FACS identyfikuje unikalną regulację genów wywołaną kokainą w selektywnie aktywowanych neuronach prążkowia dorosłych (2011) - mały% neuronów prążkowia

J Neurosci. Rękopis autora; dostępny w PMC 16 września 2011 r.
Opublikowany w końcowym edytowanym formularzu jako:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Ostateczna, zredagowana wersja tego artykułu jest dostępna bezpłatnie pod adresem J Neurosci
Zobacz inne artykuły w PMC, że cytować opublikowany artykuł.

Abstrakcyjny

Liczne badania z markerem aktywności nerwowej Fos wskazują, że kokaina aktywuje jedynie niewielką część słabo rozmieszczonych neuronów prążkowia. Do tej pory nie były dostępne skuteczne metody oceny neuroadaptacji indukowanych specyficznie w tych aktywowanych neuronach. Wykorzystaliśmy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do oczyszczenia neuronów prążkowia aktywowanych podczas lokomocji indukowanej kokainą u osób naiwnych i uwrażliwionych na kokainę cfos-lacZ transgeniczne szczury. Aktywowane neurony znakowano przeciwciałem przeciwko β-galaktozydazie, produktowi białkowemu genu lacZ. Cokaina indukowała unikalny profil ekspresji genów selektywnie w niewielkiej części aktywowanych neuronów, czego nie zaobserwowano w nieaktywowanej większości neuronów. Geny te obejmowały zmienione poziomy bezpośrednich wczesnych genów łuk, fosB, nr4a3, jak również geny zaangażowane w sygnalizację p38 MAPK i specyficzność typu komórkowego. Proponujemy, aby tę metodę FACS można było zastosować do badania neuroadaptacji molekularnych w określonych neuronach kodujących skutki behawioralne nadużywanych leków i inne wyuczone zachowania.

Słowa kluczowe: uczulenie na kokainę, jądro półleżące, zespoły neuronowe, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

WPROWADZENIE

Główną hipotezą obecnych badań neurobiologicznych nad uzależnieniem od kokainy jest to, że przewlekła ekspozycja na kokainę powoduje długotrwałe neuroadaptacje w prążkowiu i innych elementach mezolimbicznego dopaminowego obwodu nagrody, co prowadzi do kompulsywnego zażywania narkotyków i długotrwałej podatności na nawroty (Nestler, 2001; Shaham and Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers i in., 2010; Wolf and Ferrario, 2010). Hipoteza ta opiera się jednak na licznych badaniach ograniczających się do pomiaru neuroadaptacji w homogenatach obszarów mózgu lub w neuronach wybranych niezależnie od ich stanu aktywacji podczas zachowania.

Rozróżnienie między neuroadaptacjami w neuronach aktywowanych i nieaktywowanych jest ważne, ponieważ mogą one odgrywać inną rolę w fizjologicznych, behawioralnych i psychologicznych skutkach kokainy. Liczne badania z markerem aktywności nerwowej Fos wskazują, że kokaina aktywuje jedynie niewielką część słabo rozmieszczonych neuronów w prążkowiu. Po kontekstowo-specyficznym uczuleniu narządu ruchu wykazaliśmy, że Fos jest indukowany tylko wtedy, gdy szczurom wstrzyknięto w środowisku skojarzonym z lekiem, a nie w środowisku niesparowanym (Mattson i in., 2008; Koya i in., 2009). Co najważniejsze, wykazaliśmy, że te selektywnie aktywowane neurony odgrywają przyczynową rolę w wyuczonym związku między kokainą a środowiskiem leku, które pośredniczy w uczuleniu specyficznym dla kontekstu (Koya i in., 2009). Zatem neuroadaptacje w obrębie selektywnie aktywowanych neuronów prążkowia mogą odgrywać wyjątkową i ważną rolę w uczeniu się podczas uwrażliwienia kontekstowego i innych zachowań wywołanych lekami.

Do tej pory ograniczenia techniczne utrudniały ocenę zmian molekularnych w niewielkiej liczbie rzadko rozmieszczonych neuronów selektywnie aktywowanych podczas zachowania. Techniki takie jak mikrodysekcja wychwytu laserowego (Kwon i Houpt, 2010) i podwójnie znakowana immunohistochemia (Berretta i in., 1992; Gerfen i in., 1995; Peters i in., 1996) są w stanie selektywnie identyfikować zmiany molekularne w aktywowanych neuronach, ale techniki te mają bardzo niską wydajność lub nie są ilościowe. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) może być skutecznym narzędziem do oczyszczania dorosłych populacji neuronów do analizy molekularnej (Liberles i Buck, 2006; Lobo i in., 2006). Jednakże FACS nie był stosowany do oczyszczania neuronów na podstawie ich stanu aktywacji. W bieżącym badaniu wykorzystaliśmy FACS do oczyszczenia rozproszonych neuronów prążkowia aktywowanych kokainą z transgenicznych cfos-lacZ szczury i porównali ich unikalne wzorce ekspresji genów z tymi w nieaktywowanej większości neuronów.

METODY

Zwierzęta

Kobieta cfos-lacZ szczury transgeniczne (Kasof i in., 1995; Koya i in., 2009) i samice szczurów Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, Karolina Północna, USA) trzymano osobno w standardowych plastikowych klatkach w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Utrzymywano je w cyklu odwróconego światła i ciemności o godzinie 12:12 (światła włączały się o godzinie 20.00:7) i zapewniano im swobodny dostęp do pożywienia i wody. Przed podaniem leków, zwierzęta aklimatyzowano do tych warunków przetrzymywania przez co najmniej XNUMX dni. Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt NIDA.

Leczenie lekami

W przypadku ostrych eksperymentów z kokainą, szczurom wstrzyknięto kokainę (30 mg/kg, ip; n=8) lub sól fizjologiczną (1 ml/kg; n=6) i umieszczono w okrągłej komorze z pleksiglasu (o średnicy 38 cm). Szczury uśmiercono 90 minut po wstrzyknięciu w celu uzyskania tkanki mózgowej. Traktowanie to powtórzono trzy razy w różne dni, aby uzyskać trzy repliki biologiczne do analizy mikromacierzy. Dodatkowo, w podobny sposób wytworzono trzy niezależne repliki biologiczne do ilościowej reakcji PCR (qPCR). Do analiz qPCR arc, pdyn, adora2awykorzystano tylko te trzy niezależne repliki biologiczne. Do analiz qPCR fosB, nr4a3, kcnc1 i map2k6, wykorzystaliśmy również pozostały RNA z każdej próbki mikromacierzy.

