Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Publisert på nettet 2017 May 20. gjør jeg: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstrakt
Mål / hypotese
Overeating av kosten fett forårsaker fedme hos mennesker og gnagere. Nylige studier hos mennesker og gnagere har vist at avhengighet av fett deler en felles mekanisme med avhengighet av alkohol, nikotin og narkotika når det gjelder en dysfunksjon av hjernekompensasjonssystemer. Det har blitt fremhevet at et høyt fett diett (HFD) demper dopamin D2-reseptor (D2R) signalering i striatumen, en pivotal regulator i hjernens belønningssystem, noe som resulterer i hedonisk overspising. Vi har tidligere rapportert at den brune risspesifikke bioaktive komponenten y-oryzanol svekket preferansen for en HFD via hypotalamisk kontroll. Vi undersøkte derfor muligheten for at y-oryzanol ville modulere funksjonen av hjernebelønningssystemet hos mus.
Metoder
Mann C57BL / 6J-mus matet en HFD ble oralt behandlet med y-oryzanol, og striatalnivåer av molekyler involvert i D2R-signalering ble evaluert. Virkningen av y-oryzanol på DNA-metylering av D2R-promotoren og påfølgende endringer i preferanser for diettfett ble undersøkt. I tillegg ble effekten av 5-aza-2'-deoksycytidin, en potent hemmer av DNA-metyltransferaser (DNMTs), på matpreferanse, D2R-signalering og nivåene av DNMT i striatum, undersøkt. De hemmende virkningene av y-oryzanol på aktiviteten til DNMT ble evaluert enzymatisk in vitro.
Resultater
I striatum fra mus matet en HFD, ble produksjonen av D2R redusert via en økning i DNA-metylering av promotorområdet i D2R. Oral administrering av y-oryzanol reduserte ekspresjonen og aktiviteten til DNMTs, og derved gjenopprettes nivået av D2R i striatumet. Farmakologisk inhibering av DNMT med 5-aza-2'-deoksycytidin forbedret også preferansen for diettfett. I overensstemmelse med disse funnene viste enzymatiske in vitro-analyser at y-oryzanol hemmet aktiviteten til DNMTs.
Konklusjoner / tolkning
Vi demonstrerte at y-oryzanol forbedrer HFD-indusert DNA-hypermetylering av promotorområdet av D2R i musenes striatum. Vårt eksperimentelle paradigme fremhever y-oryzanol som en lovende antiobesity substans med den skarpe egenskapen til å være en roman epigenetisk modulator.
Elektronisk tilleggsmateriale
Den elektroniske versjonen av denne artikkelen (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) inneholder peer-reviewed, men unedited supplementary material, som er tilgjengelig for autoriserte brukere.
Introduksjon
Overeating hos overvektige individer deler, i hvert fall delvis, vanlige mekanismer med avhengighet av alkohol, nikotin og narkotika [1]. I tillegg til hypotalamisk og hormonell regulering av appetitt, er hjernebelønningssystemet, spesielt dopaminreceptorsignal, nært knyttet til vanedannende eller hedonisk fôringsadferd [2]. En tidligere studie hos rotter viste at knockdown av striatal dopamin D2-reseptoren (D2R) ved lentivirus-mediert kort hårnål forstyrrende RNA raskt inducerte avhengighetslignende belønning underskudd og tvangsmessig mat søker [3]. På grunn av den reduserte D2R-tettheten, er dorsalstriatumet mindre responsivt mot matbelønning sammenlignet med magre kontrollgrupper hos obese mennesker og gnagere [3-5]. I samsvar med denne oppfatningen TaqIA allelen av ANKK1 gen-locus (kodende for DRD2 / ankyrinrepetisjon og kinasedomene som inneholder 1), som reduserer striatal D2R-produksjon, er assosiert med en obese fenotype hos mennesker [6], mens effektene av vekttap etter bariatrisk kirurgi er forbundet med forhøyet striatal D2R tetthet [7]. Disse dataene foreslår sterkt viktigheten av striatal D2R som et nytt terapeutisk mål for behandling av fedme. Men noen stoffer som ble utviklet som handlet på hjernekompensasjonssystemet, forårsaket betydelige bivirkninger, inkludert alvorlige psykiatriske problemer, noe som resulterte i at de kunne trekke seg tilbake fra klinikker [8].
