Dopamine D2-receptoren in verslaving-achtige beloningsstoornissen en dwangmatig eten bij obese ratten (2010)

Commentaar: Deze studie toont aan dat wanneer een dier onbeperkt toegang krijgt, een sterke natuurlijke bekrachtiger (zeer stimulerende voeding) een afname van D2-receptoren kan veroorzaken. Deze afname werd bij bijna alle ratten waargenomen en trad vrij snel op. Toen "zeer smakelijk" voer werd verwijderd, weigerden de ratten normaal voer te eten. De ratten bleven binge (wanneer ze konden) ondanks het koppelen van elektrische schokken met de "zeer smakelijke" voedselconsumptie.

• Volledige studie

Nat Neurosci. 2010 mei; 13(5): 635-641. Gepubliceerd online 2010 maart 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstract

We ontdekten dat de ontwikkeling van obesitas gepaard ging met de opkomst van een steeds ernstiger tekort aan neurale respons op de beloning. Vergelijkbare veranderingen in beloning homeostase geïnduceerd door cocaïne of heroïne worden als cruciaal beschouwd om de overgang van casual naar compulsief drugsgebruik te bewerkstelligen. Dienovereenkomstig detecteerden we dwangmatig voedingsgedrag bij obese maar niet magere ratten, gemeten als eetbare voedselconsumptie die resistent was tegen verstoring door een aversieve geconditioneerde stimulus. Striatal dopamine D2-receptoren (D2R's) werden verlaagd in obese ratten, zoals is gemeld bij mensen die verslaafd zijn aan geneesmiddelen. Bovendien versnelde door lentivirus gemedieerde knockdown van striatale D2R's snel de ontwikkeling van verslavings-achtige beloningsstoornissen en het begin van compulsief-achtig voedsel zoeken bij ratten met uitgebreide toegang tot smakelijk vetrijk voedsel. Deze gegevens tonen aan dat overconsumptie van smakelijk voedsel verslaving-achtige neuroadaptieve reacties in hersenkartonkringen triggert en de ontwikkeling van dwangmatig eten stimuleert. Veel voorkomende hedonieme mechanismen kunnen daarom ten grondslag liggen aan obesitas en drugsverslaving.

Introductie

Voeding wordt beïnvloed door plezier en beloning, en het verkrijgen van voedselbeloningen kan consumptie krachtig motiveren1, 2. Desalniettemin blijven de hedonische mechanismen die bijdragen aan obesitas nog steeds slecht begrepen. Bij hyperfagische mensen met aangeboren leptinedeficiëntie neemt de activiteit in het dorsale en ventrale striatum, die kerncomponenten zijn van hersenbeloningscircuits aanzienlijk toe als reactie op beelden van voedsel3, en leptinesubstitutietherapie verzwakt zowel de striatale activiteit als de zelfgerapporteerde 'smaak' van voedsel3. . Dit suggereert dat het striatum belangrijk is in hedonische aspecten van voedingsgedrag. Onlangs werd aangetoond dat activering van het striatum als reactie op zeer smakelijk voedsel bij zwaarlijvige personen wordt afgestompt in vergelijking met magere controles. Bovendien zijn hypofunctie van het dorsale striatum en gewichtstoename op de lange termijn het meest uitgesproken bij personen met het TaqIA-allel van de DRD4-ANKK2-genlocus, wat resulteert in een verminderde striatale D1R-expressie en waarvan is aangetoond dat het individuen vatbaar maakt voor afhankelijkheidsstoornissen2, 4. Deze en soortgelijke waarnemingen hebben geleid tot het voorstel dat tekorten in de verwerking van beloningen een belangrijke risicofactor kunnen zijn voor de ontwikkeling van obesitas, en dat zwaarlijvige personen dwangmatig smakelijk voedsel kunnen consumeren om te compenseren voor hyposensitiviteit van beloningen5. Het is met name onduidelijk of tekorten in de verwerking van beloningen constitutief zijn en voorafgaan aan obesitas, of dat overmatige consumptie van smakelijk voedsel beloningsstoornissen kan veroorzaken en daardoor kan bijdragen aan door voeding geïnduceerde obesitas.

Een bepalend kenmerk van mensen met overgewicht en obesitas is dat ze blijven te veel eten, ondanks de bekende negatieve gezondheids- en sociale gevolgen. Veel mensen met overgewicht drukken inderdaad de wens uit om hun voedselconsumptie te beperken, maar worstelen om hun inname te beheersen en herhaaldelijk te consumeren buiten hun energievereisten 7, 8. Ontwikkeling van voedingsgedrag dat ongevoelig is voor een negatieve uitkomst is analoog aan het dwangmatige drugsgebruik dat wordt waargenomen bij verslaafden aan mensen, dat evenzo ongevoelig is voor negatieve gevolgen9. Hier hebben we de effecten van uitgebreide toegang tot een smakelijk vetrijk dieet onderzocht op de gevoeligheid van hersenbeloningssystemen bij ratten. We onderzochten ook het verband tussen door voeding veroorzaakte hedonische ontregeling en de opkomst van het zoeken naar dwangvoeding. Ten slotte onderzochten we de rol van striatale D2R's in deze verslavingsachtige gedragsreacties.

Verslaving-achtige beloningstekorten bij obese ratten

Om de effecten van beperkte of uitgebreide toegang tot een smakelijk vetrijk dieet te testen, hebben we mannelijke Wistar-ratten (300-350 g) voorbereid met een bipolaire stimulerende elektrode in de laterale hypothalamus en ze gedurende 10-14 dagen getraind in een discrete trial. huidige drempelwaarde voor hersenstimulatiebeloning (BSR) totdat stabiele beloningsdrempels zijn vastgesteld 4. In de BSR-procedure reageren ratten krachtig om belonende elektrische zelfstimulatie te verkrijgen via de inwonende stimulerende elektrode, met de minimale stimulatie-intensiteit die zelfstimulatiegedrag handhaaft, de beloningsdrempel. Omdat beloningsdrempels gedurende lange tijd stabiel en ongewijzigd blijven onder basislijnomstandigheden, biedt deze procedure een gevoelige maatstaf voor het reactievermogen van hersenbeloningssystemen. Na het vaststellen van stabiele BSR-drempels (gedefinieerd als <10% variatie in drempels over drie opeenvolgende sessies), hebben we ratten toegewezen aan drie groepen die geen verschillen vertoonden in gemiddelde lichaamsgewichten of beloningsdrempels tussen groepen. De drie groepen kregen gedifferentieerd toegang tot een 'cafetaria-achtig' dieet dat bestond uit smakelijk, energierijk voedsel dat direct beschikbaar was voor menselijke consumptie (zie Online methoden). Ratten hadden 10 uur (ratten met alleen voer; n = 0), 9 uur (ratten met beperkte toegang; n = 1) of 11-18 uur (ratten met uitgebreide toegang; n = 23) toegang tot het dieet per dag gedurende 11 opeenvolgende dagen. Van cafetariadiëten is bekend dat ze resulteren in door voeding veroorzaakte obesitas bij ratten40. Alle ratten hadden ook ad libitum toegang tot standaard laboratoriumvoer, waarbij beloningsdrempels, gewichtstoename en calorie-inname overal werden geregistreerd.