W przypadku powtarzanych eksperymentów z kokainą samice szczurów uwrażliwiano czterema zastrzykami kokainy (15 mg/kg ip) podawanych raz na drugi dzień. W dniu wstrzyknięcia każdego szczura umieszczano w komorze aktywności ruchowej z pleksiglasu o wymiarach 43 x 43 cm kwadratowej (Med Associates, St Albans, VT, USA) w celu przyzwyczajenia na 30 minut. Szczurom wstrzykiwano kokainę i rejestrowano aktywność lokomotoryczną jako przebyty dystans przez 60 minut. Po czwartym wielokrotnym wstrzyknięciu kokainy szczury pozostawały w klatce przez 7–8 dni. W dniu testu szczury przyzwyczajano przez 30 minut do komór aktywności ruchowej, a następnie wstrzykiwano im kokainę (30 mg/kg ip) lub nośnik soli fizjologicznej. Szczury dekapitowano i pobierano mózgi dziewięćdziesiąt minut po wstrzyknięciu. Całe leczenie uczulające powtórzono trzy razy w ciągu oddzielnych tygodni, aby uzyskać trzy repliki biologiczne każdej grupy do analizy qPCR.

Dysocjacja komórek

Tkankę prążkowia rozdzielono w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Szczurom dekapitowano i pobierano prążki w ciągu dwóch minut. Każde prążkowie rozdrobniono żyletkami na lodowatej szklanej płytce i umieszczono w 1 ml Hibernate A (nr kat. HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Prążki trawiono enzymatycznie w 1 ml Accutase na prążkowie (nr kat. SCR005; Chemicon, Billerica, MA), mieszając od końca do końca przez 30 minut w temperaturze 4°C. Tkankę wirowano przez dwie minuty przy 425 x gi ponownie zawieszano w 300 µl lodowatego Hibernate A. Wszystkie kolejne etapy wirowania przeprowadzono w temperaturze 4°C.

Strawioną tkankę prążkowia rozdzielono mechanicznie przez roztarcie. Cztery prążki połączono w jedną probówkę Eppendorfa i roztarto dziesięciokrotnie pipetą Pasteura o dużej średnicy (~1.3 mm). Probówki na krótko umieszczono na lodzie, aby osiadły duże kawałki tkanki; 600 µl mętnej zawiesiny zawierającej zdysocjowane komórki przeniesiono do 15 ml probówki Falcon na lodzie. Do oryginalnej probówki Eppendorfa dodano 600 μl świeżego Hibernate A, a następnie powtórzono etapy rozcierania jak powyżej, używając pipet o średniej i małej średnicy (~0.8 mm i ~0.4 mm). Każdą mętną zawiesinę zawierającą zdysocjowane komórki połączono z poprzednią zawiesiną.

Pozostałe skupiska komórek w połączonej zawiesinie komórek usunięto przez filtrację przez wstępnie zwilżone sitka komórkowe 100 µm i 40 µm (marka Falcon, BD Biosciences, San Jose, Kalifornia). Małe pozostałości komórkowe w zawiesinie zredukowano przez wirowanie przesączu przez 3 minuty przy 430 x g w trzystopniowym gradiencie gęstości Percollu (nr kat. P1644; Sigma, St. Louis, MO). Mętną górną warstwę (około 2 ml) zawierającą zanieczyszczenia odrzucono. Komórki w pozostałych warstwach ponownie zawieszono w pozostałym roztworze Percoll i wirowano przez pięć minut przy 550xg. Osad ponownie zawieszono w 1 ml Hibernate A.

Znakowanie immunologiczne i FACS

Zdysocjowane komórki utrwalono i permeabilizowano przez dodanie równej objętości etanolu do końcowego stężenia 50% etanolu i trzymano na lodzie przez 15 minut, okazjonalnie mieszając. Komórki wirowano przez dwie minuty przy 425xg i ponownie zawieszano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami wolnej od RNazy (PBS). Komórki inkubowano z biotynylowanym przeciwciałem pierwotnym przeciwko NeuN (rozcieńczenie 1:1000, nr kat. MAB377B, Chemicon) i przeciwciałem pierwotnym przeciwko β-galaktozydazie ((β-gal; rozcieńczenie 1:10000, nr kat. 4600-1409, Biogenesis, Poole , Wielka Brytania). Komórki obracano w przeciwciele pierwszorzędowym przez 30 minut w temperaturze 4°C i wirowano przez trzy minuty przy 425 x g. Komórki przemywano 800 µl PBS i ponownie zawieszano w 700 µl PBS. Komórki inkubowano ze znakowaną fluorescencyjnie streptawidyną (streptawidyna-fikoerytryna, rozcieńczenie 1:1000, nr kat. SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) i przeciwciałem wtórnym (przeciwko kozie IgG znakowane Alexa Fluor 488, rozcieńczenie 1:1000, nr kat. A-) 11055, Invitrogen) i obracano typu koniec do końca przez 15 minut Komórki przemywano 800 µl PBS, wirowano przez trzy minuty przy 425 xg i ponownie zawieszano w 1 ml PBS.

Wyznakowane immunologicznie komórki skanowano i sortowano w głównym ośrodku cytometrii przepływowej Johns Hopkins Bayview Campus. Do sortowania komórek zastosowano FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ). W pierwszej kolejności poddano analizie próbki kontrolne w celu ustalenia optymalnych kryteriów sortowania próbek testowych. Konkretnie, do ustawienia bramki rozpraszającej światło użyto utrwalonych komórek bez traktowania przeciwciałem. Następnie utrwalone komórki traktowane fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym, ale bez przeciwciała pierwszorzędowego, zastosowano następnie do ustalenia progów endogennej fluorescencji tkanki i nieswoistego wiązania przez streptawidynę lub przeciwciało drugorzędowe. Następnie zastosowano próbki kontrolne pojedynczo znakowane pierwszorzędowym i wtórnym przeciwciałem dla każdego białka (NeuN lub β-gal) w celu skompensowania nakładania się fluorescencji w sąsiednich kanałach. Na koniec przeanalizowano i posortowano próbki testowe oznaczone obydwoma markerami fluorescencyjnymi. Sortowane komórki zebrano do probówek o niskim stopniu wiązania (nr kat. 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) zawierających 100 µl PBS w każdej probówce.

