ソース
ネイサンクライン研究所、オレンジバーグ、ニューヨーク、10962、米国。 [メール保護]
抽象
子供や青年は、違法に、または多動性を伴うまたは伴わない注意欠陥障害などの一般的な神経精神疾患の治療のために、精神刺激薬にますますさらされています。 若い年齢層で精神運動刺激薬が広く使用されているにもかかわらず、未熟な脳でのこれらの薬剤に対する慢性分子神経適応反応に関してはほとんど知られていない。 ここでは、精神刺激薬の慢性投与後、 コカイン & アンフェタミン、転写因子 DeltaFosB の側坐核でアップレギュレートされています 青年期 マウス 離乳後または成人ではない マウス。 の誘導 DeltaFosB の尾状被殻でのみ発生する 青年期 マウス After アンフェタミン 管理。 これらの結果は、精神刺激薬の作用を調節する重要な分子の思春期の脳におけるユニークな可塑性を示しており、これらの神経適応の変化が 強化された 成人に比べて思春期の習慣性傾向。
概要
精神刺激薬は、注意欠陥多動性障害などの一般的な小児障害の治療に使用されます。 さらに、アンフェタミンやコカインなどの覚せい剤の乱用は、成人に比べて習慣性傾向が高まる証拠がある青少年の間で一般的です（エストロフら、1989; マイヤーズアンドアンダーソン、1991）。 発達的に調節された行動の影響を示すデータにもかかわらず、これらの薬剤の投与中に起こる未熟な脳の分子神経適応反応に関してはほとんど知られていない。 コカインとアンフェタミンは、ドーパミンDの刺激を介して部分的に長期的な行動変化に影響を与える可能性があります1背側線条体（すなわち、尾状被殻）および腹側線条体（すなわち、側坐核）における受容体およびΔFosBを含む転写因子のレベルの増加（Chenら、1997）。 おそらくタンパク質産物の安定化によるΔFosBのレベルの増加は、コカインまたはアンフェタミンへの慢性暴露後数週間持続し、少なくとも部分的にドーパミンシグナル伝達経路によって調節されます（Chenら、1997; Nestlerら、2001).
若い動物の中枢ドーパミン作動性システムは、ドーパミンDを含む正常な発達中の重要な分子のレベルの変化の結果として非常に流動的です1受容体DARPP-32（ドーパミンおよびcAMP調節リンタンパク質; Mr 32 kDa）およびcAMP（エールリッヒら、1990;Teicherら、1993; Perrone-Capano et al。、1996; Taraziら、1999;アンデルセン、2002）。 したがって、この期間中のドーパミン作動性神経伝達を増強する精神刺激薬への曝露は、ΔFosB発現の変化を含む、定量的および/または定性的に異なる分子応答をもたらす可能性があります。 精神刺激薬への慢性暴露中に年齢依存性の神経適応反応があるという仮説を検証するため、一連の実験でマウスの3つのグループを分析しました：成人（注射開始時に60 d年）、青年期（注射開始時に33 d年）、および離乳後（24 dは注入開始時に古い）。 これは、これら3つの年齢層における慢性精神刺激薬曝露に対する分子神経適応反応の最初の直接比較です。 同一の治療パラダイムの後、思春期前のマウスはコカインとアンフェタミンの両方に反応してΔFosBの上方制御が強化されることを発見しました。
材料および方法
動物および薬物投与。 オスのCD-1マウス（Charles River Laboratories、キングストン、NY）は、12時間の明暗サイクル（6：00 AMから6：00 PM）で飼育されました。 アドリブで食料と水へのアクセス。 動物は、注射の開始前に最低10 dの間動物室に収容することができました。 動物は、動物が収容されている同じ部屋ですべての注射を行った2人の調査員によって取り扱われました。 すべての動物は21日齢で離乳した。 注射は、年齢の24（離乳後）、33（思春期前）、または60（成人）から始まりました。 動物は、20 mg / kgコカイン（シグマ、ミズーリ州セントルイス）、5 mg / kgアンフェタミン（シグマ）、または4 dについて毎日、00：5と00：7 PMの間で等量の生理食塩水を腹腔内投与されました。 COに短時間さらされた後、断頭により動物が殺された2 最終注射の翌日に10：00 AMで。 脳はすぐに頭蓋骨から取り除かれ、尾状被殻と側坐核は氷上で急速に解剖された。 すべての解剖は、単一の研究者によって冠状脳スライスから行われ、タンパク質抽出物は凍結することなく新鮮な組織から調製されました。 すべての動物の手順は、施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所に準拠していました 実験動物の世話と使用のためのガイド.
ウエスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析では、BCAアッセイでタンパク質濃度を測定した後、各サンプルからの等量のタンパク質（尾状被殻の場合は40μg、側坐核の場合は20μg）を10％SDS-ポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードしました（Pierce、イリノイ州ロックフォード）。 ニトロセルロースへの転写および/または抗アクチン抗体（1：500;シグマ）でのブロッティング後のポンソーレッドによる総タンパク質の視覚化により、タンパク質の均等なローディングも検証されました。 ΔFosBアイソフォームを認識するFos関連抗原（FRA）抗血清は、M。Iadarola博士（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州）からgeneしみなく提供され、1：4000の濃度で使用されました。 以前の研究（Chenら、1997; Hiroi et al。、1997）、M-ペプチド免疫原によるFRA抗血清の事前吸着を含めて、この抗血清の特異性が示されました。 32：5で使用されるDARPP-1 10,000aモノクローナル抗体は、Drs。 ヒュー・ヘミングスとポール・グリーンガード（ニューヨーク州ニューヨークのロックフェラー大学）。 ドーパミン輸送体（DAT）抗体は ケミコン （カリフォルニア州テメキュラ）。 ブロットをNEN-DuPont（マサチューセッツ州ボストン）の化学発光システムと反応させ、フィルムに露光しました。 ΔFosB免疫反応性の濃度測定値は、ScanAnalysis for Apple（Biosoft、Ferguson、MO）を使用して取得しました。 統計的有意性は、一元配置分散分析を使用して決定され、その後に 事後に テューキーの多重比較検定または対になっていない両側の学生の検定 t 図の凡例に示されているようにテストします。 薬物治療実験では、各年齢グループの分析は別々のブロットで実行されたため、各生理食塩水グループには年齢グループ間の比較のために100％値が任意に割り当てられました。 個体発生研究のために、すべての年齢層のサンプルを単一のブロットで一緒に分析しました。
結果
コカインおよびアンフェタミン後のΔFosBの誘導は、青年期マウスのみの側坐核で起こる
ΔFosBの発現は、アンフェタミンまたはコカイン投与の7 d後の離乳後、思春期後、および成体マウスの側坐核および尾状被殻で測定されました。 側坐核は、精神刺激薬の報酬効果を仲介するために最も重要であると考えられている脳の領域です。 ΔFosB免疫反応性（35 kDa）は、アンフェタミンの慢性投与後に思春期前後の動物の側坐核に選択的に誘導されました（図 1 A）またはコカイン（図 1 B）。 対照的に、離乳後または成体動物の側坐核ではΔFosB（35 kDa）のレベルは有意に変化していませんでした（図1 A,B）。 尾状被殻では、思春期周辺の動物にのみ慢性アンフェタミンを投与した後、ΔFosBレベル（35 kDa）も有意に上方制御されました（図2 A）。 3つの年齢層すべてが、コカインの慢性投与後、尾状被殻でΔFosB（35 kDa）発現の有意な増加を示しました（図2 B）。 しかし、誘導の大きさは、特に離乳後と比較して、思春期前の動物で最大でした（図 2 B）。 他のFRAおよびFosアイソフォームは、すべての年齢層で変更されていません（データは示していません）。
慢性精神刺激薬投与後の側坐核におけるΔFosB免疫反応性。 CD-1マウスに、1日1回、7日から生理食塩水、アンフェタミン、またはコカインを24 d注射しました（P24; 離乳後）、33日目（P33; 思春期前）、または日60（成人）。 側坐核におけるΔFosB（35 kDa）免疫反応性のレベルは、慢性アンフェタミン（A）またはコカイン（B）管理。 生理食塩水からの代表的な免疫ブロット-（S）、アンフェタミン-（A）、およびコカイン-（C）離乳後注射（P24）、青年期（P33）、および成体マウスは トップパネル. ボトムパネル 基底ΔFosB発現の平均±SEMパーセンテージを示します。 n 各グループの値は バー。 ΔFosBの有意な増加は、青年期マウスのみの側坐核で見られました。 *p <0.05; ****p <0.01（学生の t テスト; 生理食塩水vs薬物）。
