Dekoding av nevrale kretser som kontrollerer kompulsiv sakkarose søker (2015) (BINGE MECHANISM)

For å identifisere LH-neuroner som gir monosynaptisk input til VTA in vivo og observere deres aktivitet under fritt bevegelig oppførsel, brukte vi en dual-virusstrategi for å selektivt uttrykke channelrhodopsin-2 (ChR2) i LH-neuroner som ga monosynaptisk input til VTA (Tall 1A og S1). Vi injiserte en adeno-assosiert virusvektor (AAV₅) som bærer ChR2-eYFP i en Cre-rekombinaseavhengig dobbel-invertert åpen leseramme (DIO) konstruert i LH for å infisere lokal somata og injisert et retrograd vandrende herpes simplex-virus (HSV) som bærer Cre-rekombinase i VTA. Senere rekombinasjon tillot opsin og fluoroforuttrykk selektivt i LH-neuroner som ga monosynaptisk input til VTA. For å bekrefte vår tilnærming, utførte vi ex vivo patch-clamp-opptak i hele celler i horisontale hjerneskiver som inneholder LH og ble registrert fra nevroner som uttrykker ChR2-eYFP, samt nærliggende LH-neuroner som var ChR2-eYFP-negative (Figur 1B). Lysfremkalt spissforsinkelse, målt fra start av lyspuls til toppen av handlingspotensialet, varierte fra 3-8 ms (Figur 1C). Vi fant også at ingen av de registrerte ikke-uttrykkende (ChR2-negative) cellene viste eksiterende responser på fotostimulering (n = 14; Figur 1C), til tross for deres nærhet til ChR2-uttrykkende celler.

For å utføre optogenetisk formidlet fotoidentifisering in vivo, ble en optrode implantert i LH for å registrere nevronaktivitet under en sukrosesøkende oppgave. I samme innspillingsøkt ga vi flere mønstre for fotostimulering for å identifisere ChR2-uttrykkende LH-VTA-neuroner (Tall 1D og S1). Vi undersøkte fordelingen av eksitatoriske fotoresponse latenser på tvers av alle LH-neuroner som viste en tidsavhengig endring i brennhastighet som respons på belysning og observert en bimodal fordeling (Figur 1E). Vi observerte en populasjon av nevroner under in vivo-opptak med ventetider i området 3-8 ms. Dette var identisk med latensområdet som ble funnet i ChR2-uttrykkende LH-VTA-neuroner da vi registrerte ex vivo. Vi kalte disse enhetene "Type 1" -enheter (Tall 1C, 1E og 1F). I tillegg var det en distinkt populasjon av celler med ~ 100 ms fotoresponsforsinkelser (Tall 1E og 1G), og vi kalte disse "Type 2" -enhetene. Vi observerte også nevroner som ble hemmet som svar på fotostimulering av LH-VTA-neuroner (Figur S2), og vi kalte disse "Type 3" -enhetene. Vi sammenlignet handlingspotensialets varighet (målt fra topp til trough) og gjennomsnittlige avfyringshastigheter for Type 1 og Type 2-enheter, samt de som ikke viste fotoresponse (Figur 1H). Fordelingen av virknings potensielle varighet av Type 1 (Figur 1I) og Type 2 (Figur 1J) enheter viser at flertallet av Type 1-enheter har en handlingspotensialvarighet mindre enn 500 μs (84%; n = 16/19, binomialfordeling, p = 0.002).

Selv om Type 1-enheter oppfyller standardkriterier for å bli klassifisert som ChR2-uttrykkende (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), var det uklart om den lengre latensfotoresponsen til Type 2-enheter var en indikasjon på ChR2-uttrykkende nevroner som svarte saktere på fotostimulering, eller om denne effekten skyldtes nettverksaktivitet. Gitt at de ChR2-uttrykkende (Type 1) LH-neuronene projiserer direkte til VTA, var en mulighet at Type 2-neuroner mottok tilbakemelding fra VTA (Figur 1K). En annen mulighet var at Type 2-neuroner ble aktivert av axon-collaterals fra Type 1-neuroner (Figur 1L). For å skille mellom disse to mulige kretsmodellene, hemmet vi VTA i forbindelse med bildeidentifikasjon i LH.