Ekstrakcja RNA

Po sortowaniu próbki zawierające komórki βgal-dodatnie lub βgal-ujemne od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę lub wszystkie komórki NeuN-dodatnie od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, wirowano przez 8 minut przy 2650 x g w temperaturze 18°C. Komórki NeuN-ujemne od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną wirowano przez 8 minut przy 6000 xg w temperaturze 18°C. Do eksperymentów na mikromacierzach RNA ekstrahowano za pomocą odczynnika Trizol (nr kat. 15596-026, Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Jakość i ilość RNA oceniano przy użyciu Bioanalyzer Picochip (nr kat. 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornia). Do eksperymentów qPCR RNA ekstrahowano za pomocą zestawu RNEasy Micro (nr kat. 74004; Qiagen, Valencia, Kalifornia) zgodnie z instrukcjami producenta, traktując DNazą. Ilość i czystość RNA oceniano za pomocą spektrofotometru Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Eksperymenty mikromacierzowe

Mikromacierze wykorzystano do analizy RNA z komórek NeuN-dodatnich i NeuN-ujemnych od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną oraz neuronów βgal-dodatnich i βgal-ujemnych od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę. Jak opisano powyżej w części dotyczącej leczenia farmakologicznego, mikromacierze zawierały trzy repliki biologiczne dla każdego z czterech typów próbek. Pięć µl całkowitego RNA z każdej próbki znakowano przy użyciu zestawu Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (nr kat. IL1791; Ambion, Austin, Teksas) w dwuetapowym procesie syntezy cDNA, po którym in vitro Transkrypcja RNA za pomocą biotyny-16-UTP. 0.75 µg cRNA znakowanego biotyną hybrydyzowano przez 16 godzin z Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (nr kat. BD-27-303; Illumina, San Diego, Kalifornia). Biotynylowany cRNA hybrydyzujący z chipem wykryto za pomocą streptawidyny znakowanej Cy3 i oznaczono ilościowo przy użyciu skanera Illumina BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems. Całość znakowania i analizy przeprowadzono w kampusie medycznym Johns Hopkins Bayview Lowe Family Genomics Core.

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym

Do walidacji wyników FACS i wyników mikromacierzy wykorzystano ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. RNA poddano odwrotnej transkrypcji na cDNA przy użyciu zestawu RETROscript (nr kat. AM1710, Ambion) ze starterem oligo(dT). Każda 25 µl reakcji PCR zawierała 12.5 µl Taqman Gene Expression Master Mix (nr kat. 4369514; Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia), 1.1 µl 20 µM starterów do przodu i do tyłu, 0.25 µl 100 µM sondy znakowanej FAM, 5 μl wody i 5 μl 1 ng/μl cDNA. Kombinacje starterów i sond [Tabela 1] zostały zaprojektowane przy użyciu Centrum projektowania testów Roche Universal Probe Library Assay tak, aby obejmowały introny. Reakcje PCR monitorowano przy użyciu Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Program rozpoczął się od 20 odczytów płytek w temperaturze 50°C w celu fotowybielania, następnie 5 minut w temperaturze 95°C, a następnie 40 cykli po 20 sekund w 94°C, 1 minuta w 60°C i odczytu płytki.

Tabela 1 

Startery i sondy stosowane w qPCR

Najpierw przeprowadzono reakcje krzywej standardowej dla każdego genu w celu określenia wydajności amplifikacji [Tabela 1] Poziomy ekspresji każdego amplifikowanego genu obliczono stosując wydajność^ΔCq gdzie ΔCq = Cq(gen eksperymentalny) - Cq(gen referencyjny) dla każdej repliki biologicznej. Gorasp2 został wybrany jako gen referencyjny, ponieważ nie ulegał różnej ekspresji między neuronami i glejami w analizach mikromacierzy. Został on następnie zweryfikowany jako gen referencyjny ze względu na równą amplifikację qPCR we wszystkich próbkach przy ładowaniu tej samej ilości matrycy. Test techniczny, trzykrotny Cq wartości uśredniono przed obliczeniem ΔCq dla każdego genu w próbce. Dla każdego mRNA zmierzonego w qPCR wartości ekspresji genów uśredniono w replikacjach biologicznych. Następnie, aby odzwierciedlić wartości krotności zmiany, podzieliliśmy tę średnią przez średnie wartości ekspresji genów w komórkach NeuN-dodatnich od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Wartości te przedstawiono na wykresach i w tabelach jako średnie i błędy standardowe.

Immunohistochemia

Tkankę mózgową uzyskano od samic szczurów Spraque-Dawley typu dzikiego po tym samym ostrym i powtarzanym leczeniu kokainą, opisanym powyżej dla eksperymentów z mikromacierzą i qPCR. Jednakże 90 minut po wstrzyknięciach w dniu badania szczury głęboko znieczulono izofluranem i perfundowano 100 ml PBS, a następnie 400 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Mózgi utrwalono w PFA na 2 godziny i przeniesiono do 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4°C na 2–3 dni. Mózgi zamrożono na sproszkowanym suchym lodzie i trzymano w temperaturze -80°C aż do pocięcia. Skrawki czołowe pocięto na grubość 40 µm pomiędzy Bregma 2.5 a -0.5 (Paxinos i Watson, 1998).

Skrawki znakowano immunologicznie Fos i Arc. W skrócie, skrawki przemyto trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) i permeabilizowano przez 30 minut w TBS z 0.2% Triton X-100. Skrawki ponownie przemyto w TBS i inkubowano w pierwszorzędowych przeciwciałach rozcieńczonych w PBS z 0.3% Triton X-100 przez 24 godziny na wytrząsarce w temperaturze 4°C. Zastosowaliśmy królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko c-Fos (rozcieńczenie 1:500, nr kat. sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia) i mysie przeciwciało monoklonalne Arc (rozcieńczenie 1:100, nr kat. sc-17839, Santa Cruz Biotechnologia). Skrawki przemyto trzykrotnie w TBS i inkubowano w wtórnych przeciwciałach rozcieńczonych w PBS przez 1.5 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Zastosowaliśmy ośle przeciwciało przeciwkrólicze znakowane Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:200, nr kat. A21206, Invitrogen) i kozie przeciwciało przeciw mysim znakowane Alexa Fluor 568 (rozcieńczenie 1:200, nr kat. A11004, Invitrogen). Skrawki przemyto w TBS, nałożono na szkiełka pokryte chromem ałunem i nakryto szkiełkami nakrywkowymi za pomocą utwardzanego środka do mocowania VectaShield.

Fluorescencyjne obrazy immunoreaktywności Fos i Arc w skorupie ogoniastej i NAc (około 2.0 mm przed Bregmą) wykonano przy użyciu kamery CCD (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) dołączonej do mikroskopu Zeiss Axioskop 2. Obrazy do zliczania znakowanych komórek wykonano przy powiększeniu 200x; obrazy do określenia kolokalizacji Fos i Arc wykonano przy powiększeniu 400x. Znakowane komórki z czterech półkul na szczura zliczano automatycznie przy użyciu oprogramowania IPLab dla komputerów Macintosh, wersja 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Zliczenia ze wszystkich czterech półkul uśredniono, aby uzyskać pojedynczą wartość dla każdego szczura.

