糖尿病。 2017; 60（8）：1502 - 1511。
オンラインで公開された2017 May 20。 土井： 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID：PMC5491592
1抽象
ねらい/仮説
食事性脂肪を食べ過ぎると、ヒトやげっ歯類で肥満が起こります。 人間とげっ歯類の最近の研究では、脂肪への嗜癖は、脳の報酬システムの機能不全に関してアルコール、ニコチン、麻薬への嗜癖と共通のメカニズムを共有していることが実証されています。 高脂肪食（ＨＦＤ）は、脳報酬システムの極めて重要な調節因子である線条体におけるドーパミンＤＸＮＵＭＸ受容体（ＤＸＮＵＭＸＲ）シグナル伝達を減弱させ、快楽過食をもたらすことが強調されている。 我々は以前、玄米特異的な生理活性成分であるγ-オリザノールが視床下部制御を介してHFDの選択を弱めることを報告した。 そこで我々は、γ-オリザノールがマウスの脳内報酬系の機能を調節する可能性を探った。
メソッド
HFDを与えられた雄のC57BL / 6Jマウスをγ-オリザノールで経口治療し、D2Rシグナル伝達に関与する線条体レベルの分子を評価した。 ＤＸＮＵＭＸＲプロモーターのＤＮＡメチル化に対するγ－オリザノールの影響およびそれに続く食事性脂肪の嗜好性の変化を調べた。 さらに、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）の強力な阻害剤である2-アザ-5'-デオキシシチジンの、食物嗜好性、D2Rシグナル伝達、および線条体中のDNMTのレベルに対する効果を調べた。 ＤＮＭＴの活性に対するγ－オリザノールの阻害効果をインビトロで酵素的に評価した。
結果
HFDを与えられたマウスからの線条体では、D2Rのプロモーター領域のDNAメチル化の増加を介してD2Rの産生が減少した。 γ-オリザノールの経口投与はDNMTの発現および活性を低下させ、それによって線条体中のD2Rのレベルを回復させた。 ＸＮＵＭＸ−アザ−ＸＮＵＭＸ'−デオキシシチジンによるＤＮＭＴの薬理学的阻害もまた、食事性脂肪に対する嗜好性を改善した。 これらの知見と一致して、酵素的インビトロアッセイは、γ－オリザノールがＤＮＭＴの活性を阻害することを実証した。
結論/解釈
本発明者らは、γ-オリザノールがマウスの線条体におけるD2Rのプロモーター領域のHFD誘導DNA過剰メチル化を改善することを証明した。 我々の実験的パラダイムは、新規のエピジェネティックモジュレーターであるという明確な性質を有する有望な抗肥満物質としてのγ－オリザノールを強調している。
電子補足資料
この記事のオンライン版（doi：10.1007 / s00125-017-4305-4）には、査読済みですが未承認の補足資料が含まれています。
イントロダクション
肥満者の過食は、少なくとも部分的には、アルコール、ニコチンおよび麻薬への嗜癖を伴う共通のメカニズムを共有する。1]。 視床下部およびホルモンによる食欲の調節と同様に、脳の報酬システム、特にドーパミン受容体シグナル伝達は、中毒性または快楽摂食行動と密接に関係しています[2]。 ラットを用いた以前の研究では、レンチウイルスを介した短鎖ヘアピン干渉RNAによる線条体ドーパミンD2受容体（D2R）のノックダウンによって、依存症様の報酬不足および強制的な食物探しが急速に引き起こされたことが示された。3]。 D2R密度が低いため、肥満のヒトおよびげっ歯類では、背側の線条体はやせた対照群と比較して食物報酬に対する反応が鈍い[1]。3–5]。 この概念に従って、 Taqの対立遺伝子 ANKK1 線条体D2R産生を減少させる遺伝子座（DRD1 /アンキリンリピートおよび2を含むキナーゼドメインをコードする）は、ヒトの肥満表現型と関連している。6一方、肥満手術後の体重減少の影響は線条体D2R密度の上昇と関連している[7]。 これらのデータは、肥満治療のための新規治療標的としての線条体D2Rの重要性を強く示唆している。 しかし、脳の報酬システムに作用するように開発されたいくつかの薬は深刻な精神医学的問題を含むかなりの悪影響を引き起こし、その結果彼らの最終的な診療所からの離脱をもたらした。8].