Basert på våre kretsmodeller, ville vi forvente at distal inhibering ikke hadde noen effekt på fotoresponsene av ChR2-uttrykkende LH-neuroner. Imidlertid, hvis fotoresponsive, men ikke-uttrykkende, LH-neuroner støttet på tilbakemelding fra VTA for å fremkalle en tidslukket respons på belysning (Figur 1K), ville vi forvente en demping av fotoresponser i disse nevronene ved VTA-inhibering. Vi uttrykte ChR2 i LH-VTA-celler som ovenfor, men denne gangen uttrykte også forbedret halorhodopsin 3.0 (NpHR) i VTA og implanterte en optisk fiber i VTA i tillegg til optroden i LH (Figur 2EN). Vi leverte de samme blålysbelysningsmønstre i LH for alle tre epoker, men også fotoinhibiterte VTA med gult lys i den andre epoken (Figur 2EN).

Fotoresponsene til Type 1-enheter til blålysbelysning i LH var upåvirket av fotoinhibering av VTA, som er konsistent med ChR2-ekspresjon i type 1 LH-VTA-neuroner (Figur 2B). I motsetning til dette viste flertallet av Type 2-enheter (87%; n = 13/15, binomialfordeling, p = 0.004) en signifikant demping av fotoresponser til blålyspulser levert i LH ved fotoinhibering av VTA-neuroner. Svarene fra Type 1- og Type 2-enheter under VTA-fotoinhibering var signifikant forskjellige (chi-kvadrat = 7.64, p = 0.0057; Tall 2B og 2C). Disse forskjellene kan også ses i maksimum Z-poengene i individuelle epoker (Figur 2D) og med gul-ON-epoken normalisert til gul-OFF-epoken (Figur 2E). Disse dataene tyder på at Type 2 LH nevroner mottar input (enten direkte eller indirekte) fra VTA (Figur 1K) i stedet for via lokale axon collaterals (Figur 1L).

Etter å ha identifisert disse to forskjellige typene LH-neuroner i LH-VTA-løkken, ønsket vi å undersøke naturlig forekommende nevralaktivitet under en sukrose selvadministrasjonsoppgave (Figur 3EN). Mus ble trent til å utføre nosepoke-svar for en indikasjon på å forutsi sukrose-levering i en tilstøtende havn (som i Tye et al., 2008). For å tillate oss å skille nevrale responser på nesepoke og cue, ble cue og sukrose levert på en delvis forsterkningsplan, hvor 50% av nosepoke ble parret med en cue og sukrose levering.

Type 1-enheter viste fasiske responser på sukrose portinngang, sett i en representativ Type 1-enhet (Figur 3B), samt populasjonsdata for alle Type 1-enheter (Figur 3C). De fasiske responsene til Type 2-enheter, men hovedsakelig reflekterte responser til den belønnings-predictive cue (Tall 3D og 3E). De normaliserte avfyringsmønstrene til alle registrerte nevroner (n = 198, delt inn i type 1, 2, 3 og ikke-responsive enheter) vises for hver oppgavekomponent: nesepoke parret med cue, nosepoke i fravær av cue, og oppføring av sukrosehavn (Figur 3F). Alle Type 1-enheter som viste oppgaverelevante faseforandringer i aktivitet (74%; n = 14/19), ble enten faset opphisset eller inhibert av oppføring av sukrose, med et lite antall som også viste fasisk hemming av belønningsprognosen (Tall 3B, 3C og 3G). I motsetning til dette var type 2-enheter mer heterogene, med oppgave-responsive nevroner som koder cue selektivt (35%), sukrose port-entry selektivt (26%), eller både cue og port entry (12%; Tall 3D, 3E og 3H). For å illustrere styrken av svarene til Type 1 og Type 2-enheter til oppgaverelaterte hendelser, plottet vi hver celle på et tredimensjonalt plott i henhold til Z-poengsummen (Figur 3JEG). For å vise fordelingen av fasiske endringer i avfyring til flere oppgavelaterte hendelser på et kvalitativt nivå, plottet vi antall celler av hver fotorespons type som falt inn i en gitt kategori (Figur 3J).

