Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 april; 300 (4): R876-R884.
Online gepubliceerd 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstract
We hebben eerder gemeld dat toediening van insuline in de boogvormige kern van de hypothalamus de motivatie voor sucrose vermindert, beoordeeld door een zelftoedieningstaak, bij ratten. Omdat het patroon van activatie van het centrale zenuwstelsel (CZS) in combinatie met sucrose zelftoediening niet is geëvalueerd, hebben we in de huidige studie de expressie van c-Fos gemeten als een index van neuronale activering. We trainden ratten om te barsten voor sucrose, volgens een schema met vaste verhoudingen (FR) of progressieve ratio (PR) en in kaart gebrachte expressie van c-Fos immunoreactiviteit in het CNS, vergeleken met c-Fos-expressie in behandelde controles. We observeerden een unieke expressie van c-Fos in de mediale hypothalamus (de boogvormige, paraventriculaire, retrochiasmatische, dorsomediale en ventromediale kernen) in samenhang met het begin van PR-prestaties en expressie van c-Fos in de laterale hypothalamus en de bedkern van stria terminalis in verband met het begin van FR-prestaties. c-Fos-expressie was verhoogd in de nucleus accumbens van zowel FR- als PR-ratten. Onze studie benadrukt het belang van zowel hypothalame energiehomeostasiscircuits als limbische circuits bij het uitvoeren van een voedselbeloningstaak. Gezien de rol van de mediale hypothalamus in de regulatie van de energiebalans, suggereert onze studie dat dit circuit kan bijdragen aan beloningsregelgeving binnen de bredere context van energiehomeostase.
het mesolimbische dopaminerge (DA) -circuit, inclusief het ventrale tegmentale gebied (VTA) en projecties naar het striatum en corticale plaatsen, is geïdentificeerd als een cruciale rol spelen in de motiverende of belonen aspecten van vele klassen van drugs van misbruik (13, 22-24, 26, 48). Recent onderzoek van ons laboratorium en anderen suggereert dat dit circuit ook een belangrijke rol speelt in de motiverende of belonende aspecten van voedsel. Functionele en anatomische interactie met schakelingen die energiehomeostase reguleert, wordt gesuggereerd door berichten over de modulatie van voedselbeloning door de voedingsstatus van dieren (10, 14, 16, 43). Modulatie van beloning, inclusief beloning van eten, door voedingswaarde of metabole status, wordt sterk beïnvloed door neurale en endocriene signalen, waaronder insuline (15), leptine (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melanine-concentrerend hormoon (MCH) (45) en orexin (5, 7): de aanwezigheid van receptoren, de biochemische en cellulaire werkzaamheid en de in vivo of gedragsmatige werkzaamheid van deze signalen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de afgelopen jaren overvloedig aangetoond.
Het verlengde limbische circuit heeft eveneens een rol gespeeld bij voeder- en voedselbeloning (2, 19, 28). Er zijn echter aanvullende bijdragende CNS-sites. Met name is de laterale hypothalamus (LH) al lang bekend als een site die voedings- en zelfstimulatiegedrag medieert (4, 31). Orexinergische neuronen en leptine signalering in de LH zijn geïdentificeerd als belangrijk voor voeder- en voedselbeloning (5, 29, 30). Onlangs hebben we vastgesteld dat insuline die ofwel in de derde hersenventrikel ofwel in de boogvormige kern van de hypothalamus (ARC) werd toegediend, de zelftoediening van sucrose kon verminderen, maar insulinetoediening in de VTA of nucleus accumbens had geen effect op dit specifieke beloningsparadigma (15). Het lijkt er dus op dat meerdere hypothalamische sites een belangrijke rol kunnen spelen bij gemotiveerde voedselzoektocht en -verwerving, en in overeenstemming daarmee zou men kunnen veronderstellen dat hypothalamische regio's substantieel worden geactiveerd in combinatie met voedselzelfbestuur. Om deze hypothese te testen, hebben we de c-Fos-expressie in het CZS van ratten die getraind zijn in een sucrose zelf-toedieningsmodel, na een training met vaste verhoudingen (FR) of na een training met progressieve ratio's (PR) in kaart gebracht, een strengere taak voor het beoordelen van de motivatie (20).
MATERIALEN EN METHODES
Onderwerpen.
De proefpersonen waren mannelijke albinoratten (325-425 g) van Simonsen (Gilroy, CA). Ratten werden ad libitum op voer gehouden. Ze werden onderhouden op een 12: 12-uurs licht-donkercyclus met lichten aan om 6 uur en werden getraind en getest tussen 7 uur en XNUMX uur, in de postprandiale en postabsorptieve toestand. Alle procedures die op de ratten werden uitgevoerd, volgden de richtlijnen van de National Institutes of Health voor dierenverzorging en werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Subcommissie van de Research and Development Committee van het VA Puget Sound Health Care System.
Sucrose zelftoediening.