エピジェネティックな修飾は発生と分化のためだけではなく、食事やライフスタイルを含む環境の変化の結果として起こるためにも重要です。9]。 DNAメチル化は、遺伝子発現の安定性に対する主な後成的事象です[9]。 ラットでは、母親が高脂肪食（HFD）に曝露すると、子孫の中枢報酬システム内でDNAメチル化が世代間で変化し、子犬によるHFDの過剰消費が引き起こされる[10]。 特に、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）は摂食行動と身体活動の両方の調節に重要な役割を果たしています。10, 11]、DNMTは肥満 - 糖尿病症候群の治療のための有望な治療標的になり得ることを示唆している。 重要なことに、カフェイン酸やエピガロカテキンを含むいくつかの天然食品由来の物質は、DNMT阻害剤として作用することが知られています。12, 13].
フェルラ酸エステルといくつかのフィトステロールの混合物である生理活性玄米特有の成分であるγ-オリザノールが、視床下部小胞体（ER）ストレスの減少を介して食事性脂肪の嗜好性を弱めることを最近示しました。14]。 マウスやウサギでは、経口投与されたγ-オリザノールは腸から急速に吸収され、主に脳に分布しました。15, 16]。 これらの知見をまとめると、中枢神経系に作用する天然食品由来の製品は、肥満における摂食障害行動を安全に改善するための代替手段となり得る。 これに関連して、本発明者らは、γ-オリザノールが脳内報酬系におけるDNAメチル化状態を変化させ、その結果マウスにおけるHFDに対する嗜好性の減弱をもたらすという仮説を検証した。
メソッド
動物
チャールズリバーラボラトリーズジャパン（神奈川県）から入手した57週齢のオスのC6BL / 3Jマウスを、特定病原体除去条件、4°C、24時間/ 12時間の光の下で飼育しました（ケージあたり12〜8匹）。ダークサイクル。 順応の5352週間後、5718週齢のマウスの体重を一致させ、5943つまたはXNUMXつのグループに分けて各実験を行いました。 マウスは食物と水への自由なアクセスを許された。 すべての動物実験は、琉球大学の動物実験倫理委員会によって承認されました（No. XNUMX、XNUMX、XNUMX）。
γ-オリザノールおよび5-アザ-2'-デオキシシチジンの投与
ＨＦＤに対する嗜好性を評価するために、γ－オリザノール（和光純薬、大阪、日本）をＸＮＵＭＸ週齢のマウスに、前述のように食物選択試験中に強制飼養により投与した［１］。14, 17]。 他の実験のために、ＸＮＵＭＸ％のγ−オリザノールを含有するＨＦＤ（ＤＸＮＵＭＸＢ；米国ニュージャージー州ニューブランズウィックのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）をペレットとして製造した。 食事の成分は電子補助物質（ESM）表に示されています 1。 12週間の給餌後、線条体と視床下部から組織を採取しました。 マウスの平均食物摂取量から推定されるγ-オリザノールの320日摂取量は、約XNUMXμg/ g体重でした。 γ-オリザノールの用量は以前に記載されたように決定された[14]。 5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ-dC; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を週0.25回、12週間腹腔内注射（XNUMXμg/ g体重）した[18].