Gitt den veldefinerte rollen til VTA i belønningsprognosefeil (f.eks. Den fasiske reduksjonen av DA-neuronskyting som svar på den uventede utelatelsen av en belønning og den fasiske eksitasjonen som svar på uventet belønningsleveranse) (Schultz et al., 1997), undersøkte vi om LH-neuroner ville kode for den uventede utelatelsen av en sukrose-belønning. For å gjøre dette registrerte vi nevralaktiviteten til fotoresponsive nevroner under den samme cue-belønningsoppgaven i godt trente dyr, men tilfeldig utelatt 30% av sukrose leveranser etter køen (Figur 4EN).

Flertallet av Type 1 enheter (88%; n = 15/17, binomial fordeling, p = 0.001) var ufølsomme for belønning utelatelse (Tall 4B og 4D), mens en stor delmengde av Type 2-enheter (67%; n = 12/18) viste en signifikant forskjellig respons på belønningspresenterte og belønningsomgitte forsøk (Tall 4C og 4D). Vi konkluderte med at LH-VTA (Type 1) nevroner kodet handlingen for å komme inn i porten, da disse portinngangsvarene var vedvarende selv ved belønning unnlatelse (Figur 4D), i motsetning til Type 2-enheter (chi-kvadrat = 10.9804, p = 0.0009).

For å avgjøre om Type 1-svar på portoppføring var virkelig kodende for den betingede responsen (CR), i motsetning til generell belønningssøkende eller utforskende oppførsel, registrerte vi i uutdannede mus som ennå ikke hadde oppnådd oppgaven. I oppgave-naive mus leverte vi sukrose til porten i fravær av en prediktiv cue (uforutsigbar belønning) og fant at Type 1-enheter ikke viste fasiske svar på portinngang (Tall 4E, 4F og 4I), i samsvar med modellen som Type 1-neuroner koder CR (Figur 4J).

For å avgjøre om type 2-enhetaktivitet er i overensstemmelse med en belønnings-prediksjonsfeillignende responsprofil, registrerte vi også nevronene i velutdannede dyr under uforutsigbar belønning.Figur 4G). Vi fant at en delmengde av Type 2-enheter reagerte på uforutsagte sukrose-leveranser (50%; Tall 4G-4I). Til sammen er delsett av Type 2-enheter følsomme overfor uventet belønning unnlatelse (Tall 4C og 4D) og uforutsigbar belønning levering (Tall 4G-4I), i samsvar med en belønnings-prediksjons feilaktig respons profil.

Som vi har vist ovenfor, representerer Type 1-enheter et neural korrelat av CR. Det er viktig at økningen i avfyringsrenten begynner før CR, rampe inntil CR er fullført (Tall 3B, 3C og 4B). For å avgjøre om aktivering av LH-VTA-banen kunne fremme CR, ønsket vi å teste muligheten for LH-VTA-aktivering ved å kjøre CR i møte med en negativ konsekvens. I vildtype-mus uttrykte vi ChR2-eYFP eller eYFP alene i LH-celllegemer og implanterte en optisk fiber over VTA (VTA)Tall 5A og S4). Omvendt, for å teste rollen til LH-VTA-banen i formidling av CR eller fôringsrelatert oppførsel, uttrykte vi bilateralt NpHR-eYFP eller eYFP alene i LH-celler og implanterte en optisk fiber over VTA (Tall 5A og S4).

