慢性コカインに対する（ヒト）行動的および構造的応答は側坐核殻（2013）におけるΔFosBおよびカルシウム/カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼIIを含むフィードフォワードループを必要とする

J Neurosci。 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, ビアロウV, マゼイ - ロビソンM, 風水J, クールリッチS, コリンズM, ウィーS, コーブG, トゥレッキG, ネーベR, トーマスM, ネスラーEJ.

ソース

フィッシュバーグ神経科学・フリードマン脳研究所、マウントシナイ医学部、ニューヨーク、ニューヨーク、10029、神経科学・心理学、ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ55455、中毒性障害の神経生物学委員会カリフォルニア州ラホーヤのスクリップス研究所、カナダのケベック州モントリオールのダグラスメンタルヘルス大学研究所およびマギル大学、マサチューセッツ州ケンブリッジのケンブリッジにあるケンブリッジのニューハンプシャー州ケンブリッジにあるモントリオール。

抽象

転写因子ΔFosBおよび脳に富むカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKIIα）は、コカインまたは他の精神刺激薬乱用への長期暴露によって側坐核（NAc）に誘発され、その2つのタンパク質は感作薬物反応を媒介する。 ΔＦｏｓＢおよびＣａＭＫＩＩαは両方とも、ＮＡｃにおけるＡＭＰＡグルタミン酸受容体の発現および機能、ＮＡｃ中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）上の樹状突起棘形成、ならびにコカインに対する自発運動感作を調節するが、今日までこれらの分子間の直接の関連は探究されていない。 ここで、我々は、ΔFosBがタンパク質安定化Ser27においてCaMKIIαによってリン酸化されていること、およびCaMKIIがタンパク質であることを証明する。 ラットNAcにおけるΔFosBのコカイン媒介蓄積に必要である。

逆に、我々は、ΔＦｏｓＢがインビボでのＣａＭＫＩＩα遺伝子発現のコカイン誘導に必要かつ十分であることを示し、これはＤに対して選択的な効果である。1NAcシェルサブリージョン内のMSNタイプのMSN.

さらに、ＮＡｃ ＭＳＮ上の樹状突起棘の誘導およびΔＦｏｓＢのＮＡｃ過剰発現後のコカインに対する行動反応性の増加は両方ともＣａＭＫＩＩ依存性である。

重要なことに、我々は初めてNAc中のΔFosBおよびCaMKIIの誘導を証明する。 人間のコカイン中毒将来の治療的介入のための可能なターゲットを提案します。 これらのデータは、ΔFosBおよびCaMKIIが慢性コカインに応答して脳の報酬回路を調節するための重要なメカニズムとして細胞型および脳領域特異的な正のフィードフォワードループに関与していることを証明している。

概要

証拠の増加は、遺伝子発現の変化が薬物中毒のメカニズムに寄与しているという見解を支持している（Robison and Nestler、2011） これらの変化の1つの重要なメディエータは、Fosファミリー転写因子であるΔFosBです（ネスラー、2008） 事実上あらゆる薬物乱用の長期投与は、報酬行動に必須の辺縁領域である側坐核（ＮＡｃ）におけるΔＦｏｓＢの長期持続的蓄積を誘導する。 Sそのような誘導は、ＤＸＮＵＭＸドーパミン受容体を発現するＮＡｃ中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）のクラスに特異的であると思われる。 これらのD1型NAc MSNにおけるΔFosBの誘導的過剰発現はコカインおよびモルヒネに対する自発運動およびやりがいのある反応を増加させる (Kelzら、1999; Zachariou他、2006（コカイン自己投与の増加を含む）Colbyら、2003). さらに、ΔFosB転写活性の遺伝的またはウイルス的遮断は、これらの薬物の有益な効果を減少させる（Zachariou他、2006）、このΔＦｏｓＢの持続的誘導が、長期薬物投与によってＮＡｃに誘導される持続的変化の重要なメディエータであることを示している。.

（他のすべてのFosファミリータンパク質と比較して）ΔFosBの異常な安定性は、完全長のFosBに存在するデグロンドメインの切断型のために、分子の固有の性質である（Carle et al。、2007そして、規制されたプロセス。 ΔFosBはリン酸化されている ビトロ & インビボの この反応は、細胞培養およびＮＡｃにおいて、ΔＦｏｓＢをさらに〜ＸＮＵＭＸ倍に安定化させる。 インビボの (Ulery-Reynolds他、2009） Ser27-ΔFosBはカゼインキナーゼ-2の基質であることが示されているが ビトロ (Ulery et al。、2006）、そのメカニズム インビボの リン酸化は未知のままである。

カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）は、αおよびβアイソフォームが12量体ホモおよびヘテロホロ酵素を形成する高発現セリン/スレオニンキナーゼです。 インビボの、そして複数の形態の神経可塑性に必須である (Lismanら、2002; コルブランアンドブラウン、2004） CaMKIIαは慢性的なアンフェタミンによってNAc殻に選択的に誘導される（Lowethら、2010）、およびNAcシェルにおけるCaMKII活性の薬理学的遮断は、アンフェタミンに対する行動感作を減少させる（Lowethら、2008）とコカイン（Pierceら、1998一方、このNAcサブ領域におけるCaMKIIαのウイルス過剰発現は、アンフェタミンへの自発的な感作およびアンフェタミンの自己投与を促進する（）。Lowethら、2010） CaMKIIαはAMPAグルタミン酸受容体サブユニットの調節を介して報酬行動に影響を与える可能性がある（Pierceら、1998CaMKIIα活性は長い間AMPA受容体機能およびシナプス標的化といくつかの形態の神経可塑性に関連してきた（マリノウとマレンカ、2002).

この文献は、ΔＦｏｓＢとＣａＭＫＩＩとの間のいくつかの類似点を実証している：両方とも、乱用薬物の複数の行動効果に必要かつ十分であり、両方とも様々な神経細胞型において樹状突起棘を上方制御する。 インビボの (Jourdain et al。、2003; Mazeら、2010そして両方ともAMPA受容体の調節を通してそれらの行動的効果の少なくともいくつかを発揮する。Kelzら、1999; マリノウとマレンカ、2002; Vialouら、2010） これらの類似点にもかかわらず、ΔＦｏｓＢとＣａＭＫＩＩとの間の機能的関連は知られていない。 ここでは、ΔFosBとCaMKIIの間の相互制御を確立し、2つのタンパク質がコカインによって誘導され、コカイン応答の範囲を制御するNAcシェルでD1型MSN特異的フィードフォワードループを形成することを実証します。 インビボの.

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材料と方法

実験1：コカイン処理後のNAcシェルおよびコアのiTRAQプロテオーム解析（イチジク1A)

成体（8週）の雄ラットに20 mg / kgコカインまたは生理食塩水ビヒクルを1日1回7日間IP投与した。 最後の注射の24時間後に、NAcシェルおよびコアを顕微解剖した（イチジク1A）とフラッシュ冷凍。 iTRAQ分析は以前に記載されたようにして行った（Rossら、2004; Davalosら、2010).