Analiza danych

Dane dotyczące uczulenia narządu ruchu analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z powtarzanymi pomiarami dla głównego efektu czasu w ciągu 4 dni iniekcji. Istotność statystyczną przyjęto na poziomie p < 0.05. Dane z mikromacierzy analizowano przy użyciu DIANE 6.0, programu do analizy mikromacierzy opartego na arkuszach kalkulacyjnych, opartego na SAS JMP 7.0, jak opisano wcześniej (Garg i in., 2009). Dane dotyczące intensywności fluorescencji z mikromacierzy poddano filtrowaniu przez detekcję p-wartości i Z normalizacja. Jakość próbki analizowano za pomocą wykresów rozrzutu, analizy głównych składników i próbki genu Z- hierarchiczne grupowanie oparte na wynikach, aby wykluczyć możliwe wartości odstające. Następnie zastosowano testy ANOVA w celu wyeliminowania genów o większych wariancjach w każdej grupie porównawczej. Geny zidentyfikowano jako ulegające zróżnicowanej ekspresji, jeśli p <0.01, bezwzględne Z-współczynnik ≥ 1.5 i współczynnik fałszywego odkrycia (fdr) <0.07. W przypadku danych qPCR zastosowano jednokierunkową ANOVA w celu porównania danych dla każdego genu. Istotność statystyczną przyjęto na poziomie p < 0.05. W przypadku immunohistochemii Fos i Arc do obliczenia istotności statystycznej zastosowano test t zakładający nierówną wariancję, ustalony na p <0.05.

WYNIKI

transgeniczne szczury cfos-lacZ

Połączenia cfos-lacZ transgen u tych szczurów jest regulowany przez a c-fos promotor podobny do promotora endogennego c-fos genu i dlatego jest podobnie aktywowany w neuronach przez wysoki poziom pobudzającego sygnału synaptycznego (Shin i in., 1990; Labiner i in., 1993; Sgambato i in., 1997). Produkt białkowy z cfos-lacZ transgen, β-galaktozydaza (βgal), ulega koekspresji z c-Fos w silnie aktywowanych neuronach (Koya i in., 2009) i zastosowano do znakowania aktywowanych neuronów prążkowia w poniższej procedurze oczyszczania FACS.

Oczyszczanie FACS aktywowanych neuronów prążkowia po pojedynczych ostrych wstrzyknięciach kokainy

Pobrano całe prążki cfos-lacZ szczury 90 minut po ostrym wstrzyknięciu 30 mg/kg kokainy lub soli fizjologicznej poza ich klatką. Zdysocjowane komórki prążkowia od podobnie leczonych szczurów połączono przed oczyszczaniem FACS dla każdej repliki biologicznej w kolejnych analizach mikromacierzowych i ilościowych analizach PCR (qPCR). Zdysocjowane komórki prążkowia początkowo analizowano pod kątem ich charakterystyki rozpraszania światła w przód i w bok [Rysunek 1a] Większość neuronów znakowanych NeuN znaleziono w pasie zdarzeń wzdłuż dolnej części wykresu. Zatem wszystkie kolejne analizy były bramkowane w przód, aby uwzględnić tylko zdarzenia znalezione w tym pasku.

Rysunek 1 

Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek neuronów znakowanych βgal od szczurów leczonych pojedynczym wstrzyknięciem kokainy

Komórki w obrębie tej bramki rozdzielono według stopnia ich znakowania immunologicznego markerem neuronalnym NeuN i markerem aktywacji nerwowej βgal. W tkance uzyskanej od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, około 15% neuronów znakowanych NeuN miało wysoki poziom βgal [Rysunek 1b], co odpowiadało około 100,000 30 neuronów znakowanych βgal na szczura. Wszystkie komórki znakowane βgal wykazywały wspólną ekspresję NeuN, co wskazuje, że tylko neurony wyrażały βgal. Natomiast bardzo niewiele neuronów znakowanych NeuN uzyskanych od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, wyrażało markery aktywacji βgal lub Fos, co potwierdza immunoreaktywność βgal i Fos jako markery aktywacji nerwowej u szczurów, którym wstrzyknięto kokainę. Mała liczba neuronów wykazujących ekspresję βgal u szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, nie zapewniła wystarczającej liczby komórek do dalszych analiz molekularnych. Zatem we wszystkich kolejnych eksperymentach z tkanką prążkowia uzyskaną od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, zastosowaliśmy jedynie znakowanie NeuN do oddzielenia komórek neuronowych od komórek nieneuronalnych. Ogółem około 600,000% wszystkich ciał komórek prążkowia było NeuN-dodatnich, co odpowiadało około XNUMX XNUMX neuronów prążkowia na szczura. Kiedy komórki oczyszczone za pomocą FACS badano pod mikroskopem fluorescencyjnym, wszystkie komórki były okrągłe i pozbawione wyrostków [Rysunek 2] Obserwacje mikroskopowe potwierdziły, że komórki posortowane FACS były odpowiednio oznakowane pod kątem immunoreaktywności NeuN- i βgal. Stwierdzono, że próbki komórek oczyszczonych za pomocą FACS mają czystość > 90%, gdy oceniano je za pomocą drugiej rundy cytometrii przepływowej (dane nie pokazane).

Rysunek 2 

Zdjęcia mikroskopowe komórek i resztek oczyszczonych za pomocą FACS

Określiliśmy selektywność naszej procedury oczyszczania FACS za pomocą mikromacierzy, aby przeanalizować wzorce ekspresji genów w komórkach oczyszczonych za pomocą FACS. Porównaliśmy ekspresję genów w neuronach βgal-dodatnich i βgal-ujemnych od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, a także w komórkach NeuN-dodatnich i NeuN-ujemnych od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Analiza głównych składowych i skupień wykazała, że ​​głównym czynnikiem różnicującym było to, czy komórki były neuronami, czy glejami.Rysunek 3a] Drugim czynnikiem różnicującym była ekspresja βgal stosowana do oddzielania neuronów aktywowanych od nieaktywowanych. Geny zidentyfikowano jako ulegające zróżnicowanej ekspresji, jeśli p <0.01, bezwzględne Z-współczynnik ≥ 1.5 i współczynnik fałszywego odkrycia (fdr) <0.07. Odkryliśmy, że w neuronach βgal-dodatnich wzrosła liczba 125 genów, a 467 uległa zmniejszeniu w neuronach βgal-dodatnich w porównaniu z neuronami βgal-ujemnymi uzyskanymi z tej samej tkanki prążkowia szczurów, którym wstrzyknięto kokainę [Rysunek 3b] Kiedy porównano te same neurony βgal-dodatnie od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, z próbkami kontrolnymi wszystkich neuronów znakowanych NeuN od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, w neuronach βgal-dodatnich zwiększono liczbę 133 genów, a 890 genów zmniejszono. Warto zauważyć, że dwie grupy kontrolne – neurony βgal-ujemne od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę i wszystkie neurony znakowane NeuN od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną – wytworzyły bardzo podobne wzorce ekspresji genów; ekspresja genów nie różniła się istotnie pomiędzy tymi grupami kontrolnymi [Rysunek 3b].

