Proc Natl Acad Sci US A. 2005 2月1。 102(5)：1737-1742。
抽象
乱用薬物であるコカインは、軸索末端でのドーパミン再取り込みを遮断することによって線条体におけるシナプスドーパミンレベルを増加させる。 有糸分裂後ニューロンにおける基質のリン酸化に関与するタンパク質であるサイクリン依存性キナーゼＸＮＵＭＸ（ＣｄｋＸＮＵＭＸ）およびその活性化因子ｐＸＮＵＭＸは、コカインへの長期曝露後にアップレギュレートされることが見出されている。 ＣｄｋＸＮＵＭＸおよびｐＸＮＵＭＸ誘導が線条体ドーパミンシグナル伝達に及ぼす影響をさらに調べるために、ＣｄｋＸＮＵＭＸまたはｐＸＮＵＭＸがニューロンにおいて特異的に過剰発現されている２つの独立したトランスジェニックマウス系統を作製した。 我々はここでは、Cdk5の過剰発現ではなく、p5の結果として、Cdk35活性の増加がコカイン媒介ドーパミンシグナル伝達の減弱をもたらすことを報告する。 Thr-5におけるドーパミンおよびcAMP調節リンタンパク質の分子量35 kDa（DARPP-5）のCdk35媒介リン酸化の増加は、Thr-5におけるDARPP-35のリン酸化の減少を伴った。 Thr-5での細胞外シグナル制御キナーゼ5のCdk32媒介リン酸化の増加は、細胞外シグナル制御キナーゼ32 / 75の活性化の減少を伴っていた。 これらの効果は、cAMP応答エレメント結合タンパク質のコカイン誘発リン酸化の減衰、ならびに線条体におけるc-fosのより少ない誘導に寄与した。 これらの結果は、Cdk32活性がコカインへの慢性曝露後の遺伝子発現変化に関与しており、したがってコカイン中毒の根底にある神経機能の長期的変化に影響を与えるという考えを支持している。
コカインは、線条体のシナプスドーパミンレベルを上昇させ、ドーパミンD1受容体から核に初期シグナルを伝播する細胞内経路を活性化することによってドーパミン受容ニューロンの遺伝子発現を変化させる（1） コカインへの慢性的な曝露は、いくつかの転写因子を上方制御し、その結果、コカイン嗜癖における神経細胞の順応の根底にあると考えられる遺伝子発現の長期的な変化をもたらします（2） そのような転写因子として同定されたΔＦｏｓＢ（3コカインに対する動物の行動反応性を高めることが示されています（）。4, 5） それ故、ΔＦｏｓＢ誘導により調節される標的遺伝子の同定は、コカイン中毒の根底にある分子メカニズムの一層の理解に寄与することが期待される。 最近、コカインによる動物の慢性的な治療は、ΔFosBの誘導を通して、線条体におけるサイクリン依存性キナーゼ5（Cdk5）およびその活性化因子p35の発現を上方制御することが示されている（6, 7).
Cdk5は、Cdkファミリーのセリン/スレオニンキナーゼのメンバーです。 細胞周期進行の主要な調節因子である他のCdksとは異なり、Cdk5は有糸分裂後ニューロンの基質のリン酸化に主に関与している (8） Cdk5活性のニューロン特異性は、主に有糸分裂後ニューロンで発現されるp35またはp39のいずれかのアクチベーターとの会合を通して達成される（8） 脳の発達におけるCdk5の本質的な役割に加えて（9, 10）、 私また、出生後の脳におけるドーパミン作動性伝達にも関与しています（11, 12） Cdk5活性の阻害は線条体におけるドーパミン放出の増加をもたらし、ドーパミン放出の負の調節因子としてのCdk5のシナプス前機能を示唆する (11） さらに、Cdk5はThr-32でドーパミンおよびcAMP制御リンタンパク質、分子量32 kDa（DARPP-75）をリン酸化することによってシナプス後ドーパミンシグナル伝達の有効性を調節し、それはDARPP-32をcAMP依存性キナーゼの阻害剤（PKA）に変換する（12).