図1

図1

コカインによるNAc中のCaMKIIの殻特異的誘導

実験2：コカイン処理後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（図1B – D)

成体（ＸＮＵＭＸ週）の雄ラットに、自発運動記録チャンバ内で７日間、１日１回、ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇコカインまたは生理食塩水ビヒクルを腹腔内投与した。 コカインの単回注射に対する自発運動反応（8 mg / kg IP）を、以前にコカインで治療した動物（「慢性」と呼ぶ）および生理食塩水で治療した動物の一部（「急性」と呼ぶ）、および生理食塩水に対する自発運動反応を記録した。単独の慢性食塩水処置動物（「食塩水」と呼ばれる）においてのみ記録された。 自発運動活性アッセイを記載のように実施した（Hiroi et al。、1997） 手短に言うと、成体雄ラットを18”×24” PASオープンフィールド記録ボックス（San Diego Instruments）に入れて30 minで慣らし、生理食塩水を1回IP注射し、さらに30 minでモニターした。 5 mg / kgコカインの単回IP注射および30 minについてモニターした。

この最終注射のＸＮＵＭＸ時間後に、ラットを麻酔なしで断頭して、神経タンパク質レベルおよびリン酸状態に対する麻酔薬の影響を回避した。 脳を24 mmマトリックス（Braintree Scientific）で連続的にスライスし、標的組織を、NAcコア用の1.2ゲージパンチおよび残りの14ゲージパンチを使用して、プロテアーゼ（Roche）およびホスファターゼ（Sigma Aldrich）阻害剤を含むリン酸緩衝生理食塩水中で除去した。 NAcシェル用ティッシュ（を参照） イチジク1A）すぐにドライアイスで凍らせる。 サンプルを修飾ＲＩＰＡ緩衝液中での超音波処理によって均質化した：ＸＮＵＭＸｍＭトリス塩基、ＸＮＵＭＸｍＭ塩化ナトリウム、ＸＮＵＭＸｍＭドデシル硫酸ナトリウム、ＸＮＵＭＸ％トリトンＸ − ＸＮＵＭＸ、ＸＮＵＭＸ％デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ ＸＮＵＭＸ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤。上記のように。 Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加した後、タンパク質をＸＮＵＭＸ〜ＸＮＵＭＸ％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢｉｏＲａｄ）上で分離し、ウエスタンブロッティングを製造業者のプロトコルに従ってＯｄｙｓｓｅｙシステム（Ｌｉ － Ｃｏｒ）を用いて実施した。

実験3：コカイン離脱後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（イチジク1E)

成体（8週）の雄ラットに10 mg / kgコカインまたは生理食塩水ビヒクルを1日1回7日間IP投与した。 最後の注射の14日後に、食塩水で処置した動物に別の食塩水注射（「食塩水」と呼ぶ）を与え、コカインで処置した動物に別の食塩水注射（14日撤退または「14d WD」と呼ぶ）または単回コカイン注射（挑戦のために「14d WD Chal」と呼ばれる）。 最後の注射の１時間後、動物を断頭し、ウエスタンブロッティングを以下のように実施した。 実験2.

実験4：コカイン自己投与後のラットNAcコアおよびシェルにおけるタンパク質変化の定量化（図2A – C)

ラットは、固定比率の0.5スケジュールに従って1時間のセッションで9日間1 mg / kg /コカインの注入を自己投与するように訓練された。 9回のベースラインセッションの後、最後の2回のセッションでラットをコカイン摂取によってバランスのとれた2つのグループに分けた。 一方のラット群は1時間のセッションでコカインを自己投与することができ（0.5 mg / kg /注入）、他方のラットのグループは6時間のセッションで自己投与した（ロングアクセス、LgA）。 ）さらに10日間（エスカレーションセッション）。

記載されているように、脳切片を免疫組織化学用に処理した。Perrottiら、2004） 最後の薬物曝露から18〜24時間後に脳を灌流した結果、残存するすべての免疫反応性がΔFosBを反映するように、残存する完全長FosBタンパク質が分解された。 この分解はウエスタンブロッティングによって確認され、それはΔＦｏｓＢを認識しない完全長ＦｏｓＢのＣ末端に対する抗体による有意な染色を示さなかった（データは示さず）。 ＸＮＵＭＸμｍ切片にスライスした後、盲検観察者により各ラットのＮＡｃを通して２つの切片でΔＦｏｓＢ免疫陽性細胞の数を定量し、次いでＸＮＵＭＸ×視野あたりの平均値を各動物の領域別に計算した。 各動物を統計分析のために個々の観察と見なした。 関心領域は、PaxinosとWatson（パキシノスとワトソン、2007).

ＣａＭＫＩＩα免疫反応性の定量化は、記載のようにＬｉｃｏｒシステムを使用して実施した（Covingtonら、2009） ＣａＭＫＩＩおよびＧＡＰＤＨの積分強度は、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いて決定した。 結果は１ｍｍ当たりの積分強度値として表される。2 そして、平均値±標準誤差として表されます（n = 4 –10 /グループ）。 スライス厚さおよび条件に関してＣａＭＫＩＩ強度を正規化するための基準としてＧＡＰＤＨの値を使用した。

図2

図2

自己投与ラットおよびヒトコカイン中毒者のNAc殻におけるCaMKIIの誘導

実験5：コカイン依存性ヒトにおけるタンパク質レベルの定量化図2D)

手順

死後のヒト脳組織はケベック自殺ブレインバンクから入手した。 （ダグラスメンタルヘルス大学研究所、モントリオール、ケベック、カナダ）。 組織の保存は本質的に記載されているように進行した（Quirionら、1987） 手短に言えば、一旦抽出されると、脳は発泡スチロール箱の中の湿った氷の上に置かれそしてケベック自殺ブレインバンク施設に急行される。 半球は、脳、脳幹、および小脳の真ん中の矢状切開によってすぐに分離されます。 血管、松果体、脈絡叢、小脳半球、および脳幹の半分を典型的には左半球から解剖し、次いでそれを凍結する前に冠状に1 cm厚のスライスに切断する。 凍結する前に、後半の小脳を矢状に1cm厚のスライスに切断する。 組織をＸＮＵＭＸ−メチルブタン中で−ＸＮＵＭＸ℃で〜ＸＮＵＭＸ秒間急速冷凍する。 すべての凍結組織は長期保存のために-2℃でビニール袋に別々に保存されます。 周囲の温度を制御するために、ドライアイスを備えたステンレス鋼プレート上の凍結冠状スライスから特定の脳領域を解剖する。 ウエスタンブロッティングは、に記載のように実施した。 実験2.

コホート

コホートは、37〜3歳の範囲の年齢の15男性および66女性被験者から構成された。 全ての被験者は長期の苦痛な状態または長期にわたる医学的疾患なしに突然死亡した. いずれの場合も、死因はケベックの検死官事務所によって確認され、そして毒物学的スクリーニングが組織サンプルを用いて行われ、死亡時の投薬および違法物質使用に関する情報が得られた。 対象群は、コカイン依存についてのSCID-1基準を満たした20個体から構成された。 対照群は、コカイン依存症の既往歴および主要な精神医学的診断のない20対象から構成された。 すべての被験者は脳組織に直接影響を及ぼさなかった原因で突然死亡した。 グループは、平均対象年齢、冷蔵遅延、およびpHについて一致させた。 すべての被験者について、心理学的剖検を以前に記載されたように行った（Dumaisら、2005）精神医学的および病歴に関する詳細な症例情報、ならびにその他の関連する臨床的および社会人口学的データにアクセスできるようにする。 簡単に言うと、訓練を受けた面接官が DSM-IVのための構造化臨床面接 1人以上の死亡者の情報提供者を伴う精神障害（SCID-1）。 臨床医のパネルがSCID-1の評価、症例報告、検死官の記録、および医療記録をレビューして合意の精神医学的診断を得た。

実験6：ラットNAcに対するクロマチン免疫沈降（図3A – C)

成体（8週）の雄ラットに10 mg / kgコカインまたは生理食塩水ビヒクルを1日1回7日間IP投与した。 最後の注射のＸ時間後に、ＮＡｃシェルおよびコアを顕微解剖した。 クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、全群ＸＮＵＭＸ（全ＸＮＵＭＸ動物、ＸＮＵＭＸコカインプール、ＸＮＵＭＸ生理食塩水プール）中の１群あたり７匹のラットからのシェルまたはコアの両側ＮＡｃパンチをプールすることで行った。 組織を架橋し、洗浄し、そして超音波処理によるクロマチン剪断まで−ＸＮＵＭＸ℃で保存した。 剪断したクロマチンを、予め磁性ビーズに結合した抗体（Dynabeads M-24、Invitrogen）と共に一晩インキュベートした。 非免疫IgGを対照として使用した。 逆架橋およびＤＮＡ精製後、ｑＰＣＲを使用してＣａＭＫＩＩαプロモーターＤＮＡのレベルを測定した。 転写開始部位の前の〜14 bpに位置するAP-98コンセンサス配列を含む領域を増幅するようにプライマーを設計した（Forward：ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse：TGTGCTCCTCAGAATCCACAA）。