Epigenetiske modifikasjoner er kritiske, ikke bare for utvikling og differensiering, men også fordi de oppstår som følge av miljøforandringer, inkludert i kosthold og livsstil [9]. DNA-metylering er en epigenetisk hendelse for stabiliteten av genuttrykk [9]. Hos rotter forandrer mors eksponering for høyt fett diett (HFD) generasjon av DNA-metylering i det sentrale belønningssystemet i avkom, noe som fører til overforbruk av HFD av valpene [10]. Spesielt spiller DNA-metyltransferaser (DNMTs) kritiske roller i reguleringen av både føderadferd og fysisk aktivitet [10, 11], noe som tyder på at DNMT kan være lovende terapeutiske mål for behandling av fedme-diabetes syndrom. Viktig er at noen naturlige mat-avledede stoffer, inkludert koffein syre og epigallocatechin, er kjent for å fungere som DNMT-hemmere [12, 13].
Vi har nylig vist at den bioaktive, brune ris-spesifikke komponenten y-oryzanol, en blanding av ferulsyreester og flere fytosteroler, demper preferansen for diettfett via en reduksjon i hypotalamisk endoplasmatisk retikulum (ER) stress [14]. Hos mus og kaniner ble oralt administrert y-oryzanol absorbert raskt fra tarmen og distribuert hovedsakelig til hjernen [15, 16]. Ved å ta disse funnene sammen, kan naturlige mat-avledede produkter som virker på sentralnervesystemet være et alternativ til å sikre verre fosterskader i fedme på en trygg måte. I denne sammenheng testet vi hypotesen om at y-oryzanol ville endre DNA-metyleringsstatus i hjernekompensasjonssystemet, noe som resulterte i en demping av preferansen for en HFD hos mus.
Metoder
dyr
Syv uker gamle C57BL / 6J hannmus oppnådd fra Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japan) ble plassert (3-4 per bur) under spesifikke patogenfrie forhold ved 24 ° C under 12 timer / 12 timer lys / mørk syklus. Etter en ukes akklimatisering ble 8 uker gamle mus vektmatchet og delt inn i to eller tre grupper for å gjennomgå hvert eksperiment. Musene fikk fri tilgang til mat og vann. Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Experiment Ethics Committee ved University of the Ryukyus (nr. 5352, 5718 og 5943).
Administrasjon av y-oryzanol og 5-aza-2'-deoksycytidin
For å evaluere preferansen for HFD, ble y-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) administrert til 8-uker gamle mus ved sondring under matvalgetesten som tidligere beskrevet [14, 17]. For de andre forsøkene ble en HFD (D12079B, forskningsdiett, New Brunswick, NJ, USA) inneholdende 0.4% y-oryzanol produsert som pellets. Komponentene i dietten er vist i ESM-tabell (Electronic Supplementary Material) 1. Etter 12 ukers fôring ble vev samlet fra striatum og hypothalamus. Det daglige inntaket av γ-oryzanol, estimert fra gjennomsnittlig matinntak av musene, var omtrent 320 μg / g kroppsvekt. Dosene av y-oryzanol ble bestemt som tidligere beskrevet [14]. 5-aza-2'-deoksycytidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ble injisert intraperitonealt (0.25 μg / g kroppsvekt) tre ganger i uken i 12 uker [18].
Beregning av preferanse for diettfett
For å evaluere preferanser for kostholdsfett ga matforsøk et valg mellom chow og HFD (D12450B og D12451; Research Diets) som tidligere beskrevet [14]. Komponentene av diett er vist i ESM Table 1. Kort fortalt fikk musene fri tilgang til chow og HFD. Inntak av chow og HFD ble målt ukentlig og analysert for endringer i preferanser for diettfett. HFD-preferanse ble beregnet i henhold til formelen: HFD-preferanse = [(HFD-inntak / totalt matinntak) × 100].