Rysunek 3 

Analiza mikromacierzy komórek wyselekcjonowanych z prążków szczura po pojedynczym wstrzyknięciu kokainy lub soli fizjologicznej

Specyficzne geny znalezione w różnych grupach próbek potwierdziły oddzielenie neuronów aktywowanych od nieaktywowanych, a także komórek neuronowych od nieneuronalnych przy użyciu FACS [Tabela 2] Neurony βgal-dodatnie od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, wyrażały wyższy poziom wielu genów markerów aktywacji nerwowej w porównaniu z neuronami βgal-ujemnymi od tych samych szczurów, którym wstrzyknięto kokainę lub wszystkimi neuronami znakowanymi NeuN od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną [Rysunek 3c] Obejmowały te geny markerowe aktywności c-fos, junB, łuk, EGR rodzina (1, 2, 4) i nr4a3 (Guzowski i in., 2005). Co ciekawe, te neurony βgal-dodatnie również wyrażały znacząco wyższe poziomy genu prodynorfiny, specyficznego dla typu komórki markera receptora dopaminy D1 i znacznie niższe poziomy genu receptora dopaminy D2.

Tabela 2 

Podsumowanie danych mikromacierzy i qPCR z ostrego eksperymentu z kokainą.

Dane dotyczące ekspresji genów na mikromacierzach zweryfikowano za pomocą qPCR. Geny markerowe aktywności fosB, łuk, nr4a3 ulegały ekspresji na wyższym poziomie w neuronach βgal-dodatnich szczurów, którym wstrzyknięto kokainę w porównaniu z obydwoma neuronami βgal-ujemnymi od tych samych szczurów, którym wstrzyknięto kokainę i wszystkimi neuronami szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną [Rysunek 4a; dane i informacje statystyczne w Tabela 2] Neurony βgal-dodatnie również wyrażały wyższy poziom genu prodynorfiny [Rysunek 4b] Podczas gdy neurony βgal-dodatnie miały najwyraźniej niższy poziom ekspresji kilku genów, w tym receptora adenozyny A2A, kanału potasowego Kv3.1 i genów map2k6/MEKK6, tylko poziomy ekspresji Kv3.1 i map2k6/MEKK6 były statystycznie różne przy użyciu qPCR [Rysunek 4c] Ogólnie rzecz biorąc, zmiany ekspresji genów oceniane za pomocą qPCR były prawie identyczne ze zmianami ekspresji genów ocenianymi za pomocą eksperymentów z mikromacierzami.

Rysunek 4 

Ilościowa PCR wykazuje inny profil ekspresji genów dla neuronów βgal-dodatnich po ostrych wstrzyknięciach kokainy w porównaniu z neuronami βgal-ujemnymi tych samych szczurów lub wszystkimi neuronami szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną

Aby określić, czy zmiany mRNA w aktywowanych neuronach znalazły odzwierciedlenie na poziomie białka, wykorzystaliśmy analizę immunohistochemiczną skrawków mózgu koronowego samic szczurów typu dzikiego, którym wstrzyknięto kokainę i sól fizjologiczną [Rysunek 5] Skrawki te nie zostały poddane dysocjacji ani FACS, dlatego też dysocjacja komórek stwierdzona w procedurze FACS nie miała wpływu na analizę immunohistochemiczną. W prążkowiu brzusznym szczurów, którym wstrzyknięto kokainę [Rysunek 5a], markery aktywności neuronowej Fos i Arc ulegały wspólnej ekspresji w tych samych komórkach: 85 ± 4% wszystkich komórek Fos-dodatnich było Arc-dodatnich, podczas gdy 82 ± 3% wszystkich komórek Arc-dodatnich było Fos-dodatnich. Zastrzyki z kokainy powodowały 2.7-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Fos i 2.7-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Arc. W prążkowiu grzbietowym szczurów, którym wstrzyknięto kokainę [Rysunek 5b], 80 ± 2% wszystkich komórek Fos-dodatnich było Arc-dodatnich, podczas gdy 86 ± 3% wszystkich komórek Arc-dodatnich było Fos-dodatnich. Zastrzyki z kokainy powodowały 4.4-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Fos i 3.8-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Arc.

Rysunek 5 

Fos i Arc ulegają wspólnej ekspresji w (a) prążkowiu brzusznym i (b) prążkowiu grzbietowym po pojedynczym wstrzyknięciu kokainy

Oczyszczanie FACS aktywowanych neuronów prążkowia od szczurów uwrażliwionych na kokainę

W drugim eksperymencie FACS wszystkie szczury uczulono wielokrotnymi zastrzykami kokainy. Powtarzane podanie kokainy do aparatu ruchu wzmagało lokomocję wywołaną kokainą: lokomocja w dniu 7 wynosiła 180±18% w porównaniu z lokomocją w dniu 1 (główny efekt czasu po 4 powtarzanych wstrzyknięciach, F3, 363 = 24.9, p < 0.001), co wskazywało na istotne uczulenie psychomotoryczne. Siedem dni później, w dniu testu, szczurom podano kokainę lub sól fizjologiczną w tym samym pudełku narządu ruchu. Dziewięćdziesiąt minut później ekstrahowano tkankę prążkowia zawierającą NAc i komórki oczyszczono za pomocą FACS, stosując procedurę opisaną powyżej.

Komórki w tym samym pasie zdarzeń bramkowanych światłem rozproszonym, jak w poprzednim eksperymencie, rozdzielono zgodnie z ich stopniem znakowania immunologicznego markerem neuronalnym NeuN i markerem aktywacji nerwowej βgal. W tkance uzyskanej od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, około 10% neuronów znakowanych NeuN miało wysoki poziom βgal [Rysunek 6], co odpowiadało około 60,000 30 neuronów znakowanych βgal na szczura. Wszystkie komórki znakowane βgal wykazywały wspólną ekspresję NeuN, co wskazuje, że tylko neurony wyrażały βgal. Ponownie, tkanka uzyskana od szczurów, którym w dniu badania wstrzyknięto sól fizjologiczną, wytworzyła bardzo niewiele neuronów wykazujących ekspresję βgal lub Fos, a zatem nie było wystarczającej liczby komórek do późniejszych analiz molekularnych. Dlatego zastosowaliśmy jedynie znakowanie NeuN do oddzielenia komórek neuronalnych od komórek nieneuronalnych uzyskanych od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Około 400,000% wszystkich ciał komórkowych szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, było NeuN-dodatnich, co w tym eksperymencie odpowiadało około XNUMX XNUMX neuronów prążkowia na szczura.