図3

図3

CaMKIIαの細胞型および領域特異的なΔFosB誘導 インビボの

実験ＸＮＵＭＸ：細胞型特異的ΔＦｏｓＢ過剰発現を用いたＣａＭＫＩＩ転写物およびタンパク質発現の測定（図3D)

に由来する雄の二形質転換マウス NSE-tTA （行A）× TetOp-ΔfosB （行11）そして NSE-tTA （ラインB）× TetOp-FLAG-ΔfosB （ライン11）マウス（Chenら、1998; Kelzら、1999; Werme et al。、2002; Zachariou他、2006開発中にΔFosBの発現を抑制するために、100 µg / mlドキシサイクリンを投与した。 同腹仔を離乳時に分けた：半分はドキシサイクリンを投与したままにし、残りの半分は水に切り換え、ΔＦｏｓＢの転写効果が最大になったときに動物をＸＮＵＭＸからＸＮＵＭＸに使用した。Kelzら、1999; McClungとNestler、2003） 転写分析のために、マウスを急速に断頭し、そして脳を取り出しそして氷上に置いた。 ＮＡｃの解剖をＸＮＵＭＸゲージニードルパンチで行い、ＲＮＡが抽出されるまでドライアイス上で迅速に凍結した。 ＲＮＡ単離、ｑＰＣＲ、およびデータ分析は、以前に記載されたように実施した（LaPlantら、2009） 手短に言えば、RNAをTriZol試薬（Invitrogen）で単離し、Qiagen製のRNAeasyマイクロキットでさらに精製し、AgilentのBioanalyzerで品質を調べた。 逆転写はiScript（BioRad）を用いて行った。 以下のサイクルパラメータを用いて、Applied Biosystemsの7900HT RT PCRシステムを用いてqPCRを実施した。 ＸＮＵＭＸ分についてはＸＮＵＭＸ℃、ＸＮＵＭＸ秒についてはＸＮＵＭＸ℃、ＸＮＵＭＸ秒についてはＸＮＵＭＸ℃。 単一のPCR産物を確認するための解離曲線を作成するために10°Cまで段階的に加熱した。 ΔＦｏｓＢおよびＣａＭＫＩＩαタンパク質発現の免疫組織化学的分析は、に記載されているように行った。 実験4.

実験ＸＮＵＭＸ：コカイン媒介タンパク質変化に対するＮＡｃ内ＤＸ​​ＮＵＭＸおよびＤＸＮＵＭＸドーパミン受容体拮抗薬の効果（イチジク3H)

成体（8週）の雄ラットに10 mg / kgコカインまたは生理食塩水（「ビヒクル」群）を1日1回7日間腹腔内投与した。 各コカイン注射のＸＮＵＭＸ分前に、ラットにＤＸＮＵＭＸ受容体拮抗薬ＳＣＨ ＸＮＵＭＸ（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ、「ＤＸＮＵＭＸ Ａｎｔ」群）、またはＤＸＮＵＭＸ受容体拮抗薬エチクロプリド（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ、「ＤＸＮＵＭＸ Ａｎｔ」群）をＩＰ投与した。または生理食塩水対照注射（「コカイン」群）。 最後の注射のＸＮＵＭＸ時間後に、動物を断頭し、タンパク質をウエスタンブロッティングにより以下のように定量した。 実験2.

実験ＸＮＵＭＸ：タンパク質発現に対するＡＡＶ媒介ΔＦｏｓＢ過剰発現の効果（図4 A – C)

ＡＡＶ − ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＡＡＶ − ＧＦＰ − ΔＦｏｓＢを注射するために成体雄性ラット（ＸＮＵＭＸ週）に対して定位固定手術を行った（ＸＮＵＭＸ週）。Mazeら、2010） 33ゲージ針（Hamilton）をすべての手術に使用し、その間に0.5μlの精製高力価ウイルスを5分の期間にわたって両側に注入し、続いて追加の5分の注入後休止期間を続けた。 全ての距離はブレグマに対して測定される：ＸＮＵＭＸ°角度、ＡＰ ＝ ＋ ＸＮＵＭＸｍｍ、Ｌａｔ ＝ ＸＮＵＭＸｍｍ、ＤＶ ＝ −ＸＮＵＭＸｍｍ。 手術のＸＮＵＭＸ日後に、動物に、自発運動モニタリングチャンバーにおいてＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇコカインの単回ＩＰ注射を与えて、ΔＦｏｓＢ過剰発現の行動的影響を評価した。 この最後の注射のＸＮＵＭＸ時間後に、ラットを以下のように断頭した。 実験2そして、ＧＦＰ陽性ＮＡｃ組織を得るために、蛍光顕微鏡下で組織の顕微解剖を行った。 次にウェスタンブロッティングを以下のようにして行った。 実験2

図4

図4

ΔFosBはNAc殻におけるコカイン媒介D1受容体依存性CaMKIIα誘導に必要かつ十分である

実験ＸＮＵＭＸ：コカイン依存性タンパク質発現に対するＡＡＶ媒介ΔＪｕｎＤ過剰発現の効果図4 D – F)

ＡＡＶ − ＧＦＰまたはＡＡＶ − ＧＦＰ − ΔＪｕｎＤの定位注射は、以下の通りに行った。 実験8 手術からＸＮＵＭＸ日後、動物に、自発運動記録チャンバー内で７日間、１日１回、ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇコカインまたは生理食塩水ビヒクルを腹腔内投与した。 コカイン（14 mg / kg IP）または食塩水の単回注射に対する自発運動反応を記録した。 この最後の注射のＸＮＵＭＸ時間後に、ラットを断頭し、組織を採取し、そしてウエスタンブロットを以下の通りに行った。 実験9

実験11： インビトロの プロテインキナーゼアッセイ（図5A – D)

組換えＣａＭＫＩＩαおよびΔＦｏｓＢを昆虫細胞から精製した（Brickeyら、1990; Jorissenら、2007そしてプロテインキナーゼアッセイを実施した（Ａ．コルブラン、1993、前述したように）。 手短に言えば、ＣａＭＫＩＩを氷上でＸＮＵＭＸ μＭ（または表示濃度）のΔＦｏｓＢ、ＸＮＵＭＸ ｍＭ Ｃａとプレインキュベートした。2+40 mM Mg2+、ＸＮＵＭＸ μＭカルモジュリン、およびＸＮＵＭＸｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ＸＮＵＭＸ。 リン酸化は15μMATPを添加して添加してもしなくても開始した。32P] ATPを室温で10 minの間進行させた（図5A＆B）または氷上で2分（図5C＆D） 生成物をウエスタンブロッティングによって分離した（図5A＆B）またはオートラジオグラムとシンチレーションカウンティングによる（図B – D）。

図5

図5

ΔFosBはCaMKIIαの強力な基質です

実験ＸＮＵＭＸ：ＳｅｒＸＮＵＭＸ ΔＦｏｓＢリン酸化の同定（イチジク5E)

インビトロの キナーゼアッセイを以下のように実施した。 実験11タンパク質をSDS-PAGEで分離し、ΔFosBに対応するバンドを切り出してタンデム質量分析にかけた。 全てのパネルにおける対応するイオンフラグメントのｍ ／ ｚ割り当ては、イオンピークの上にラベル付けされている。 スペースの制限により、すべてのフラグメントイオンが標識されているわけではありません。 一般に、フラグメントイオンラベルのテキストは、目的のリン酸化部位の存在を直接確認または追加する場合を除き、黒色で表示されています。その場合、赤色で表示されます。 バックボーンフラグメンテーション産物の証拠は、単一のアミノ酸文字の名称で赤で示されているリン酸化残基の検出された部位を有するホスホペプチドの配列読み出しにおいて提示されている。 観察されたフラグメントイオンの数字による説明も、ペプチド配列上にｂおよびｙイオンとしてマークされている。 より低い強度のフラグメントイオンを示すためのｍ ／ ｚ軸の区画に対するズーム率は、各フラグメント質量スペクトルの上部にマークされている。 パネルＨに示されるフラグメントイオンは、部位ＳｅｒＸＮＵＭＸ、ＳｅｒＸＮＵＭＸ、ＳｅｒＸＮＵＭＸ、およびＴｈｒＸＮＵＭＸでの他のリン酸化イソ型の混合物内の、ＳｅｒＸＮＵＭＸリン酸化イソ型の存在を確認する。 pa27、pa28-P、pb31、およびpb34-Pイオンの存在により、Ser37残基のリン酸化が一意に確認されます。