Bisulfitt-sekvensering for DNA-metylering
DNA ble renset ved bruk av et DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). DNA-løsningen ble blandet med nypreparert 3 mol / l NaOH, inkubert ved 37 ° C i 15 minutter og tilsatt til 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l natriumbisulfitt og 4.9 mmol / l hydrokinon. Løsningen ble utsatt for 15 sykluser av denaturering ved 95 ° C i 30 s og inkubasjon ved 50 ° C i 15 minutter [19]. Det bisulfittbehandlede DNA ble renset ved hjelp av MinElute PCR-rensingssett (QIAGEN) og amplifisert ved PCR ved bruk av et KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR-sett (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) og primere rundt CpG-stedet i promotorområdet D2R . Primersekvensene var som følger: Fremre primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; revers primer, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Deretter ble adapter-sekvensene tilsatt og renset opp ved bruk av Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Prøver ble deretter samlet og lastet på en GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) for sekvensering i henhold til produsentens protokoll. Methyleringsnivået ble uttrykt som prosentandelen metylerte cytosiner i alle cytosinerrester.
DNMT aktivitetsanalyse
DNMT-enzymatisk aktivitetsanalyse ble utført under anvendelse av et EpiQuik DNA-metyltransferaseaktivitets- / inhiberingsassaysett (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) og EPI-genet Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) i henhold til produsentens protokoller.
For å bedømme den hemmende aktivitet av hver forbindelse på DNA-metylering, dannelsen av S-adenosyl-l-homocystein (SAH) ble målt i nærvær av hver forbindelse (20 μmol / l for screeninganalyser), S-adenosylmetionin (SAM; 10 μmol / l) og DNMT-substrat (4 ng / ul) ved 37 ° C i 90 minutter. For å evaluere Michaelis – Menten-kinetikken ble DNMT1 (20 μmol / l) inkubert med γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) og den indikerte konsentrasjonen av poly dI-dC ved 37 ° C i 90 minutter. DNMT3a (100 μmol / l) og DNMT3b (100 μmol / l) ble inkubert med γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) og den indikerte konsentrasjonen av poly dG · dC ved 37 ° C i 120 minutter. Analysene ble utført i fire eksemplarer. Ekstrahert protein (0.75 mg / ml) ble inkubert med SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml) og poly dG · dC (5 μg / ml) ved 40 ° C i 120 minutter, og SAH-dannelse ble målt.
Estrogen-relatert reseptor-y aktivitetsanalyse
Den potensielle antagonistiske aktiviteten til γ-oryzanol på det østrogenrelaterte reseptoren-γ (ERRγ) ble vurdert ved hjelp av Human Estrogen-Related Receptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble ikke-humane pattedyrreporterceller som konstitutivt uttrykker aktiv ERRγ eksponert for de angitte konsentrasjonene av hver forbindelse i 24 timer i tre eksemplarer.
Western blotting
Dette ble utført som tidligere beskrevet [20] med antistoffer mot D2R (1: 500, kanin), dopamintransportør (DAT; 1: 500, kanin), tyrosinhydroksylase (TH; 1: 1000, kanin) (AB5084P, AB1591P og AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), signaltransduser og aktivator for transkripsjon 3α (STAT3α; 1: 1000, kanin), DNMT1 (1: 1000, kanin), DNMT3a (1: 1000, kanin) (nr. 8768, 5032 og 3598; Cellesignaleringsteknologi, Tokyo, Japan), DNMT3b (1 μg / ml, kanin), ERRγ (1: 1000, kanin) og β-aktin (1: 10,000, mus) (ab16049, ab128930 og ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Kvantitativ sanntids-PCR
Genuttrykk ble undersøkt som tidligere beskrevet [14]. mRNA-nivåene ble normalisert til Rn18s (18S rRNA). Primersettene som brukes for de kvantitative sanntids-PCR-analysene er oppsummert i ESM Table 2.