Vi utviklet en Pavlovian-konditioneringsoppgave der matmangelte mus måtte krysse et støtgitter for å hente sukrose belønning (Figur 5B). I den første "baseline" -epoken (med sjokkristen av), bekreftet vi at hver mus hadde tilegnet seg den pavloviske betingede tilnærmingsoppgaven. I den andre ("Shock") epoken leverte sjokkristen milde fotstøt hvert sekund. Til slutt, i den tredje epoken ("Shock + Light"), fortsatte vi å levere fotsjokk, men også opplyste LH-terminaler i VTA med blått lys (10 Hz) hos mus som uttrykker ChR2 og matchet eYFP-kontroller og gult lys (konstant) for mus som uttrykker NpHR og deres eYFP-kontroller (Figur 5B).

Vi observerte et betydelig høyere antall portoppføringer per kø under Shock + Light-epoken og en signifikant høyere differansepoeng (Shock + Light epoch - Shock-only epoch) i ChR2-mus i forhold til eYFP-mus (Figur 5C og Film S1). I motsetning til dette resulterte fotoinhibering av LH-VTA-banen i en signifikant reduksjon av portposter per cue og differansescores i NpHR-musene i forhold til eYFP-mus (Figur 5D og Film S2). Innen-sessionsutryddelsesforsøk under hvilke cue-presentasjoner ikke ble fulgt av sukrose-leveranser viste lignende trender i virkeligheten (Figur S4).

Viktigst, vi ønsket å avgjøre om endringene i sukrose som vi hadde fått, var forårsaket av endringer i foderrelatert atferd eller følsomhet for smerte. Vi observerte at fotoaktivering av LH-VTA-projeksjonen økte den tidsmessige fôringen i velmatte mus i ChR2-gruppen (Figur 5E). Imidlertid reduserte fotoinhibisjonen av LH-VTA-banen ikke signifikant fôring (Figur 5F), selv om disse dyrene var mat berøvet for å forbedre vår evne til å oppdage en reduksjon i forhold til baseline-epoken (sammenlignet med sated animals in Figur 5E). I hverken ChR2 (Figur 5G) eller NpHR-gruppe (Figur 5H) observerte vi en forskjell i latens til tilbaketrekking av halen fra varmt vann (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto og Sulman, 1967), noe som indikerer at manipulering av LH-VTA-projeksjonen ikke endret analgesi.

For å studere sammensetningen av hurtigoverføringskomponentene til LH-innganger til VTA som fremkalte disse effektene, utførte vi helcelle-patch-clamp-opptak fra VTA-neuroner i et akutt skivepreparat mens vi optisk aktiverte LH-innganger som uttrykte ChR2-eYFPTall 6A og S5). Gitt at det er veletablert heterogenitet innen VTA, inkludert ~ 65% DA-neuroner, ~ 30% GABA-neuroner og ~ 5% glutamatneuroner (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007), fylte vi celler med biocytin mens vi registrerte for å tillate identifisering av celletype ved bruk av post-hoc immunhistokjemi for tyrosinhydroksylase (TH; Figur 6B), i tillegg til å registrere den hyperpolariseringsaktiverte kationstrømmen (I_h) og kartlegging av celleplassering (Tall 6B og S5).

Først registrerte vi i strømklemme under fotostimulering av ChR2-uttrykkende LH-innganger og observerte at 23 av 27-neuroner viste en tidsbesparende respons på fotostimulering av LH-innganger (Figur 6C). Flertallet av DA-neuroner som ble samplet i VTA, mottok en netto eksitatorisk inngang fra LH (56%), mens en annen delmengde viste nettoinhibering (30%; Figur 6C). Den romlige fordeling av disse DA-neuronene er kartlagt på en atlas for horisontale skiver som inneholder VTA (Figur 6D).

For å etablere det monosynaptiske bidraget fra LH-innganger til VTA DA-neuroner, brukte vi ChR2-assistert kretskartlegging, der spenningsklemmeopptak ble utført i nærvær av tetrodotoxin (TTX) og 4-aminopyridin (4AP; Petreanu et al., 2007) . I samsvar med våre observasjoner fra gjeldende klemmeopptak, observerte vi at flertallet av registrerte VTA DA-neuroner eksklusivt mottok eksitatorisk monosynaptisk input fra LH (67%), sammenlignet med VTA DA-neuroner som eksklusivt mottok inhiberende monosynaptisk input (11%), eller begge (22%; Tall 6E og S6).