これらの所見は、ＣｄｋＸＮＵＭＸおよびｐＸＮＵＭＸが、コカインへの長期曝露後、したがってコカイン中毒における、ドーパミンシグナル伝達の長期活性化の下流調節因子であることを示唆している。 線条体ドーパミンシグナル伝達におけるＣｄｋＸＮＵＭＸの役割にさらに取り組むために、ＣｄｋＸＮＵＭＸまたはｐＸＮＵＭＸのいずれかがｐＸＮＵＭＸプロモーターの制御下でニューロンにおいて特異的に過剰発現される２つのトランスジェニックマウス系統を生成した。 本発明者らの知見は、ＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質のレベルがＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質の活性の律速であることを示唆して、ＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質のレベルの増加はＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質のレベルの増加を伴わずにアップレギュレートされることを示した。 私達はここに提供します インビボの p5の過剰発現の結果としてCdk35活性が増加すると、PKAおよび細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）カスケードの阻害を介して核へのコカイン媒介ドーパミンシグナル伝達の減弱がもたらされるという証拠。
材料と方法
抗体 Cdk5（C-8）およびp35（C-19）に対するポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。 ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ、ＥＲＫＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ、およびｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）に対するリン酸化依存性および非依存性抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手した。 ホスホ-Thr-1に対する抗体DARPP 2（13）、ホスホ-Thr-75 DARPP-32（12）、合計DARPP-32（12）、およびc-fos（14）を記載のように使用した。 アクチンに対する抗体はSigmaから購入した。
実験動物 我々は以前にマウスp35遺伝子をクローニングした Cdk5r1、これはp35タンパク質をコードし、そしてそのゲノム構造を特徴付けた。15） ｐＸＮＵＭＸ（ＴｇｐＸＮＵＭＸ）のニューロン過剰発現を有するトランスジェニックマウスを作製するためには、ＸＮＵＭＸ − ｋｂ エコRI-エコ1.2-kbプロモーター領域を含むRI断片をpGEM9Z（ - ）プラスミドにサブクローニングし、SV45由来の40-bpタグをその中に挿入した。 Kpn私はpoly（Aの下流にサイト+）シグナル（図1A） タグには Spe私は動物のジェノタイピングのためのサイトです。 ＸＮＵＭＸ − ｋｂフラグメントをプラスミドから切り出しそして精製し、続いてトランスジーンの前核注入によりトランスジェニックマウスを生成した。 6-kb p1.2プロモーターの制御下にある導入遺伝子の発現プロファイルを調べる インビボの例えば、二重トランスジェニックマウス（ＴｇｐＸＮＵＭＸ； ｐＸＮＵＭＸ - ／ - ）は、ＴｇｐＸＮＵＭＸマウスを内因性ｐＸＮＵＭＸヌルバックグラウンドで再生するという２段階の育種戦略を用いることによってさらに生成された。 この研究で使用された他のマウスモデルは、p35 +/–、p35 - / - 、Cdk35 +/–、およびCdk35（TgCdk35）の神経細胞過剰発現を有するトランスジェニックマウスを含んでいた（9, 16, 17） これらのマウスの遺伝子型は、尾部生検から単離したゲノムDNAに対してサザンブロット分析またはPCRのいずれかを行うことによって決定した。 マウスをＸＮＵＭＸ − ｈ明／ ＸＮＵＭＸ − ｈ暗サイクル下で飼育した。 実験動物および実験動物の管理および使用に関する米国国立衛生研究所のガイドラインに従って、すべての管理が行われた。