Statistisk analyse
Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. Enveis ANOVA og gjentatte målinger ANOVA etterfulgt av flere sammenligningstester (Bonferroni – Dunn-metoden) ble brukt der det var aktuelt. Studentens t test ble brukt til å analysere forskjeller mellom to grupper. Forskjeller ble vurdert som signifikante på p <0.05.
Resultater
Farmakologisk inhibering av DNMT ved 5-aza-dC dempet preferansen for diettfett i mus
I mus fôret HFD ble DNA-metylering i promotorregionen av D2R i striatum betydelig forbedret sammenlignet med mus som matet en chow diett (Fig. (Fig.1a) .1en). På den annen side var hypotalamisk DNA-metylering i promotorregionen av D2R tilsynelatende høyere enn den i striatumen under en chow diett (p <0.01) (fig. (Fig.1a, 1a, f) og ble ikke endret av HFD (fig. (Fig.1f) .1f). I mus som matet HFD, ble den forsterkede DNA-metyleringen i promotorområdet av D2R i striatum normalisert ved behandling med 5-aza-dC, en sterk DNMT-inhibitor (Fig. (Fig.1a) .1en). I kontrast ble DNA-metylering i promotorregionen av D2R i hypothalamus ikke signifikant endret ved behandling med 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). I striatum av 20 uker gamle hannmus som matet HFD i 12 uker, ble mRNA og proteinnivåer av D2R signifikant redusert (fig. (Fig.1b, 1b, k, l). I kontrast, nivåer av dopamin D1 reseptorer (D1Rs, kodet av Drd1), som virker på motsatt måte til D2R på adenylyl-syklase og cAMP-mediert intracellulær signalering, var uendret (Fig. (Fig.1c) .1c). Videre var det ingen endring i nivåene av andre molekyler relatert til D2R-signalering, slik som TH og DAT ved mRNA og / eller proteinnivået (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). På den annen side ble det ikke observert noen tilsynelatende endringer i hypothalamus, inkludert for D2R (Fig. (Fig.1g-m) .1g-m). Spesielt var proteinnivåene av D2R og TH i hypothalamus mye lavere enn de i striatumet (fig. (Fig.1l, 1l, m), muligens reflekterer den relative betydningen av dopaminreseptorsignalering i hjernebelønningssystemet sammenlignet med hypothalamus.
For å undersøke om DNA-metylering i promotorområdet av D2R ville endre preferansen for diettfett, ble foderadferdigheten til 5-aza-dC-behandlede mus analysert. Som forventet økte 5-aza-dC signifikant mRNA og protein nivåer for D2R i striatum av HFD-matede mus (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). På den annen side var det ingen effekt på nivåer av Drd1, Th og Slc6a3 (kodende DAT) i striatum, eller på nivåer av Drd2, Drd1, Th og Slc6a3 i hypothalamuset (fig. (Fig.1c-e, 1c-e, g-m). Mens vehikelbehandlede mus foretrukket HFD, var preferansen for HFD signifikant redusert i 5-aza-dC-behandlede mus (88% av verdiene for vehikelbehandlede mus) (Fig. (Fig.1n) .1n). Følgelig reduserte behandlingen med 5-aza-dC gevinsten i kroppsvekt (Fig. (Fig.11o).
y-oryzanol reduserer nivåene av DNMT i striatum av HFD-matede mus
Som vi tidligere rapporterte [14], ble oral administrering av y-oryzanol til hannmus ved hjelp av forsinkelse svekket fortrinnsvis for en HFD (93% av verdiene for vehikelbehandlede mus) (Fig. (Fig.2a), 2a), noe som resulterer i en tilsynelatende demping av kroppsvektsøkning (fig. (Fig.2b) .2b). Vi undersøkte derfor den potensielle effekten av y-oryzanol på epigenetisk modulering av D2R i striatumet.