Rysunek 6 

Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek neuronów znakowanych βgal od uczulonych szczurów prowokowanych kokainą 7 dni po wielokrotnym leczeniu kokainą

Zastosowaliśmy qPCR do porównania ekspresji genów w neuronach βgal-dodatnich i βgal-ujemnych od szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, jak również we wszystkich neuronach NeuN-dodatnich od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną po uczuleniu na kokainę. Neurony βgal-dodatnie szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, wyrażały wyższy poziom trzech genów markerowych aktywności nerwowej: fosB, łuk, nr4a3– w stosunku do neuronów βgal-ujemnych od tych samych szczurów, którym wstrzyknięto kokainę i do wszystkich neuronów u szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną [Rysunek 7a; dane i informacje statystyczne w Tabela 3] Neurony βgal-dodatnie również wyrażały wyższy poziom genu prodynorfiny, podobny do tego w eksperymencie z pojedynczym wstrzyknięciem kokainy [Rysunek 7b] Natomiast neurony βgal-dodatnie miały niższy poziom ekspresji kilku genów [Rysunek 7c], w tym Drd2 kodujący receptor dopaminy D2 i Mapa2k6 kodujący kinazę aktywującą p38 MAPK, podobnie jak w eksperymencie z pojedynczym ostrym wstrzyknięciem kokainy. Wreszcie, neurony βgal-dodatnie miały zwiększoną ekspresję pył1, znany również jako mkp1 [Rysunek 7c], który koduje fosfatazę inaktywującą p38 MAPK (Sgambato i in., 1998).

Rysunek 7 

Ilościowa PCR wykazuje inny profil ekspresji genów w neuronach βgal-dodatnich u uczulonych szczurów prowokowanych kokainą w porównaniu z neuronami βgal-ujemnymi tych samych szczurów lub wszystkimi neuronami szczurów prowokowanych solą fizjologiczną
Tabela 3 

Podsumowanie danych qPCR z powtarzanego eksperymentu z kokainą.

Aby określić, czy zmiany mRNA w aktywowanych neuronach znajdują odzwierciedlenie na poziomie białka, wykorzystaliśmy analizę immunohistochemiczną skrawków mózgu koronowego od samic szczurów typu dzikiego uwrażliwionych na kokainę po wstrzyknięciach kokainy lub soli fizjologicznej w dniu testu. W prążkowiu brzusznym szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, markery aktywności nerwowej Fos i Arc ulegały wspólnej ekspresji w tych samych komórkach: 90 ± 2% wszystkich komórek Fos-dodatnich było Arc-dodatnich, a 83 ± 2% wszystkich Arc-dodatnich komórki były Fos-dodatnie. Testowe zastrzyki kokainy powodowały 2.3-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Fos i 2.2-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Arc. W prążkowiu grzbietowym szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, 93 ± 2% wszystkich komórek Fos-dodatnich było Arc-dodatnich, a 90 ± 3% wszystkich komórek Arc-dodatnich było Fos-dodatnich. Testowe zastrzyki kokainy powodowały 4.4-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Fos i 4.5-krotny wzrost liczby neuronów znakowanych Arc. Zatem bardzo niewiele komórek nieznakowanych Fos wyrażało Arc i bardzo niewiele komórek nieznakowanych Arc wyrażało Fos, co potwierdza nasze ustalenia z posortowanych komórek.

DYSKUSJA

Opracowaliśmy procedurę oczyszczania i oceny zmian molekularnych w neuronach określonych jedynie na podstawie ich poprzedniego stanu aktywacji podczas aktywności lokomotorycznej indukowanej kokainą. Dane z eksperymentów mikromacierzy, qPCR i immunohistochemii niezależnie potwierdziły, że nasza procedura FACS zidentyfikowała unikalne zmiany molekularne w aktywowanych neuronach, zgodnie z definicją c-fos indukcja ekspresji βgal przez promotor. Głównym odkryciem biologicznym przy zastosowaniu tej procedury było to, że bezpośrednie wczesne geny (IEG) są indukowane tylko w aktywowanych neuronach, podczas gdy ekspresja IEG pozostaje niezmieniona lub nawet zmniejszona w nieaktywowanej większości neuronów. Ponieważ wiele z tych markerów aktywności neuronalnej IEG jest również czynnikami transkrypcyjnymi, jest prawdopodobne, że w tych aktywowanych neuronach indukowane są następnie bardzo różne wzorce ekspresji genów, co może przyczyniać się do fizjologicznych i behawioralnych skutków kokainy (na przykład patrz (zob.Curran i Franza, 1988; Nestler i wsp., 1993; McClung i wsp., 2004; Loebrich i Nedivi, 2009).

Różnicowa indukcja IEG między aktywowanymi i nieaktywowanymi neuronami potwierdza hipotezę, że tylko niewielka część neuronów jest silnie aktywowana podczas lokomocji wywołanej kokainą, podczas gdy większość neuronów jest aktywowana w znacznie mniejszym stopniu lub wcale. Eksperymenty elektrofizjologiczne na szczurach typu dzikiego wskazują, że ekspresja białka Fos koreluje z wysokim poziomem pobudzającego sygnału synaptycznego (Shin i in., 1990; Labiner i in., 1993; Sgambato i in., 1997). Wiemy, że ekspresja Fos i βgal jest podobnie regulowana w tych samych neuronach cfos-lacZ szczury (Koya i in., 2009). Zatem wnioskujemy, że zwiększona ekspresja βgal i IEG tylko w niewielkiej liczbie neuronów prążkowia wskazuje, że tylko mniejszość neuronów prążkowia otrzymuje wysoki poziom pobudzającego sygnału synaptycznego w odpowiedzi na podanie kokainy.