サザンブロット分析。 尾部生検から抽出したゲノムDNAをで消化した。 エコRIと SpeＩ、ＸＮＵＭＸ％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写した。 膜をランダムプライムしたものとハイブリダイズさせた。 32一晩ＸＮＵＭＸ℃でＰ標識プローブ。 ｐＸＮＵＭＸノックアウト（ｐＸＮＵＭＸ - ／ - ）およびＴｇｐＸＮＵＭＸマウスの遺伝子型決定のためのＸＮＵＭＸ − ｂｐプローブは、以下のプライマーを使用することによってＰＣＲによって生成された：ＸＮＵＭＸ' − ＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣ − ＸＮＵＭＸ 'およびＸＮＵＭＸ' − ＣＣＡＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＸ。 ハイブリダイズした膜を、ＸＮＵＭＸ×ＳＳＣ ／ ＸＮＵＭＸ％ＳＤＳ中、ＸＮＵＭＸ℃で、ＸＮＵＭＸ ｍｉｎで２回洗浄し、そしてＸＮＵＭＸ×ＳＳＣ ／ ＸＮＵＭＸ％ＳＤＳ中、ＸＮＵＭＸ℃でＸＮＵＭＸ ｍｉｎで２回洗浄し、そしてＸ線フィルムに露光した。
薬物治療 コカイン（Sigma）を滅菌食塩水に溶解した。 ＸＮＵＭＸ月齢で動物にコカイン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）または等量の生理食塩水を腹腔内注射し、注射後の異なる時点（Ｘ ＮＵＭＸ、Ｘ ＮＵＭＸ、Ｘ ＮＵＭＸ、およびＸ ＮＵＭＸ ｍｉｎ）で断頭により殺した。 脳を急速に取り出し、そして氷冷ＰＢＳ中で冷却した。 次に線条体を解剖し、ノーザンまたはウエスタンブロット分析にかけた。 免疫組織化学的分析のために、注射からh時間後にマウスから線条体切片を得た。
ノーザンブロット分析。 全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて線条から抽出し、記載のようにノーザンブロット分析に供した（Ｃ．18） ｃ − ｆｏｓ ｍＲＮＡの検出のために、マウスｃ − ｆｏｓ ｃＤＮＡのＸＮＵＭＸ − ｂｐフラグメントを記載のようにプローブとして使用した。19） c-fos mRNAのレベルは、Nih image software、Version 1.62を備えた画像分析システムを用いて特定のバンドの光学密度を測定することによって定量した。
ウエスタンブロット分析。 線条体組織を1％SDS中で超音波処理し、そして10 minで煮沸した。 各サンプル中のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ（Pierce）によって決定された。 ニトロセルロース膜に移す前に、等量のタンパク質をSDS / PAGEによって分離した。 膜を、ＸＮＵＭＸ％スキムミルクおよびＸＮＵＭＸ％Ｔｗｅｅｎ ＸＮＵＭＸを含有するＸＮＵＭＸ×ＰＢＳ中でブロッキングし、そして一次抗体と共にＸＮＵＭＸ℃で一晩インキュベートした。 ペルオキシダーゼ結合抗マウスまたはウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションを室温でＸＮＵＭＸ ｍｉｎで行った。 増強化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によってシグナルを検出し、そしてバンドの光学濃度を上記のように定量した。
ＣｄｋＸＮＵＭＸキナーゼアッセイ。 線条体ライセートは、50 mM Tris・HCl、pH X NUM X / X NUM X mM NaCl / X NUM X mM EDTA / X NUM X％Triton X-X NUM X / X NUM X m M D T T / X NUM X mMフェニルメチルスルホニルフルオリド/ X NUM Xμg/ mlからなる溶解バッファーで調製した。 ｍｌロイペプチン／ホスファターゼ阻害剤（ホスファターゼ阻害剤混合物ＩおよびＩＩ、Ｓｉｇｍａ）。 溶解物を抗ＣｄｋＸＮＵＭＸ（Ｃ − ＸＮＵＭＸ）または抗ｐＸＮＵＭＸ（Ｃ − ＸＮＵＭＸ）抗体のいずれかで免疫沈降させた。 Cdk7.4免疫沈降物は、50μlの溶解物（5μgタンパク質に相当する）を抗Cdk1抗体（100μg）と一晩1℃でインキュベートし、続いて1μlのプロテインA-アガロースビーズ（1）とインキュベートすることによって調製した。 1℃で、溶解バッファー中の100％スラリー； Santa Cruz Biotechnology）。 p5免疫沈降物の調製のために、8μlの溶解物（35 mgタンパク質に相当する）を上記のように抗p19抗体（5μg）とインキュベートした。 免疫沈降物を溶解緩衝液で２回そしてＸＮＵＭＸ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ ＸＮＵＭＸ ／ Ｘ ＮＵＭＸ ｍＭ ＭｇＣｌからなるキナーゼ緩衝液で２回洗浄した。2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT、60μlのキナーゼ緩衝液に再懸濁した。 基質としてヒストンH1を用いてキナーゼ活性を測定した（18).