De procedures waren gebaseerd op onze gepubliceerde methodologie (15) en werden uitgevoerd op gevoede ratten. Het experiment omvatte drie fasen: autoshaping om training te starten, FR-training en progressieve ratio's (PR) training met behulp van het PR-algoritme van Richardson en Roberts (38). Het PR-algoritme vereist 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999 ( enz.) hendeltje drukt op opeenvolgende beloningsleveringen binnen een sessie (38). Ratten werden getraind om zelf 5% sucrose (0.5 ml beloning) toegediend in een houder voor vloeistofdruppels toe te dienen. De operant boxes, bestuurd door een Med Associates (Georgia, VT) -systeem, hadden twee hendels, maar slechts één hendel (een actieve, intrekbare hendel) activeerde de infusiepomp. Drukken op de andere hendel (een inactieve, stationaire hendel) werden ook opgenomen. Zoals we eerder hebben waargenomen, was het aantal keren dat de inactieve hendel werd ingedrukt erg laag (minder dan 10-persen / sessie). De sucrose-oplossing werd afgeleverd in een vloeistof-druppel-houder voor orale consumptie (Med Associates, St. Albans, VT). De initiële training werd uitgevoerd tijdens 1-h-sessies onder een continu versterkingsschema (FR1: elke hendelpers was versterkt). Elke sessie begon met het invoegen van de actieve hendel en de verlichting van een wit huislicht dat gedurende de hele sessie aan bleef. Een 5-s toon (2900 Hz, 20 dB boven de achtergrond) en licht (7.5 W wit licht boven de actieve hendel) discrete samengestelde keu ging elke beloning af, met een 20-s time-out beginnend met de sucrose-afgifte. FR-training werd uitgevoerd voor 10-dagen; stabiel reageren wordt bereikt door de vijfde sessie. PR-training werd uitgevoerd voor een maximaal mogelijke 3 h / dag voor 10-dagen. PR-sessies beëindigd nadat 30 min. Geen actieve hendelpers reageerde, waarna het huislampje automatisch werd uitgeschakeld en de actieve hendel werd ingetrokken; ratten werden uit de kamers gehaald en teruggebracht naar hun huiskooien. "Stoptijd" gemeld in Tabel 2 staat voor de tijd waarop het systeem werd uitgeschakeld; daarom zou de laatste actieve hendelpers 30 min vóór de eindtijd zijn opgetreden. Gedragsgegevens (Tabel 2) vertegenwoordigen gemiddelden van sessies 6-10 voor FR-training, en sessies 1-9 voor PR-training. Met controle behandelde ratten werden uit de behuizingskamer gehaald en geplaatst in een schone operante kamer met huislicht voor 60 min, in de procedurekamer, om de hanteer- en kamerbelevingen van de ratten zelf-toedienende sucrose te simuleren. Ze kregen niets te eten of te drinken terwijl ze in de operante dozen waren en hadden geen toegang tot hendels.
Op de laatste dag werden de ratten volgens trainingsdagen in de kamers geplaatst en 90 minuten in de kamers gehouden, waarna ze werden verwijderd voor anesthesie, perfusie en daaropvolgende immunohistochemie. Controleratten werden eveneens in de behandelkamer gebracht en gedurende 90 minuten in een schone operatiekamer gehouden, zoals per trainingsdagen, waarna ze werden verdoofd en geperfuseerd. Onmiddellijk na die laatste sessie van 90 minuten werden ratten diep verdoofd met isofluraaninhalatie en geperfuseerd met 0.9% NaCl gevolgd door koude 4% paraformaldehyde-oplossing. De timing voor anesthesie en euthanasie was gebaseerd op het bekende tijdsverloop van piekexpressie van c-Fos-eiwit 90-120 minuten na de gebeurtenis. De expressie van c-Fos zou dus de activering van het CZS bij het begin van de gedragstaak weerspiegelen, in plaats van het resultaat te zijn van het ervaren van de taak door de dieren en het opnemen van sucrose. Hersenen werden verwijderd en enkele dagen later in paraformaldehyde gefixeerd; vervolgens werden ze vervolgens in 20% sucrose-PBS geplaatst, waarna ze in 30% sucrose-PBS-oplossing werden geplaatst. Hersenen werden doorgesneden op een cryostaat (Leica CM 3050S cryostaat) voor immunohistochemie.
c-Fos immunohistochemie en kwantificatie.