Het gewicht nam aanzienlijk toe bij ratten met uitgebreide toegang tot het dieet van de cafetaria in vergelijking met de chow-only of groepen met beperkte toegang (Fig. 1a). Gewicht nam ook de neiging toe te nemen in de ratten met beperkte toegang in vergelijking met alleen ratten, maar dit effect bereikte geen statistische significantie. De ontwikkeling van obesitas bij ratten met verlengde toegang was nauw verbonden met een verslechtering van het tekort aan hersenenbeloningsfunctie, weerspiegeld in progressief verhoogde BSR-drempels (Fig. 1b). Omdat er geen verschillen in responslatenties voor BSR werden waargenomen tussen de drie groepen (aanvullend Fig. 1), kunnen tekorten in gedragsprestaties geen verklaring bieden voor deze waarneming. Vergelijkbare tekortkomingen in de functie van hersenbeloning zijn gerapporteerd bij ratten met uitgebreide maar niet-beperkte toegang tot intraveneuze cocaïne- of heroïneautoriteiten 12, 13, 14. Zo kan uitgebreide toegang tot smakelijk vetrijk voedsel leiden tot verslavingsproblemen in de beloningsfunctie van de hersenen, beschouwd als een belangrijke bron van motivatie die overeten kan veroorzaken en kan bijdragen aan de ontwikkeling van obesitas 1, 6.

Figuur 1: Gewichtstoename en beloningsdisfunctie bij ratten met uitgebreide toegang tot een cafetariadieet.

(a) Gemiddelde (± sem) gewichtstoename bij ratten met alleen chow, beperkte toegang en uitgebreide toegang (toegang × daginteractie: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met groep met alleen voer, post-hoc-test). (b) Gemiddelde (± sem) procentuele verandering ten opzichte van de baseline beloningsdrempels (toegang × tijdinteractie: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test).

Toen we het voedingsgedrag in detail onderzochten (figuur 2), ontdekten we dat de totale dagelijkse calorie-inname vergelijkbaar was tussen chow-only en ratten met beperkte toegang (figuur 2a, d). Daarentegen was de totale calorie-inname bij ratten met uitgebreide toegang bijna tweemaal zo groot als die van de ratten met beperkte toegang en alleen voer (Fig. 2a, d). Hoewel de ratten met beperkte toegang en chow-only ongeveer dezelfde dagelijkse calorie-inname (Fig. 2a, d) behielden, verkregen ratten met beperkte toegang slechts ~ 33% van hun dagelijkse calorieën uit voer (Fig. 2b, d), wat aangeeft dat ze ontwikkelden een vreetachtig eetgedrag en consumeerden ~ 66% van hun dagelijkse calorie-inname tijdens hun 1 h-toegangssessie tot de cafetaria diet15 (Fig. 2d). Ratten met verlengde toegang verkregen slechts een kleine fractie (~ 5%) van hun totale calorie-inname van voer (Fig. 2b); ze gebruikten bijna uitsluitend het cafetariadieet (afb. 2d). De verschuiving in voedingsvoorkeur in de groepen met beperkte toegang en verlengde toegang werd ook weerspiegeld in een opmerkelijke toename van de vetinname vergeleken met ratten die alleen voer waren (Fig. 2c en Aanvullend Fig. 2). In overeenstemming met eerdere rapporten16 was er een tendens dat de consumptie van het cafetariadieet na verloop van tijd zou afnemen in de ratten met verlengde toegang. Dit kan een weerspiegeling zijn van de ontwikkeling van tolerantie voor de smakelijkheid van de voedselproducten die in de loop van de tijd worden verstrekt als onderdeel van het dieet van de cafetaria. Desalniettemin bleef de voorkeur voor het cafetariadieet versus standaardvoer constant hoog in deze ratten (aanvullend Fig. 3). Deze gegevens tonen aan dat uitgebreide maar niet-beperkte toegang tot een smakelijk vetrijk dieet leidt tot verslavingsbeloningen, te veel eten en verlies van homeostatische energiebalans. De beperkte toegang tot smakelijk voedsel leidt daarentegen tot eetbuienachtige consumptiepatronen, maar verstoort de homeostatische energiebalans en de functie van de hersenen niet. Het is echter mogelijk dat beperkte toegang tot het cafetariadieet voor meer dan 40 opeenvolgende dagen zou leiden tot aanzienlijke gewichtstoename en verstoring van de hersenbeloningsfunctie.

Figuur 2: Consumptiepatronen bij ratten met uitgebreide toegang tot een cafetariadieet.

(a) Gemiddelde (± sem) dagelijkse calorie-inname bij ratten met alleen chow, beperkte toegang en uitgebreide toegang (toegang: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tijd: F18,324 = 7.8, P <0.0001; toegang × tijdinteractie: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test). (b) Gemiddelde dagelijkse calorie-inname (± sem) van chow (toegang: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tijd: F18,504 = 5.9, P <0.0001; toegang × tijdinteractie: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test). (c) Gemiddelde dagelijkse calorie-inname (± sem) uit vet (toegang: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tijd: F18,486 = 8.8, P <0.0001; toegang × tijdinteractie: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test). (d) Vergelijking van de gemiddelde (± sem) totale calorie-inname en calorieën die uitsluitend via chow worden geconsumeerd, gedurende de volledige toegangsperiode van 40 dagen (toegang: F2,54 = 25.0, P <0.0001; caloriebron: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; toegang × interactie caloriebron: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 vergeleken met het totaal aantal calorieën in de groep die alleen voer, ### P <0.001 vergeleken met het totaal aantal calorieën in de zelfde groep ratten, post hoc test).

Na 40 dagen kregen ratten geen toegang meer tot het smakelijke dieet, maar bleven ze ad libitum toegang tot standaard laboratoriumvoer. We beoordeelden dagelijks beloningsdrempels en voerconsumptie tijdens deze afgedwongen 'onthoudingsperiode'. De verhogingen van de beloningsdrempels hielden gedurende minstens 2 weken aan bij de ratten met uitgebreide toegang toen ze geen toegang meer hadden tot het smakelijke dieet (Fig. 3a). Dit staat in contrast met de relatief voorbijgaande (~ 48 uur) tekorten in de beloningsfunctie die worden gerapporteerd bij ratten die onthouding van zelf-toegediende cocaïne ondergaan. Er was ook een duidelijke afname van de calorie-inname (figuur 13b) en een geleidelijke afname van het lichaamsgewicht (figuur 3c) bij ratten met verlengde toegang, en in mindere mate bij ratten met beperkte toegang, tijdens deze periode van onthouding, consistent met eerdere rapporten3, 11. Na 15 dagen onthouding werden ratten gedood en werden elektrodeplaatsingen bepaald door cresylvioletkleuring (Fig. 14d).

Figuur 3: Aanhoudende beloningsdisfunctie en hypofagie tijdens abstinentie bij ratten met uitgebreide toegang tot een cafetariadieet.

(a) Gemiddelde procentuele verandering ten opzichte van de baseline beloningsdrempels (± sem) tijdens onthouding van een smakelijk vetrijk dieet (toegang: F2,112 = 3.7, P <0.05; tijd: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test). (b) Gemiddelde calorie-inname (± sem) op de laatste dag van toegang tot het vetrijke dieet (basislijn) en tijdens de 14 dagen van onthouding wanneer alleen standaardvoer beschikbaar was (toegang: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tijd: F6,168 = 65.6, P <0.0001; toegang × tijdinteractie: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met alleen-voer-groep, post-hoc-test). (c) Verandering in gemiddeld lichaamsgewicht (± sem) vergeleken met lichaamsgewicht op de laatste dag van toegang tot het vetrijke dieet (basislijn) en tijdens de 14 dagen van onthouding wanneer alleen standaardvoer beschikbaar was (toegang: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tijd: F7,126 = 3.1, P <0.01; toegang × tijdinteractie: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 vergeleken met alleen-chow-groep, post-hoc-test). (d) Histologische reconstructie van de locatie van BSR-stimulerende elektroden in de laterale hypothalamus van chow-only (driehoeken), beperkt toegankelijke (vierkanten) en extended-access (cirkels) ratten.