食物脂肪の好みの推定
食事性脂肪の嗜好性を評価するために、食品試験では前述のように固形飼料とHFD（D12450BとD12451、Research Diets）のどちらかを選択しました。14]。 食事の成分はESM表に示されています 1。 手短に言えば、マウスは固形飼料およびHFDへの自由なアクセスを許可された。 固形飼料とHFDの摂取量を毎週測定し、食事脂肪の好みの変化を分析しました。 HFD選好は、次の式に従って計算されました：HFD選好= [（HFD摂取量/総食物摂取量）×100]。
DNAメチル化のための重亜硫酸塩配列決定
DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGEN、東京、日本）を使用してDNAを精製しました。 DNA溶液を新たに調製した3mol / l NaOHと混合し、37°Cで15分間インキュベートし、5.3 mol / l尿素、1.7 mol / l重亜硫酸ナトリウム、および4.9 mmol / lヒドロキノンに添加しました。 この溶液を、15℃で95秒間の変性と30℃で50分間のインキュベーションを15サイクル行った[19]。 重亜硫酸塩処理ＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｕｒａｃｉｌ ＋ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲキット（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州ウォーバーン）およびＤＸＮＵＭＸＲのプロモーター領域のＣｐＧ部位周辺のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。 。 プライマー配列は以下の通りであった：フォワードプライマー、2'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-5 '。 リバースプライマー、ＸＮＵＭＸ' − ＡＣＣＣＴＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣ − ＸＮＵＭＸ '。 次に、アダプター配列を追加し、Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter、Brea、CA、USA）を使用してクリーンアップした。 次いでサンプルをプールし、製造元のプロトコルに従って配列決定するためにGS Junior（Roche Diagnostics、Tokyo、Japan）にロードした。 メチル化レベルは、全シトシン残基中のメチル化シトシンの百分率として表した。
DNMT活性アッセイ
DNMT酵素活性アッセイは、EpiQuik DNAメチルトランスフェラーゼ活性/阻害アッセイキット（Epigentek Group、ブルックリン、NY、米国）およびEPIgenethメチルトランスフェラーゼアッセイキット（Cisbio Japan、千葉、日本）を製造元のプロトコルに従って用いて行った。
ＤＮＡメチル化に対する各化合物の阻害活性を評価するために、 S-アデノシル-20-ホモシステイン（SAH）は、各化合物の存在下で測定されました（スクリーニングアッセイではXNUMXμmol/ l）。 S-アデノシルメチオニン（SAM;10μmol/ l）およびDNMT基質（4ng /μl）、37°Cで90分間。 ミカエリスメンテン動力学を評価するために、DNMT1（20μmol/ l）をγ-オリザノール、SAM（5μmol/ l）および示された濃度のポリdI-dCと37°Cで90分間インキュベートしました。 DNMT3a（100μmol/ l）およびDNMT3b（100μmol/ l）をγ-オリザノール、SAM（5μmol/ l）および示された濃度のポリdG・dCとともに37℃で120分間インキュベートしました。 アッセイは0.75回行った。 抽出したタンパク質（5 mg / ml）をSAM（5μmol/ l）、poly dI-dC（5μg/ ml）、poly dG・dC（40μg/ ml）と120°CでXNUMX分間インキュベートし、 SAH形成を測定した。
エストロゲン関連受容体-γ活性測定
エストロゲン関連受容体-γ（ERRγ）に対するγ-オリザノールの潜在的な拮抗活性は、ヒトエストロゲン関連受容体ガンマレポーターアッセイシステム（INDIGO Bioscience、ステートカレッジ、ペンシルベニア州、米国）を製造元のプロトコルに従って使用して評価しました。 簡単に説明すると、活性ERRγを構成的に発現する非ヒト哺乳動物レポーター細胞を、示された濃度の各化合物に24時間XNUMX回曝露した。
ウエスタンブロッティング
これは以前に記述されたように実行された20] D2R（1：500、ウサギ）、ドーパミントランスポーター（DAT; 1：500、ウサギ）、チロシンヒドロキシラーゼ（TH; 1：1000、ウサギ）（AB5084P、AB1591PおよびAB152、Merck Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ、 USA）、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子3α（STAT3α; 1：1000、ウサギ）、DNMT1（1：1000、ウサギ）、DNMT3a（1：1000、ウサギ）（番号8768、5032および3598; Cell Signaling Technology、東京、日本）、DNMT3b（1μg/ ml、ウサギ）、ERRγ（1：1000、ウサギ）およびβ-アクチン（1：10,000、マウス）（ab16049、ab128930およびab6276; Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国）。
定量的リアルタイムPCR
遺伝子発現は以前に記載されているように調べた[14]。 ｍＲＮＡレベルを標準化した。 Rn18 （ＸＮＵＭＸＳ ｒＲＮＡ）。 定量的リアルタイムPCR分析に使用したプライマーセットをESM表に要約する。 2.