Dyskretna aktywacja neuronów prążkowia jest zgodna z hipotezą stanu górnego i dolnego, która opisuje przeciwstawny wpływ dopaminy na aktywność neuronów prążkowia. Uważa się, że dopamina indukowana kokainą zwiększa różnice między neuronami o wysokiej i niskiej aktywności poprzez zwiększenie bieżącej aktywności elektrofizjologicznej neuronów, które są już w stanie wysokiej aktywności, jednocześnie osłabiając bieżącą aktywność większości neuronów o niższej aktywności (Wilsona i Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez i in., 1997; Nicola i in., 2000; O'Donnell, 2003; Nicola i in., 2004). Wynikający z tego wzrost stosunku sygnału do szumu nie tylko zwiększa selektywność podczas ostrej sygnalizacji, ale, jak sugerujemy w naszym badaniu, może również przyczyniać się do indukcji unikalnych neuroadaptacji molekularnych tylko w neuronach o wysokiej aktywności. Tymczasem ekspresja genów w neuronach βgal-ujemnych, które stanowią większość neuronów prążkowia u szczurów, którym wstrzyknięto kokainę, wydawała się nie różnić od ekspresji genów w neuronach prążkowia u szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną; potwierdza to hipotezę, że większość neuronów prążkowia pozostaje w stanie dolnym podczas narażenia na kokainę.

Składniki szlaku sygnalizacyjnego kinazy p38 MAP również uległy różnym zmianom pomiędzy neuronami aktywowanymi i nieaktywowanymi. Ekspresja genu Map2k6/MEKK6, kinazy aktywującej p38, została zmniejszona, podczas gdy ekspresja genu Mkp1/Dusp1, fosfatazy inaktywującej p38 (Sgambato i in., 1998) był zwiększony w neuronach aktywowanych, ale nie w neuronach nieaktywowanych. Zatem wykazano, że ogólna sygnalizacja p38 MAPK odgrywa rolę w plastyczności synaptycznej (Bolszakow i in., 2000; Izumi i wsp., 2008) może być osłabiony w aktywowanych neuronach w porównaniu z nieaktywowaną większością neuronów.

FACS może również pomóc w identyfikacji typów neuronów, które aktywują się po ostrej lub powtarzającej się ekspozycji na kokainę. Stwierdziliśmy wyższą ekspresję prodynorfiny genu markera neuronalnego D1 w aktywowanych neuronach i niższą ekspresję genów markerów neuronalnych D2 receptora dopaminowego D2 i receptora adenozynowego A2A w aktywowanych neuronach. Sugeruje to, że Fos był indukowany głównie w neuronach prążkowia D1. Chociaż zgadza się to z wieloma badaniami immunohistochemicznymi, które donoszą o indukcji Fos głównie w neuronach D1 po wstrzyknięciach środków psychostymulujących w klatka domowa (Berretta i in., 1992; Cenci i in., 1992), zaprzecza to jednakowej aktywacji neuronów D1 i D2 stwierdzanej po wstrzyknięciach środków psychostymulujących w stosunkowo dużym stopniu nowatorskie środowisko poza klatką domową szczura (Jaber i in., 1995; Badiani i in., 1999; Hope i wsp., 2006).

Ponieważ użyliśmy tego samego markera βgal do identyfikacji aktywowanych neuronów podczas FACS, jakiego użyliśmy w naszej wcześniej opisanej procedurze inaktywacji Daun02 (Koya i in., 2009), prawdopodobne jest, że obserwujemy unikalne zmiany molekularne w zespołach neuronowych niezbędne dla wyuczonego składnika kontekstowo-specyficznego uczulenia lokomocji wywołanej kokainą. Wcześniej odkryliśmy, że inaktywacja tylko niewielkiej liczby słabo rozproszonych neuronów w domniemanym zespole jest wystarczająca, aby zakłócić specyficzne dla kontekstu uczulenie psychomotoryczne na kokainę (Koya i in., 2009). Odkrycie to powtórzono na tej samej samicy cfos-lacZ szczury i schemat uczulenia zastosowany w niniejszym badaniu [http://irp.drugabuse.gov] Neurony te nie są z natury bardziej wrażliwe na wszystkie bodźce, ponieważ zmiana środowiska lub kontekstu, w którym podano lek, aktywowała inny zestaw neuronów prążkowia po wstrzyknięciu kokainy (Mattson i in., 2008; Koya i in., 2009). Wybór konkretnego zespołu neuronalnego prążkowia wydaje się zależeć przede wszystkim od wzorca aktywności korowych i podkorowych aferentów glutaminergicznych (Pennartz i in., 1994; O'Donnell, 2003), a te dane wejściowe są same w sobie determinowane przez specyficzne bodźce środowiskowe i interoceptywne obecne podczas zachowania. Na podstawie tej poprzedniej pracy wraz z naszymi obecnymi danymi stawiamy hipotezę, że powtarzające się łączenie kokainy z bodźcami środowiskowymi podczas naszego schematu uwrażliwiania powoduje unikalne zmiany molekularne w obrębie wielokrotnie aktywowanych zespołów neuronalnych, które mogą przyczyniać się do wyuczonych skojarzeń leżących u podstaw uczulenia kontekstowego.

Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowaliśmy nowatorskie zastosowanie FACS do izolowania neuronów dorosłych selektywnie aktywowanych podczas ostrej aktywności lokomotorycznej indukowanej kokainą i powtarzającego się uczulenia narządu ruchu indukowanego kokainą. Proponujemy, aby to podejście można było również zastosować do identyfikacji unikalnych neuroadaptacji molekularnych w zespołach neuronowych kodujących behawioralne skutki nadużywanych leków i innych wyuczonych zachowań. Należy ostatecznie zbadać przyczynową rolę tych unikalnych neuroadaptacji molekularnych w plastyczności i zachowaniu neuronów poprzez manipulację ekspresją genów tylko w aktywowanych neuronach; jednakże technika ta nie została jeszcze opracowana.

Podziękowanie

Badania te były wspierane w ramach Stacjonarnego Programu Badań Narodowego Instytutu ds. Narkomanii. D. Guez-Barber był wspierany przez NIH MSTP TG 5T32GM07205, nagrodę nr F30DA024931 przyznaną przez Narodowy Instytut ds. Narkomanii oraz Katedrę Psychiatrii Charlesa BG Murphy'ego na Uniwersytecie Yale. Dziękujemy Joe Chrestowi za jego doskonałą pomoc techniczną przy FACS oraz Chrisowi Cheadle, Tonyi Watkins i Alanowi Bergerowi za ich pracę nad mikromacierzą. Dziękujemy Yavinowi Shahamowi za pomocne uwagi na temat manuskryptu.

Przypisy

 

Nie ma konfliktu interesów żadnego z autorów tego manuskryptu.