免疫組織化学 マウスをアベルチン（250 mg / kg、Fluka）の腹腔内注射によって麻酔し、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、続いて非架橋固定剤であるStreck Tissue Fixative（Streck Laboratories、ラビスタ、NE）を経心的に灌流した。 解剖した脳を同じ固定液中で一晩ＸＮＵＭＸ℃でさらに固定した。 次に、脳をパラフィン包埋し、厚さ37-μmの冠状切片に切断し、ジアミノベンジジンを基質としてアビジン - ビオチン - ペルオキシダーゼ複合体法（Vector Laboratories）を用いて免疫組織化学検査を行った。 切片をc-fosに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体と共に5℃で一晩インキュベートした。 染色特異性は一次抗体の省略により評価した。
結果
ｐＸＮＵＭＸのニューロン過剰発現を有するトランスジェニックマウスの作製。 ｐＸＮＵＭＸのニューロン発現の増大を達成するために使用された導入遺伝子は、ＸＮＵＭＸ − ｋｂプロモーターを含有するクローン化マウスｐＸＮＵＭＸ遺伝子のＸＮＵＭＸ − ｋｂフラグメントおよびｐＸＮＵＭＸの全コード配列を含んでいた。図1 A） マウスの遺伝子型は、野生型マウスからp35 - / - およびTgp35マウスを区別するように設計されたプローブを使用することによるサザンブロット分析によって決定された。図1 A および B)。 ＸＮＵＭＸ − ｋｂ ｐＸＮＵＭＸプロモーターの制御下で導入遺伝子発現を調べるために、我々は、ｐＸＮＵＭＸ発現が導入遺伝子のみから駆動される二重トランスジェニックマウス（ＴｇｐＸＮＵＭＸ； ｐＸＮＵＭＸ - ／ - ）を作製した。 Tgp1.2; p35 - / - マウスにおけるp35発現は脳内でのみ観察された（図1Cここで、空間的発現パターンは野生型マウスのそれと類似していた（図1D） p35の欠如は、マウスの大脳皮質および海馬における異常な層構造をもたらすことが示されています（10） しかしながら、ＴｇｐＸＮＵＭＸ； ｐＸＮＵＭＸ - ／ - マウスは、ｐＸＮＵＭＸ - ／ - 脳表現型の完全な救済を示した（図1E） これらのデータは、1.2-kb p35プロモーターが、内在性p35遺伝子由来のp35の発現プロファイルと同様の発現プロファイルで導入遺伝子の発現を制御したことを示した。
p35蛋白質レベルはCdk5活性のアップレギュレーションの律速である 我々は、35月齢で、p5 - / - 、p35 +/-、野生型、Tgp35、Cdk35 +/-、およびTgCdk5マウスからの線条体抽出物におけるタンパク質発現に対するp5およびCdk3をコードする遺伝子の遺伝子量効果を調べた。 p35およびCdk5タンパク質のレベルは、それぞれ遺伝子量とよく相関していました（図2 A および B） ＴｇｐＸＮＵＭＸマウスは、野生型マウスと比較してｐＸＮＵＭＸタンパク質レベルにおいて約ＸＮＵＭＸ倍の増加を示したが、ＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質レベルは異なるレベルのｐＸＮＵＭＸタンパク質によって影響されなかった。 ＴｇＣｄｋＸＮＵＭＸマウスは、野生型マウスと比較して、ＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質レベルの約ＸＮＵＭＸ倍の増加を示したが、ｐＸＮＵＭＸタンパク質レベルは、異なるレベルのＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質の影響を受けなかった。 Cdk35活性に対する異なる量のp1.6タンパク質の効果を調べるために、抗Cdk35抗体を用いて線条体抽出物からCdk5を免疫沈降させ、キナーゼ活性を測定した。 同様に、キナーゼ活性に対する異なる量のCdk35タンパク質の効果を調べるために、抗p5抗体を用いて線条体抽出物からp1.9を免疫沈降させ、キナーゼ活性を測定した。 Cdk5活性は、p35タンパク質のレベルとよく相関したが、Cdk5タンパク質のレベルとは相関しなかった（図2 C および D） これらの結果は、ｐＸＮＵＭＸタンパク質の量がＣｄｋＸＮＵＭＸ活性の律速因子であることを示した。 したがって、我々はTgp35マウスを用いて、線条体ドーパミンシグナル伝達に対するCdk5活性の増加の影響を調べた。