Striatal D2R's bij obese ratten: rol in beloningsstoornissen

Vervolgens hebben we de hypothese getest dat overconsumptie van een smakelijk cafetariadieet de striatale D2R-dichtheid zou kunnen verminderen, wat zou bijdragen aan de ontwikkeling van verslaving-achtige beloningshyposensitiviteit. Een nieuw cohort van ratten met alleen voer, ratten met beperkte toegang en ratten met uitgebreide toegang kregen toegang tot het cafetariadieet totdat er een statistisch significante toename van het lichaamsgewicht was bij de ratten met uitgebreide toegang in vergelijking met de groep met alleen voer (P <0.05, 4 ; Afb. 70a). Striatale expressie van de naar verluidt sterk geglycosyleerde (~ 2 kDa) membraangebonden vorm van de D4R was lager bij de ratten met uitgebreide toegang dan bij de ratten met beperkte toegang of alleen voer (Fig. 2b; zie online methoden). Toen we de ratten in elke toegangsgroep verdeelden in twee subgroepen op basis van een mediane verdeling van lichaamsgewichten (licht of zwaar), vonden we een duidelijk omgekeerd verband tussen lichaamsgewicht en striatale D4R-expressie (figuur 39a, c). We hebben geen statistisch significante afnames in de expressie van de niet-geglycosyleerde onvolgroeide (~ 51 kDa) en tussentijdse geglycosyleerde cytoplasmatische (~ 2 kDa) vormen van de D4R (aanvullende figuur 17) 2 gedetecteerd, wat aangeeft dat striatale DXNUMXR-expressie bij ratten met verlengde toegang waarschijnlijk is gereguleerd door post-transcriptionele mechanismen.

Figuur 4: Gewichtstoename is omgekeerd evenredig met striatale D2R-niveaus.

(a) Chow-only ratten, ratten met beperkte toegang en uitgebreide toegang werden onderverdeeld in twee groepen per toegangsconditie op basis van een gemiddelde verdeling van lichaamsgewichten: licht (L) of zwaar (H). (b) Het volledige striatale complex werd verzameld van alle ratten en D2R-niveaus in elke groep gemeten door western blotting. De membraangeassocieerde D2R-band werd ontbonden bij 70 kDa en de eiwitlaadcontrole wordt hieronder weergegeven (β-actine, 43 kDa). Immunoblots van volledige lengte worden getoond in aanvullende figuur 12. (c) Relatieve hoeveelheden D2R in het striatum van ratten met alleen voer, beperkte toegang en uitgebreide toegang werden gekwantificeerd door densitometrie (F2,6 = 5.2, 0.05, P <0.05, 0.01, belangrijkste effect van toegang; * P <XNUMX en ** P <XNUMX vergeleken met alleen-chow-L-groep).

Vervolgens, om de functionele relevantie van door voeding geïnduceerde reducties in striatale D2R tot hersenbeloningsfunctie te testen, hebben we een lentivirale vector ontworpen en gevalideerd om een ​​kort haarspeldinterfererend RNA (shRNA) af te geven om D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 en aanvullende afbeelding 5). Beloningsdrempels begonnen te stijgen bij ratten die behandeld werden met Lenti-D2Rsh bijna onmiddellijk nadat ze uitgebreide toegang hadden gekregen tot het cafetariadieet, terwijl beloningsdrempels onveranderd bleven in ratten met verlengde toegang die behandeld werden met een lege lentivirusvector (Lenti-controle) gedurende de relatief korte periode toegang tot het cafetariadieet (14 d; Fig. 6a). Responslatenties waren ongewijzigd in beide groepen ratten, wat aantoont dat dit effect niet secundair was aan tekorten in taakprestaties (aanvullend Fig. 6). Beloningsdrempels waren ook ongewijzigd bij ratten die werden behandeld met Lenti-D2Rsh of Lenti-controle die in dezelfde periode alleen toegang hadden tot chow (Fig. 6b).

Drempels bleven aanhoudend verhoogd tijdens een extra 15 d van onthouding toen alle ratten alleen toegang hadden tot standaard voer (supplementaire afbeelding 7). Knockdown van striatale D2R verhoogde daarom de kwetsbaarheid voor door voeding geïnduceerde beloningshypofunctie, maar veranderde de basislijnactiviteit van hersenbeloningssystemen niet.

Figuur 5: Lentivirus-gemedieerde knockdown van striatale D2R-expressie.

(a) Grafische weergave van de striatale gebieden waarin Lenti-D2Rsh tot overexpressie werd gebracht. Groene cirkels in de linker striatale hemisfeer geven de locaties aan waarop virale infusies waren gericht. Groene kleuring in de rechter striatale hemisfeer is een representatieve immunochemische kleuring voor groen fluorescerend eiwit (GFP) uit de hersenen van een Lenti-D2Rsh-rat. (b) Representatieve immunoblot van de verminderde D2R-expressie in het striatum van Lenti-D2Rsh-ratten. Immunoblots van volledige lengte worden getoond in aanvullende figuur 13. (c) Relatieve hoeveelheden D2R in het striatum van Lenti-controle en Lenti-D2Rsh-ratten, gekwantificeerd door densitometrie (* P <0.05, 2 vergeleken met de Lenti-controlegroep, post-hoc-test ). (d) Infectie van gliacellen in het striatum door de Lenti-D2Rsh-vector werd niet gedetecteerd. Groene kleuring is GFP van een virus; rood is de astrocyt marker glia fibrillair zuur proteïne (GFAP); celkernen worden gemarkeerd door DAPI-kleuring in blauw. Witte pijlen geven een gelokaliseerd gebied van gliosis aan dat alleen wordt aangetroffen op de plaats van virusinjectie in het striatum en niet in de omliggende weefsels waarin het virus is verspreid. Zelfs in dit gebied is geen van de astrocyten GFP-positief. De gele pijlen in de vergrote afbeelding markeren de typische GFP-negatieve astrocyten die werden gedetecteerd. (e) Hoge niveaus van neuronale infectie in het striatum door de Lenti-D2Rsh-vector. Groene kleuring is GFP van een virus; rood is de neuronale nucleaire marker NeuN; celkernen worden gemarkeerd door DAPI-kleuring in blauw. De gele pijlen in het vergrote beeld markeren GFP-positieve en NeuN-positieve neuronen in het striatum. (f) Een afbeelding met een sterkere vergroting van een viraal geïnfecteerd (GFP-positief) neuron in het striatum van Lenti-DXNUMXRsh-ratten dat de typische morfologische kenmerken van middelgrote stekelige neuronen vertoont.

Figuur 6: Knockdown van striatum D2R verhoogt de kwetsbaarheid voor beloningsdisfunctie bij ratten met uitgebreide toegang tot een cafetariadieet.

(a) Gemiddelde (± sem) procentuele verandering ten opzichte van de baseline beloningsdrempels bij Lenti-control en Lenti-D2Rsh-ratten die 14 opeenvolgende dagen uitgebreide toegang hadden tot het cafetariadieet (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tijd: F13,156 = 2.2, P <0.05; interactie met virus × tijd: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, interactie-effect). (b) Gemiddelde (± sem) procentuele verandering ten opzichte van de baseline beloningsdrempels bij Lenti-control en Lenti-D2Rsh-ratten die alleen toegang hadden tot voer. (c) Gemiddelde (± sem) calorie-inname van ratten gedurende 14 dagen alleen voer of uitgebreide toegang (toegang: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Gemiddelde (± sem) gewichtstoename tijdens 14 dagen alleen voer of uitgebreide toegang (toegang: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, hoofdeffect van toegang).