実験13：Ser27リン酸化の定量化（イチジク5F)

標準ペプチドは、Ser27ΔFosBのホスホ型および非ホスホ型を模して設計された。 合成および精製後、各「重い」イディオタイプペプチドを50 / 50アセトニトリル/水緩衝液に溶解し、アミノ酸分析に送って合成ペプチドストック溶液上の絶対濃度を決定した。 次に、各「重い」ペプチドを4000 QTRAP質量分析計（MS）に直接注入して、MS / MSフラグメンテーションおよび2から4回のMRM遷移に最適な衝突エネルギーを決定しました。 次に、ペプチドの分離を確実にするために、純粋な「重い」ペプチドを4000 QTRAPでLCMSにかけた。 Q1を特定の前駆体m / z値に設定し（Q1はスキャンしていない）、Q3をそのペプチドの特定のフラグメントに対応する特定のm / z値に設定して、機器をトリプル四重極モードで実行した。 MRMモードでは、一連の単一反応（衝突エネルギーを調整して目的のフラグメントイオンの強度を最適化するプリカーサ/フラグメントイオン遷移）を連続して測定し、サイクル（通常は1〜2秒）をループスルーしました。 ＨＰＬＣ分離の全時間。 既存のペプチドのＭＳ ／ ＭＳスペクトルからＭＲＭ遷移を決定した。 次いで、高強度フラグメントイオンに対応するペプチドあたり２つの遷移を選択し、自動化ソフトウェアを用いてＭＲＭ遷移の信号強度を最大にするように衝突エネルギーを最適化した。 次いで、ＣａＭＫＩＩまたは対照に曝露された標準ペプチドおよびΔＦｏｓＢサンプルから生じるピークを比較して、反応中の各ペプチド形態の絶対存在量を決定した。 LC-MRMデータのデータ解析は、AB Multiquant 1.1ソフトウェアを使用して行われます。

実験14：CaMKII過剰発現マウスにおけるΔFosBの誘導（図5G＆H)

T286D CaMKIIを過剰発現するトランスジェニックマウス（Mayfordら、1996; Kourrichら、2012野生型同腹仔をドキシサイクリンの非存在下で飼育して導入遺伝子の発現を可能にした。 成体マウスに20 mg / kgコカインまたは生理食塩水を1日1回14日間投与した。 最後の注射のＸＮＵＭＸ時間後に、動物を断頭し、そして免疫組織化学およびΔＦｏｓＢ発現の定量化を以下のように実施した。 実験4.

実験15：NAc樹状突起棘に対するHSV媒介ΔFosB過剰発現およびCaMKII阻害の効果図6A – E)

成体雄性マウス（ＸＮＵＭＸ週）にＨＳＶ − ＧＦＰ、ＨＳＶ − ＧＦＰ − ΔＦｏｓＢ（ＮＳＡｃ）を定位注射した。Olaussonら、2006）、ＨＳＶ − ＧＦＰＡＣＸＮＵＭＸＩ、またはＨＳＶ − ＧＦＰＡＣＸＮＵＭＸＩ − ΔＦｏｓＢ。 これらの構築物において、ＣａＭＫＩＩ活性のペプチドベースの阻害剤であるＡＣＸＮＵＭＸＩは、ＧＦＰのＣ末端に融合している。 ＧＦＰＡＣＸＮＵＭＸＩを、テンプレートとしてＧＦＰＡＣＸＮＵＭＸＩを含むｐＭＭＸＮＵＭＸ−ベクターを用いて、以下のプライマーを用いてＰＣＲによってクローン化した。ＧＦＰ − ＡＣＸＮＵＭＸＩ − Ｆ： GFP-AC3I-R：3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3'（clampBspEIstop）。 得られたPCR産物を、NheIおよびBspEI部位を用いてp3 +およびp400 +-ΔFosBベクターに挿入した。 構築物を配列決定により確認した。 定位座標は：ＸＮＵＭＸ°、ＡＰ ＝ ＋ ＸＮＵＭＸｍｍ、Ｌａｔ ＝ ＋ ＸＮＵＭＸｍｍ、ＤＶ ＝ −ＸＮＵＭＸｍｍであった（Ｂａｒｒｏｔら、ＸＮＵＭＸ）。 灌流および脳切片化は、通りに実施した。 実験4.

記載されているように脊椎分析を行った（Christoffelら、2011） 手短に言えば、体細胞から離れた樹状セグメント50〜150μmを、GFPを発現するHSV感染細胞から無作為に選択した。 形態学的分析のために共焦点LSM 710（Carl Zeiss）で画像を取得し、NeuronStudioとrayburstアルゴリズムを使用した。 NeuronStudioは、（1）縦横比、（2）頭と首の比、（3）頭の直径の値に基づいて、背骨を細いか、きのこか、または短かいとして分類します。 首のある棘は細いかキノコのどちらかに分類することができ、有意な首のないものはスタビーとして分類されます。 首のある棘は、頭の直径に基づいて細いまたはきのことして分類されます。

図6

図6

CaMKII活性の遮断はNAcにおけるΔFosBの形態学的および行動的影響を防止する

実験ＸＮＵＭＸ：コカイン応答に対するＨＳＶ媒介ΔＦｏｓＢ過剰発現およびＣａＭＫＩＩ阻害の効果（イチジク6F)

成体雄性マウスにウイルスを注射した。 実験15そして、コカインの単回5 mg / kg注射に対する自発運動反応を以下のように測定した。 実験9 自発運動データは、コカイン注射後のＸＮＵＭＸ分にわたる総ビーム遮断として表される。

追加情報

アニマルハウジング

オスのSprague Dawleyラット（250〜275 g; Charles River Laboratories）をペアで飼育した。 ８週齢のＣＸＮＵＭＸＢＬ ／ ＸＮＵＭＸＪオスマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、ケージ当たり最大５匹の動物でグループに収容した。 すべての動物は実験操作の前に≧57週間動物施設に慣れ、6時間の明/暗サイクル（1：23 AMで点灯）で気候制御室（25〜12°C）に収容した。そして水 アドリブで。 実験は、神経科学学会およびシナイ山の施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指針に従って行われた。

薬物

薬物を腹腔内投与し、コカイン（5-20 mg / kg /マウス、10 ml /ラット、NIDA）およびSCH 1または塩酸エチクロプリド（23390 mg / kg / 0.5 ml、Tocris）を含む滅菌食塩水に溶解した。 定位外科手術のために、滅菌生理食塩水中のケタミン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）およびキシラジン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅａｉｎ）の「カクテル」でマウスを麻酔した。

抗体

CaMKIIα（合計）：アップステート05〜532、1：5,000

ＣａＭＫＩＩホスホ−ＴｈｒＸＮＵＭＸ：プロメガＶＸＮＵＭＸＡ、ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ

ΔFosB（合計）：セルシグナリング5G4、1：250

ΔFosBホスホ-Ser27：リン酸溶液、1：500

GluA1（合計）：Abcam、Ab31232、1：1,000

GluA1ホスホ-Ser831：ミリポアN453、1：1,000

GluA1ホスホ-Ser845：ケミコンAb5849、1：2,000

GluA2：ミリポア07 – 598、1：2,000

NR2A：シグマHPA004692、1：2,500

NR2B：ミリポアAb1557P、1：1,000

統計分析

全ての統計分析は、Prism 6ソフトウェアパッケージ（GraphPad）を用いて行った。 スチューデントのt検定はすべてのペアワイズ比較に使用され（t値が与えられる結果に示される）、そして一元配置分散分析はすべての多重比較に使用された（F値が与えられる結果のセクションに示される）。

