ソース
ネイサン・クライン研究所、ニューヨーク州オレンジバーグ、郵便番号10962、アメリカ合衆国。[email protected]
抽象
小児および青年は、違法な使用、あるいは注意欠陥障害（多動性障害の有無を問わず）などの一般的な神経精神疾患の治療のために、精神刺激薬にますます曝されるようになっている。若年層における精神運動刺激薬の広範な使用にもかかわらず、未熟な脳におけるこれらの薬剤に対する慢性的な分子神経適応反応についてはほとんど知られていない。本研究では、精神刺激薬であるコカインとアンフェタミンを慢性的に投与した後、転写因子DeltaFosBが、離乳後マウスや成体マウスではなく、思春期前後のマウスの側坐核で上方制御されることを明らかにした。また、アンフェタミン投与後、 DeltaFosBの誘導は思春期前後のマウスの尾状核被殻でのみ起こる。これらの結果は、精神刺激薬の作用を調節する重要な分子が思春期の脳において特異的な可塑性を持つことを示しており、これらの神経適応変化が、成人と比較して思春期における依存傾向の増大に関与している可能性を示唆している。
イントロダクション
精神刺激薬は、注意欠陥多動性障害などの一般的な小児期障害の治療に使用されます。さらに、アンフェタミンやコカインなどの刺激薬の乱用は、成人に比べて依存傾向が高まっている年齢である青年期によく見られます（Estroff et al., 1989 ; Myers and Anderson, 1991）。発達的に調節された行動効果を示すデータがあるにもかかわらず、これらの薬剤の投与時に未熟な脳で起こる分子レベルの神経適応反応についてはほとんどわかっていません。コカインとアンフェタミンは、ドーパミンD 1受容体の刺激と、背側線条体（すなわち尾状核被殻）および腹側線条体（すなわち側坐核）におけるΔFosBなどの転写因子のレベルの増加を介して、長期にわたる行動変化を引き起こす可能性があります（Chen et al., 1997）。 ΔFosB レベルの上昇は、おそらくタンパク質産物の安定化を介して、コカインやアンフェタミンへの慢性的な曝露後数週間持続し、少なくとも部分的にはドーパミンシグナル伝達経路によって制御されている（Chen et al., 1997 ; Nestler et al., 2001）。
若い動物の中枢ドーパミン作動系は、正常な発達過程における重要な分子のレベルの変化の結果として、非常に変動が激しい。これには、ドーパミンD1受容体DARPP-32（ドーパミンおよびcAMP調節リン酸化タンパク質、分子量32kDa）およびcAMPが含まれる（ Ehrlich et al ., 1990 ; Teicher et al., 1993 ; Perrone-Capano et al., 1996 ; Tarazi et al., 1999 ; Andersen, 2002）。この時期にドーパミン作動性神経伝達を増強する精神刺激薬に曝露されると、ΔFosB発現の変化を含む、量的および／または質的に異なる分子応答が生じる可能性がある。精神刺激薬への慢性曝露中に年齢依存的な神経適応反応が存在するという仮説を検証するため、3つのマウス群（成体（注射開始時60日齢）、思春期前後（注射開始時33日齢）、離乳後（注射開始時24日齢））を連続実験で解析した。これは、これら3つの年齢群における慢性精神刺激薬曝露に対する分子レベルの神経適応反応を直接比較した初めての研究である。同一の治療パラダイムの後、思春期前後のマウスはコカインとアンフェタミンの両方に対してΔFosBのアップレギュレーションが亢進していることがわかった。
材料および方法
動物および薬物投与。雄のCD-1マウス（Charles River Laboratories、ニューヨーク州キングストン）を12時間明暗サイクル（午前6時～午後6時）で飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。動物は注射開始前に最低10日間、動物飼育室に順応させた。動物の取り扱いは2名の研究者が行い、動物が飼育されているのと同じ部屋で全ての注射を行った。全ての動物は生後21日で離乳させた。注射は生後24日（離乳後）、33日（思春期前後）、または60日（成体）から開始した。動物には、7日間毎日午後4時～5時の間に、20 mg/kgのコカイン（Sigma、ミズーリ州セントルイス）、5 mg/kgのアンフェタミン（Sigma）、または同量の生理食塩水を腹腔内投与した。動物は、最終注射の翌日の午前10時に短時間CO2に曝露された後、断頭により安楽死させた。脳は直ちに頭蓋骨から摘出され、尾状核、被殻、側坐核は氷上で迅速に解剖された。すべての解剖は、単一の研究者によって冠状断脳切片から行われ、タンパク質抽出物は凍結せずに新鮮な組織から調製された。すべての動物実験手順は、施設内動物実験委員会によって承認され、米国国立衛生研究所の実験動物の飼育および使用に関するガイドに準拠して行われた。