We ontdekten dat calorie-inname (Fig. 6c) en gewichtstoename (Fig. 6d) vergelijkbaar waren in de Lenti-D2Rsh en overeenkomstige Lenti-controlegroepen onder chow-only of extended-access condities (Aanvullende Figuren 8 en 9). Aldus veranderde de striatale D2R knockdown niet de voorkeur voor het cafetariadieet noch de totale calorie-inname wanneer het smakelijke voedsel vrij beschikbaar was voor consumptie.

Dwangmatig eten bij obese ratten: rol voor striatum D2R

Vervolgens hebben we de hypothese getest dat dwangmatig eten zou kunnen optreden bij ratten met uitgebreide toegang tot het cafetariadieet en dat tekorten in striatale D2R-signalering kunnen bijdragen aan dit effect. Een nieuw cohort van ratten met alleen voer, ratten met beperkte toegang en ratten met uitgebreide toegang kregen> 40 dagen toegang tot het cafetariadieet totdat statistisch significante gewichtstoenames optraden bij de verlengde ratten (P <0.05, 30 vergeleken met ratten met alleen voer; gegevens niet getoond). Alle drie groepen ratten kregen vervolgens slechts 5 minuten per dag toegang tot het cafetariadieet gedurende 7–10 dagen in een operatiekamer totdat een stabiele inname was bereikt (gedefinieerd als <7% variatie in dagelijkse inname). De helft van de ratten in elke toegangsconditie werd vervolgens blootgesteld aan een lichte (geconditioneerde stimulus) die gepaard ging met het toedienen van voetschokken (gestrafte groep), terwijl de resterende ratten in elke groep werden blootgesteld aan het cue-licht in afwezigheid van voetschok ). Op de testdag onderzochten we de effecten van alleen cue-lichtblootstelling op smakelijke voedselconsumptie (afb. 30; zie online methoden). We ontdekten dat de gemiddelde calorie-inname tijdens de 7 minuten durende baseline-sessies hoger was bij de ratten met alleen voer en beperkte toegang dan bij de ratten met uitgebreide toegang (Fig. 30a, b). Dit suggereert dat de ratten die alleen chowen en ratten met beperkte toegang bingen op het smakelijke voedsel tijdens de intermitterende toegangssessies van 40 minuten, weerspiegeld in het feit dat deze ratten ~ 50-100% van hun dagelijkse calorie-inname consumeerden, meestal ~ 7 kCal, tijdens deze sessies (Fig. 40a, b). Daarentegen lijken ratten met uitgebreide toegang resistent te zijn tegen het ontwikkelen van dit eetbui-achtige voedingsgedrag, misschien omdat hun geschiedenis van bijna onbeperkte toegang tot het smakelijke voedsel gedurende> 7 opeenvolgende dagen vaste eetpatronen heeft vastgesteld die relatief onbuigzaam waren om te veranderen. Op de testdag hebben we geen statistisch significante effecten waargenomen van cue light replay op voedselconsumptie bij de ongestrafte ratten van de chow-only, beperkt toegankelijke of extended-access groepen in vergelijking met inname tijdens de basislijnperiode (figuur 7a). Het cue light alleen had daarom geen motiverende saillantie. Bij gestrafte ratten verminderde het shock-gepaarde cue-licht de smakelijke voedselopname aanzienlijk bij de ratten die alleen chow en beperkt toegankelijk waren. Het cue-licht had echter geen effect op de smakelijke voedselopname bij ratten met uitgebreide toegang, wat aantoont dat hun consumptie ongevoelig was voor aversieve omgevingsfactoren die tegenslag voorspelden. De energie-inname bij baseline bij de ratten met verlengde toegang was lager dan die in de andere groepen. Omdat de voeropname tijdens vergelijkbare perioden echter veel lager was (Fig. 18d), is het onwaarschijnlijk dat dit een 'vloereffect' vertegenwoordigt dat onze bevindingen vertroebelt. Samen ondersteunen onze gegevens het idee dat dwangmatig eetgedrag kan opduiken bij ratten met uitgebreide toegang op een manier die analoog is aan het dwangmatig gebruik van cocaïne bij ratten met een geschiedenis van uitgebreide toegang tot het medicijn.

Figuur 7: Op een dwangmatige manier reageren op smakelijke voeding.

(a) Gemiddelde (± sem) smakelijke dieetconsumptie bij ongestrafte ratten tijdens de basissessies van 30 minuten en op de testdag waarop ratten werden blootgesteld aan een neutraal geconditioneerde stimulus die niet eerder gepaard was gegaan met een schadelijke voetschok (toegang: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 vergeleken met ratten met alleen voer). (b) Gemiddelde (± sem) smakelijke dieetconsumptie bij gestrafte ratten tijdens de basissessies van 30 minuten en op de testdag waarop ratten werden blootgesteld aan een geconditioneerde stimulus die eerder gepaard ging met een schadelijke voetschok (toegang: F2,21 = 3.9 , P <0.05; cue: F1,21 = 8.6, P <0.01; toegang × cue-interactie: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 vergeleken met inname tijdens de baseline-sessie, #P <0.05 vergeleken met ratten met alleen voer). (c) Gemiddelde (± sem) smakelijke dieetconsumptie tijdens de basissessies van 30 minuten en op de testdag bij Lenti-controle- en Lenti-D2Rsh-ratten die voorheen alleen eten of uitgebreide toegang hadden tot een cafetariadieet (cue: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 vergeleken met inname tijdens de baseline-sessies, post-hoctest). (d) Gemiddelde (± sem) voerconsumptie tijdens de basissessies van 2 minuten en op de testdag bij Lenti-controle- en Lenti-D1,26Rsh-ratten die voorheen alleen voer hadden of uitgebreide toegang tot een cafetariadieet (cue: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX vergeleken met inname tijdens de baseline-sessies, post-hoc-test).

Ten slotte onderzochten we de effecten van de straf-gepaarde geconditioneerde stimulus op de voedselinname bij de Lenti-controle en Lenti-D2Rsh-ratten die voorheen alleen toegang hadden tot voer of uitgebreide toegang tot het cafetariadieet (ratten uit figuur 6). We ontdekten dat de smakelijke voedselinname bij aanvang tijdens de basissessies van 30 minuten vergelijkbaar hoog was (~ 40 kCal) in alle vier de groepen (Fig. 7c). Bovendien was de totale dagelijkse consumptie van voer (in de thuiskooi) vergelijkbaar tussen alle vier groepen ratten tijdens de conditioneringssessies en op de testdag (aanvullende figuur 10). De 14 dagen van eerdere toegang tot het cafetariadieet was daarom niet voldoende om eetbui-achtig eetgedrag te blokkeren op een manier die vergelijkbaar is met die bij ratten die> 40 dagen uitgebreide toegang tot het cafetariadieet hadden (figuur 7a, b). De aversieve cue-lichtstimulus verstoorde de smakelijke voedselopname bij Lenti-control en Lenti-D2Rsh-ratten die voorheen alleen toegang hadden tot voer (Fig. 7c). Evenzo verstoorde de aversieve geconditioneerde stimulus de smakelijke voedselopname bij de Lenti-controleratten die eerder 14 dagen lang toegang hadden tot het cafetariadieet. Daarentegen had de aversieve geconditioneerde stimulus geen invloed op de smakelijke voedselconsumptie bij de Lenti-D2Rsh-ratten die voorheen 14 dagen lang toegang hadden tot het cafetariadieet (Fig. 7c). BSR-drempels bleven significant verhoogd bij deze ratten wanneer ze 48 uur na de testsessie werden geregistreerd, terwijl drempels stabiel en ongewijzigd bleven in de andere drie groepen ratten