統計分析
データは平均±SEMとして表されます。 該当する場合は、一元配置分散分析と反復測定分散分析に続いて多重比較検定（ボンフェローニ-ダン法）を使用しました。 学生 t テストは2つのグループ間の違いを分析するために使用されました。 違いは有意であると見なされました p <0.05。
結果
5‐アザ‐dCによるDNMTの薬理学的阻害はマウスにおける食餌性脂肪の嗜好性を弱めた
HFDを給餌されたマウスでは、線条体のD2Rのプロモーター領域におけるDNAメチル化は、固形飼料を給餌されたマウスと比較して有意に増強された（図3）。 （図.1a）.1ａ）。 一方、D2Rのプロモーター領域における視床下部DNAメチル化は、固形飼料下の線条体におけるそれより明らかに高かった（p <0.01）（図 （Fig.1a、1ａ、ｆ）ＨＦＤによって変化しなかった（図２）。 （図.1f）.1f）。 HFDを与えられたマウスでは、線条体中のD2Rのプロモーター領域における増強されたDNAメチル化は、強力なDNMT阻害剤である5-アザ-dCによる処理によって標準化された（図２）。 （図.1a）.1ａ）。 対照的に、視床下部におけるＤＸＮＵＭＸＲのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化は、ＸＮＵＭＸ－アザ－ｄＣによる処理によって有意には変化しなかった（図２）。 （図.1f）.1f）。 HFDを20週間与えた12週齢の雄マウスの線条体では、D2RのmRNAおよびタンパク質レベルが有意に減少しました（図。 （Fig.1b、1ｂ、ｋ、ｌ）。 対照的に、ドーパミンＤＸＮＵＭＸ受容体（ＤＸＮＵＭＸＲ、 Drd1これは、アデニリルシクラーゼおよびｃＡＭＰ媒介細胞内シグナル伝達に対してＤＸＮＵＭＸＲとは反対の方法で作用し、変化しなかった（図２）。 （図.1c）.1c）。 さらに、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルでは、ＴＨおよびＤＡＴなどのＤＸＮＵＭＸＲシグナル伝達に関連する他の分子のレベルに変化はなかった（図２）。 （Fig.1d、1ｄ、ｅ、ｋ、ｍ）。 一方、視床下部ではD2Rを含めて明らかな変化は観察されなかった（図2）。 （Fig.1g – m）.1g – m） 特に、視床下部におけるD2RおよびTHのタンパク質レベルは、線条体におけるものよりはるかに低かった（図2）。 （図11、1L、M)視床下部と比較して脳報酬システムにおけるドーパミン受容体シグナル伝達の相対的重要性を反映している可能性がある。
ＤＸＮＵＭＸＲのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化が食餌性脂肪の嗜好性を変えるかどうかを調べるために、ＸＮＵＭＸ−アザ−ｄＣ処置マウスの摂食行動を分析した。 予想通り、2-アザ-dCは、HFDを給餌したマウスの線条体におけるD5RのmRNAおよびタンパク質レベルを有意に増加させた（図3）。 （Fig.1b、1ｂ、ｋ、ｌ）。 一方、のレベルに影響はありませんでした Drd1, Th (NAIST) と Slc6a3 （DATをコード化する）線条体、または Drd2, Drd1、Th (NAIST) と Slc6a3 視床下部に （Fig.1c-e、1c - e、g - m）。 ビヒクル処置マウスはＨＦＤを好んだが、ＨＦＤに対する好みはＸＮＵＭＸ−アザ−ｄＣ処置マウスにおいて有意に減少した（ビヒクル処置マウスの値のＸＮＵＭＸ％）（図２）。 （図.1n）.1n）。 その結果、5-アザ-dCによる治療は体重の増加を減少させました（図2）。 （図11o）
γ-オリザノールはHFD給餌マウスの線条体におけるDNMTのレベルを低下させる
以前に報告したように[14］強制経口投与による雄マウスへのγ−オリザノールの経口投与は、ＨＦＤに対する選択性を著しく弱めた（ビヒクル処置マウスに対する値のＸＮＵＭＸ％）（図２）。 （図2a）、2a）、体重増加の明らかな減弱をもたらす（図2）。 （図.2b）.2b）。 したがって、我々は線条体におけるD2Rのエピジェネティックな調節に対するγ-オリザノールの潜在的な影響を調べた。