We gebruikten onze gevestigde methodologie om het immuunreactieve c-Fos-eiwit in hersencoupes te kwantificeren (12). Het eerste kwalitatieve scherm van de gehele hersenen werd uitgevoerd voor expressie van c-Fos. In dia's gemonteerde 12-μm whole-brain coronale secties werden 3 keer gewassen in PBS (Oxoid, Hampshire, VK). Secties werden vervolgens geblokkeerd voor 1 h bij kamertemperatuur in PBS met 5% normaal geiten- of ezelserum. Secties werden vervolgens meerdere keren in PBS gewassen en een nacht bij 4 ° C geïncubeerd in primaire antilichaamoplossingen die in PBS waren opgemaakt. Secties werden driemaal in PBS gewassen en vervolgens in het donker bij kamertemperatuur in secundaire antilichaamoplossing in PBS voor 1 h geïncubeerd. Secties werden vervolgens opnieuw gewassen in PBS en gemonteerd en bedekt gleed in Vectashield hard set-montage medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) monteermedium. Digitale afbeeldingen van secties werden verkregen met behulp van een Nikon Eclipse E-800 fluorescentiemicroscoop verbonden met een Optiphot-camera en met Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) -software.
Vervolgens hebben we ons gericht op een beperkt aantal gebieden met een duidelijk verschil tussen de omstandigheden, voor kwantificering en voor neuronale fenotypering. In het bijzonder hebben we ons gericht op nucleus accumbens core en shell (NAc); nucleus anterior and posterior bed van stria terminalis (aBNST, pBNST); mediale hypothalamische gebieden [ventromediale nucleus (VMH), dorsomediale hypothalamus (DMH), paraventriculaire nucleus (PVN), retrochiasmatic area (RCh) en ARC]; laterale hypothalamus (LH), inclusief dorsale en ventrale regio's en het periforni- sche (peF) gebied; VTA; hersenstam [inferior olive, hypoglossal (nXII) nucleus van het solitary tract, lateral reticular nucleus, en C1 / A1 adrenaline / noradrenaline kernen]. Atlas-overeenkomende 12-μm secties werden geëvalueerd op c-Fos expressie en kwantificatie in gematchte secties en regio's, gebaseerd op de atlas van Paxinos en Watson (34). Alsjeblieft zie Tabel 1 voor specifieke stereotaxische coördinaten. De primaire focus van de testen was om elke gedragstaak te vergelijken met de respectieve controle (PR versus PRC; FR versus FRC). Om mogelijke verschillen op basis van gedrag versus controlecondities te optimaliseren, werden piekpresteerders uit de PR- en FR-groepen geselecteerd voor analyse. Aldus werden 4 / 12 PR- en 3 / 12 FR-ratten geanalyseerd: deze ratten hadden actief hefboompersnummer (het primaire gedragseindpunt) dat groter was dan één standaardafwijking boven het gemiddelde voor hun respectieve gedragsgroep. Een subcohort van de controleratten (5 PRC- en 3 FRC-ratten, aanwezig in de procedurekamer op hetzelfde tijdstip als de FR- of PR-ratten) werd ook geanalyseerd. Een extra groep van drie ratten werd via de FR-procedure ("FRext") genomen om de toegevoegde duur van de PR-procedure na te bootsen (dwz voor een totaal van 20-dagen, omdat PR-ratten door FR en vervolgens PR worden genomen) om te evalueren of verschillen tussen FR en PR waren te wijten aan de gedragstaak of de duur van de procedure. De FRext-hersenen werden niet systematisch geanalyseerd en gescreend, maar specifieke interessegebieden werden met de andere vier groepen getest om vergelijkende kwantificering mogelijk te maken, zoals specifiek aangegeven in de resultaten.
Voor kwantificering (bij 40 × vergroting) werden atlas-overeenkomende gebieden geselecteerd. ImagePro Plus-software (Media Cybernetics) werd gebruikt om een afbeelding van het gewenste gebied te maken. Er werd een gebied afgebakend om te tellen en er werd een drempel voor positieve celaantallen vastgesteld. Het identieke gebied en de achtergrond (drempel) werden gebruikt voor secties van de respectieve experimentele groepen, en softwaretelling van positieve cellen (kwantificering) werd uitgevoerd in dezelfde sessie voor alle experimentele groepen, om tussentijdse veranderingen in de achtergrondinstelling te voorkomen. Voor statistische analyse werden alleen tellingen uitgevoerd van een individuele rat als overeenkomstige of volledige secties door elk gebied (zoals gedefinieerd in Tabel 1) waren beschikbaar; gegevens voor een specifiek gebied werden niet van een rat genomen als er onvolledige bilaterale vertegenwoordiging voor dat gebied was.
Kwalitatieve dubbel-gelabelde immunofluorescentieanalyse.