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結果

慢性コカインはNAc殻にCaMKIIを誘導する

多くの研究は、NAcの殻と核のMSNは、乱用薬物への慢性的な曝露に対して異なる生化学的および生理学的反応を示すことを示しています（KourrichとThomas、2009; Lowethら、2010そして、2つの小領域は薬物探索行動を異なって調節すること (伊藤ら、2004） NAcシェルのタンパク質成分に対するコカインの異なる効果を決定する 対 コアでは、我々は多重等圧タギング（iTRAQ）とタンデム質量分析（MS / MS）を使用しました。 成体雄ラットにコカイン（20 mg / kg）または生理食塩水を7日間毎日腹腔内注射した。 最後の注射の24時間後に、NAcシェルおよびコアを顕微解剖した（イチジク1A）とフラッシュ冷凍。 次にこれらのサンプル中のタンパク質をiTRAQを用いて定量した。 ４つ全てのＣａＭＫＩＩアイソフォームは、コアと比較してＮＡｃシェルに特異的なコカイン処理後の発現の大きな増加を示した。 PP1触媒サブユニットと調節サブユニット、およびPP2Aを含むいくつかのプロテインホスファターゼは、以前は他のシステムでさまざまなCaMKII基質と結合していました（コルブラン、2004）、同様のパターンに従った。 これらの知見は、CaMKIIシグナル伝達経路が殻特異的な様式でNAc中のコカインによって顕著に調節されているという新規の公平な証拠を提供した。

この知見をより定量的に検証するために、本発明者らは上記のようにラットをコカイン（様々な用量で）または食塩水で処置し、コカインに対する運動応答（5 mg / kg）または食塩水チャレンジ用量を測定した。 10 mg / kgコカインへの反復暴露は、自発運動感作の典型的なパターンをもたらした（イチジク1B） この投与計画を用いたさらなる研究は、ウエスタンブロッティングの使用により、反復コカインがコカインの最後の注射の１時間後にＮＡｃ殻ＸＮＵＭＸにおいて選択的にＣａＭＫＩＩαを誘導することを明らかにした。図1CとD; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； F = 0.0019。 df = 7.943） 加えて、AMPA受容体のGluA29サブユニットの標準CaMKII基質Ser831のリン酸化は、NAcシェルでは有意に増加し、コアではなかった（p = 1; F = 0.0261; df = 4.208）が、CaMKIIαThr28自己リン酸化は強くないが増加しなかった。殻のみでの誘導に向かう著しい傾向（図1D） 他のいくつかのグルタミン酸受容体は影響を受けなかった。 ＣａＭＫＩＩのこれらの尺度とは対照的に、同じ組織試料は、ＮＡｃのシェル（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； Ｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）およびコア（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； Ｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）の両方においてΔＦｏｓＢの誘導を示した。 （図1CとD）以前の発見と一致するPerrottiら、2008).

AMPA受容体のコカイン調節に関するいくつかの以前の研究は、慢性コカインからの離脱の約14日後に動物を分析したので（議論を参照）、この時点でこれらの生化学的分析を繰り返した。 我々は、コカインの最終注射の14日後に、ΔFosBはNAcにおいて上昇したままであり（p = 0.0288; F = 4.258; df = 22）、一方CaMKIIもGluA1のリン酸化も増加しないままであることを見出した。イチジク1E） しかしながら、コカインの単回投与量1 mg / kg後の10時間、総CaMKIIレベル（p = 0.0330; F = 3.947; df = 26）およびGluA1 Ser831（p = 0.0213; F = 4.509; df = 27）。リン酸化は両方とも最初の慢性的なコカイン曝露の後に見られるのと同じ程度まで上昇します（イチジク1E） これらのデータは、おそらくCaMKII遺伝子プロモーターの直接プライミングを介して、NAcシェルニューロンが長期間の禁酒期間中にCaMKII誘導のためにプライミングされることを示している（考察を参照）。 さらに、ΔＦｏｓＢ誘導がＣａＭＫＩＩ誘導よりも持続的であるという事実は、考察でカバーされているように、クロマチンベースであろうとなかろうと、ＣａＭＫＩＩ調節に「ブレーキをかける」追加のメカニズムの存在を示唆する。

これらの観察をさらに強化するために、我々はコカイン自己投与のモデルを調査した。それは任意の薬物摂取を含む。 成体雄性ラットにはコカインへの短期または長期のアクセスを与えた。 予想通り （Ahmed and Koob、1998）、長いアクセス条件のみが薬物の自己投与の増大をもたらした（イチジク2A） ΔＦｏｓＢは長期にわたってより多く誘導された。 対 NAcシェル（p = 0.0011; F = 11.12; df = 17）およびコア（p = 0.0004; F = 13.86; df = 17）の両方でコカインへの短いアクセス。 対照的に、CaMKIIαはコカインへの長いアクセスによってのみNAcシェルで誘導された（図2BとC; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； F = 0.0236。 df = 4.957） 短期アクセスの動物（〜16 mg / kg IV）、長期アクセスの動物（〜12 mg / kg IV）、および実験者が投与した動物（70 mg / kg）の平均1日コカイン摂取量を比較することは興味深いです。なぜ後者はΔFosBとCaMKIIの強力な誘導を引き出すのに対し、ショートアクセスは引き出さないのかを尋ねなさい。 この矛盾は、ピークコカインレベルの差（実験者投与コカインは単回ボーラスIPとして与えられるが、自己投与コカインは複数のIV用量で送達される）、または薬物曝露の長さの差（実験者の10日数）による可能性が高い管理、自己管理のための7日）。

コカイン作用におけるΔＦｏｓＢおよびＣａＭＫＩＩに関する多数の文献にもかかわらず、ヒトのコカイン使用者におけるこれらのタンパク質の研究はない。 ここで、我々は、ΔFosB（p = 0.0316; t = 1.921; df = 34）およびCaMKII（p = 0.0444; t = 1.755; df = 32）の両方のレベルがコカイン依存性ヒトのNAcにおいて増加するという最初の証拠を提示する。図2D, テーブル1） これらのデータは、げっ歯類NAcにおけるコカインによるΔFosBおよびCaMKII誘導の我々の試験がヒトのコカイン中毒に臨床的に関連があることを示している。

テーブル1

テーブル1

ヒトコカイン常用者および対応対照群からの試料の特性化

ΔFosBはNAcシェルのD1型MSNにおいてCaMKII転写を選択的に調節する

CaMKIIおよびΔFosBの両方がげっ歯類NAcにおいてコカインによってアップレギュレートされるという知見は、ΔFosBがCaMKII遺伝子の転写を調節し得るかどうかを決定するために我々を導いた。 我々は以前にＣａＭＫＩＩαをＮＡｃの不偏マイクロアレイ分析においてΔＦｏｓＢの可能性のある標的として報告した。McClungとNestler、2003しかし、この発見はその研究ではさらに検証されていません。 我々は最初に定量的ChIP（qChIP-ChIPとそれに続く定量的PCR）を用いて成体雄ラットのNAcにおいてCaFKIIα遺伝子プロモーターにΔFosBが結合するかどうかを決定し、そしてこの結合は殻において慢性コカイン投与により有意に増加することを発見した。 p = 0.0133; t = 2.901; df = 12）ただし、コアではない部分領域（イチジク3A） ＣａＭＫＩＩαプロモーターへのΔＦｏｓＢの結合におけるこの小領域特異的な差異に関連する機構をさらに理解するために、本発明者らは、このゲノム領域におけるヒストン修飾の状態を特徴付けるためにｑＣｈＩＰを使用した。 以前の研究は、全マウスＮＡｃにおけるＣａＭＫＩＩαプロモーターでのＨＸＮＵＭＸアセチル化のコカイン誘導を実証した（Wangら、2010） 対照的に、我々は、コカインが、NAcコアにおいてCaMKIIαプロモーターにおけるH3アセチル化を選択的に減少させることを見出した（イチジク3B; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｔ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）、殻内で明らかな変化はなく、ΔＦｏｓＢ結合を超えた部分領域特異的クロマチン変化と一致する。 抑制マーク、ジメチル化H0.0213リジン2.726（H10K3me9）のqChIPは、シェルとコアの両方のサブ領域の減少傾向を明らかにした（イチジク3C).