慢性精神刺激薬投与後の尾状被殻におけるΔFosB免疫反応性。 CD-1マウスに、1日1回、7日から生理食塩水、アンフェタミン、またはコカインを24 d注射しました（P24; 離乳後）、33日目（P33; 思春期前）、または日60（成人）。 尾状被殻のΔFosB（35 kDa）免疫反応性のレベルは、慢性アンフェタミン（A）またはコカイン（B）管理。 生理食塩水からの代表的な免疫ブロット-（S）、アンフェタミン-（A）、およびコカイン-（C）注射された青年期マウス（P33）に表示されますトップパネル. ボトムパネル 基底ΔFosB発現の平均±SEMパーセンテージを示します。 n 各グループの値は バー。 アンフェタミン誘発性の有意なΔFosB免疫反応性の増加は、青年期マウスのみの尾状被殻で見られた（A）。 慢性コカイン投与により、3つの年齢層すべてでΔFosBが増加しました（B）。 *p <0.05; ****p <0.01（学生の t テスト; 生理食塩水vs薬物）。
DATおよびDARPP-32のレベルは、慢性的なコカインまたはアンフェタミンの後に変更されません
DARPP-32、Dを含むドーパミン作動性および/またはドーパミン受容ニューロンによって発現されるいくつかの重要な分子1 ドーパミン受容体、およびDATは、精神刺激薬に対する急性および慢性応答に寄与します（Moratallaら、1996; Fienberg et al。、1998; Sora et al。、1998; Gainetdinov et al。、2001）。 DARPP-32、Dからのデータ1 受容体、およびDATヌルおよびDATノックダウンマウスは、それらのレベル、ドーパミン作動性活性の調節、および精神刺激薬への反応の複雑な関係を示しています。 実際、ΔFosB誘導は、慢性コカインを投与されたDARPP-32 nullマウスでは発生しません（Fienberg et al。、1998）。 ただし、成体マウスでは、7 mg / kgコカインへの20 d曝露は、DARPP-32の合計レベルを変更しません（Fienberg et al。、1998）。 精神刺激薬への暴露後のドーパミン輸送体への放射性リガンド結合の変化がいくつかの種で報告されているがレッチワースら、2001）。 ここでは、DARPP-32およびDATタンパク質のレベルを測定して、これらのタンパク質の発現が3世代のマウスのいずれかに慢性精神刺激薬を投与した後に変化するかどうかを判断しました。 私たちの調査結果は、3つの年齢層のいずれかでコカインまたはアンフェタミンのいずれかの慢性投与後、尾状被殻または側坐核全体の総DARPP-32またはDATのレベルに有意な変化はなかったことを示しています（表 1).
ΔFosBのベースラインレベルは発生的に規制されています
線条体におけるΔFosBの発現が遺伝子工学的に増加した成体マウスは精神刺激薬に対する行動反応が高まるため、我々はΔFosBの個体発生を調べた（Kelzら、1999）。 ΔFosBのベースラインレベルは、尾状被殻と側坐核の両方で成体と比較して若い動物で有意に低いことがわかりました（図3 A）。 DARPP-32を含むドーパミン系の機能マーカーのレベル（エールリッヒら、1990）、DAT（Perrone-Capano et al。、1996）、およびドーパミン受容体（Teicherら、1993; Taraziら、1999）も発達的に規制されています。 CD-1マウスの以前のレポートでは、出生後32（P28）で線条体DARPP-28のピークが示されています（エールリッヒら、1990）。 ラットの尾状核被殻および側坐核、D1受容体レベルはP28からP40（Teicherら、1993; Taraziら、1999）、しかし、同様の研究はマウスで行われていません。 対照的に、ここでは尾状被殻および側坐核のDATタンパク質レベルが出生後24と成人期の間で一定であることがわかりました（図 3 B）。 したがって、D1 受容体、DAT、DARPP-32、およびΔFosBは年齢グループ間で異なり、潜在的にD1 ΔFosB誘導の程度に影響を与える可能性のある受容体活性。
ΔFosBおよびDATの発達的発現。 A、年齢に応じたナイーブCD-35マウスの尾状被殻および側坐核におけるΔFosB（37–1 kDa）免疫反応性。 代表的なイムノブロットは、 トップパネル.ボトムパネル showは、グループごとに3匹のマウスの±SEMを意味します。 *p <0.05、成人対P24; ＃p <0.05、成人対P36（ANOVA後のテューキーの多重比較検定）。 B、年齢の関数としてのナイーブCD-1マウスの尾状被殻および側坐核におけるDAT免疫反応性の濃度測定値。 DATのレベルは、3つの年齢グループ間で差はありませんでした。
考察