(Aanvullende afbeelding 11). Om te verifiëren dat de weerstand tegen geconditioneerde stimulus-geïnduceerde onderdrukking van eetbare voedselopname in de Lenti-D2Rsh extended-access ratten niet secundair was aan stoornissen in klassieke conditioneringsprocessen, testten we de effecten van de aversieve geconditioneerde stimulus op consumptie van minder smakelijk standaardvoer in alle vier groepen ratten. In tegenstelling tot de binge-achtige consumptie van smakelijk voedsel, vonden we dat alle vier de groepen ratten weinig voer consumeerden (~ 2 kCal) tijdens de 30 min baselinesessies (Fig. 7d) en dat de voerinname in alle vier de groepen werd verstoord door een vergelijkbare magnitude na blootstelling aan de aversieve geconditioneerde stimulus (Fig. 7d). Deze gegevens tonen aan dat de knockdown van striatale D2R's de opkomst van het dwangmatig eten van eetbaar voedsel opmerkelijk versnelde, maar alleen bij ratten met een geschiedenis van uitgebreide toegang. Bovendien, omdat dwangmatig eten alleen werd gedetecteerd in Lenti-D2Rsh ratten die verhoogde BSR-drempels hadden, kan door voeding geïnduceerde beloningshypofunctie een noodzakelijk antecedent zijn voor het ontstaan ​​van dwangmatig voedsel zoeken.

Discussie

Gemakkelijke toegang tot smakelijk vetrijk voedsel wordt beschouwd als een belangrijke milieurisicofactor voor obesitas19. We vonden dat uitgebreide toegang tot een zeer smakelijk cafetarieachtig dieet resulteerde in overeten en gewichtstoename in combinatie met toenemende BSR-drempels bij ratten. Dit effect op BSR-drempels kan worden verklaard door de responsiviteit van hersen-beloningscircuits geleidelijk af te bouwen, een interpretatie die consistent is met het feit dat voedselbeperking en gewichtsverlies 20 kunnen verhogen, terwijl een acute overvoeding kortstondig 21 kan verlagen en reageert op BSR bij ratten. Deze bevinding is een uitbreiding van het werk waaruit blijkt dat acuut overvoeren van ratten via een intragastrische voedingsslang 21 en maaguitzetting of intraveneuze glucagoninfusie die postprandiale verzadiging nabootst, 22, 23, 24, de respons voor het belonen van laterale hypothalamische BSR vermindert en de aversie-achtige reacties op de stimulation25. Eerder werk heeft ook aangetoond dat herhaaldelijk dwangvoeding van ratten door intra-gastrische buizen totdat hun gewicht is toegenomen met ~ 200 g op vergelijkbare wijze de reactiesnelheid voor BSR verlaagt, een effect dat aanhoudt totdat het lichaamsgewicht 23 heeft genormaliseerd. Zoals in deze bevindingen bij ratten, werd het reageren bij katten op laterale hypothalamische BSR geremd door eerdere voeding met verzadiging26, wat aantoont dat interacties tussen functie van de hersenen en de metabolische toestand worden behouden en dus waarschijnlijk ook bij de mens voorkomen. Gemak van toegang en consequente overeten van cafetaria-achtige diëten bij mensen wordt beschouwd als een belangrijke bijdrage van het milieu aan de huidige obesitas-epidemie in westerse samenlevingen 19. Onze gegevens laten zien dat beloninghypofunctie ontstaat bij ratten die vrijwillig een smakelijk cafetariadiëet gebruiken dat vergelijkbaar is met het dieet dat mensen consumeren en dat dit effect steeds slechter wordt naarmate ze meer gewicht krijgen. Met name hadden alle ratten met beloningsdrempelverhogingen ≥ 20% BSR-elektroden binnen ~ 500 μm van de fornix dorsolateraal gelokaliseerd. De gevoeligheid van beloningsgerelateerde neuronen in dit gebied wordt verhoogd door voedselbeperking op een manier die gevoelig is voor het van vet afgeleide hormoon leptine, en dit hersengebied wordt beschouwd als een belangrijk substraat voor voedselbeloning27. De hersencircuits die voedsel-hedonics reguleren, worden daarom geremd door het plaatsen van signalen die verzadiging voorspellen, consistent met recente menselijke beeldvormingsstudies die aantonen dat maag-distentie28 en het van de ingewanden afgeleide postprandiale factorpeptide YY3-36 (PYY) 29 de activiteit van hersengebieden moduleren betrokken bij beloningsverwerking. Bovendien worden beloningssystemen ook geremd door overmatige gewichtstoename. Recente rapporten geven aan dat circulerend leptine, een belangrijke regulator van energiebalans, in hersenweefsel kan doordringen en de activiteit van beloningscircuits 3, 27, 30 en 31 kan remmen.

Beloningstekorten bij ratten met overgewicht kunnen een weerspiegeling zijn van contra-adaptieve dalingen in de basisgevoeligheid van beloningscircuits in de hersenen om hun overstimulatie door smakelijk voedsel tegen te gaan. Een dergelijke door het dieet geïnduceerde hypofunctie van de beloning kan bijdragen aan de ontwikkeling van obesitas door de motivatie te vergroten om 'obesogene' diëten met hoge beloningen te consumeren om deze staat van negatieve beloning te vermijden of te verlichten6, 32. Dit zou de hypofagie kunnen verklaren die we hebben waargenomen bij uitgebreide toegang ratten en in mindere mate bij ratten met beperkte toegang wanneer het smakelijke voedsel werd teruggetrokken en alleen het minder smakelijke voer beschikbaar was. Een dergelijk scenario is ook consistent met gegevens uit beeldvormingsstudies van de menselijke hersenen waarin afgestompte activering van het striatum als reactie op zeer smakelijk voedsel, vooral bij personen met genetische polymorfismen waarvan wordt aangenomen dat ze striatale D2R-expressie verminderen, wordt geassocieerd met gewichtstoename op de lange termijn. Het was onduidelijk of een dergelijke hyposensitiviteit van de beloning bij zwaarlijvige personen zich manifesteert vóór de ontwikkeling van zwaarlijvigheid en uitsluitend verband houdt met genetische factoren ('beloningsdeficiëntiesyndroom') of dat overeten de verwerking van beloningen kan verstoren. Onze gegevens tonen aan dat uitgebreide toegang tot smakelijk, energierijk voedsel en daaropvolgend te veel eten de gevoeligheid beloont en daarom een ​​belangrijk hedonisch mechanisme kan vertegenwoordigen dat de ontwikkeling van obesitas bevordert. Een soortgelijke beloningsdisfunctie als hier gerapporteerd bij zwaarlijvige ratten wordt ook gedetecteerd bij ratten met een geschiedenis van uitgebreide toegang tot intraveneuze cocaïne of heroïne zelftoediening, maar niet bij mensen met een geschiedenis van beperkte toegang4, 12, 13. Bovendien is de overgang van Er is voorgesteld dat het incidenteel tot dwangmatig zoeken naar drugs het resultaat is van een poging om de aanhoudende toestand van verminderde beloning te verlichten die wordt veroorzaakt door deze door drugs veroorzaakte beloningsstoornis14, 12, 32. Onze gegevens geven dus aan dat obesitas en drugsverslaving onderliggende hedonische mechanismen kunnen delen.