I pattedyr er det tre store DNMTs-DNMT1, 3a og 3b. DNMT1 fungerer for å opprettholde DNA-metylering, mens DNMT3a og 3b spiller en rolle for å lette de novo DNA-metylering [21]. For å undersøke den potensielle effekten av y-oryzanol på DNMTs in vivo, evaluerte vi nivåer av DNMT i hjernen til HFD-matede mus. Selv om HFD i seg selv ikke hadde noen effekt på mRNA og protein nivåer av DNMT i enten striatum eller hypothalamus, økte tilskudd med y-oryzanol signifikant dNMT-nivåer i striatumet, men ikke i hypothalamus (Fig. (Fig.2c-e, 2c-e, g-i, k-n). Disse dataene øker muligheten for at y-oryzanol kan regulere nivåer av DNMT på en striatum-spesifikk måte. På lignende måte reduserte 5-aza-dC signifikant mRNA-nivåene av DNMT3a og 3b fortrinnsvis i striatumet (ESM Fig. 1a-d).
På grunnlag av en tidligere studie som viste at mRNA-nivået av DNMT1 var positivt regulert, i det minste delvis ved atom-reseptoren ERRγ [22], undersøkte vi den potensielle effekten av y-oryzanol på ERRγ-aktivitet. I ikke-humane pattedyrceller som uttrykker aktivt ERRγ, 4-hydroksytamoxifen, en potent invers agonist av ERRγ, markert redusert ERRγ-aktivitet. Av oppmerksomhet reduserte y-oryzanol delvis ERRγ-aktivitet (en omtrentlig 40% reduksjon av den medfødte verdien) (Fig. (Fig.3a) .3en). Det var viktig at ERRY var svært uttrykt i striatumen, men ikke i hypothalamusen (fig. (Fig.3b-d) .3b-d). I motsetning til situasjonen for striatum økte y-oryzanol signifikant proteinnivåer av DNMT1 bare i hypothalamus (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Disse resultatene kan forklares, i hvert fall delvis ved å finne ut at STAT3α, en positiv regulator av DNMT1 nivå [23], ble uttrykt rikelig i hypothalamus, men ikke i striatumet (fig. (Fig.33e-g).
For ytterligere å vurdere effekten av y-oryzanol på aktiviteten til DNMTs in vivo, ble dannelsen av SAH, et biprodukt av DNA-metylering og også en sterk inhibitor av DNMT, evaluert i y-oryzanolbehandlede mus som matet HFD. Det var ingen signifikante endringer i SAH-dannelse i enten striatum eller hypothalamus mellom HFD-matede og chow-matede mus (fig. (Fig.2f, 2f, j). Merkbart redusert y-oryzanol signifikant SAH-dannelse i striatumet (fig. (Fig.2f) 2f) men ikke i hypothalamusen (fig. (Fig.2j), 2j), noe som tyder på at y-oryzanol kan undertrykke aktiviteten av DNMTs på en striatum-spesifikk måte i HFD-matede mus.
Enzymatiske analyser på inhibitoriske egenskaper av y-oryzanol for DNMTs in vitro
Vi vurderte deretter virkningen av y-oryzanol på aktiviteten av DNMTs in vitro. De inhibitoriske potensene for y-oryzanol, ferulinsyre, 5-aza-dC, haloperidol (en representativ D2R-antagonist), kinpirole (en representativ D2R-agonist) og SAH mot DNMTs ble evaluert. Som en positiv kontroll dempet SAH sterkt aktivitetene til DNMTs på en doseavhengig måte (Fig. (Fig.4a-f) .4a-f). Som forventet viste haloperidol og quinpirole ingen effekt på aktivitetene til DNMTs (ESM Fig. 2). Merkbart hemmet y-oryzanol signifikant aktivitetene til DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) og 3b (maksimal hemning 57%) (fig. (Fig.4d-f) .4d-f). I motsetning hertil var inhibitorisk aktivitet av ferulinsyre, en metabolitt av y-oryzanol, mye lavere enn den for y-oryzanol (fig. (Fig.44d-f).