精神運動刺激薬の行動への影響は年齢に依存します。 中毒性の傾向は、違法物質の使用がエスカレートする思春期に最も高くなります（エストロフら、1989; マイヤーズアンドアンダーソン、1991）。 実際、思春期の若者と大人は多幸感を経験するのに対し、年少の子供は精神刺激薬にさらされるとしばしば不快感を覚えます（Rapoportら、1980）。 げっ歯類モデルでは、思春期前の動物の方がベースラインの活動レベルが高いことが示唆されている研究もあります槍とブレーキ、1983）若年および高齢の動物と比較した精神刺激薬に対する反応の変化。 したがって、彼らは、離乳および成体動物と比較して、精神刺激薬の急性低用量投与に応答した運動刺激および新規探索の少ないが、高用量治療後の多動性の増加を示す。 慢性投与では、コカイン誘発運動に対する感作は成体と比較して思春期前のラットで大きくなりますが、ステレオタイプに対する感作は低くなります。 また、微小透析データは、アンフェタミン誘発性ドーパミン放出に対する感作に関して、青年期ラットと成体ラットの違いを明らかにしました（Laviolaら、1995; Adriani et al。、1998; AdrianiとLaviola、2000;Laviolaら、2001）。 しかし、思春期のラットにメチルフェニデートを投与した後のコカインに対する長期の反応性に関して矛盾する研究があります（ブランドン他、2001; Andersen et al。、2002）。 後者の2つのレポートは、異なる実験パラダイムが使用されている場合の研究の比較が困難であることを強調しています。 若い動物の行動研究を比較する試みは、異なる種と系統の使用によってさらに混乱します。
マウスは精神刺激薬の使用と乱用の研究でますます重要な動物モデルになりつつあり、これはマウスまたは他の単一種の3つの異なる発達年齢における分子神経適応反応の最初の体系的分析です。 治療パラダイムを導き出した以前の研究では、コカインとアンフェタミンの慢性投与後、野生型成体ラットの孤立した背側および腹側線条体のΔFosBの増加が示されました（Hopeら、1994; Nye et al。、1995; Turgeonら、1997）ただし、慢性コカイン後の野生型成体マウスの背側線と腹側線条体の組み合わせ、または孤立した背側線条体のみ（Fienberg et al。、1998; Zachariou他、2001).
現在、離乳後、青年期、および成体マウスにおける精神刺激薬誘発のΔFosBの空間的および量的な違いを示しています。 成人および離乳後と比較して思春期前の動物の反応が高まっているという観察は、コカインとアンフェタミンで処理したマウスで反応が似ているという事実によって強化されています。 精神刺激薬のコカインとアンフェタミンは、シナプスのドーパミンとセロトニンとノルエピネフリンの両方を増加させますが、メカニズムは異なります。 コカインは、ドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリンの原形質膜輸送体に結合し、シナプス前終末への再取り込みを阻害します。 対照的に、アンフェタミンはこれらの伝達物質の放出を促進します。 7 dの覚せい剤投与後の思春期前後の年齢層のみの側坐核におけるΔFosBの選択的誘発と、尾状被殻におけるΔFosBの比較的高められた誘発は、神経生物学的表現であるか、以前に指摘された精神刺激薬乱用の増加傾向の原因である可能性があります年齢層 （エストロフら、1989; マイヤーズアンドアンダーソン、1991）および遺伝子発現のその他の長期的な変化は、年齢層によって異なります（Andersen et al。、2002）。 さらに、これらの違いは、ΔFosB自体を含む重要な分子のレベルの発達上の変化によって本質的に調節されている可能性があります。 年齢層間のΔFosBのベースラインレベルの違いの潜在的な影響は、ラット系統間の違いに関して提案されたものに類似しています（Haileら、2001）。 実際、近交系マウスでも同様の系統差が見られると予想されます。 また、年齢の異なるマウスが側坐核以外の脳の領域で異なる分子適応を示す可能性もあります。 主要な分子のレベルの遺伝子操作された変化と同時行動観察を伴う思春期前のマウスを使用した追加の分析は、これらの仮説をさらにテストします。
脚注
- 受信された 4月8、2002。
- 改訂を受け取りました 8月の6、2002。
- 受け入れ 8月の8、2002。
この作業は、国立衛生研究所/国立神経障害研究所および脳卒中助成金NS41871（MEEおよびEMU）および国立薬物乱用助成金P30-DA13429（EMU）によってサポートされていました。
対応は、トーマス・ジェファーソン大学のミシェル・E・エールリッヒ博士、ペンシルバニア州フィラデルフィアのウォルナット・ストリート、カーティス310、カーティス1025、19107に宛ててください。 Eメール： [メール保護].
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