Hersensecties werden genomen van de ratten waarin c-Fos werd gekwantificeerd, voor dubbel gelabelde immunohistochemie. Omdat we de gedragsprestaties van de dieren niet wilden verstoren, werden ze niet voorbehandeld met colchicine om de visualisatie van peptide-neurotransmitters te optimaliseren. Daarom was de visualisatie van neuronale fenotypes geactiveerd in verband met de zelftoedieningstaak beperkt. Om echter te beginnen met de beoordeling van de fenotypes van geactiveerde neuronen op een aantal CZS-locaties, werden digitale beelden (verkregen zoals beschreven in het bovenstaande gedeelte) genomen met een vergroting van 20 ×, 40 × of 60 × (zoals aangegeven in figuurlegendes). . De dubbele kleuringsprocedure voor glutamaatdecarboxylase (GAD), tyrosinehydroxylase (TH), CRF, neuropeptide Y (NPY), Agouti-gerelateerd peptide (AgRP) en tryptofaanhydroxylase was vergelijkbaar met de test van c-Fos-immunoreactiviteit op zijn eigen, behalve dat een mengsel van c-Fos-Ab en een van de andere primaire antilichamen werd gebruikt voor incubatie gedurende de nacht bij 4 ° C; Evenzo bevonden beide secundaire antilichamen zich in dezelfde oplossing en werden ze 1 uur in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. Een wasbehandeling met 20% ethanol van 50 minuten voorafgaand aan de blokkeerstap werd gebruikt voor de orexine-test. Initiële optimalisatietesten werden uitgevoerd om een geschikte verdunning van de primaire antilichamen te bepalen. Primaire antilichamen die werden gebruikt waren konijn-anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) en muis-anti-c-Fos (1: 800) (beide van Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-GAD van muis (1: 1,000), anti-tyrosine hydroxylase van muis (1: 500) en anti-tryptofaan hydroxylase van schaap (alle van Chemicon, Temecula, CA); konijn anti-CRF (1: 500) (geschenk van Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); konijn-anti-NPY (1: 1,000), konijn-anti-AGRP (1: 1,000) en geit-anti-orexine A (1: 5,000) alle van Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Secundaire antilichamen die werden gebruikt waren Cy3-geconjugeerd geit-anti-konijn of anti-muis (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 geit-anti-muis of anti-konijn of ezel anti-schapen IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; alle secundaire antilichamen werden verdund tot 1: 500. c-Fos / MCH dubbele immunokleuring werd serieel getest; ten eerste voor MCH (1: 2,500 primair antilichaam, Millipore) met Alexa-488-geit anti-konijn (1: 500) secundair antilichaam. De objectglaasjes werden opnieuw geblokkeerd met 5% normaal geitenserum en gekleurd op anti-c-Fos (1: 500) en cy3-geit-anti-konijn als een secundair antilichaam. Voor de MCH-assay werd een wasbehandeling van 20 minuten met 50% ethanol voorafgaand aan de blokkeerstap gebruikt.
Statistische analyse.
Groepsgegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SE in de tekst, tabellen en figuren. Betekenis wordt gedefinieerd als P ≤ 0.05. Statistische vergelijkingen worden gemaakt tussen experimentele groepen (FR vs. PR) of tussen experimentele groepen en overeenkomstige controles (PR vs. PRC; FR vs. FRC) met behulp van ongepaarde Student's t-test. Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen actieve hefboompersen en c-Fos-expressie in verschillende hersengebieden, evenals de correlatie van c-Fos-expressie tussen verschillende hersenregio's onder identieke experimentele omstandigheden, werden berekend met behulp van het StatPlus: mac LE statistische analyseprogramma voor Mac OS-versie 2009 door AnalystSoft. We hebben getest op lineaire correlaties (Pearson's R statistiek) tussen c-Fos-expressie in verschillende CNS-gebieden. We onderzochten ook de correlaties tussen c-Fos-expressie in verschillende geactiveerde CZS-regio's en gedrag. FR- en PR-gegevens van ratten, waarvoor c-Fos-kwantificatie werd uitgevoerd, werden voor deze correlaties gebruikt.
RESULTATEN
c-Fos kwantificatie.
Zoals we eerder hebben waargenomen, was het aantal actieve hefboompersen aanzienlijk groter voor PR versus FR-prestaties (Tabel 2) en het aantal sucrose-beloningen was groter tijdens FR-prestaties. De sessielengte voor de PR-ratten was ongeveer 90 min (stoptijd - 30). Tabel 3 vermeldt c-Fos immunoreactieve celtellingen in alle CNS-gebieden waar kwantificatie werd uitgevoerd. Het patroon van c-Fos-expressie voor de FR- en PR-ratten is samengevat in Fig 1. Er was een significante activering van de mediale hypothalamus (MHpeutereen samenstelling van ARC, PVN, RCh, DMH en VMH) van ratten die zich bezighouden met PR-hendel die op sucrose drukte, maar geen totale activering bij ratten die in een FR-hendel op sucrose drukten, vergeleken met respectieve controles. Binnen de mediale hypothalamus van PR-ratten vond deze activatie plaats in de PVN, ARC en VMH (Fig 2). FR-hendelbediening, maar niet PR-hendelpersen, was geassocieerd met significante activering binnen de LH (voornamelijk gebaseerd op activering binnen het periforni- sche gebied). Zowel actieve hefboompersen als hypothalamische c-Fos-expressie waren vergelijkbaar tussen de FRext- en FR-groepen (MHpeuter, 946 ± 26 en 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 en 186 ± 10; LHpeuter, 468 ± 79 en 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 en 173 ± 15, respectievelijk), wat suggereert dat het verschil in expressiepatroon tussen FR- en PR-groepen niet gerelateerd is aan de duur van de training / ervaring, maar aan de aard van de instrumentele taak. Voor de FR-groep was er een significante toename in c-Fos-expressie in de BNST, waargenomen in zowel aBNST als pBNST. Zowel FR- als PR-hendelpersen waren geassocieerd met verhoogde c-Fos-immunopositieve neuronen in de NAc-schaal; c-Fos-tellingen waren significant verhoogd in de NAc-kern van ratten die betrokken waren bij het indrukken van een FR-hendel, met een niet-significante trend in de richting van verhoogde expressie van c-Fos bij ratten die betrokken zijn bij PR-hendelpersen. c-Fos was niet verhoogd in de VTA met de PR-taak, hoewel een niet-significante trend in de richting van een toename werd waargenomen met de FR-taak. Ten slotte was c-Fos significant verhoogd in de hypoglossale (schedelzenuw XII) nucleus in de hersenstam van ratten die waren getraind voor PR, maar niet voor FR.