Vi identifiserte VTA GABA-neuroner ved å injisere en Cre-avhengig fluorofor (AAV₅-DIO-mCherry) i VTA av VGAT :: Cre mus og benyttet mCherry-uttrykk for å lede opptaket av VTA GABA-neuroner (n = 24; Figur 6F). 64 prosent av VTA GABA-nevronene reagerte med nettokitasjon, mens 54% reagerte med nettoinhibering, til fotostimulering av ChR2-uttrykkende LH-innganger (Figur 6G). Den romlige fordeling av disse cellene er vist i Figur 6H. Ved undersøkelse av monosynaptisk inngang fra LH (som beskrevet ovenfor) fant vi at 18% av samplede GABA-neuroner mottok eksklusivt eksitatorisk inngang og 9% mottatt utelukkende hemmende inngang (Figur 6JEG). I forhold til VTA DA-neuroner fant vi imidlertid at flere VTA GABA-neuroner mottok både eksitatoriske AMPAR-medierte og inhiberende GABA_AR-mediert monosynaptisk inngang fra LH (73%; chi-firkant = 5.0505, p = 0.0246; Tall 6jeg og S6).

Gitt at våre ex vivo-opptak ga bevis som støtter robust innspill fra både GABAergic og glutamatergic LH-projeksjoner til VTA, undersøkte vi neste gang hver komponents rolle uavhengig. For å gjøre dette brukte vi transgene muselinjer som uttrykker Cre-rekombinase i nevroner som uttrykte enten vesikulær glutamattransportør 2 (VGLUT2) eller vesikulær GABA-transportør (VGAT). Vi injiserte AAV₅-DIO-ChR2-eYFP eller AAV₅-DIO-eYFP i LH av VGLUT2 :: Cre og VGAT :: Cre mus og implantert en optisk fiber over VTA (VTA)Figur S7). Disse dyrene ble deretter kjørt på hver av de adferdsanalysene som er vist i Figur 5.

Vi observerte ikke noen påviselige forskjeller i antall portoppføringer gjort per kø mellom mus som uttrykker ChR2 eller eYFP i LH^glut-VTA-projeksjon (Figur 7A) eller i LH^GABA-VTA-projeksjon (Figur 7B). Men ved videoanalyse oppdaget vi avvikende gnaveadferd i LH^GABA-VTA: ChR2-gruppen ved blått lysbelysning (se Filmer S3 og S4). I LH^glut-VTA-mus, selv om det var en trend mot reduksjon i fotostimulering i ChR2-gruppen sammenlignet med eYFP-gruppen, var dette ikke statistisk signifikant (Figur 7C). I kontrast vi observerte en robust økning i tiden brukt fôring i sated mus ved belysning i LH^GABA-VTA: ChR2-gruppe i forhold til kontroller (Figur 7D og Film S3). I ingen av dyrene var det en effekt av lysstimulering i haleuttagningsanalysen (Tall 7E og 7F).

Under fôringsoppgaven, som vi gjorde under sukrose-søkende oppgave, oppdaget vi igjen avvigende foderrelaterte motorsekvenser som ikke var rettet mot mat. Vi filmet en representativ mus i LH^GABA-VTA: ChR2-gruppe i et tomt gjennomsiktig kammer, og ved 20 Hz fotostimulering observerte vi uvanlige appetittvekkende motorsekvenser som å slikke og gnage gulvet eller tomt rom (Film S4). Vi kvantifiserte disse "gnave" atferd under fôringsoppgaven i vildtype LH-VTA (Figur 7G), LH^glut-VTA (Figur 7H) og LH^GABA-VTA (Figur 7Jeg) grupper og viste at LH^GABA-VTA: ChR2-mus gnawed mer enn villtype eller LH^glut-VTA: ChR2-mus når fotostimulert, sammenlignet med deres respektive eYFP-grupper (Figur 7J). Vi vurderte om avvigende tilførselsrelaterte atferd kan skilles fra riktig rettet fôring ved lavere frekvenser. Men da vi testet LH^GABA-VTA: ChR2-gruppe med 5 Hz og 10 Hz tog med blått lys, vi observerte et proporsjonalt forhold mellom stimuleringsfrekvens og både fôring og gnaging (Figur 7K).