哺乳動物には、DNMT1、3a、および3bという3つの主要なDNMTがあります。 DNMT1はDNAのメチル化を維持するように機能し、DNMT3aと3bは新規のDNAメチル化を容易にする役割を果たします。21]。 インビボでのＤＮＭＴに対するγ－オリザノールの潜在的な影響を調べるために、我々は、ＨＦＤを与えられたマウスの脳におけるＤＮＭＴのレベルを評価した。 HFD自体は線条体または視床下部のいずれにおいてもDNMTのmRNAおよびタンパク質レベルに影響を及ぼさなかったが、γ-オリザノールの添加は線条体におけるDNMTのレベルを有意に低下させたが視床下部においては低下させなかった（図1）。 （Fig.2c-e、2c - e、g - i、k - n）。 これらのデータは、γ-オリザノールが線条体特異的な様式でDNMTのレベルを調節し得るという可能性を提起する。 同様に、5-アザ-dCは線条体において優先的にDNMT3aおよび3bのmRNAレベルを有意に減少させた（ESM図3）。 1広告）。
DNMT1のmRNAレベルが、少なくとも部分的には、核内受容体ERRγによって正に調節されていたことを示す以前の研究に基づいて[1]。22］、我々はＥＲＲγ活性に対するγ－オリザノールの潜在的効果を調べた。 活性型ERRγを構成的に発現する非ヒト哺乳動物細胞では、ERRγの強力なインバースアゴニストである4-ヒドロキシタモキシフェンが著しくERRγ活性を低下させた。 注目すべきことに、γ－オリザノールは部分的にＥＲＲγ活性を減少させた（生来値の約ＸＮＵＭＸ％の減少）（図２）。 （図.3a）.3a）。 重要なことに、ＥＲＲγは線条体において高度に発現されたが視床下部においては発現されなかった（図２）。 （Fig.3b – d）.3b - d）。 線条体の状況とは反対に、γ-オリザノールは視床下部においてのみDNMT1のタンパク質レベルを有意に増加させた（図3）。 （Fig.2k、2ｋ、ｌ）。 これらの結果は、少なくとも部分的には、STAT3α、DNMT1レベルの正の調節因子であるという本発明者らの発見によって説明することができた。23]は、視床下部において豊富に発現されたが、線条体においては発現されなかった（図1）。 （図33例えば）。
インビボでのＤＮＭＴの活性に対するγ－オリザノールの影響をさらに評価するために、ＤＮＡメチル化の副産物でありそしてＤＮＭＴの強力な阻害剤でもあるＳＡＨの形成を、ＨＦＤを与えたγ－オリザノール処置マウスにおいて評価した。 HFD給餌マウスと固形飼料給餌マウスとの間で、線条体または視床下部のいずれにおいてもSAH形成に有意な変化はなかった（図1）。 （Fig.2f、2J F）。 注目すべきことに、γ-オリザノールは線条体におけるSAH形成を有意に減少させた（図3）。 （Fig.2f）2f）視床下部にはない（Fig。 （図2j）、2ｊ）、γ−オリザノールは、ＨＦＤ給餌マウスにおいて線条体特異的にＤＮＭＴの活性を抑制し得ることを示唆する。
in vitroでのDNMTに対するγ-オリザノールの阻害特性に関する酵素分析
次に、インビトロでのＤＮＭＴの活性に対するγ－オリザノールの影響を評価した。 ＤＮＭＴに対するγ－オリザノール、フェルラ酸、ＸＮＵＭＸ－アザ－ｄＣ、ハロペリドール（代表的なＤＸＮＵＭＸＲアンタゴニスト）、およびキンピロール（代表的なＤＸＮＵＭＸＲアゴニスト）およびＳＡＨの阻害効力を評価した。 陽性対照として、SAHはDNMTの活性を用量依存的に強く減衰させた（図1）。 （Fig.4a – f）.4a〜f） 予想通り、ハロペリドールとキンピロールはDNMTの活性に影響を及ぼさなかった（ESM Fig。 2） 注目すべきことに、γ-オリザノールはDNMT1（IC 50）の活性を有意に阻害した。50 =3.2μmol/ l）、3a（IC50 =22.3μmol/ l）および3b（最大阻害57％）（図。 （Fig.4d – f）.4d - f）。 対照的に、γ-オリザノールの代謝産物であるフェルラ酸の阻害活性は、γ-オリザノールのそれよりはるかに低かった（図2）。 （図44d - f）。