c-Fos-expressie werd waargenomen in andere CZS-regio's, waaronder de amygdala en de hersenschors (Fig 3). Expressie werd echter waargenomen in zowel de controlecondities als in samenhang met PR- en FR-taken, wat suggereert dat de niet-specifieke aspecten van de procedure (behandeling, verplaatsing naar de procedurekamer) in deze activering kunnen hebben geresulteerd. Kwantificering in deze regio's werd niet uitgevoerd. Evenzo werd activering binnen hersenstamgebieden anders dan nXII waargenomen, maar trad op in associatie met zowel controle- als taakgerelateerde aandoeningen, wat ook een rol suggereert in niet-specifieke opwinding of gedragsactivatie.
We hebben getest op correlaties tussen c-Fos-expressie in verschillende CZS-regio's. Door gegevens te combineren van groepen die de hefboom indrukken, vonden we een negatieve correlatie tussen c-Fos-expressie in de LH en de VMH; activering van de VMH was dus geassocieerd met een verminderde algehele activering van de LH (Pearson's R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). We hebben ook een significante positieve correlatie waargenomen tussen c-Fos-expressie in het perifornische gebied van de LH en de VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), consistent met bekende monosynaptische connectiviteit tussen deze twee regio's (zie discussie in Ref. 2 en 13). We vonden een significante negatieve correlatie tussen c-Fos-expressie in de VTA versus de NAc-shell, of deze nu afzonderlijk zijn getest op FR-prestaties (Pearson's R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) of voor PR-prestaties (Pearson's R, -0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), consistent met bekende wederzijdse invoer tussen striatale regio's naar de substantia nigra en VTA (2, 13). We hebben ook getest op correlaties tussen c-Fos-expressie in verschillende CZS-regio's en gedrag. Door gegevens van groepen met hefboomdrukken te combineren, zagen we een significante positieve correlatie tussen c-Fos in de ARC en actieve hefboompersen (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identificatie van neuronen geactiveerd met sucrose-inname en motivatie voor sucrose.
In de hersenstam vertoonden c-Fos-positieve neuronen geen positieve immunokleuring voor TH, het snelheidsbeperkende enzym voor epinefrine en norepinefrine (en dopamine); aldus bleken deze catecholaminerge neuronen niet te worden geactiveerd door de FR- of PR-taken. Sommige c-Fos-positieve neuronen vertoonden echter positieve immunokleuring voor tryptofaanhydroxylase, wat aangeeft dat een populatie van serotonine-neuronen was geactiveerd. Zoals getoond in Fig 4in de ARC werden c-Fos-positieve cellichamen omgeven door AGRP-gekleurde vezels en een vergelijkbaar patroon voor NPY-fiber / c-Fos immunokleuring werd waargenomen (niet getoond). In de PVN bleken c-Fos-positieve neuronen CRF-positieve neuronen te omringen, maar er werd geen colocalisatie waargenomen (gegevens niet getoond). Fig 5 toont immunokleuring voor zowel orexine als MCH in de LH. Orexine-neuronen werden gevonden in zowel de dLH als de peLH. Hoewel we MCH-positieve neuronen in de peLH waarnamen, was er in wezen geen colocalisatie met c-Fos in dat gebied van de LH. We hebben echter de colocalisatie van c-Fos in orexin-positieve neuronen in de peLH waargenomen (Fig 6, top), en zeer beperkte c-Fos-colocalisatie met MCH in de vLH (Fig 6, bodem). Er moet nogmaals op worden gewezen dat zowel lokalisatie als colocalisatie met c-Fos kan worden onderschat voor de peptide-neurotransmitters zoals CRH, omdat ratten niet waren voorbehandeld met colchicine. Eindelijk, binnen de nucleus accumbens core en shell (Fig 7), c-Fos coimmunokleuring met GAD, het synthetische enzym voor de neurotransmitter GABA, werd waargenomen, zowel voor FR- als PR-ratten. Er was robuuste kleuring voor TH binnen de VTA; echter, c-Fos-positieve neuronen werden zelden waargenomen en leken niet uitsluitend te colocaliseren met TH.