De downregulatie van striatale D2R-expressie is een opmerkelijke neuroadaptieve reactie op overconsumptie van smakelijk voedsel. Inderdaad, verminderingen in striatale D2R-dichtheid worden waargenomen bij personen met overgewicht 4, 34 en knaagdieren35, 36. Omgekeerd hebben personen met anorexia nervosa een verhoogde striatale D2R37 en gewichtsverlies bij obese personen na een bariatrische (gastric bypass) operatie is geassocieerd met een verhoogde striatale D2R density28. Het gen polymorfisme aangeduid als het TaqIA A1 allel resulteert in verminderde striatale D2R dichtheid, en individuen die dit allel herbergen zijn oververtegenwoordigd in obese populaties 4. Het TaqIA-allel verhoogt ook de kwetsbaarheid voor alcohol, opioïde en psychomotorische stimulantverslaving38. Reducties in striatale D2R-densiteit die optreedt door constitutieve genetische factoren of als gevolg van te veel eten, kunnen daarom bijdragen aan de neurobiologische mechanismen van obesitas. We vonden dat striatale niveaus van de 70 kDa D2R isovorm, waarvan wordt aangenomen dat ze de membraan-geassocieerde D2R weerspiegelen, omgekeerd evenredig waren aan het lichaamsgewicht bij ratten uit de chow-only, restricted-access en extended-access groups (Fig. 4). Knockdown van striatale D2R-expressie, het meest prominent in het dorsolaterale striatum (Fig. 5), veroorzaakte dat de BSR-drempels bijna onmiddellijk toenamen na blootstelling aan het cafetariadieet. Afnames in striatale D2R-expressie versnelden daarom snel de opkomst van beloningshypofunctie bij ratten met uitgebreide toegang tot zeer smakelijk voedsel, een bevinding die consistent was met beeldvormingsgegevens van menselijke hersenen die aangeven dat tekorten in striatale D2R-dichtheid bijdragen aan beloningshypofunctie bij obese individuen4.

Drie kenmerken van de Lenti-D2Rsh-ratten zijn ook opmerkelijk. Ten eerste, hoewel striatale D2R knock-down gecombineerd met uitgebreide toegang tot het smakelijke dieet resulteerde in het verhogen van de BSR-drempels, waren er geen verschillen in calorie-inname of gewichtstoename bij deze ratten vergeleken met controleratten. Dit zou kunnen wijzen op het feit dat ratten alleen 14 d hadden van toegang tot het cafetariadieet; langere perioden van toegang zouden in de loop van de tijd kunnen resulteren in een hogere gewichtstoename, vergelijkbaar met de hogere gevoeligheid voor gewichtstoename bij mensen met tekorten in striatale D2R-signalering4. Het voordeel van het beperken van de toegang tot het cafetariadieet tot alleen 14 d is echter dat de knockdown-ratten met uitgebreide toegang als enige groep verhoogde BSR-drempels vertoonden, en dit stelde ons in staat om de potentiële rol van beloningshypofunctie in de ontwikkeling van dwangmatig te beoordelen eten (zie hieronder). Ten tweede bleven de BSR-drempels stabiel en onveranderd in de knockdown-ratten die alleen toegang tot het voer hadden. Dit geeft aan dat verlaagde striatale D2R-expressie alleen niet voldoende was om hypogevoeligheid voor beloning te induceren; in plaats daarvan leek het in wisselwerking te staan ​​met overconsumptie van smakelijk voedsel om de opkomst van deze toestand van verminderde beloningsgevoeligheid te versnellen. Andere adaptieve responsen in hersen-beloningscircuits kunnen daarom leiden tot beloning van hypogevoeligheid bij ratten met uitgebreide toegang tot het cafetariadieet. Met dit in ons achterhoofd merken we dat de D2R-agonist bromocriptine de circulerende niveaus van leptine39 verlaagt, en leptine remt de voeding ten minste gedeeltelijk door de striatale gebieden die de hedonische responsen op voedsel 3, 30 en 31 controleren te remmen. Het is dus mogelijk dat downregulatie van striatale D2R als reactie op het verhogen van het lichaamsgewicht de leptinesignalering verhoogt en daardoor de remmende effecten van deze adipokine op de beloningssystemen van de hersenen verhoogt. Tot slot merken we dat we onze lentivirus-vectoren richtten op het dorsolaterale striatum. Dit was primair om technische redenen, omdat laterale plaatsing van canules voor virusafgifte in het striatum ons ook in staat stelde om de inwonende hypothalamus stimulerende elektrode geschikt te maken voor BSR drempelbepaling. Het is dus mogelijk dat targeting van D2R's voor knockdown in andere gebieden van het striatum, met name de dorsomediale en ventrale gebieden (nucleus accumbens core en shell), verhoogde BSR-drempels zou kunnen hebben, zelfs in de afwezigheid van het smakelijke dieet.

Het dorsolaterale striatum is sterk betrokken bij het leren van het type stimulusresponsgewoonten, zoals weerspiegeld in de ontwikkeling van consumptiegedrag dat ongevoelig is voor devaluatie door voorafgaande voeding tot verzadiging of door te paren met schadelijke stimuli. Door ons voornamelijk op het dorsolaterale striatum te richten, zouden we populaties van D40R's kunnen hebben uitgeschakeld die de kwetsbaarheid van de rat voor de ontwikkeling van dwangmatig eten reguleren. In overeenstemming met een rol voor striatale D2R's bij dwangmatig gedrag, wordt het TaqIA-allel van de menselijke DRD2-ANKK2-genlocus - wat resulteert in een lage striatale D1R-dichtheid2, striatale activering in reactie op smakelijk voedsel5 en verhoogt het de kwetsbaarheid voor obesitas4 - wordt ook geassocieerd met tekortkomingen bij het leren vermijden van acties met negatieve gevolgen4. Verlies van remmende controle over gedrag dat een negatief resultaat kan hebben, is een kenmerkend kenmerk van zowel zwaarlijvigheid als drugsverslaving, waarbij consumptiegedrag aanhoudt ondanks negatieve sociale, gezondheids- of financiële gevolgen. Cocaïne-gebruik bij ratten met een voorgeschiedenis van uitgebreide medicijninname kan inflexibel worden en resistent tegen verstoring door een aversieve geconditioneerde stimulus die een negatief resultaat voorspelt (voetschok) 41. Evenzo zullen muizen die voorheen toegang hadden tot een smakelijk, vetrijk dieet, meer tijd doorbrengen in een aversieve omgeving (helder verlicht) om het smakelijke voedsel te verkrijgen dan muizen die geen ervaring hadden met het dieet18. We ontdekten dat smakelijke voedselconsumptie bij ratten met uitgebreide toegang tot het cafetariadieet op dezelfde manier ongevoelig was voor een aversieve geconditioneerde stimulus. In overeenstemming met een rol voor striatale D42R's in dit effect, werd dwangmatig eten gevonden bij de striatale D2R knockdown-ratten die voorheen 2 dagen uitgebreide toegang hadden tot het cafetariadieet, maar niet in de controlegroepen. Vanuit een neurocircuitperspectief zou uitgebreide toegang tot smakelijk voedsel kunnen leiden tot plasticiteit in corticostriatale routes, waardoor dieren kwetsbaarder worden voor de ontwikkeling van compulsief gedrag, met tekorten in striatale D14R-signalering die dit proces versterken. Inderdaad, verminderde striatale D2R-dichtheid bij obese personen is gecorreleerd met een verminderd metabolisme in prefrontale en orbitofrontale corticale gebieden die remmende controle over gedrag uitoefenen.