Thr ‐ 32でのDARPP ‐ 34のコカイン誘導りん酸化はTgp35マウスで減弱する DARPP-32の機能は、複数の部位におけるそのリン酸化状態に依存します（20） PKAはThr-32でDARPP-34をリン酸化するのに対し、Cdk5はThr-32でDARPP-75をリン酸化する。 したがって、我々は野生型マウスおよびTgp32マウスからの線条体抽出物中のDARPP-35のリン酸化状態を調べた。 ホスホ-Thr-75 DARPP-32のレベルは、Tgp35マウスにおいて高かった（図3A; 野生型マウスの値の1.6±0.2倍。 次に、線条体ドーパミンシグナル伝達に対するCdk5活性の増加の影響を評価した。 Thr-35におけるDARPP-32のリン酸化状態を分析することにより、Tgp34マウスにおけるコカイン誘発性PKA活性化を調べた。 ホスホ−Ｔｈｒ − ＸＮＵＭＸ ＤＡＲＰＰ − ＸＮＵＭＸのレベルは、コカイン注射の数分後に野生型マウスのＸＮＵＭＸにおいて増加した。図3B; 1.8±0.2 - 基礎レベルより上）。 しかしながら、ＤＡＲＰＰ − ＸＮＵＭＸのＴｈｒ − ＸＮＵＭＸリン酸化に対するコカインの効果は、ＴｇｐＸＮＵＭＸマウスにおいて減弱された（ＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ−基礎レベルの倍以上）。 これらの結果は、Cdk34活性の増加がおそらくThr-32でのDARPP-35リン酸化を介してコカイン誘発性PKA活性化を減弱させることを示した（6, 12） シナプス前ＣｄｋＸＮＵＭＸ活性の増加がドーパミン放出の減少をもたらし、そしてこれがコカインの効果の減少に寄与する可能性もある。 特に、コカインの単回注射は、p5およびCdk35タンパク質のレベル、ならびにキナーゼ活性に影響を及ぼさなかった（図3 C および D） これは、コカインへの慢性的な曝露がp35およびCdk5の発現を上方制御することが示されているという以前の研究とは対照的です（6).
Cdk5活性のアップレギュレーションはERK1 / 2のコカイン誘導活性化を減弱させる 最近の証拠は、線条体におけるドーパミン受容体活性化が、ERK経路を含む他のシグナル伝達カスケードも活性化することを示している（21, 22コカインに対する行動反応に重要な役割を果たしている。23） したがって、我々は、Cdk5活性がコカイン誘発性のERK経路の活性化に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。 Ｓｅｒ − ＸＮＵＭＸおよびＳｅｒ − ＸＮＵＭＸでのＭＥＫＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ（基底レベルよりもＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ倍）およびＥＲＫＸＮＵＭＸのリン酸化の増加によって明らかなように、ＥＲＫ経路の活性化は野生型マウスからの線条体抽出物におけるコカイン注射後に観察された。 Thr-1およびTyr-2での/ 217（ERK221リン酸化：基底レベルの1.5±0.2倍）（図4 A および B） しかしながら、MEK1 / 2（基底レベルより1.2±0.2倍）およびERK1 / 2（基底レベルよりXRUMXリン酸化：2±1.2倍）のコカイン誘発性活性化はTgp0.2マウスにおいて減弱した（図4 A および B） さらに、ホスホ－ＥＲＫＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸの基礎レベルは、ＴｇｐＸＮＵＭＸマウス（ＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ倍、野生型マウスの値より低い）においてより低かったが、この傾向は統計的に有意ではなかった。 この後者の結果は、Thr-1でのMEK2のCdk35依存性リン酸化に起因する可能性があり、その結果、触媒活性が低下する（24） この可能性を評価するために、我々はThr-1でのMEK286のリン酸化状態を調べ、Tgp286マウスからの線条体抽出物中に高レベルのホスホ-Thr-1 MEK35が存在することを見出した（図4C; 野生型マウスの値の1.3±0.1倍。 さらに、Thr-1でのMEK286のリン酸化状態は、コカインの単回注射によって変化しなかった。これは、Cdk5活性が治療によって影響されなかったという知見と一致する（図3D).