ウェスタンブロット解析。ウェスタンブロット解析では、BCAアッセイ（Pierce、Rockford、IL）でタンパク質濃度を測定した後、各サンプルから等量のタンパク質（尾状核被殻では40 μg、側坐核では20 μg）を10% SDS-ポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードした。タンパク質の等量ロードは、ニトロセルロース膜への転写後、ポンソーレッドによる総タンパク質の可視化、および／または抗アクチン抗体（1:500；Sigma）を用いたブロッティングによっても確認した。ΔFosBアイソフォームを認識するFos関連抗原（FRA）抗血清は、M. Iadarola博士（米国国立衛生研究所、Bethesda、MD）より提供され、1:4000の濃度で使用した。以前の研究（Chen et al., 1997 ; Hiroi et al., 1997）では、FRA抗血清をMペプチド免疫原で前吸着させることにより、この抗血清の特異性が実証されている。1:10,000で使用したDARPP-32 5aモノクローナル抗体は、Hugh Hemmings博士とPaul Greengard博士（ロックフェラー大学、ニューヨーク州ニューヨーク）から提供された。ドーパミントランスポーター（DAT）抗体はChemicon（カリフォルニア州テメキュラ）製である。ブロットはNEN-DuPont（マサチューセッツ州ボストン）の化学発光システムと反応させ、フィルムに露光した。ΔFosB免疫反応性のデンシトメトリー値は、ScanAnalysis for Apple（Biosoft、ミズーリ州ファーガソン）を使用して取得した。統計的有意性は、図の説明に示されているように、一元配置分散分析（ANOVA）の後、事後検定としてTukeyの多重比較検定、または対応のない両側スチューデントt検定を用いて判定した。薬物投与実験では、各年齢群の分析を別々のブロットで行ったため、各生理食塩水投与群には年齢群間の比較のために便宜的に100%の値を割り当てた。発生過程の研究では、すべての年齢群のサンプルを1枚のブロットでまとめて分析した。
結果
コカインおよびアンフェタミン後のΔFosBの誘導は、青年期マウスのみの側坐核で起こる
ΔFosB の発現は、アンフェタミンまたはコカインを 7 日間投与した後の離乳後、思春期前後、および成体マウスの側坐核および尾状核被殻で測定された。側坐核は、精神刺激薬の報酬効果を媒介する上で最も重要であると考えられている脳領域である。ΔFosB 免疫反応性 (35 kDa) は、アンフェタミン (図1 A ) またはコカイン (図1 B ) を慢性的に投与した後の思春期前後の動物の側坐核で選択的に誘導された。対照的に、離乳後または成体動物の側坐核では ΔFosB (35 kDa) のレベルは有意に変化しなかった (図1 A、B )。尾状核被殻では、ΔFosB (35 kDa) レベルも、慢性アンフェタミン投与後に思春期前後の動物でのみ有意に上昇した (図2 A )。コカインの慢性投与後、3 つの年齢グループすべてで尾状核被殻における ΔFosB (35 kDa) 発現が有意に増加した (図2 B )。ただし、誘導の程度は、特に離乳後動物と比較して、思春期前後の動物で最も大きかった (図2 B )。他の FRA および Fos アイソフォームは、すべての年齢グループで変化がなかった (データは示していない)。
慢性精神刺激薬投与後の側坐核におけるΔFosB免疫反応性。 CD-1マウスに、1日1回、7日から生理食塩水、アンフェタミン、またはコカインを24 d注射しました（P24; 離乳後）、33日目（P33; 思春期前）、または日60（成人）。 側坐核におけるΔFosB（35 kDa）免疫反応性のレベルは、慢性アンフェタミン（A）またはコカイン（B）管理。 生理食塩水からの代表的な免疫ブロット-（S）、アンフェタミン-（A）、およびコカイン-（C）離乳後注射（P24）、青年期（P33）、および成体マウスは トップパネル. ボトムパネル 基底ΔFosB発現の平均±SEMパーセンテージを示します。 n 各グループの値は バー。 ΔFosBの有意な増加は、青年期マウスのみの側坐核で見られました。 *p <0.05; ****p <0.01（学生の t テスト; 生理食塩水vs薬物）。
慢性精神刺激薬投与後の尾状被殻におけるΔFosB免疫反応性。 CD-1マウスに、1日1回、7日から生理食塩水、アンフェタミン、またはコカインを24 d注射しました（P24; 離乳後）、33日目（P33; 思春期前）、または日60（成人）。 尾状被殻のΔFosB（35 kDa）免疫反応性のレベルは、慢性アンフェタミン（A）またはコカイン（B）管理。 生理食塩水からの代表的な免疫ブロット-（S）、アンフェタミン-（A）、およびコカイン-（C）注射された青年期マウス（P33）に表示されますトップパネル. ボトムパネル 基底ΔFosB発現の平均±SEMパーセンテージを示します。 n 各グループの値は バー。 アンフェタミン誘発性の有意なΔFosB免疫反応性の増加は、青年期マウスのみの尾状被殻で見られた（A）。 慢性コカイン投与により、3つの年齢層すべてでΔFosBが増加しました（B）。 *p <0.05; ****p <0.01（学生の t テスト; 生理食塩水vs薬物）。