Met name werd dwangmatig eten van smakelijk voedsel alleen gedetecteerd in de knockdown-ratten die eerder uitgebreide toegang hadden tot het cafetariadieet, niet in controle-ratten die gedurende dezelfde periode uitgebreid toegang hadden tot het cafetariadieet, noch in knockdown-ratten die chow-only toegang. Het belangrijkste verschil tussen de knockdown-ratten met eerder uitgebreide toegang en de andere groepen was hun aanhoudend verhoogde BSR-drempels. Dit kan een weerspiegeling zijn van de gemeenschappelijke neurobiologische oorsprong van beloningshypofunctie en de opkomst van dwangmatig eten, die in de tijd samenvallende maar onafhankelijke verschijnselen zijn. Als alternatief kan door voeding geïnduceerde beloningshypofunctie dienen als een substraat voor negatieve versterking dat de ontwikkeling van compulsief-achtige etenswaren 14, 32 en 33 vergemakkelijkt. Wat de onderliggende mechanismen ook zijn, onze bevindingen tonen aan dat verslaving-achtige dwangmatige reacties op eetbaar voedsel kunnen ontstaan ​​bij obese ratten, en aangeven dat tekorten in striatale D2R-signalering de kwetsbaarheid voor de ontwikkeling van dit gedrag vergroten.

Samengevat vonden we dat overstimulering van hersenbeloningssystemen door overmatige consumptie van smakelijk, energierijk voedsel een diepe staat van beloning veroorzaakt, hypogevoeligheid en de ontwikkeling van dwangmatig eten. Deze onaangepaste gedragsreacties bij obese ratten komen waarschijnlijk voort uit door het dieet teweeggebrachte tekorten in striatale D2R-signalering. Overconsumptie van drugs van misbruik verlaagt op vergelijkbare wijze de striatale D2R-dichtheid, induceert een diepe staat van beloning-hypofunctie en veroorzaakt het verschijnen van dwangmatig achtig druggebruik. Onze bevindingen ondersteunen daarom eerdere werk4, 19, 42, 45, 46, 47 in het aangeven dat obesitas en drugsverslaving kunnen voortkomen uit soortgelijke neuroadaptieve responsen in hersen-beloningscircuits.

Methoden

Rats.

Mannelijke Wistar-ratten die 300-350 g wogen bij het begin van de experimenten werden verkregen van Charles River. Bij aankomst werden de ratten individueel gehuisvest bij constante temperatuur op een 12-h licht-donkercyclus (lichten aan bij 2200 h). Ratten kregen ad libitum toegang tot standaard laboratoriumvoer en water voor de duur van het experiment. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Scripps Florida, en ratten werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen uiteengezet door de National Institutes of Health met betrekking tot de principes van dierenverzorging.

Chirurgische procedures.

Ratten bereid met BSR-stimulerende elektroden werden eerst verdoofd door inhalatie van 1-3% isofluraan in zuurstof en gepositioneerd in een stereotaxisch frame (Kopf). Bipolaire BSR-elektroden (11 mm lang) werden geïmplanteerd in de laterale laterale hypothalamus (anteroposterior, -0.5 mm van bregma; mediolateral, ± 1.7 mm van middellijn; dorsoventral, 8.3 mm van dura; snijtandbalk was aangepast tot 5 mm boven de interaurale lijn ) 47. Ratten die virusinjecties ontvingen werden ook bereid met bilaterale geleidecanules (23-gauge, 14 mm lang) gepositioneerd boven het striatum (anteroposterior, 2.8 mm van bregma; mediolateral, ± 3.1 mm vanaf de middellijn; dorsoventral, -2.4 mm van dura) 48 en gevuld met 14-mm-styletten. Vier roestvrijstalen schedeschroeven en dentaal acryl hielden de elektrode en de canules op hun plaats. De chirurgische wond werd behandeld met plaatselijk antibioticum eenmaal elke 12 h voor 5 d na de operatie. Ratten mochten 7-10 d herstellen van een operatie en werden vervolgens getraind in de BSR-drempelprocedure.

BSR-procedure.

Ratten werden getraind om te reageren op BSR-stimulatie volgens een discrete-test stroomdrempelprocedure vergelijkbaar met die elders beschreven10, 14. In het kort werden BSR-stroomniveaus gevarieerd in afwisselende aflopende en oplopende series in 5-μA-stappen. In elke testsessie werden vier afwisselende aflopende / opgaande series gepresenteerd. De drempel voor elke reeks werd gedefinieerd als het middelpunt tussen twee opeenvolgende stroomsterkten waarvoor ratten reageerden in ten minste drie van de vijf proeven en twee opeenvolgende stroomsterkten waarvoor ratten niet reageerden in drie of meer van de vijf proeven. De algemene drempel van de sessie werd gedefinieerd als het gemiddelde van de drempels voor de vier individuele reeksen. Elke testsessie had een duur van ongeveer 30 min. Stabiele BSR-drempels werden gedefinieerd als ≤10% variatie in drempels over 5 opeenvolgende dagen, meestal vastgesteld na 10-14 van training. De reactatielatentie voor elke testsessie werd gedefinieerd als de gemiddelde responslatentie van alle onderzoeken gedurende welke een positieve respons optrad.

Virale verpakking en levering.

Kort haarspeld-RNA werd afgeleverd en constitutief tot expressie gebracht met behulp van het pRNAT-U6.2 / Lenti-vectorsysteem (GenScript). Virale deeltjes werden bereid volgens het protocol van de fabrikant. In het kort werden HEK 293FT-cellen getransfecteerd met een vector die het shRNA-insert bevat (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ') of de lege vector, plus ViraPower Packaging Mix na 72 uur (Invitrogen) vervangen gedurende 24 uur (medium) (Invitrogen). Supernatant werd vervolgens verzameld en geconcentreerd door middel van ultracentrifugatie (76,755 g, Beckman Coulter SW 32 TI rotor., 90 min, 4 ° C) en de virale titer werd bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering volgens de instructies van de fabrikant. Virus werd in porties verdeeld en tot gebruik bewaard in lichtbeschermde dozen bij -80 ° C.

Ratten met stabiele BSR-drempels ontvingen bilaterale virale injecties op drie plaatsen in het striatum van elke hersenhelft (2 μl per injectie, 1 μl min-1, 1 min tussen injecties, in totaal zes injecties per rat). Aan ratten werd ten minste 2-3 d herstel van intrastriatale injecties toegestaan ​​voordat de BSR-drempelbeoordeling werd hervat. Dagelijkse beoordeling van de BSR-drempelwaarde vervolgde voor 33 d na virusinjecties om te zorgen voor maximale striatale D2R knockdown werd bereikt voordat ratten toegang kregen tot het cafetariadieet. Er waren geen verschillen in BSR-drempels tussen de Lenti-controle en Lenti-D2Rsh-ratten tijdens deze 33 d (gegevens niet getoond).

Immunoblotting.