ΔFosBがCaMKIIα転写を調節するかどうかを調べる インビボの我々は、ＤＸＮＵＭＸにおいて特異的にΔＦｏｓＢを誘導的に過剰発現する２つの二遺伝子導入マウス系統を利用した。 対 飲料水中のドキシサイクリン投与によって制御される方法でのD2型MSNChenら、1998; Kelzら、1999; Werme et al。、2002） ＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮのみでΔＦｏｓＢを過剰発現する成体雄性マウスは、ＮＡｃ中のＣａＭＫＩＩα ｍＲＮＡのレベルが有意に増加していた（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｔ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）。図3D） ＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮにおけるΔＦｏｓＢ発現によって誘導されたＣａＭＫＩＩα ｍＲＮＡの増加は、ＮＡｃシェル（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｔ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｔ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｔ）の両方においてＣａＭＫＩＩαタンパク質の付随する増加を伴った。 = 1; df = 0.0030; イチジク3EとF） これらのデータは、ΔＦｏｓＢが両方の小領域においてＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮにおいてＣａＭＫＩＩα遺伝子発現を駆動することができることを実証している。 図3B は、CaMKIIαプロモーターでのコカイン媒介クロマチン変化（例えば、アセチル化の減少）が、コカイン後のコアサブ領域においてΔFosBがCaMKIIを上方制御するのを妨げることを示唆している。

私たちのトランスジェニックマウスのデータは、CaMKII遺伝子発現のΔFosB誘導がNAcのD1型MSNに特異的であることを示したので、次に、CaMKIIのコカイン依存性アップレギュレーションがD1ドーパミン受容体の活性化を必要とするかどうかを決定しようとしました。 成体の雄ラットには以前と同様に慢性コカインまたは生理食塩水を投与しましたが、各注射の30分前に、コカイングループのラットに生理食塩水、D1拮抗薬SCH 23390（0.5 mg / kg）、またはD2受容体拮抗薬エチクロプリドのIP注射を行いました。 （0.5mg / kg）。 コカインの最後の注射の24時間後に動物を分析した。 ウエスタンブロッティングにより、以前に報告されたように（p <1; F = 2; df = 0.0001）、D18.96ではなくD18アンタゴニストがコカインを介したΔFosBの増加を完全にブロックしたことが明らかになりました（Nye et al。、1995CaMKIIと同様に（p = 0.0005; F = 10.99; df = 18;）。 図3GとH） これらのデータは、コカインが、特にＮＡｃシェルのＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮにおいて、ＣａＭＫＩＩ遺伝子発現のΔＦｏｓＢ媒介性増加を引き起こすという仮説を支持する。 この脳領域内のＣａＭＫＩＩ発現に対するコカインのこの細胞型特異的効果を直接証明することは将来の研究において重要であろう。

ΔＦｏｓＢは、ＮＡｃシェルにおけるＣａＭＫＩＩのコカイン誘導に必要かつ十分である。

二トランスジェニックマウスの使用を補完するために、我々は次にラットにおけるウイルス媒介遺伝子導入の使用によるCaMKIIαのコカイン誘導の媒介におけるΔFosBの役割を研究した。 本発明者らは、アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子を成体雄ラットのNAcシェル（シェルを選択的に標的とすることができる）に注射して、ΔFosBプラスGFPまたはGFPのみを過剰発現させた。 次に動物に10 mg / kgコカインの単回IP注射を与えた。 ΔＦｏｓＢ ／ ＧＦＰを過剰発現している動物は、ＧＦＰ単独を過剰発現している動物と比較して自発運動反応の増加を示した（イチジク4A） 単回コカイン注射の24時間後に、GFP陽性NAc組織をこれらの動物から蛍光光源下での解剖により切除した。 この組織のウエスタンブロッティング（図4BとCGFP動物と比較して、強力なΔFosB過剰発現ならびに総CaMKIIαタンパク質の有意な増加を明らかにした（p = 0.0070; t = 2.894; df = 30）。これは慢性コカイン投与で見られる誘導と同様である。 さらに、Thr286でのCaMKIIα自己リン酸化（酵素活性化を示す）は、CaMKII基質のSer0.0330（p = 2.243; t = 28; t = 831; t = 1; t = 0.0540）によって増加した（p = 2.012; t = 28）。 XNUMX; df = XNUMX）、ここでも慢性コカインの作用を真似ている図1CとD） Tまとめると、これらのデータは、NAcシェルにおけるΔFosB発現がコカインに対する自発運動感作およびこの小領域におけるCaMKII誘導および活性化に十分であるというさらなる証拠を提供する。

我々は、同様のアプローチを用いて、NAcシェルにおけるCaMKIIαのコカイン媒介誘導にもΔFosBが必要であるかどうかを決定した。 AAVを用いて、ΔFosB転写活性化の負の調節因子であるΔJunDと呼ばれる短縮型JunDタンパク質を過剰発現させた（Winstanley et al。、2007）GFPまたはGFP単独。 ２週間後、導入遺伝子の発現が最大になったとき、動物にコカイン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）または生理食塩水を毎日ＸＮＵＭＸ日間投与し、最後の慢性注射のＸ時間後のコカインチャレンジ（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）ＸＮＵＭＸに対する自発運動反応を試験した。図4D） ΔJunDの過剰発現はコカインに対する自発運動感作を妨げ、またNAcシェルにおけるCaMKIIαの誘導および活性化も妨げた（イチジク4EとF; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； F = 0.0437。 これは、ΔＦｏｓＢ転写活性が、この小領域におけるコカイン媒介性のＣａＭＫＩＩαの誘導に必要であることを示している。 興味深いことに、本発明者らは、ΔJunDが食塩水およびコカイン処理条件下でΔFosBのレベルを低下させ（p = 2.997; F = 38; df = 0.0004）、ΔFosBがそれ自身の発現レベルに関してAP-8.110活性に依存するという新たな可能性を高めた。

CaMKIIはSer27でΔFosBをリン酸化する

使い方 ビトロ プロテインキナーゼアッセイにより、本発明者らは、精製ΔＦｏｓＢがＣａＭＫＩＩαに対する頑健な基質であることを確認した。 彼のインキュベーション6ＣａＭＫＩＩαおよびＡＴＰを用いた－ΔＦｏｓＢは、ΔＦｏｓＢの電気泳動移動度において上方へのシフトを引き起こした。イチジク5A; 得られたいくつかのバンドは複数のリン酸化部位を示唆した。 似ている ビトロ [γ-を用いたキナーゼアッセイ32P 1 ATPは、シフトしたΔFosBバンドへの放射能標識リン酸の取り込みを示した（イチジク5B）、タンパク質の直接リン酸化を示す。 我々は、以前に特徴付けられたΔFosBのSer27に対するリン酸特異的抗体を作製した。Ulery et al。、2006） この抗体はSer27リン酸化されたΔFosBを含む脳抽出物に対するシグナルを生成しませんが（データは示されていません）、我々は細胞内でSer27リン酸化を検出することができました。 ビトロ CaMKIIを用いたキナーゼアッセイイチジク5B） ΔFosBのCaMKIIリン酸化の速度論的分析は、それがキナーゼの強力な基質であることを示している（イチジク5C見かけのKM 5.7±2.0µMとKの関係CAT 2.3±0.3minの値-1。 これらの結果は、よく特徴付けられている多くのものと同等です。 インビボの CaMKIIの基質（コルブランアンドブラウン、2004） さらに、我々は、ＣａＭＫＩＩがＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ ｍｏｌ ／ ｍｏｌの化学量論でΔＦｏｓＢをリン酸化することを決定した。図5D）、Ｈｉｓ内に少なくとも３つのＣａＭＫＩＩリン酸化部位があることを示す。6と一致する-ΔFosBタンパク質 イチジク5A.