DISCUSSIE
In de huidige studie gebruikten we expressie van het directe vroege gen, c-Fos, om het patroon van acute CNS-activatie te evalueren geassocieerd met het begin van sucrose zelftoedieningshendelpersactiviteit, hetzij als een relatief niet-veeleisende taak (FR) of een steeds moeilijker wordende taak waarvan gedacht wordt dat ze gemotiveerd het zoeken naar een beloning weerspiegelt, zoals sucrose, en om sterk limbische circuits te betrekken (22, 24, 49) (PR). Hypothalamische patronen van activering verschilden tussen de twee taken, waarbij LH / limbische activering de overhand had in de FR-taak en mediale hypothalamus / limbische activering de overhand had in de PR-taak (zie Fig 1). Daar zijn verschillende mogelijke redenen voor. Ten eerste kunnen deze paradigma's "in kaart brengen" als kwalitatief verschillende ervaringen in het CNS. Rats die getraind zijn in FR-prestaties verwachten een gemakkelijke activiteit met hoge beloning. Anticiperen op een belonend voedsel zou het c-Fos-patroon in de FR-ratten sterk moeten beïnvloeden. Het schijnbare kwalitatieve verschil in activeringspatroon suggereert dat een tweede mogelijkheid - dat de PR-dieren eenvoudigweg meer ervaring met de taak hebben - minder waarschijnlijk is, en dit werd ondersteund door onze meting van c-Fos in de hypothalamus van ratten die 20 FR-sessies ontvingen , die activiteit vertoonde die vergelijkbaar was met de FR-groep, niet met de PR-groep. Beide mogelijkheden kunnen worden getest door systematisch de moeilijkheid van FR-training te vergroten en veranderingen in CNS-activering te evalueren, in welk geval men een kwalitatieve verandering in activeringspatroon zou voorspellen. Hoewel het aantal trainingservaringen mogelijk niet het CNS-activeringspatroon verklaart, zou het gemiddelde aantal sucrose-beloningen in een sessie kunnen zijn: de PR-taak kan eenvoudig worden geleerd als een "minder lonende" ervaring, en deze kan functioneel gekoppeld zijn aan de gebrek aan LH-activering. Het activeringspatroon van het CNS aan het begin van de sessie kan dus een interoceptieve toestand weerspiegelen, zoals die van het geconditioneerde plaatsparadigma: de activeringssterkte binnen het limbische circuit is gebonden aan leren en aan motivatie. We observeerden de variabiliteit van c-Fos-expressie in de mediale hypothalamus van de FRC-dieren. Met name binnen de PVN kan deze variabiliteit de activering maskeren in de FR-ratten, waarvoor een trend naar verhoogde c-Fos vs. FRC-ratten werd waargenomen (Tabel 3). Echter, de algemene mediale hypothalamische activering verschilde niet tussen FR- en FRC-dieren.
Opgemerkt moet worden dat hoewel ons doel was om CNS-plaatsen te identificeren die bijdragen aan het begin van gedrag, temporele resolutie enigszins een overweging is. Zoals hieronder wordt besproken, wordt nu duidelijk dat verschillende subcomponenten van instrumenteel of operant gedrag worden gemedieerd door activering van verschillende populaties van neuronen (13, 23, 33, 49). We kunnen niet volledig uitsluiten dat activering als gevolg van zeer directe bar-pressing of het likken van beloningen enigszins heeft bijgedragen aan de activeringspatronen die we hebben waargenomen. Onze bevindingen vormen wel de basis voor verder onderzoek naar de rollen van specifieke CNS-sites in verschillende aspecten of componenten van de zelftoedieningstaak, en voor dergelijke studies, meting van andere directe vroege genen met verschillende "aan" en "uit" tijdcursussen (36) is erg handig.
De correlaties die we vonden in c-Fos-expressie tussen verschillende hersenregio's ondersteunen de bekende functionele connectiviteit van hypothalamische en primaire limbische regio's voor deze specifieke beloningstaak, zoals tussen de LH en de VMH, en tussen de perifornische regio van de LH en de VTA (zie discussie in Ref. 2 en 13). We onderzochten ook de correlaties tussen c-Fos-expressie in verschillende geactiveerde regio's en gedrag. De correlatie tussen c-Fos in de ARC en actieve hefboompersen past in de welomschreven rol van ARC-activiteit in voedselinname (1); met onze vorige observatie dat insuline-injectie specifiek in de ARC de zelftoediening van sucrose verminderde (15); met eerdere rapporten over de cruciale rol van de ARC en zijn endorfinergische neuronen bij de verwerving en uitvoering van cocaïne zelftoediening (40-42); en met de geïdentificeerde projecties van de ARC naar het NAc (17). De ARC speelt dus waarschijnlijk een sleutelrol in het gemotiveerde gedrag om vele soorten belonende stimuli te zoeken en te verkrijgen, inclusief, maar niet beperkt tot, voedsel. Tenslotte hebben we significante activatie van de PVN en VMH waargenomen met het begin van het zoeken naar PR-sucrose. Dit is consistent met de goed gekarakteriseerde rollen van deze mediale hypothalamische kernen in de regulatie van voedselinname, directe synaptische connectiviteit met de ARC en geïdentificeerde verbindingen met de limbische circuits (1, 27, 37).