DATおよびDARPP-32のレベルは、慢性的なコカインまたはアンフェタミンの後に変更されません
ドーパミン作動性ニューロンおよび/またはドーパミン受容性ニューロンによって発現されるいくつかの重要な分子、DARPP-32、D 1ドーパミン受容体、および DAT は、精神刺激薬に対する急性および慢性反応に寄与する ( Moratalla et al., 1996 ; Fienberg et al., 1998 ; Sora et al., 1998 ; Gainetdinov et al., 2001 )。DARPP-32、D 1受容体、および DAT 欠損マウスと DAT ノックダウンマウスのデータは、それらのレベル、ドーパミン作動性活動の調節、および精神刺激薬に対する反応の間に複雑な関係があることを示している。実際、慢性的にコカインを投与された DARPP-32 欠損マウスでは ΔFosB 誘導は起こらない ( Fienberg et al., 1998 )。しかし、成体マウスでは、20 mg/kgのコカインに7日間曝露しても、DARPP-32の総量は変化しない（Fienbergら、1998）。DATタンパク質の調節は、精神刺激薬に慢性的に曝露されたマウスではこれまで報告されていないが、精神刺激薬への曝露後にドーパミントランスポーターへの放射性リガンド結合の変化がいくつかの種で報告されている（Letchworthら、2001）。ここでは、DARPP-32およびDATタンパク質のレベルを測定し、3つの年齢のマウスのいずれにおいても、慢性的な精神刺激薬投与後にこれらのタンパク質の発現が変化するかどうかを調べた。我々の知見は、3つの年齢群のいずれにおいても、コカインまたはアンフェタミンのいずれかを慢性的に投与した後、尾状核被殻全体または側坐核における総DARPP-32またはDATのレベルに有意な変化がなかったことを示している（表1）。
ΔFosBのベースラインレベルは発生的に規制されています
線条体におけるΔFosBの発現が遺伝子工学的に増加した成体マウスは精神刺激薬に対する行動反応が高まるため、我々はΔFosBの個体発生を調べた（Kelzら、1999）。 ΔFosBのベースラインレベルは、尾状被殻と側坐核の両方で成体と比較して若い動物で有意に低いことがわかりました（図3 A）。 DARPP-32を含むドーパミン系の機能マーカーのレベル（エールリッヒら、1990）、DAT（Perrone-Capano et al。、1996）、およびドーパミン受容体（Teicherら、1993; Taraziら、1999）も発達的に規制されています。 CD-1マウスの以前のレポートでは、出生後32（P28）で線条体DARPP-28のピークが示されています（エールリッヒら、1990）。 ラットの尾状核被殻および側坐核、D1受容体レベルはP28からP40（Teicherら、1993; Taraziら、1999）、しかし、同様の研究はマウスで行われていません。 対照的に、ここでは尾状被殻および側坐核のDATタンパク質レベルが出生後24と成人期の間で一定であることがわかりました（図 3 B）。 したがって、D1 受容体、DAT、DARPP-32、およびΔFosBは年齢グループ間で異なり、潜在的にD1 ΔFosB誘導の程度に影響を与える可能性のある受容体活性。
ΔFosB および DAT の発達的発現。A 、ナイーブ CD-1 マウスの尾状核被殻および側坐核における ΔFosB (35–37 kDa) 免疫反応性を年齢の関数として示す。代表的なイムノブロットを上段パネルに示す。下段パネルは、各群 3 匹のマウスの平均 ± SEM を示す。* p < 0.05、成体と P24 の比較。# p < 0.05、成体と P36 の比較 (ANOVA 後の Tukey の多重比較検定)。B 、ナイーブ CD-1 マウスの尾状核被殻および側坐核における DAT 免疫反応性の濃度測定値を年齢の関数として示す。DAT レベルは 3 つの年齢群間で差がなかった。
考察