核へのドーパミンシグナル伝達の伝播はCdk5活性の増加により減弱する PKAおよびERKを含む複数のシグナル伝達カスケードのコカイン誘導活性化は、その後のSer-133でのリン酸化を介して核内の転写因子CREBの活性化をもたらす（22, 25） ＰＫＡおよびＥＲＫ活性化カスケードに対するＣｄｋＸＮＵＭＸ媒介阻害効果が核内のＣＲＥＢリン酸化に収束し得るかどうかを調べるために、野生型マウスおよびＴｇｐＸＮＵＭＸマウスからの線条体抽出物におけるＳｅｒ − ＸＮＵＭＸでのＣＲＥＢのリン酸化状態を調べた。 ホスホＣＲＥＢの基礎レベルは、ＴｇｐＸＮＵＭＸマウスにおいてより低かった（ＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ倍の野生型マウスの値）（図5） コカインの注射に応答して、ホスホ−ＣＲＥＢのレベルは野生型マウスの線条体において増加した（基礎レベルのＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ倍）が、コカインに対するこの応答はＴｇｐＸＮＵＭＸマウスにおいて減弱した（ＸＮＵＭＸ±ＸＮＵＭＸ−）。基礎レベルより上に折る）（図5).
Ser-133でのCREBのリン酸化は、c-fos遺伝子を含む特定の遺伝子のプロモーター領域におけるcAMP応答エレメントを介してその転写活性を増強する（26） したがって、コカイン注射後、野生型マウスおよびTgp35マウスの線条体におけるc-fosの誘導を調べた。 野生型マウスでは、c-fos mRNAのレベルは、コカイン注射のX分後にピーク値（X NUMX±X NUM X倍の基礎レベル）まで増加し、その後注射後X NUM X分で基礎レベルに戻った（図6 A および B） しかしながら、c-fos mRNAのレベルは、注射後最低30まで、Tgp35マウスの方が野生型マウスよりも約30％低かった（図6 A および B） Tgp35マウスにおけるc-fosの誘導が少ないことは、免疫組織化学によりさらに裏付けられた（図6 C–F） コカイン投与は、野生型マウスとTgp35マウスの両方において、線条体の背内側 - 背中中心部で強くc-fos免疫反応性を増加させた。 しかしながら、c-fos免疫陽性細胞数のコカイン誘発性増加は、Tgp35マウスの線条体において顕著に減弱した（図6G） まとめると、これらの結果は、核への線条体ドーパミンシグナル伝達のコカイン媒介性増強がTgp35マウスにおいて阻害されたことを示し、これはCdk5活性の増加の結果である可能性が高い。
議論
Cdk5とその活性化因子p35はコカインへの慢性曝露によりアップレギュレートされる標的遺伝子として同定されている (6). 我々はここでCdk5アップレギュレーションよりもむしろp35アップレギュレーションの結果としてCdk5活性の増加が線条体ニューロンにおけるコカイン媒介ドーパミンシグナル伝達の減弱をもたらすという証拠を報告する。 線条体ドーパミンシグナル伝達に対するＣｄｋＸＮＵＭＸまたはｐＸＮＵＭＸのいずれかの上方制御された発現の影響を調べるために、２つのトランスジェニックマウス系統、ＴｇＣｄｋＸＮＵＭＸおよびＴｇｐＸＮＵＭＸマウスを分析した。 ＣｄｋＸＮＵＭＸ活性は、ｐＸＮＵＭＸタンパク質のレベルの増加に比例してアップレギュレートされたが、ＣｄｋＸＮＵＭＸタンパク質のレベルの増加によっては影響されないことがわかった。 我々の以前の報告はまた、活性がCdk5免疫沈降物を用いて測定された場合、TgCdk35マウス脳におけるCdk5活性が野生型マウス脳におけるよりも低いことを証明した。17ｐＸＮＵＭＸレベルが増加しない場合、ＣｄｋＸＮＵＭＸ過剰発現は単量体ＣｄｋＸＮＵＭＸレベルの増加をもたらすことを示唆している。 これらの結果は、p5タンパク質のレベルがCdk5活性の律速因子であることを示した。