本発明者らはさらに、ＤＮＭＴに対するγ－オリザノールの阻害特性を調べた。 SAHの形成を測定して、インビトロでDNMTに対するγ-オリザノールの阻害活性を評価した。 DNMTを介したDNAメチル化中のSAH形成に関するデータは、γ-オリザノールの有無にかかわらず、ミカエリス - メンテン速度論の飽和パターンを示しています（図1）。 （Fig.4g – i）.4g – i）。 DNMT1を介したDNAメチル化では、Eadie-Hofstee分析により、γ-オリザノールは、 V マックス SAH形成の割合（ビヒクル、597 pmol / min;γ-オリザノール2μmol/ l、619 pmol / min;γ-オリザノール20μmol/ l、608 pmol / min）、γ-オリザノールは明らかに増加しました K m （ビヒクル、0.47μg/ ml;γ-オリザノール2μmol/ l、0.67μg/ ml;γ-オリザノール20μmol/ l、0.89μg/ ml）（図。 （Fig.4j）.4j）。 これらの結果は、γ－オリザノールがＤＮＭＴＸＮＵＭＸを少なくとも部分的に競合的に阻害することを示唆している。 一方、DNMT1aおよび3bを介したDNAメチル化では、γ-オリザノールは V マックス SAHの形成速度（DNMT3a：ビヒクル、85.3 pmol / min;γ-オリザノール2μmol/ l、63.1 pmol / min;γ-オリザノール20μmol/ l、42.5 pmol / min; DNMT3b：ビヒクル、42.3 pmol / min;γ -オリザノール2μmol/ l; 28.0 pmol / min、γ-オリザノール20μmol/ l、15.0 pmol / min）、同様に、 K m この反応の場合（DNMT3a：ビヒクル、0.0086μg/ ml;γ-オリザノール2μmol/ l、0.0080μg/ ml;γ-オリザノール20μmol/ l、0.0058μg/ ml; DNMT3b：ビヒクル、0.0122μg/ ml;γ-オリザノール2μmol/ l、0.0097μg/ ml;γ-オリザノール20μmol/ l、0.0060μg/ ml）（図。 （Fig.4k、4ｋ、ｌ）。 これらの結果は、γ－オリザノールがＤＮＭＴＸＮＵＭＸａおよびＸＮＵＭＸｂを少なくとも部分的に非競合的に阻害することを示唆している。
γ-オリザノールはHFD給餌マウスの線条体におけるD2Rのレベルを増加させる
我々は次に、γ－オリザノールがＤＮＭＴの阻害を通して線条体ＤＸＮＵＭＸＲ含有量を増加させる可能性を試験した。 HFD給餌マウスでは、γ-オリザノールの経口投与は、D2Rのプロモーター領域における線条体DNAメチル化を有意に減少させた（図3）。 （図5a）、5a）、視床下部ではこれをしなかった（Fig。 （図.5f）.5f）。 これらの発見に従って、ＤＸＮＵＭＸＲのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは相互的に増加した（図２）。 （Fig.5b、5ｂ、ｇ、ｋ、ｌ）。 ＸＮＵＭＸ−アザ−ｄＣによる治療に関するデータと同様である（図２）。 （図1）、1）のＲＮＡおよびタンパク質レベルに対する明らかな影響はなかった。 Drd1, Th (NAIST) と Slc6a3 （DAT）線条体、およびのレベルには影響なし Drd1, Th (NAIST) と Slc6a3 視床下部に （Fig.5c-e、5c - e、h - k、m）。
以前の研究は、ＤＸＮＵＭＸＲおよびＤＮＭＴＸＮＵＭＸのレベルが、少なくとも部分的にＮＦ － κＢを介してＥＲストレスおよび炎症によって調節されることを示している［17, 24, 25]。 したがって、ERストレス関連および炎症関連遺伝子のレベルを調べました。 前述のとおり26ＨＦＤは、ＴＮＦ −αをコードする遺伝子の発現を増加させた。Tnfa）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）（Ccl2）、Ｃ ／ ＥＢＰ相同タンパク質（チョップ）、ERローカライズされたDnaJ 4（ERdj4）（Dnajb9）およびスプライス型のXボックス結合タンパク質1（Xbp1視床下部にはあるが線条体にはない（Fig。 （図.6）.6） 特に、γ-オリザノールを用いたHFDの補給は、の発現増加を有意に減少させた。 Ccl2, チョップ, Dnajb9 (NAIST) と Xbp1 視床下部にのみ存在し、線条体には存在しない（図1）。 （図66).