Ratten werden ongeveer 1 uur na hun reguliere toegang tot het cafetariadieet gedood en de hersenen werden snel verwijderd. Hersensecties van ~ 1-2 mm dikte werden bereid met behulp van een coronale hersenmatrix (1-mm plakinterval; Plastics One) op een ijsblok en weefselstansen van dorsaal striatum (bregma: ~ 2.2 tot -0.26 mm) werden genomen. Striatale weefselponsen werden snel verzameld, snel bevroren en bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Afzonderlijke monsters werden ontdooid op ijs en gelijke hoeveelheden striataal weefsel werden gepoold op basis van een gewichtsafhankelijke mediane verdeling van toegangsgroepen (7-10 ratten per verzameling). Weefsel werd geresuspendeerd in 500 μl ijskoude RIPA-buffer (Thermo Scientific) die natriumorthovanadaat, fosfatase-cocktailinhibitoren 1 en 2 (Sigma-Aldrich), leupeptine en pepstatine bevat voorafgaand aan homogenisatie. Weefselysaten werden gekookt voor 10 min in monsterbuffer en geladen op 4% -20% of 10% Tris-glycine SDS-gels (Invitrogen). Eiwit werd overgebracht op nitrocellulosemembranen, geblokkeerd voor 1 h bij ~ 23-25 ° C (5% niet-vette droge melk en 0.2% Tween-20 in PBS, pH 7.4), en overnacht geïncubeerd in primair antilichaam bij 4 ° C. De volgende primaire antilichamen werden in blokoplossing verdund: monoklonaal D2R-muis (Santa Cruz, 1: 100) of monoklonaal ß-actine-muis (Santa Cruz, 1: 200). Chemiluminescent ECL-reagens werd toegevoegd na incubatie met met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen (Amersham, 1: 2,000). De volwassen membraangeassocieerde vorm van D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 werd genormaliseerd naar een eiwitbeladingscontrole (ß-actine; 43 kDa) en gekwantificeerd door densitometrie met behulp van NIH Image J-software.

Immunochemische analyse.

Ratten werden geanesthetiseerd en transcardiaal geperfundeerd met 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.6). Hersenen werden verwijderd, gedurende de nacht gefixeerd en opgeslagen in sucrose (30% oplossing in PBS, pH 7.4) gedurende ten minste 72 h. Bevroren weefselcoupes (30 μm dikte) werden verzameld uit een microtoom en geblokkeerd (3% BSA, 5% normaal geitenserum en 0.3% Triton X-100 in PBS) voor 1 h bij ~ 23-25 ° C. De volgende primaire antilichamen werden aan de blokoplossing toegevoegd en een nacht bij 4 ° C geïncubeerd: polyklonale kip tegen GFP (Abcam, 1: 1,000); monoklonaal konijn aan GFAP (Millipore, 1: 1,000); muis monoklonaal naar NeuN (Millipore, 1: 1,000). Secties werden geïncubeerd met fluorescent-kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen bij ~ 23-25 ° C: anti-kip-488-nm kleurstof (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), anti-konijn-594-nm kleurstof (Invitrogen, 1: 1,000 ) en anti-muis-594-nm kleurstof (Invitrogen, 1: 1000). Secties werden gemonteerd met Vectashield-montagemedia die DAPI (Vector Labs) bevatten en dekglaasjes kregen. Beelden werden genomen met behulp van een Olympus BX61-fluorescentiemicroscoop (x XUMENTO-objectief) of een Olympus-confocale microscoop (x XUMXX- en × 2-doelstellingen).

Voer procedure.

Ratten werden individueel gehuisvest op papieren beddengoed (alfablokjes, Shepherd Specialty Papers) om te voorkomen dat voedselproducten werden bevuild met losse beddingmaterialen. Het cafetariadieet bestond uit spek, worst, cheesecake, pondcake, glazuur en chocolade, die individueel werden gewogen voordat ze beschikbaar werden gemaakt voor de ratten. De voedingsproducten voor het cafetariadion werden in kleine metalen houders afgeleverd. Alle voedselproducten, inclusief standaard laboratoriumvoer, werden opnieuw gewogen na voltooiing van de voersessie. De calorie-inname van de verschillende macronutriënten werd berekend met behulp van de voedingsinformatie die door de fabrikant werd verstrekt.

Door cue geïnduceerde onderdrukking van voedingsgedrag.

Voedingsprocedures vonden plaats in geluidgedempte operante kamers die qua afmetingen identiek waren aan die gebruikt in de BSR-experimenten. Ratten werden in een operatiekamer geplaatst en hadden gedurende 30 minuten toegang tot het cafetariadieet of voer. De voedingsproducten werden geleverd in kleine metalen bakjes. Alle voedselproducten werden gewogen voor en na voedersessies, die werden uitgevoerd tijdens de normale voederperiode van de ratten. De consumptie van het voer werd bepaald door consumptie van 45 mg voerpellets die qua samenstelling identiek waren aan het voer dat in de huiskooien van de ratten werd verstrekt. Ratten kregen vervolgens 30 minuten per dag toegang tot het cafetariadieet totdat een stabiele inname was bereikt (gedefinieerd als <10% variatie in dagelijkse inname), waarvoor 5–7 dagen nodig waren. Na stabilisatie van de smakelijke voedselopname tijdens deze basislijnperiode, werden ratten in elke toegangsconditie toegewezen aan twee groepen: gestraft (degenen die voetschok kregen) en ongestraft (die geen voetschok ontvingen). Ratten werden vervolgens onderworpen aan vier conditioneringssessies op opeenvolgende dagen in dezelfde operatiekamer waarin ze voorheen toegang hadden tot het smakelijke voedsel. Tijdens de conditioneringssessies van 30 minuten werd een cue-lampje (geconditioneerde stimulus) 10 minuten geactiveerd, 10 minuten uitgeschakeld en vervolgens 10 minuten weer ingeschakeld. Gestrafte ratten kregen alleen voetschokken tijdens de presentatie van het cue-licht (0.5 mA gedurende 1.0 s; 10 stimulaties met intervallen van ~ 1 minuut). De ongestrafte ratten werden op dezelfde manier met het keu-licht aangeboden, maar zonder de afgifte van een voetschok. Op de testdag, de dag na de laatste conditioneringssessie, ontvingen ratten in de gestrafte groepen intermitterende voetschokken (vijf stimulaties in totaal) gepaard met activering van het cue-licht gedurende 5 minuten. De ongestrafte ratten werden opnieuw blootgesteld aan het keu-licht in afwezigheid van voetschokken. Na de strafperiode van 5 minuten kregen alle ratten toegang tot het smakelijke voedsel voor een sessie van 30 minuten waarbij de geconditioneerde stimulus met tussenpozen werd geactiveerd (10 minuten cue-licht aan, 10 minuten cue-licht uit, 10 minuten cue-licht aan).

Statistische analyse.

Beloningsdrempels voor de basislijn werden gedefinieerd als de gemiddelde drempelwaarde voor de 5 d voor toegang tot het cafetariadieet voor elk onderwerp. Beloningsdrempels werden uitgedrukt als de procentuele verandering ten opzichte van de basislijndrempelwaarde. Gegevens over het percentage basislijnbeloningsdrempelwaarden, gewichtstoename, calorieverbruik en calorieverbruik door vet werden geanalyseerd met behulp van tweevoudige, herhaalde variantie-analyse, met toegang (alleen voer, beperkte toegang of uitgebreide toegang), calorische bron ( standaard dieet voor chow of cafetaria), virus (Lenti-control of Lenti-D2Rsh) en cue (gekoppeld of ongepaard met straf) als de between-subjects-factoren en tijd als de within-subjects-factor. Indien van toepassing werden de hoofdeffecten in de variantieanalyses verder geanalyseerd door post-hoc-testen van Bonferroni. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism-software.

Referenties

Referenties

Correspondentie met:

· Paul J Kenny ([e-mail beveiligd])