Vi undersøkte ytterligere de hemmende egenskapene til y-oryzanol på DNMTs. Dannelsen av SAH ble målt for å bestemme inhibitorisk aktivitet av y-oryzanol på DNMTs in vitro. Data på SAH-dannelse under DNMT-mediert DNA-metylering indikerer et mettet mønster av Michaelis-Menten kinetikk for både nærvær og fravær av y-oryzanol (fig. (Fig.4g-i) .4g-i). I DNMT1-mediert DNA-metylering viste Eadie-Hofstee-analyse at y-oryzanol ikke viste noen effekt på V max av SAH-dannelse (bærer, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), mens γ-oryzanol tilsynelatende økte K m (kjøretøy, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (fig. (Fig.4j) .4j). Disse resultatene antyder at y-oryzanol hemmer DNMT1 i hvert fall delvis på en konkurransedyktig måte. På den annen side, for DNMT3a- og 3b-mediert DNA-metylering, reduserte y-oryzanol den V max av dannelse av SAH (DNMT3a: bærer, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: bærer, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) og tilsvarende K m for denne reaksjonen (DNMT3a: bærer, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: bærer, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (fig. (Fig.4k, 4k, l). Disse resultatene antyder at y-oryzanol hemmer DNMT3a og 3b i det minste delvis på en ikke-konkurransedyktig måte.
y-oryzanol øker nivåene av D2R i striatum av HFD-matede mus
Vi testet nå muligheten for at y-oryzanol øker striatal D2R-innhold gjennom en inhibering av DNMT. HFD-matede mus reduserte oral administrering av y-oryzanol signifikant striatal DNA-metylering i promotorområdet av D2R (fig. (Fig.5a), 5a), mens det ikke gjorde dette i hypothalamusen (fig. (Fig.5f) .5f). I samsvar med disse funnene ble mRNA og protein nivåer av D2R økt gjensidig (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). I likhet med dataene på behandling med 5-aza-dC (fig. (Fig.1), 1), var det ingen tilsynelatende effekter på RNA og protein nivåer av Drd1, Th og Slc6a3 (DAT) i striatum, og ingen effekter på nivåer av Drd1, Th og Slc6a3 i hypothalamuset (fig. (Fig.5c-e, 5c-e, h-k, m).
Tidligere studier har vist at nivåene av D2R og DNMT1 er regulert av ER stress og betennelse i det minste delvis via NF-KB [17, 24, 25]. Vi undersøkte derfor nivåene av ER-stressrelaterte og betennelsesrelaterte gener. Som tidligere vist [26] økte HFD ekspresjonen av gener kodende for TNF-a (TNFa), monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP homologt protein (Hugge), ER-lokalisert DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) og den spleiseformede form av X-boks bindende protein 1 (Xbp1s) i hypothalamus, men ikke i striatumet (fig. (Fig.6) .6). Spesielt redusert tilskudd av HFD med y-oryzanol signifikant det forsterkede uttrykket av Ccl2, Hugge, Dnajb9 og Xbp1s utelukkende i hypothalamus, men ikke i striatumet (fig. (Fig.66).
Diskusjon
Hovedfunnet i den foreliggende studien er at y-oryzanol virker som en potent DNMT-inhibitor i musenes striatum, og derved demper, i det minste delvis, preferansen for en HFD via epigenetisk modulering av striatal D2R. I striatum fra HFD-matede mus ble nivåene av D2R redusert betydelig, mens de av D1R, TH og DAT ikke ble forandret (Fig. (Fig.1b-e, 1b-e, k-m). Disse dataene stemmer overens med oppfatningen at dysregulering av striatal D2R spiller en kritisk rolle i oppfatningen av matbelønning når det er på en HFD, noe som fører til hedonisk overforbruk av HFD hos overvektige dyr [3]. I den foreliggende studien økte behandlingen av HFD-matede mus med 5-aza-dC signifikant nivåer av striatal D2R (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) muligens gjennom en reduksjon i DNA-metyleringsnivå i promotorområdet av D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), og dermed dempet preferansen for diettfett (Fig. (Fig.1n) .1n). Dette funnet støtter også en kritisk rolle av striatal D2R i oppfatningen av matbelønning når den er på en HFD.