We vonden een significante negatieve correlatie tussen c-Fos-expressie in de VTA versus de NAc-schaal, ongeacht of deze werd getest op FR- of PR-prestaties. Het was enigszins verrassend dat een sterkere VTA-activering niet werd waargenomen in combinatie met PR- of FR-sucrose zelf-toediening (versus respectieve controles). Misschien weerspiegelt deze bevinding de timing van onze meting, met de nadruk op potentiële CNS-locaties die actief waren bij het begin van de taak, waarvoor deze dieren goed waren opgeleid. Dit zou in overeenstemming zijn met de observaties en de these van Schultz (44), dat dopamine-neuronale activering dient als een marker van onverwachte stimuli of beloningen, en deze activering vermindert in combinatie met training. Het is echter aangetoond dat striatale dopamine-afgifte tijdens het nemen van sucrose in getrainde dieren optreedt als een zeer precieze en tijdelijk discrete gebeurtenis (39). Het is dus mogelijk dat de trends die we waarnamen sterk significant zouden zijn bij een grotere studiegroep (dat wil zeggen meer statistische power). We hebben NAc-activering waargenomen in combinatie met het begin van zowel FR- als PR-sucrosevergunningen. Zowel activering als remming van NAc-neuronen zijn gemeld in verband met instrumentele beloningsprestaties, en het patroon van activering / activiteit is afhankelijk van training en omgeving en is geassocieerd met verschillende componenten van het gedrag (bijv. Oriëntatie, benadering, inname) (6, 33, 50). Zoals hierboven besproken, zou het meten van c-Fos dergelijke specifieke activiteit niet vangen. Carlezon heeft voorgesteld dat "beloning" voornamelijk geassocieerd is met een afname van de activiteit van de NAc-neuronen, dwz middelgrote stekelige neuronen (3). Dit is niet consistent met onze observaties-aanzienlijk verbeterde NAc c-Fos vergeleken met hanteringscontroles en c-Fos-positieve neuronen gecoördineerd met GAD, consistent met activering van middelgrote stekelige neuronen (GABAergic) -maar we hebben niet specifiek NAc-neuronale remming beoordeeld " ”. NAc-activering en -remming kunnen beide optreden tijdens instrumentele taken, met zowel anatomische als temporele specificiteit. Vanuit het perspectief van deze studie kan men concluderen dat het NAc betrokken is bij het begin van het nemen van instrumentale sucrose, waarbij de NAc-kern bijdraagt aan motorische activering en de NAc-schaal bijdraagt aan zowel motorische als motiverende aspecten van de taak.
We observeerden ook de activering van beide belangrijke regio's van de BNST (anterieure en posterieure) in FR-ratten. De BNST is een deel van het limbische circuit dat neuro-endocriene reacties moduleert op herhaalde stimuluservaringen (8, 9), en in een grotere betekenis, wordt geassocieerd met het leren over terugkerende stimuli. Hoewel zijn rol het meest uitvoerig is toegelicht in relatie tot herhaalde stressbelevingen, suggereert onze bevinding een bredere rol voor de BNST: de BNST kan de reacties van het centrale zenuwstelsel op terugkerende positieve, maar ook op negatieve of stressvolle stimuli moduleren. Aangezien we deze activering bij het begin van FR, maar niet PR, prestaties hebben waargenomen, kan BNST-rekrutering worden gekoppeld aan de verhoogde sucrose-beloningen van FR-training. Onze observatie van geen directe activering van CRF-neuronen suggereert dat instrumentele respons voor sucrose geen belangrijke stressfactor is; de expressie van c-Fos in andere PVN-neuronen is echter consistent met modulatie van stress-circuits (46). In feite hebben Ulrich-Lai en collega's gemeld dat, met behulp van een ander dieet / voedingsparadigma, de inname van sucrose de PVN-functie moduleert (47). Ten slotte observeerden we activatie van de kern van de hypoglossale zenuw in combinatie met PR, maar niet met FR-prestaties. Van de betekenis hiervan kan alleen worden gespeculeerd; een mogelijkheid is dat de smaakrelevantie van sucrose verhoogd kan zijn bij ratten die minder sucrose-beloningen opnemen.