リン酸化の個々の部位を調べるために、我々は我々のサンプルからのＭＳ分析を採用した。 ビトロ キナーゼアッセイ。 イチジク5E 以前に特徴付けられたＳｅｒＸＮＵＭＸおよびいくつかのさらなる部位でのΔＦｏｓＢリン酸化を示す（データは示さず）。 Ser27の以前の機能的特徴付けを考慮して、Ser27のリン酸状態および非リン酸状態を模倣する標識合成ペプチドを生成することによってこの部位に焦点を合わせ、次に前後のΔFosBのMRM分析における標準としてこれらのペプチドの既知量を使用した。 ビトロ CaMKIIによるリン酸化。 後続の定量（イチジク5FＳｅｒＸＮＵＭＸがＣａＭＫＩＩに対する強力な基質であることを確認している。 これらの結果は、ΔＦｏｓＢ内の複数のリン酸化残基の中で、ＳｅｒＸＮＵＭＸがＣａＭＫＩＩにとって特に有効な基質であることを示している。

CaMKIIはNAcシェルにおけるΔFosBのコカイン蓄積を仲介する

CaMKIIはΔFosBをリン酸化することができるので ビトロ その安定性を劇的に高める場所で ビトロ & インビボの (Ulery et al。、2006; Ulery-Reynolds他、2009CaMKII活性がNAc中のΔFosBレベルを制御するかどうかを調べた。 インビボの。 この問題に取り組むために、我々は最初に、NAcを含む複数の脳領域においてCaMKIIαのカルシウム非依存性変異体（T286D）を過剰発現するマウス系統を使用した（Mayfordら、1996; Kourrichら、2012） 20日の間、1日1回、14 mg / kgコカインまたは生理食塩水を同年齢の成体雄突然変異体および野生型同腹仔に注射し、次いで最終注射の1日後に動物を分析した。 ΔＦｏｓＢの基礎レベルは、ＮＡｃ殻の突然変異動物において増加したが（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； Ｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）、コアではないことを我々は見出した（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ）。図5GとH） 驚くべきことに、ΔFosBのコカイン依存性誘導は、シェルおよびコアの両方で変異動物において阻止され、CaMKIIはNAcシェルにおけるΔFosB安定性を直接調節し得るが、それはまた両方のNAcサブ領域におけるコカイン活性化経路においてΔFosBの上流にもあり得ることを示唆する。 。

CaMKII活性はΔFosB仲介構造および行動可塑性に必要である

NAc MSN上の樹状突起棘のコカイン誘導は、この脳領域で最もよく確立された薬物誘導適応の1つであり、そのような脊椎誘導は薬物に対する感作行動反応と相関している（ロビンソンとコルブ、2004; Russoら、2010）およびD1型MSNに対して選択的であると報告されている（Lee他、2006） 我々は最近、NAcにおける樹状突起棘のコカイン誘導がΔFosBとその下流の転写プログラムに依存していることを証明した。Mazeら、2010） 樹状突起棘の形態および他の脳領域および実験系における誘発におけるCaMKIIの関与に関する広範な文献があるが（Jourdain et al。、2003; Penzesら、2008; 岡本ら、2009）、ＮＡｃ ＭＳＮ棘形成におけるその役割は研究されていない。 したがって、CaMKII活性を阻害することが以前に示されている構築物である、GFPに融合したCaMKII阻害剤ペプチドAC3IのHSV媒介過剰発現を利用することによって、CaMKII活性がΔFosB媒介MSN樹状突起棘の誘導に必要かどうかを決定した。 インビボの (Zhangら、2005; Klugら、2012）。 成体マウスのNAcシェルにおけるΔFosBのウイルス過剰発現は、MSN樹状突起棘密度の有意な増加を誘発しました（p <0.0001; F = 8.558; df = 59; 図6AとB以前に報告されたように（）Mazeら、2010そして、この増加は主に細い（p = 0.0027; F = 5.319; df = 59）とスタビー（p = 0.0378; F = 2.988; df = 59）背骨タイプ（両方とも未熟背骨と考えられている）（図6C – E） より成熟したきのこ型の棘には影響が見られなかった。 しかし、GFP-AC3Iを共発現させると、棘のΔFosB誘導は完全に無効になった（図6A – Eこれは、CaMKII活性がNAcシェルにおける樹状突起棘のΔFosB誘導に必要であることを示している。

次に、同じウイルスツールを使用して、CaMKII活性がコカインに対する行動感受性に対するΔFosBの効果に必要かどうかを決定しました。 ＮＡｃ殻へのウイルス注射のＸＮＵＭＸ時間後に、動物にＸＮＵＭＸｍｇ ／ ｋｇコカインの単回注射を与え、そしてそれらの自発運動活性を記録した。 以前に示されたように、ΔＦｏｓＢのＡＡＶ過剰発現をさらに延長した（イチジク4AΔＦｏｓＢのＨＳＶ媒介性過剰発現はコカインに対する自発運動感受性を増加させた（ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； Ｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄｆ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄ ＝ ＸＮＵＭＸ； ｄ）。 イチジク6F） 樹状突起棘の誘導と同様に、GFP-AC3Iの共発現によるCaMKII活性の阻害は、コカイン感受性のΔFosB媒介増加を完全に阻止し、CaMKII活性がコカインの行動効果のΔFosB誘導変化に必要であることを示している。

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議論

本研究はコカインがNAcシェルにおけるCaMKIIα遺伝子の転写を選択的に上方制御するNAcにおいてΔFosBを誘導する新規フィードフォワード機構を描写する。. ＣａＭＫＩＩαは、続いてΔＦｏｓＢをリン酸化および安定化して、より大きなΔＦｏｓＢ蓄積およびさらなるＣａＭＫＩＩα誘導をもたらす（Ｆ．イチジク6G） コカインへの慢性的な曝露の間の2つのタンパク質の共増加レベルは、それから薬への感作された行動反応に本質的な方法で貢献します。 ΔＦｏｓＢおよびＣａＭＫＩＩの両方が、コカインに対する行動反応の増大に必要であることがそれぞれ以前に実証されているので、これは特に魅力的な仮説である。 (Pierceら、1998; Peakmanら、2003そして、我々は、特にウイルスアプローチを用いて、NAcシェル中のΔFosBについてのこの発見を複製する（イチジク4 & and66).

ＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮにおけるトランスジェニックΔＦｏｓＢ過剰発現は、ＮＡｃシェルおよびコカインナイーブ動物のコアの両方においてＣａＭＫＩＩ誘導を駆動することができるが、両方の小領域において生じる内因性ΔＦｏｓＢの蓄積は、特にＮＡｃシェルにおいてＣａＭＫＩＩの誘導を駆動する。 。 この差は、我々の二トランスジェニックモデルにおいて誘導されたより高いレベルのΔＦｏｓＢに関連する可能性があるが、それはまた、コカインが殻中のＣａＭＫＩＩαプロモーターを示差的に変化させる能力を反映する可能性もある。 対 コアＭＳＮは、前者においてΔＦｏｓＢ結合を促進するか、または後者のサブ領域においてそれを排除するかのいずれかである。 事実、NAcコアのみのCaMKIIα遺伝子プロモーターでのヒストンのコカイン媒介脱アセチル化を明らかにする我々のChIPデータは、クロマチン機構の関与の可能性を支持する。 この仮説に沿って、D1型MSNにおけるΔFosB過剰発現は、コカインの非存在下でNAcコアにおけるCaMKIIα誘導を促進することができた（イチジク3Fこれは、慢性コカイン曝露中にこの誘導を妨げるCaMKIIαプロモーターの活発な修飾があることを示唆している。 CaMKIIプロモーターでのクロマチンランドスケープの調節はまた、なぜCaMKIIが慢性コカイン離脱ラットのNAc殻におけるチャレンジ用量のコカインによって誘発されるのかを説明するかもしれない（イチジク1E）麻薬未使用の動物ではない（図1D） これは、ΔFosBのエピジェネティックな「遺伝子プライミング」効果を表す可能性がある（Robison and Nestler、2011したがって、コカイン渇望の潜伏の1つの分子メカニズムかもしれません（ピケンズら、2011） しかしながら、このクロマチンの変化が欲求の潜伏と因果的に結びつくためには、時間とともに増加する必要があるでしょう。 これが事実であるかどうかを決定すること、および他の遺伝子がコカインによるΔFosB依存性、小領域特異的調節を示すかどうかを研究することは興味深いであろう。 また、ここで説明するフィードフォワードループは、CaMKIIやΔFosBの無限の累積につながらないことに注意することも重要です。イチジク1E; その原因となる分子の「ブレーキ」を解明することは、将来の研究の重要な目標です。