LH-projeksjonen til VTA har blitt utforsket med elektriske stimuleringskollisjonsstudier (Bielajew og Shizgal, 1986) og har lenge vært hypotetisert til å spille en rolle i belønningsprosessering (Hoebel og Teitelbaum, 1962, Margules og Olds, 1962), men likevel fastslår dette rolle har vært en utfordring. Her gir vi en detaljert disseksjon av hvordan enkelte komponenter i LH-VTA-løkken behandler ulike aspekter av en belønningsrelatert oppgave.

Gjennom bruk av optogenetisk-mediert fototagging (Figur 1), har vi identifisert to separate populasjoner av LH-neuroner: celler som sender fremskrivninger til VTA (Type 1) og celler som mottar tilbakemelding fra VTA (Type 2; Figur 2) - selv om disse populasjonene ikke trenger å være gjensidig, da det er mulig at LH-neuroner både kunne sende og motta innganger til og fra VTA. Interessant fant vi at relativt få fotoresponsive neuroner falt utenfor bimodalfordelingen som innkapslet disse to populasjonene (Tallene S2B og 1E). Gitt dette, i kombinasjon med den lange forsinkelsen i Type 2-fotoresponser (~ 100 ms), spekulerer vi i at det kan være en dominerende vei som bidrar til aktiviteten til Type 2-neuroner. I tillegg, fordi DA binder G-proteinkoblede reseptorer, er kinetikken langsommere enn de fleste glutamatergiske synapser (Girault og Greengard, 2004) og kan forklare denne klyngen på 100 ms latens fotoresponsive enheter. Det er også mulig at VTA kan gi indirekte tilbakemelding gjennom andre distale regioner, via eksiterende mellomregioner som amygdala, eller med desinhibering via nucleus accumbens (NAc) eller bed nucleus of the stria terminalis (BNST).

Interessant, mens fotostimulering av Type 1-enheter fremkaller stimulerende responser i Type 2-enheter, viser Type 1 og 2 enheter tydelige atferdskodende egenskaper. For eksempel er antall Type 1- og Type 2-enheter som selektivt koder for belønningsforutsigende signal, signifikant forskjellige (n = 0/19 Type 1 versus n = 12/34 Type 2, chi-square = 8.67, p = 0.003) . Dette paradoksale responsmønsteret kan skyldes beregningsprosesser ved et mellomliggende kretselement, slik som VTA, som kan spille en aktiv rolle under atferdsoppgaven, men inaktiv under fotomerking. I tillegg kan dyrets atferdstilstand påvirke hvordan disse dataene behandles.