Sucrose-zoeken en sucrose nemen moet worden beschouwd als een multimodaliteitservaring, dynamisch in de tijd, omdat inname zou resulteren in perifere signalen gerelateerd aan de calorische inhoud van de sucrose, evenals gewenning en alliesthesie binnen de sessie (25). Hoewel ons onderzoek zich heeft gericht op de invloed van perifere endocriene signalen, zoals insuline en leptine, om voedselbeloningen te moduleren, kunnen hun effecten op hun beurt direct centraal worden gemedieerd door zenders en neuropeptiden die een rol spelen op de korte of lange termijn. voeder of voedselbeloning (zie discussie in Ref. 14). De huidige studie geeft hier enig inzicht in; we hebben enige activatie van neuronen waargenomen die MCH of orexin tot expressie brengen, twee neuropeptiden die orexigeen zijn. Deze bevindingen onderschatten in feite de rol van MCH of orexin in voedselbeloning, omdat immunocytochemie bij niet-colchicine behandelde ratten ongetwijfeld de visualisatie van deze beide neuropeptiden beperkte. De identificatie van geactiveerde orexine neuronen in de LH is over het algemeen consistent met de talrijke studies die neuronen in voeding, voedselbeloning en meer algemene prikkelbeloning (bijv. 5, 7, 29) impliceren. We observeerden activering van peFLH orexine neuronen. Aston-Jones en collega's (5) hebben de rollen van verschillende populaties van LH orexine neuronen in beloningsgedrag ontleed en hebben peFLH orexine neuronen geïmpliceerd in opwinding, in tegenstelling tot beloning op zich. Onze bevinding suggereert dus een rol voor LH-orexine bij opwinding en misschien een oriëntatie op de actieve hefboom of aanwijzingen voor het nemen van sucrose.
Waardig voor toekomstige overweging is de uniciteit of generaliseerbaarheid van sucrose als een stimulerende stimulus. Of het patroon van vroege CZS-activering dat we hier rapporteren specifiek is voor voedsel als een stimulus, of gegeneraliseerd wordt naar andere belonende stimuli, moet nog worden bepaald. Zoals hierboven vermeld, in het bijzonder in de FR-taak, zou inname van een aantal sucrose-beloningen naar verwachting metabolische gevolgen hebben, met modulatie van hormoonafgifte (bijvoorbeeld cholecystokinine, ghreline, insuline) en veranderingen in perifere en CNS neurale activering. Van deze veranderingen wordt niet verwacht dat ze een directe rol spelen in de vroege CZS-activeringspatronen die we hebben gemeten, maar mogelijk een rol spelen bij het leren over sucrose-beloning tijdens de training. Nogmaals, neuropeptiden zoals orexine kunnen kritisch worden geïmpliceerd.
Onze studie vertegenwoordigt, voor zover ons bekend, de eerste demonstratie van activering van specifieke mediale hypothalamische kernen bij het begin van sucrose zelftoediening, inclusief zowel de PVN, betrokken bij homeostase en stress responsiviteit, als de ARC, die cruciaal is voor energiehomeostase, detectie van voedingsstoffen en regulering van voedselinname. Belangrijk is dat we activatie van de mediale hypothalamus en het NAc, in samenhang met PR-aanvang, waarnamen, wat suggereert dat zowel homeostatische als sommige limbische plaatsen een rol spelen bij de initiatie van sucrose zelftoediening. Extra limbische circuitsites kunnen op een later tijdstip in de taak worden gerekruteerd.
Perspectieven en betekenis
Terwijl historisch gezien onderzoek naar motiverend en beloningsgedrag het CNS limbische circuit het sterkst zou impliceren, is er een grote hoeveelheid bewijsmateriaal ontstaan dat de kritische functionele interactie tussen limbische en energiehomeostasiscircuits benadrukt. De huidige studie suggereert nu het waarschijnlijke belang van specifieke mediale hypothalamische kernen bij gemotiveerd werk voor sucrose. Extrapolerend van deze studie, kunnen toekomstige studies evalueren of de rol van de mediale hypothalamus nodig is en of de activering ervan betrokken is bij gemotiveerd zoeken naar andere beloningen, zoals misbruik drugs. Bovendien bieden de bevindingen van deze studie de reden voor het bestuderen van veranderingen van gemotiveerd gedrag in omstandigheden die samengaan met gewijzigde mediale hypothalamische fysiologie, zoals bij obesitas.
SUBSIDIES
Dit onderzoek werd ondersteund door National Institutes of Health Grant DK40963. Dr. Dianne Figlewicz Lattemann is Senior Research Career Scientist, Biomedical Laboratory Research Program, Department of Veterans Affairs Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Dr. Sipols wordt ondersteund door de Letse Council of Science Grant 04.1116.
DISCLOSURES
Geen belangenconflicten, financieel of anderszins, worden door de auteurs aangegeven.
ACKNOWLEDGMENTS
We danken Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius en JE Blevins voor advies en nuttige discussies.
REFERENTIES
;