Tgp35マウスは、コカインの急性注射後に線条体においてCREBリン酸化およびc-fosの両方の誘導が少ないことを示し、これはコカインに対する線条体応答がCdk5活性の増加によって阻害されたことを示唆する。 Tgp35マウスにおけるコカイン媒介ドーパミンシグナル伝達の減弱は、DARPP-5、PKA、およびERKが関与する複数のシグナル伝達カスケードのCdk32媒介阻害によって達成された可能性が高い。 コカイン投与は、野生型マウスにおいてThr-32でのDARPP-34のPKAリン酸化を増加させたが、この応答はTgp35マウスにおいて減弱された。 Thr-32でのDARPP-34のPKAリン酸化は、CREBのSer-1の脱リン酸化に関与する酵素であるプロテインホスファターゼ1（PP133）の活性を阻害することが示されている（27） したがって、PP1活性は、Tgp32マウスにおいてDARPP-1 / PP35経路を介して拮抗されないであろう。
ERK1 / 2のコカイン誘発性活性化はまた、Tgp35マウスにおいても弱毒化された。 ＣｄｋＸＮＵＭＸがコカイン誘発性のＥＲＫＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸの活性化を阻害することができるいくつかの異なるメカニズムがある。 第一に、Thr-5でのDARPP-1のCdk2依存性リン酸化はPKAを阻害し得、ERK5 / 32活性化に必要とされるあらゆるPKA媒介MEK75 / 1活性化のその後の阻害をもたらし得る。 最近の研究はまた、Thr-2でのDARPP-1のリン酸化が、MEK活性化の間接的調節および線条体濃縮ホスファターゼ、チロシンの調節を含む複数の経路によるERK2 / 32の活性化に必要であることを見出した。 ERK34 / 1に直接作用するホスファターゼ（28） この可能性の裏付けは、Ｔｅｒ − ＸＮＵＭＸおよびＳｅｒ − ＸＮＵＭＸでのＭＥＫＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸのコカイン誘発性リン酸化がＴｇｐＸＮＵＭＸマウスにおいて廃止されたという知見によって示唆される。 もう1つの可能性のある経路はThr-1でのMEK2のCdk217依存性リン酸化によるものであり、それはその触媒活性の低下をもたらし、ERK221 / 35活性の阻害をもたらすであろう（24).
線条体におけるCdk5活性の阻害は、動物における慢性コカイン治療の行動的効果を増強することが示されている（6） Cdk5活性のアップレギュレーションはコカイン反復投与の影響を打ち消すためのニューロン適応に寄与しうるという仮説と一致する (6我々は、DARPP-5およびMEK32のCdk1を介したリン酸化がERK1 / 2のコカイン誘発性活性化の減弱に寄与し、線条体におけるCREBリン酸化およびc-fosの誘導がより少ないことを見出した。 我々の調査結果は、p5のアップレギュレーションの結果として、Cdk35の活性が上昇すると、コカインに慢性的に曝された後に線条体の遺伝子発現が変化する可能性があるという考えを支持している。 これは、CREBおよびc-fosなどの転写因子の活性の変化を通して起こり得る。 したがって、Cdk5活性化因子p35は、そのCdk5活性に対する律速効果のおかげで、コカイン中毒の根底にある神経機能の長期的な変化に寄与する可能性がある。.
謝辞
私たちは博士に感謝します。 原稿の批評を読んでくれたMary Jo Danton、Philip Grant、そしてSashi Kesavapany。 この作品は、国立衛生研究所助成金Z01DE00664-05（ABKへ）、米国公衆衛生局助成金DA10044、およびSimons財団、Peter J. Sharp財団、およびPicower財団（PGへ）からの助成金によって支えられました。
ノート
略語：ＣｄｋＸＮＵＭＸ、サイクリン依存性キナーゼＸＮＵＭＸ。 ＥＲＫ、細胞外シグナル調節キナーゼ。 DARPP-5、ドーパミンおよびcAMP制御リンタンパク質、分子量5 kDa。 ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性キナーゼ。 MEK、ERKキナーゼ。 CREB、cAMP応答エレメント結合タンパク質。
参考文献
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