Våre belønningsforsøk eksperimenter tillot oss å skille mellom LH nevrale koding av CR og forbruket av ubetinget stimulus (USA). I disse forsøkene reagerte en delmengde av Type 2-enheter på belønningsprognose (CS) og USA, og viste også en nedgang i avfyringshastigheten når forventede belønninger ble utelatt. Videre viser en delmengde av Type 2-enheter også fasisk excitasjon ved uventet belønning levering (Tall 4G og 4H). Disse dataene minner om måten DA-nerveceller i VTA koder for belønningsprognosefeil (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Vi spekulerer i at VTA-neuroner kan overføre belønningsprognosefeilsignaler til en delmengde av LH-neuroner, som er godt posisjonert for å integrere disse signalene for å bestemme en passende atferdsutgang. Nærmere bestemt er LH robust sammenkoblet med en rekke andre hjerneområder (Berthoud og Münzberg, 2011) og har vært årsakssammenheng med homeostatiske tilstander som søvn / opphisselse og sult / metthet (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Tvangsmessig belønningssøkende oppførsel har primært blitt diskutert i sammenheng med narkotikamisbruk, hvor et klassisk paradigme for tvangsmessig narkotikasøk har vært å undersøke i hvilken grad narkotikasøkende atferd vedvarer i møte med en negativ konsekvens, for eksempel et fotsjokk (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren and Everitt, 2004). Vi tilpasset denne oppgaven for sukrose som ønsket å tillate oss å undersøke om aktivering av LH-VTA-banen var tilstrekkelig til å fremme tvangssukkarosøking. Gitt at en tydelig forskjell mellom medikament og naturlig belønning er at stoffbelønning ikke er nødvendig for å overleve, er det kontrovers om hvilken oppførsel som vil utgjøre tvangssukker- eller matsøkende atferd. En alternativ tolkning av dataene våre er at aktivering av LH-VTA-banen bare øker motivasjonsdriften eller trangen til å søke appetittvekkende forsterkere. Ettersom frekvensen av fedme har økt de siste tiårene (Mietus-Snyder og Lustig, 2008), er tvangsmessig overspising og sukkeravhengighet utbredte forhold som er en stor trussel mot menneskers helse (Avena, 2007). Fôringsatferden hos mettede (fullmatede) mus etter aktivering av LH-VTA-banen minner om spiseadferd sett hos mennesker diagnostisert med tvangsmessig overspisingsforstyrrelse (eller binge-eating disorder) (DSM-V).

Det har blitt foreslått at gjentatte handlinger fører til dannelsen av vaner, som selv fører til tvangsmessig belønning som kjennetegner avhengighet (Everitt og Robbins, 2005). Vår oppfatning at LH-VTA-neuroner bare koder for portinngang etter kondisjonering tyder på at denne banen er selektivt kodende for en betinget respons, ikke bare en motivert handling. Dette er i tråd med våre observasjoner at optisk aktivering av denne projeksjonen kan fremme tvangsmessig belønning som søker i møte med en negativ konsekvens (Figur 5C), så vel som i fravær av behov (som sett i sated mus, Figur 5E). Denne tolkningen er ytterligere begrunnet av vår konstatering av at fotoinhibering av LH-VTA-banen selektivt reduserer kompulsiv sukrose-søkende (Figur 5D) men reduserer ikke fôring hos matbegrensede mus (Figur 5F). En av de største utfordringene ved å behandle tvangsmessige overeating eller binge-spiseforstyrrelser er risikoen for å svekke fôringsegenskaper generelt. Fra et translasjonelt perspektiv kan vi ha identifisert en spesifikk nevrale krets som et potensielt mål for utvikling av terapeutiske inngrep for tvangsmessig overspising eller sukkeravhengighet uten å ofre naturlig fôringsadferd.

Vi viser at i tillegg til en glutamatergisk LH-VTA-komponent (Kempadoo et al., 2013), er det også en betydelig GABAergisk komponent i projeksjonen (Leinninger et al., 2009), og at LH-neuroner synapser direkte på både DA og GABA-nevroner i VTA (Figur 6). Imidlertid er det en forskjell i balansen mellom eksitatorisk / hemmende inngang på VTA DA og GABA nevroner.