Vår in vitro-analyse viste at den hemmende aktiviteten til y-oryzanol mot DNMT var tilsynelatende sterkere enn den av metabolitten ferulinsyre (Fig. (Fig.4d-f), 4d-f), noe som tyder på betydningen av den komplette strukturen av y-oryzanol for sin inhiberende virkning på DNMTs. HFD-matte mus antyder våre studier at γ-oryzanol etter oral administrering når hjernen som en komplett struktur og reduserer DNMTs nivåer og aktiviteter fortrinnsvis i striatumen, med en tilsvarende reduksjon i DNA-metylering i promotorregionen av D2R i striatumet. Videre har våre in vitro-studier vist at y-oryzanol virker som en delvis antagonist mot ERRγ, som primært tjener som en positiv regulator for DNMT1-produksjon [22], og dermed redusert aktiviteten til DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3en). Av oppmerksomhet var ERRY høyt uttrykt i striatumet, men ikke i hypothalamus hos mus (fig. (Fig.3b) .3b). Disse dataene antyder at y-oryzanol har potensial til å redusere mRNA-nivået av DNMT1, i hvert fall delvis gjennom inhibering av ERRγ. I motsetning til striatum viste y-oryzanol ingen effekt på nivået av D2R i hypothalamus fra HFD-matede mus (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
På den annen side viste vi at γ-oryzanol økte signifikant nivåene av DNMT1 i hypothalamus, men ikke i striatumet (fig. (Fig.2k, 2k, l). Det har vist seg at STAT3 øker innholdet i DNMT1 i ondartede T-lymfomceller [23]. Spesielt viste vi tidligere at γ-oryzanol økte signifikant leptininducert STAT3-fosforylering i hypotalamus fra HFD-matede mus [14]. Det skal også bemerkes at STAT3a ble vesentlig uttrykt i hypothalamus, men ikke i striatum i musene (fig. (Fig.3e-g) .3e-g). Disse dataene frister oss til å spekulere på at den tilsynelatende forskjellen i effekten av y-oryzanol på nivåer av DNMT1 mellom hypothalamus og striatum kan tilskrives, i det minste delvis, til det regionsspesifikke innholdet i STAT3a og ERRγ i hjernen til mus ( Fig. (Fig.3b-g) .3b-g). Samlet ser det ut til å være et gjensidig mønster av uttrykk for ERRγ og STAT3a mellom striatum og hypothalamus hos mus. På grunnlag av resultatene er det derfor rimelig å spekulere det i striatum, hvor ERRγ-produksjonen er rikelig, kan y-oryzanol fortrinnsvis redusere mRNA-nivået og enzymaktiviteten til DNMT1 som en negativ regulator for ERRγ. I motsetning, i hypotalamus, hvor STAT3α-produksjon er dominerende, kan y-oryzanol fortrinnsvis øke nivåene av DNMT1.
En nylig studie viste at en demping av striatal D2R-signalering indusert av en HFD dysregulerer tilførselsadferd [3], som tyder på den potensielle betydningen av inhiberingen av striatal DNMT for behandling av fedme. På den annen side viste en tidligere studie en mulighet for at statusen for DNA-metylering av melanokortinreceptor 4-genet uttrykt i spesifikke hypotalamuskjerner kunne modulere transgenerasjonelle former for fedme hos agouti-levedyktige gule mus [27]. Selv om ytterligere studier er berettiget til å belyse de underliggende mekanismer, tyder disse studiene på viktigheten av vev-, gen- og sekvens-spesifikk DNA-metylering i patofysiologien av HFD-indusert fedme.