Referencje

  1. Badiani A, Oates MM, Day HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Modulacja środowiskowa indukowanej amfetaminą ekspresji c-fos w neuronach prążkowia D1 i D2. Zachowaj mózg Res. 1999;103:203–209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Agoniści dopaminy i glutaminianu stymulują specyficzną dla neuronów ekspresję białka podobnego do Fos w prążkowiu. J Neurofizjol. 1992;68:767–777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Podwójne szlaki kinazy MAP pośredniczą w przeciwstawnych formach długoterminowej plastyczności w synapsach CA3-CA1. Nat Neurosci. 2000;3:1107–1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. Plastyczność synaptyczna receptora AMPA indukowana przez psychostymulanty: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość terapeutyczna. Neuron. 2010;67:11–24. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Indukcja c-fos prążkowia przez kokainę lub apomorfinę zachodzi preferencyjnie w neuronach wyjściowych wystających do istoty czarnej u szczura. Eur J Neurosci. 1992;4:376–380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos i Jun: połączenie AP-1. Komórka. 1988;55:395–397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. Ekspresja MyD88 przez komórki rezydujące w OUN jest kluczowa dla wywołania odporności ochronnej w ropniach mózgu. ASN Neuro. 2009:1. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. Funkcja receptorów dopaminowych D1 i D2 w prążkowiu: koaktywacja receptorów dopaminowych D1 i D2 w oddzielnych populacjach neuronów skutkuje wzmocnioną natychmiastową wczesną odpowiedzią genową w neuronach zawierających D1. J Neurosci. 1995;15:8167–8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Mapowanie istotnych behawioralnie obwodów neuronowych za pomocą natychmiastowej i wczesnej ekspresji genów. Curr Opin Neurobiol. 2005;15:599–606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. Aktywacja receptora D1 zwiększa wywołane wyładowania w neuronach kolczastych średniego prążkowia poprzez modulowanie przewodnictwa Ca2+ typu L. J Neurosci. 1997;17:3334–3342. [PubMed]
  11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Indukowana kokainą aktywność lokomotoryczna i ekspresja Fos w jądrze półleżącym są uczulone przez 6 miesięcy po wielokrotnym podaniu kokainy poza klatką domową. Eur J Neurosci. 2006;24:867–875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Długotrwałe wzmocnienie hamowania przez aktywację receptora N-metylo-D-asparaginianu na niskim poziomie obejmuje kalcyneurynę, tlenek azotu i kinazę białkową aktywowaną mitogenem p38. Hipokamp. 2008;18:258–265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Ostre i przewlekłe leczenie amfetaminą w różny sposób regulują poziomy informacyjnego RNA neuropeptydów i immunoreaktywność Fos w neuronach prążkowia szczura. NEURONAUKA. 1995;65:1041–1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Hipoteza uzależnienia od homeostazy glutaminianowej. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561 – 572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontaniczna i wywołana sygnalizacja glutaminianu wpływa na ekspresję Fos-lacZ i śmierć komórek piramidalnych w hodowlach skrawków hipokampa od transgenicznych szczurów. Brain Res Mol Brain Res. 1995;34:197–208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Ukierunkowane zakłócanie Neurony jądra półleżącego aktywowane kokainą zapobiegają uczuleniu kontekstowemu. Nat Neurosci. 2009;12:1069–U1152. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  17. Kwon B., Houpt TA. Połączona metoda mikrodysekcji wychwytu laserowego i histologii X-Gal do analizy ekspresji genów w neuronach specyficznych dla c-Fos. J Metody neurologiczne. 2010;186:155–164. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Indukcja mRNA c-fos przez napady rozpalone: ​​złożony związek z odpalaniem impulsów neuronowych. J Neurosci. 1993;13:744–751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Druga klasa receptorów chemosensorycznych w nabłonku węchowym. Natura. 2006;442:645–650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Szary M, Geschwind DH, Yang XW. Profilowanie za pomocą macierzy FACS podtypów neuronów projekcyjnych prążkowia w mózgach młodych i dorosłych myszy. Nat Neurosci. 2006;9:443–452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Funkcja genów regulowanych aktywnością w układzie nerwowym. Physiol Rev. 2009;89:1079–1103. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Kontekstowo-specyficzne uczulenie na aktywność lokomotoryczną indukowaną kokainą i powiązane zespoły neuronalne w jądrze półleżącym szczura. Eur J Neurosci. 2008;27:202–212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekularny przełącznik do długoterminowej adaptacji w mózgu. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146 – 154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Uzależnienie od narkotyków – model molekularnych podstaw plastyczności neuronowej. Neuron. 1993;11:995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Molekularne podstawy długotrwałej plastyczności leżącej u podstaw uzależnienia. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119 – 128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminergiczna modulacja pobudliwości neuronów w prążkowiu i jądrze półleżącym. Annu Rev Neurosci. 2000;23:185–215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Wzmocnienie kontrastu: fizjologiczny efekt dopaminy prążkowia? Rozdzielczość tkanki komórkowej 2004;318:93–106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Bramkowanie dopaminowe zespołów nerwowych przodomózgowia. Eur J Neurosci. 2003;17:429–435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. Mózg szczura we współrzędnych stereotaktycznych. 4. San Diego: Prasa akademicka; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Jądro półleżące jako kompleks funkcjonalnie odrębnych zespołów neuronalnych: integracja danych behawioralnych, elektrofizjologicznych i anatomicznych. Prog Neurobiol. 1994;42:719–761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. Ekspresja c-Fos w ulotce międzykolankowej szczura: regulacja fototyczna, kolokalizacja z Fos-B i identyfikacja komórkowa. Rozdzielczość mózgu 1996;728:231–241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Wpływ elektrycznej stymulacji kory mózgowej na ekspresję białka Fos w zwojach podstawy mózgu. Neurologia. 1997;81:93–112. [PubMed]
  33. Sgambato V, Pages C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) kontroluje natychmiastową wczesną indukcję genów podczas stymulacji korowo-prążkowiowej. J Neurosci. 1998;18:8814–8825. [PubMed]
  34. Shaham Y., Hope BT. Rola neuroadaptacji w nawrotach poszukiwania narkotyków. Nat Neurosci. 2005;8:1437–1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Indukcja ekspresji mRNA c-fos przez wyładowanie wtórne w hipokampie szczurów naiwnych i rozpalonych. J Neurochem. 1990;55:1050–1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Początki dwustanowych spontanicznych fluktuacji potencjału błonowego neuronów kolczastych neoprążkowia. J Neurosci. 1996;16:2397–2410. [PubMed]
  37. Wilk ME, Ferrario CR. Plastyczność receptora AMPA w jądrze półleżącym po wielokrotnym narażeniu na kokainę. Neurosci Biobehav wersja 2010 [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]