議論
本研究における主な発見は、γ-オリザノールがマウスの線条体において強力なDNMT阻害剤として作用し、それによって線条体D2Rのエピジェネティックな調節を介してHFDに対する優先性を少なくとも部分的に弱めることである。 HFD給餌マウス由来の線条体では、D2Rのレベルは有意に減少したが、D1R、THおよびDATのレベルは変化しなかった（図２）。 （Fig.1b-e、1b - e、k - m）。 これらのデータは、線条体D2Rの調節不全が、HFDの場合に食物報酬の認識に重要な役割を果たし、肥満動物におけるHFDの快楽な過剰消費をもたらすという考えと一致している。3]。 本研究において、5-アザ-dCによるHFD給餌マウスの治療は、線条体D2Rのレベルを有意に増加させた（図3）。 （Fig.1b、1ｂ、ｋ、ｌ）恐らくはＤＸＮＵＭＸＲのプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化レベルの減少を介してである（図２）。 （図1a）、1その結果、食事性脂肪の嗜好性が弱まりました（図2）。 （図.1n）.1n）。 この所見はまた、HFDの場合の食物報酬の認識における線条体D2Rの重要な役割を支持する。
本発明者らのインビトロアッセイは、ＤＮＭＴに対するγ−オリザノールの阻害活性がその代謝産物フェルラ酸のそれより明らかに強いことを実証した（図３）。 （Fig.4d – f）、4d-f）は、DNMTに対する阻害作用のためのγ-オリザノールの完全構造の重要性を示唆している。 HFD給餌マウスでは、経口投与後、γ-オリザノールは完全な構造として脳に到達し、線条体において優先的にDNMTのレベルと活性を低下させ、その結果としてプロモーター領域のDNAメチル化が低下することが示唆された。線条体のD2R。 さらに、本発明者らのインビトロ研究は、γ－オリザノールがＥＲＲγに対する部分的拮抗薬として作用し、それが主にＤＮＭＴＸＮＵＭＸ産生のための正の調節因子として働くことを実証した［22]、そして結果としてDNMT1の活性を減少させた（図1）。 （図.3a）.3a）。 注目すべきことに、ＥＲＲγはマウスの線条体で高度に発現されたが視床下部では発現されなかった（図２）。 （図.3b）.3b）。 これらのデータは、γ－オリザノールが、少なくとも部分的には、ＥＲＲγの阻害を通して、ＤＮＭＴＸＮＵＭＸのｍＲＮＡレベルを減少させる可能性があることを示唆している。 線条体とは対照的に、γ-オリザノールは、HFDを与えられたマウスからの視床下部におけるD1Rのレベルに効果を示さなかった（図3）。 （Fig.5g、5ｇ、ｋ、ｌ）。
一方、本発明者らは、γ-オリザノールが視床下部においてDNMT1のレベルを有意に増加させるが線条体においては増加させないことを実証した（図1）。 （Fig.2k、2ｋ、ｌ）。 STAT3は悪性Tリンパ腫細胞のDNMT1の含有量を増加させることが示されています。23]。 特に、我々は以前にγ-オリザノールが有意にHFD給餌マウスの視床下部におけるレプチン誘発性STAT3リン酸化を増加させることを実証した。14]。 マウスの視床下部ではSTAT3αが実質的に発現していたが線条体では発現していなかったことにも注意すべきである（図１）。 （Fig.3e – g）.3例えば）。 これらのデータは、視床下部と線条体との間のＤＮＭＴＸＮＵＭＸのレベルに対するγ－オリザノールの効果の明らかな違いが、少なくとも部分的には、マウスの脳におけるＳＴＡＴＸＮＵＭＸαおよびＥＲＲγの領域特異的含有量に起因し得ると推測する。イチジク。 （Fig.3b – g）.3b - g）。 まとめると、マウスでは線条体と視床下部との間にERRγとSTAT3αの発現の相互パターンがあるように思われる。 我々の結果に基づいて、それ故、ERRγ産生が豊富である線条体において、γ-オリザノールは、ERRγの負の調節因子としてのDNMT1のmRNAレベル及び酵素活性を優先的に減少させるかもしれないと推測することは合理的である。 対照的に、STAT3α産生が優勢である視床下部では、γ-オリザノールは優先的にDNMT1のレベルを増加させる可能性があります。
