発パラダイムにおいてコカイン探索行動を引き起こす（Self, 2010）。興味深いことに、この効果にはNAcシェルにおけるD1受容体依存的なCaMKII活性の増加が必要であるが、コアでは必要ない（Anderson et al., 2008）。この結果は、ここで提案されているD1およびシェル特異的なΔFosB-CaMKIIループとよく一致する。

我々は以前、ΔFosBのSer27がカゼインキナーゼ-2によってリン酸化されることを報告したが（Ulery et al., 2006）、本研究ではCaMKIIがΔFosBのこの部位および他の部位をはるかに高い速度と化学量論でリン酸化すること、そしてコカイン曝露によるΔFosBの見かけのMrの上昇を再現できることを明らかにした（図5A ）（Nestler , 2008）。Ser27のリン酸化がΔFosBの安定性と転写活性を高めることは既に知られている（Ulery et al., 2006 ; Ulery and Nestler, 2007 ; Ulery-Reynolds et al., 2009）。今後の研究では、本研究で示されたΔFosBの新規リン酸化部位の同定とその機能的影響に焦点を当てる。

ここで説明するフィードフォワードループは、コカインの反復投与が側坐核の進行性異常を引き起こすもっともらしい新しいメカニズムを提供する。したがって、この生化学的経路は、将来の依存症治療介入の重要な標的となる可能性がある。CaMKIIは遍在し、多くの基本的な神経機能および行動機能に必要であるため、CaMKII阻害剤の直接使用は依存症治療として避けられてきた。我々のデータは、脳の報酬回路の個々の細胞型およびサブ領域に特異的なCaMKII誘導メカニズムをより微妙に標的とすることで、全身性CaMKII阻害の合併症を回避できる治療標的が得られる可能性を示唆している。

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謝辞

この作品は、国立薬物乱用研究所（EJN）、NIDAエールプロテオミクスセンターDA018343（AJRとEJN）、およびハートウェル財団（AJR）からの助成金によってサポートされていました。 著者らは、Gabby Rundenkoに精製されたΔFosBの寛大な贈り物を、Roger Colbranに精製されたCaMKIIαの寛大な贈り物を感謝したいと思います。

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