Mens vi brukte immunohistokjemisk behandling for å verifisere identiteten til VTA-neuroner, måler vi også jeg_h, en hyperpolariseringsaktivert, innvendig korrigerende ikke-spesifikk kationestrøm (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). Tilstedeværelsen av denne strømmen har blitt brukt mye i elektrofysiologiske studier for å identifisere DA-neuroner, men det har vist seg å være tilstede bare i delpopulasjoner av DA-neuroner, avgrenset av projeksjonsmål (Lammel et al., 2011). Selv om det tidligere har blitt foreslått i en gjennomgang av Fields og kolleger at "LH neurons synapse onto VTA projections to the PFC, but not those projecting to the NAc" (Fields et al., 2007), foreslår våre data at denne kontroversen gjenåpnes for nærmere etterforskning. Selv om vi observerte en delmengde av DA-neuroner som mottok netto eksitasjon fra LH og hadde et veldig lite jeg_h (i samsvar med mPFC- eller NAc-medialskallprojiserende DA-neuroner), observerte vi også en delmengde av DA-neuroner som mottok nettopp eksitatorisk inngang og viste en stor I_h (i samsvar med karakteristika av DA-neuroner som projiserer til sideskallet til NAc; Figur S5; Lammel et al., 2011). Omvendt viste VTA DA-neuroner som mottok netto hemmende inngang, et veldig lite jeg_h eller manglet denne strømmen, noe som er i samsvar med forestillingen om at LH overveiende hemmende inngang på VTA DA-neuroner som projiserer til mPFC eller det mediale skallet til NAc. Vi viser også at LH-innganger kan observeres i både medial og lateral VTA, noe som tyder på at LH gir innganger på VTA-neuroner med forskjellige projeksjonsmål, da det er kjent at VTA-projeksjonsmål tilsvarer noe romlig beliggenhet langs en medial-lateral akse ( Lammel et al., 2008).

Rollen til LH-VTA-banen i å fremme belønning har tidligere blitt tilskrevet glutamatergisk overføring i VTA (Kempadoo et al., 2013), da CaMKIIα-promotoren ofte antas å være selektiv for eksiterende projeksjonsneuroner. Våre data viser imidlertid tydelig at å uttrykke ChR2 under kontroll av CaMKIIα-promoteren også målretter mot GABAergic projeksjonsneuroner i LH (Figur 6).

Oppførselen fremkalt av fotostimulering av LH^GABA-VTA-banen var frenzied, mis-directed og maladaptive (Film S4). En tolkning er at aktivering av LH^GABA-VTA-banen sender et signal til musen som forårsaker anerkjennelsen av en appetitiv forsterker. En alternativ tolkning er at LH^GABA-VTA-banen kan kjøre incitamentsalience eller en intens "ønsker", som er konsistent med et signal underliggende betinget tilnærming, men på et ikke-fysiologisk nivå som produserer denne avvigende foderrelaterte oppførselen (Berridge og Robinson, 2003). I samsvar med dette er det mulig at aktivering av LH^GABA-VTA-projeksjon produserer faktisk intense følelser av trang, eller oppfordrer til å mate. Imidlertid viser våre eksperimenter at aktivering av LH^GABA-VTA produserer ikke en økning i kompulsiv sukrose-søking, men dette skyldes trolig den overdrevne gnave og avvigende appetitiv oppførsel som er fokusert på ikke-matobjekter i testkammeret. Selv om det er vanskelig å bestemme opplevelsen av musen under denne manipulasjonen, er det klart at riktig rettet foderrelatert oppførsel krever koordinert aktivering av både GABAergic og glutamatergiske komponenter i LH-VTA-banen.

Optogenetiske og farmakogenetiske manipulasjoner er kraftige verktøy for å etablere årsaksforhold, men de avslører ikke de endogene, fysiologiske egenskapene til nevrale kretselementer. Vår studie forener informasjon om synaptisk tilkobling, den naturlig forekommende endogene funksjonen og årsakssrollen til LH-VTA-banen, noe som gir et nytt nivå av innsikt i hvordan informasjon er integrert i denne kretsen. Disse resultatene understreker viktigheten av å undersøke den funksjonelle rollen til nevroner ved tilkobling, i tillegg til genetiske markører. LH-VTA-neuroner selektivt kodet virkningen av belønningsøkning, men kodet ikke miljøstimuli, mens givende stimuli og belønnings-prediktive signaler ble kodet av en diskret populasjon av LH-neuroner nedstrøms for VTA. Videre har vi identifisert en bestemt projeksjon som er årsakssammenhengende med kompulsiv sukrose-søker og fôringsadferd. Heterogeniteten i LH-VTA-projeksjonen er nødvendig for å gi en adaptiv balanse mellom drivmotivasjon og regulering av hensiktsmessig rettet appetitiv oppførsel. Disse funnene gir innsikt som er relevant for patologiske forhold som kompulsiv overeating lidelse, sukkeravhengighet og fedme