最近の研究は、HFDによって誘発された線条体D2Rシグナル伝達の減弱が摂食行動を調節不全にすることを実証した。3］、肥満治療のための線条体ＤＮＭＴの阻害の潜在的重要性を示唆している。 一方、以前の研究では、特定の視床下部核に発現しているメラノコルチン受容体4遺伝子のDNAメチル化の状態が、黄色黄色マウスの世代を超えた肥満を調節する可能性があることが示されました。27]。 根底にある機序を解明するためにさらなる研究が保証されているが、これらの研究は、HFD誘発性肥満の病態生理学における組織特異的、遺伝子特異的および配列特異的なDNAメチル化の重要性を示唆している。
我々は最近、HFDがマウスの膵島におけるD2Rのレベルを増加させることを報告した。17, 24]。 D2Rのプロモーター領域にはいくつかのNF-κB応答性要素があるため、そのような増大は、少なくとも部分的には、ERストレスおよびNF-κBを介した炎症によって媒介されると考えられる。17, 24]。 さらに、最近の研究では、TNF-αとIL-1βがHFD給餌マウスの脂肪組織におけるDNMT1のレベルと活性を増加させることが示されました。25]。 重要なことに、本研究は、ＨＦＤが視床下部において優先的にＥＲストレスおよび炎症を誘導したが線条体においては誘導しなかったことを実証した（図２）。 （図.6）.6） 我々の実験的パラダイムにおける組織、領域および部位特異的DNAメチル化および脱メチル化の詳細なメカニズムはさらなる研究を待たなければならない。
γ-オリザノールがマウスの小胞体ストレスの視床下部調節を介してHFDに対する嗜好性を減弱させることを示す我々の以前の報告と合わせて[14］ γ－オリザノールはまた、快楽的および代謝的な摂食行動の調節異常の両方を改善するという独特の性質を表す。 開発されているいくつかの抗肥満薬は重大な有害作用を引き起こすことが知られているからです。8]、肥満 - 糖尿病症候群を安全に治療するために、脳の報酬システムへの自然の食物ベースのアプローチが期待されています。16]。 このパラダイムでは、γ-オリザノールはエピジェネティックモジュレーターであるという明確な性質を持つ有望な抗肥満薬候補です。
謝辞
原稿のレビューをしてくださったS. Okamoto（日本の琉球大学）に感謝します。 秘書の支援をしてくださった平田正雄、金城英雄、阿里I.、野口C.（琉球大学）に感謝いたします。
略語
| 5-アザ-dC | 5-アザ-2'-デオキシシチジン |
| D1R | ドーパミンD1受容体 |
| D2R | ドーパミンD2受容体 |
| DAT | ドーパミントランスポーター |
| DNMT | DNAメチルトランスフェラーゼ |
| ER | 小胞体 |
| ERR | エストロゲン関連受容体 |
| HFD | 高脂肪食 |
| SAH | S- アデノシル-1-ホモシステイン |
| SAM | S- アデノシルメチオニン |
| STAT3α | シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子3α |
| TH | チロシンヒドロキシラーゼ |
Notes
データ可用性
本研究中に生成および／または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する作者から入手可能である。
資金調達
この作品の一部は、学術振興会からの助成金（JSPS; KAKENHI助成金番号15K19520および24591338）、科学技術イノベーション評議会（CSTI）、省庁間戦略的イノベーション促進プログラムによって支援されました。 （SIP）「次世代の農林水産業創出技術」、ロッテ財団、応用酵素科学振興財団、新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）、ライフサイエンスネットワーク形成プロジェクト（製薬分野） ）（沖縄県、沖縄県）、および沖縄県からの高度医療推進のための助成金（沖縄県、日本）の助成を受けています。
関心のある二元性
著者らはこの原稿に関連する興味の二重性はないと宣言しています。
寄付明細書
CKとHMが研究をデザインしました。 CKとTKが実験を行い、データを分析した。 TK、CS-O、CT、MT、MM、およびKAは、データの解釈に貢献しました。 CKとHMが原稿を書きました。 全著者がデータ解釈に貢献した。 すべての著者は原稿の改訂に参加し、その最終版を承認しました。 HMは、この作業の保証人であり、すべてのデータに完全にアクセスでき、データの完全性とデータ分析の正確性について全責任を負います。
参考情報