精神運動刺激薬の行動への影響は年齢によって異なる。依存傾向は、違法薬物の使用が増加する思春期に最も高くなる（Estroff et al., 1989 ; Myers and Anderson, 1991）。実際、幼い子供は精神刺激薬に曝露されると不快な気分になることが多いのに対し、思春期の若者や成人は多幸感を経験する（Rapoport et al., 1980）。げっ歯類モデルでは、思春期前後の動物は、より若い動物や高齢の動物に比べて、基礎活動レベルが高く（Spear and Brake, 1983）、精神刺激薬に対する反応も変化していることを示唆する研究もある。そのため、離乳期や成体の動物に比べて、精神刺激薬の急性低用量投与に対する運動刺激や新規性探索行動は少ないが、高用量投与後には過活動が増加する。慢性投与の場合、コカイン誘発性運動に対する感作は成体ラットに比べて思春期前後のラットの方が大きいが、常同行動に対する感作は低い。また、マイクロダイアリシスデータでは、アンフェタミン誘発性ドーパミン放出に対する感作に関して思春期前後のラットと成体ラットの間に違いがあることが明らかになっている（Laviola et al., 1995 ; Adriani et al., 1998 ; Adriani and Laviola, 2000 ; Laviola et al., 2001）。しかし、思春期ラットへのメチルフェニデート投与後のコカインに対する長期反応性については、相反する研究がある（Brandon et al., 2001 ; Andersen et al., 2002）。後者の2つの報告は、異なる実験パラダイムが使用されている場合、研究を比較することの難しさを強調している。若い動物における行動研究を比較しようとする試みは、異なる種や系統が用いられることによってさらに複雑化する。
マウスは精神刺激薬の使用と乱用の研究においてますます重要な動物モデルになりつつあり、これはマウスまたは他の単一種における3つの異なる発達段階における分子神経適応反応の体系的な分析としては初めてのものである。我々が治療パラダイムを導き出した以前の研究では、慢性コカインおよびアンフェタミン投与後の野生型成体ラットの分離背側および腹側線条体におけるΔFosBの増加が実証されているが（Hope et al., 1994 ; Nye et al., 1995 ; Turgeon et al., 1997）、慢性コカイン投与後の野生型成体マウスの複合背側および腹側線条体または分離背側線条体においてのみ増加が実証されている（Fienberg et al., 1998 ; Zachariou et al., 2001）。
我々は今回、離乳後、思春期前後、成体マウスにおける精神刺激薬誘発性ΔFosBの空間的および量的差異を明らかにした。成体および離乳後マウスと比較して思春期前後の動物で反応が亢進しているという観察結果は、コカインおよびアンフェタミン投与マウスで反応が類似しているという事実によって裏付けられる。精神刺激薬であるコカインとアンフェタミンはどちらもシナプスドーパミン、セロトニン、ノルアドレナリンを増加させるが、そのメカニズムは異なる。コカインはドーパミン、セロトニン、ノルアドレナリンの細胞膜トランスポーターに結合し、シナプス前終末への再取り込みを阻害する。対照的に、アンフェタミンはこれらの神経伝達物質の放出を促進する。刺激剤投与7日後に思春期前後の年齢群のみで側坐核に選択的にΔFosBが誘導され、尾状核・被殻でΔFosBの誘導が比較的高かったことは、この年齢群で精神刺激薬乱用傾向が高まっていること（Estroff et al., 1989 ; Myers and Anderson, 1991）や、年齢群によって異なる遺伝子発現の長期的な変化（Andersen et al., 2002）の神経生物学的表現または原因である可能性がある。さらに、これらの違いは、ΔFosB自体を含む主要分子のレベルの発達的変化によって本質的に制御されている可能性がある。年齢群間のΔFosBのベースラインレベルの違いがもたらす潜在的な影響は、ラットの系統間の違いに関して提案されたものと類似している（Haile et al., 2001）。実際、近交系マウスでも同様の系統差が見られると予想される。また、マウスの年齢によって、側坐核以外の脳領域における分子レベルでの適応が異なる可能性もある。遺伝子操作によって主要分子のレベルを変化させた思春期前後のマウスを用いた追加解析と、それに伴う行動観察によって、これらの仮説をさらに検証できるだろう。
脚注
- 受信された 4月8、2002。
- 改訂を受け取りました 8月の6、2002。
- 受け入れ 8月の8、2002。
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この作業は、国立衛生研究所/国立神経障害研究所および脳卒中助成金NS41871（MEEおよびEMU）および国立薬物乱用助成金P30-DA13429（EMU）によってサポートされていました。
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連絡先は、ミシェル・E・エーリック博士（トーマス・ジェファーソン大学、カーティス310、1025 ウォルナット・ストリート、フィラデルフィア、ペンシルベニア州 19107）まで。Eメール： [email protected]
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