Vi rapporterte nylig at HFD økte nivået av D2R i bukspyttkjertelen på musene [17, 24]. Det er sannsynlig at slik forstørrelse formidles, i det minste delvis, av ER-stress og betennelse via NF-KB, fordi det er flere NF-KB-responsive elementer i promotorområdet D2R [17, 24]. Videre har en nylig studie vist at TNF-a og IL-1β øker nivået og aktiviteten til DNMT1 i fettvev fra HFD-matede mus [25]. Viktigst viste den foreliggende studien at HFD induserte ER-stress og betennelse fortrinnsvis i hypothalamus, men ikke i striatumet (Fig. (Fig.6) .6). Dyptgående mekanismer for vev-, region- og områdespesifikke DNA-metylering og demetylering i vårt eksperimentelle paradigme må avvente videre undersøkelse.
Sammen med vår tidligere rapport som viser at y-oryzanol demper preferansen for en HFD via hypotalamisk regulering av ER-stress hos mus [14], representerer y-oryzanol også en unik egenskap for å forbedre både hedonisk og metabolsk dysregulering av fôringsadferd. Fordi noen antiobesity-legemidler som er blitt utviklet, er kjent for å forårsake kritiske bivirkninger [8], er en naturlig matbasert tilnærming mot hjernebelønningssystemet forventet å behandle fedme-diabetes-syndrom trygt [16]. I dette paradigmet er y-oryzanol en lovende antiobesity kandidat med en distinkt egenskap av å være en epigenetisk modulator.
Takk til
Vi er takknemlige for S. Okamoto (Ryukyus universitet, Japan) for å gjennomgå manuskriptet. Vi takker M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato og C. Noguchi (Ryukyus Universitet, Japan) for sekretærhjelp.
Forkortelser
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | Dopamin D1-reseptor |
| D2R | Dopamin D2-reseptor |
| DAT | Dopamin transportør |
| DNMT | DNA-metyltransferase |
| ER | Endoplasmatisk retikulum |
| ERR | Østrogen-relatert reseptor |
| HFD | Høyt fett diett |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocystein |
| SAM | S-Adenosylmetionin |
| STAT3α | Signal transducer og aktivator av transkripsjon 3a |
| TH | Tyrosinhydroksylase |
Merknader
Datatilgjengelighet
Datasett generert og / eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelige forespørsler.
Finansiering
Dette arbeidet ble delvis støttet av Grants-in-Aid fra Japan Society for Promotion of Science (JSPS, KAKENHI Grant Numbers 15K19520 og 24591338), Rådet for Vitenskap, Teknologi og Innovasjon (CSTI), Kryssministerial Strategic Innovation Promotion Program (SIP) "Technologies for å skape neste generasjons landbruk, skogbruk og fiskeri", Lotte Foundation, Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy og Industrial Technology Development Organisation (NEDO), prosjektet for dannelse av Life Science Network (Pharmaceutical Field ) (Okinawa prefektur, Japan) og Promotion Project of Medical Clustering i Okinawa Prefecture, Japan, sammen med et stipend fra Okinawa Prefecture for å fremme avansert medisin (Okinawa Prefecture, Japan).
Duality of Interest
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interesser knyttet til dette manuskriptet.
Bidragserklæring
CK og HM utformet forskningen. CK og TK utførte forsøkene og analyserte dataene. TK, CS-O, CT, MT, MM og KA bidro til tolkning av data. CK og HM skrev manuskriptet. Alle forfattere bidro til datatolkning. Alle forfattere begynte å revidere manuskriptet og godkjente sin endelige versjon. HM er garantisten for dette arbeidet, hadde full tilgang til alle dataene og tar fullt ansvar for dataets integritet og nøyaktigheten av dataanalysen.
Fotnoter
Elektronisk tilleggsmateriale
Den elektroniske versjonen av denne artikkelen (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) inneholder peer-reviewed, men unedited supplementary material, som er tilgjengelig for autoriserte brukere.
Referanser