いくつかの実験系および脳領域におけるΔFosBおよびCaMKIIの既知の機能は多くのレベルで収束する (イチジク6F） どちらの分子も樹状突起棘の成長と密接に関係しています：CaMKIIはアクチン細胞骨格と相互作用します（岡本ら、2009）、背骨の頭の大きさを調節する（松崎他、2004また、海馬器官型スライス培養における糸状仮足およびシナプス数の可塑性誘発性増加に必要かつ十分である（Jourdain et al。、2003）、wΔＦｏｓＢは、ＮＡｃ ＭＳＮにおけるコカイン誘発樹状突起棘形成に必要かつ十分である。Mazeら、2010） さらに、両方の分子はAMPAグルタメート受容体の調節に関連している。 CaMKIIはAMPA受容体サブユニットの全レベルを調節しないが、培養中の海馬錐体ニューロンにおいてSer1でGluA831をリン酸化することによりAMPA受容体のシナプスへの挿入を促進し、AMPAチャンネルコンダクタンスを増加させる。 インビボの （（でレビューマリノウとマレンカ、2002; コルブランアンドブラウン、2004））。 シナプスへのGluA1のそのような増加した輸送は同様に慢性的なコカイン作用にも関係していました（ボドローとオオカミ、2005） さらに、NAcにおけるAMPA受容体活性化に対する行動反応は、D1ドーパミン受容体依存的にCaMKIIαの過剰発現によって増強される（シンガーら、2010） ΔFosBの長期D1特異的過剰発現は、NAcにおいてGluA2転写を誘導することが示されている（Kelzら、1999これは、GluA1を介したAMPA応答を抑制しますが、ここでは短期間のΔFosBの過剰発現と短期間のコカイン曝露がこのサブユニットに影響を及ぼさないことを示します（図1） それにもかかわらず、我々は最近、短期間のΔＦｏｓＢ過剰発現がそれにもかかわらずＮＡｃ中のＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮ中のＡＭＰＡ応答を減少させることを見出した。Grueterら、2013） これらのデータは、まだよく理解されていない中毒進行の異なる側面の根底にあるコカインへの時間依存的な一連の神経適応を構成するかもしれない時間的に異なるメカニズムを示唆している。 行動レベルでは、CaMKIIとΔFosBの両方がコカインに対する自発運動感作に必要であり（上記参照）、両方ともげっ歯類のコカイン自己投与の持続に必要である（Colbyら、2003; Wangら、20102つのタンパク質は、部分的に異なる根本的なメカニズムを介してではあるが、薬物曝露に対する短期および長期の行動適応に重要であることを示唆している。 おそらく、ΔFosBおよびCaMKIIは、NAcシナプス機能の変化を介してそのような複雑な行動適応を調節するが、シナプス現象を行動変化に直接関連づけるためにはさらに多くの作業が必要である。

CaMKIIホロ酵素は同時に様々なシナプス関連タンパク質と相互作用します（Robison他、2005これはシナプス後密度（PSD）へのターゲティングを調節すると考えられており、シナプス可塑性にとって重要であることが示唆されている。 特に、CaMKIIとNMDA型グルタミン酸受容体のGluN2Bサブユニットとの相互作用は、シナプス可塑性と学習の両方を調節することが最近示された（Haltら、2012） AC3IペプチドはCaMKIIの自己阻害ドメインを模倣し、そしてそれ故酵素触媒活性を阻害するが、それはまた多数のタンパク質 - タンパク質相互作用を遮断する（Strackら、2000; Robison他、2005） したがって、ここで報告されたHSV-GFP-AC3Iの行動的および形態学的効果は、CaMKII標的タンパク質のリン酸化の減少、CaMKII標的化の変化、またはシナプスでのCaMKIIの提案された構造的役割の変化を通して起こり得る。Lismanら、2002).

最近の研究は、コカイン投与に応答したNAcシェルとコアとの間のいくつかの生理学的差異を実証しているので、提案されたΔFosB-CaMKIIループのNAcシェルへの制限は特に注目に値する。 。 NAcシェルのMSNは慢性コカイン投与後に数週間持続する発火能力の低下を示すが、同じ動物のコアMSNは一過性の（1 - 1日）発火能力の増加を示し、3週以内に基礎レベルに戻る（KourrichとThomas、2009） さらに、多数のシナプスタンパク質は、NAcシェルにおいて異なって調節されている。 対 GluA2を含む慢性的なコカインに曝露された動物の中心Knackstedt et al。、2010） 慢性的なアンフェタミンは特にNAc殻にCaMKIIαを誘導するので（Lowethら、2010私たちがコカインと同様の効果を見いだすのは驚くことではありません。 しかし、ΔFosBは慢性コカインによってNAcシェルとコアの両方に誘導されるので（Perrottiら、2008そして、我々は、殻中のＣａＭＫＩＩα誘導がΔＦｏｓＢ依存的であることを示すので、我々の発見は、殻中のＣａＭＫＩＩαの選択的誘導の原因であるこれら２つの小領域間のＣａＭＫＩＩαプロモーターにおける異なる転写機構の新しい証拠を提供する。

最近の多くの研究は、ＤＸＮＵＭＸ型とＤＸＮＵＭＸ型のＮＡｃ ＭＳＮとの間の違いを描写することに焦点を合わせてきた。 D1とD2受容体の両方がコカインのやりがいのある効果に関与していますが (自己、2010), 最近の研究は、ＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮの光遺伝学的活性化はコカインに対する行動反応を増加させるが、ＤＸＮＵＭＸ型ＭＳＮ活性化は反対の効果を有することを実証している（Loboら、2010） これらの知見と一致して、D1受容体ノックアウトマウスはコカイン自己投与の獲得が不十分である（Caineら、2007D2ノックアウトは (Caineら、2002） NAcへのD1アゴニスト投与は回復パラダイムにおいてコカイン探索行動を誘発する（自己、2010） 興味深いことに、この効果にはNAcシェルのCaMKII活性のD1受容体依存性の増加が必要であるが、コアでは必要ではない（アンダーソン他、2008）、ここで提案されたＤＸＮＵＭＸおよびシェル特異的ΔＦｏｓＢ − ＣａＭＫＩＩループとうまく一致するという結果。

我々は以前に、ΔFosB中のSer27がカゼインキナーゼ-2によってリン酸化され得ることを報告した。Ulery et al。、2006しかしながら、我々はここで、CaMKIIがはるかに大きな動力学および化学量論でこの部位および他の部位でΔFosBをリン酸化し、そしてより高い見かけのMを複製できることをここで確立する。r ΔFosB（イチジク5A）コカイン暴露 インビボの (ネスラー、2008） Ser27のリン酸化は、ΔFosBの安定性と転写活性を高めることをすでに知っています（Ulery et al。、2006; ウレリーとネスラー、2007; Ulery-Reynolds他、2009） 今後の研究は現在、本研究によって示されるΔＦｏｓＢリン酸化の新規部位の同定および機能的結果に焦点を合わせるであろう。

本明細書に記載のフィードフォワードループは、コカインの反復投与がNAcの進行性の異常を促進するもっともらしい新しいメカニズムを提供する。 そのように、この生化学的経路は、嗜癖障害における将来の治療的介入のための重要な標的を提供し得る。 CaMKIIはいたるところに存在し、多くの基底ニューロンおよび行動機能に必要とされるので、CaMKII阻害剤の直接使用は中毒治療として避けられてきた。 本発明者らのデータは、個々の細胞型および脳の報酬回路の小領域に特異的であるＣａＭＫＩＩ誘導のメカニズムのより微妙な標的化が、全身性ＣａＭＫＩＩ阻害の合併症を回避する治療標的を提供し得ることを示唆する。

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謝辞

この作品は、国立薬物乱用研究所（EJN）、NIDAエールプロテオミクスセンターDA018343（AJRとEJN）、およびハートウェル財団（AJR）からの助成金によってサポートされていました。 著者らは、Gabby Rundenkoに精製されたΔFosBの寛大な贈り物を、Roger Colbranに精製されたCaMKIIαの寛大な贈り物を感謝したいと思います。

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